Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bifidobacteria ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotics

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN HOÀNG TUẤN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
BIFIDOBACTERIA ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM PROBIOTICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN HOÀNG TUẤN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
BIFIDOBACTERIA ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM PROBIOTICS
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Đào Thị Lương
2. PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Đào Thị Lương Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội, người đã trực
tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong
suốt thời gian thực tập vừa qua.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Bùi Thị Việt Hà - Chủ nhiệm bộ
môn Vi sinh - Khoa Sinh học - Trường ĐH Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia
Hà Nội, người đã chỉ bảo và góp ý nhiệt tình giúp tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ
này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS. TS Dương Văn Hợp, cùng các cô chú
anh chị, đặc biệt là Ths. Trần Thị Lệ Quyên và KS. Hà Thị Hằng, thuộc Bảo tàng
giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học (IMBT)
- Đại học Quốc Gia Hà Nội, đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trình
thực tập.
Tôi cũng xin tỏ lòng biết ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh, khoa
Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã cung cấp cho
tôi những kiến thức quý báu, tạo nền tảng giúp tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã
luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập vừa
qua.
Xin chân thành cảm ơn !!!
Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2017
Học viên

Nguyễn Hoàng Tuấn


CHỮ VIẾT TẮT

VTCC

Vietnam Type Culture Collection
(Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam)

GRAS

Generally Recognized as Safe
( Một loại chứng nhận an toàn của FDA)

FAO

Food and Agriculture Organization
(Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

WHO

World Health Organization
(Tổ chức Y tế Thế giới)

FISH

Fluorescence In situ Hydridization
(Lai tại chỗ phát huỳnh quang)

F-6-PPK

Fructose-6-Phosphate Phosphoketolase

ATP

Adenosine Triphosphat

GI Tract

Gastrointestinal Tract
(Đường tiêu hóa)

IBD

Inflammatory Bowel Disease
(Bệnh viêm ruột)

HMO

Human Milk Oligosaccharides

MRS

De Man Rogosa Sharpe

CMC

Carboxymethyl Cellulose

OD

Optical Density
(Mật độ quang học)

CFU

Colony Forming Unit
(Số lượng tế bào vi khuẩn)


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU......................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 3
1.1. Định nghĩa probiotic...................................................................................... 3
1.2. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic ......................................................... 3
1.3. Lợi ích của probiotic....................................................................................... 4
1.4. Bifidobacteria...................................................................................................5

1.4.1. Giới thiệu.......................................................................................... 5
1.4.2. Phân loại...........................................................................................5
1.4.2.1. Hình thái..............................................................................................5
1.4.2.2. Sinh học phân tử..................................................................................6

1.4.3. Môi trường sống...............................................................................9
1.4.4. Đặc điểm sinh lý sinh hóa............................................................. 11
1.4.4.1. Sự trao đổi carbohydrate.................................................................. 11
1.4.4.2. Nhiệt độ và pH sinh trưởng tối ưu.................................................... 15
1.4.4.3. Độ nhạy cảm oxy...............................................................................15

1.4.5. Bifidobacteria mang đặc tính probiotic........................................ 16
1.4.5.1. Giảm tiêu chảy.................................................................................. 16
1.4.5.2. Làm giảm sự không dung nạp lactose.............................................. 16
1.4.5.3. Ức chế Helicobacter pylori...............................................................17

1.4.5.4. Phòng ngừa bệnh viêm ruột..............................................................17
1.4.5.5. Giảm táo bón.....................................................................................17
1.4.5.6. Phòng ung thư đại trực tràng........................................................... 17


1.4.6. Một số loài bifidobacteria đã được thương mại hóa...................18
1.4.6.1. Bifidobacterium adolescentis............................................................18
1.4.6.2. Bifidobacterium animalis..................................................................18
1.4.6.3. Bifidobacterium bifidium.................................................................. 19
1.4.6.4. Bifidobacterium breve.......................................................................20
1.4.6.5. Bifidobacterium longum....................................................................21
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP......................................... 22
2.1. Nguyên liệu.....................................................................................................22

2.1.1. Chủng vi khuẩn..............................................................................22
2.1.2. Hóa chất..........................................................................................22
2.2. Thiết bị............................................................................................................22
2.3. Môi trường..................................................................................................... 23
2.4. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................24

2.4.1. Phân lập..........................................................................................24
2.4.2. Phân loại bằng sinh học phân tử..................................................24
2.4.3. Nghiên cứu đặc tính probiotic và tuyển chọn chủng.................. 29
2.4.3.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào.................................................... 29
2.4.3.2. Khả năng sinh trưởng....................................................................... 30
2.4.3.3. Khả năng sinh axít hữu cơ................................................................ 30
2.4.3.4. Khả năng chịu muối mật................................................................... 31
2.4.3.5. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột........................31
2.4.3.6. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và
ruột mô phỏng................................................................................................ 31

2.4.3.7. Khả năng chịu kháng sinh.................................................................32


2.4.4. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng
Bifidobacterium........................................................................................32
2.4.4.1. Lựa chọn môi trường nuôi thích hợp................................................32
2.4.4.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp..................................................... 32
2.4.4.3. Lựa chọn pH nuôi thích hợp............................................................. 33
2.4.4.4. Lựa chọn nguồn cacbon nuôi thích hợp........................................... 33
2.4.4.5. Lựa chọn nguồn Nitơ nuôi thích hợp................................................33
2.4.4.6. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp................................................... 33

2.4.5. Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng
Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít..............................................36
2.4.5.1. Chế độ khuấy đảo..............................................................................36
2.4.5.2. Tỷ lệ giống cấy.................................................................................. 36
2.4.5.3. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp................................................... 36

2.4.6. Bước đầu nghiên cứu một số loại chất mang thích hợp cho quá
trình đông khô các chủng Bifidobacterium............................................36
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................37
3.1. Phân lập và phân loại....................................................................................37

3.1.1. Phân lập và quan sát hình thái..................................................... 37
3.1.2. Tách DNA genome và xác định gen F-6-PPK............................. 38
3.1.3. Phân loại dưa vào trinh tư rDNA 16S..........................................39
3.2. Nghiên cứu các đặc tính probiotic và lựa chọn chủng Bifidobacterium..42

3.2.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào................................................. 42
3.2.2. Khả năng sinh trưởng và sinh axít hữu cơ.................................. 44

3.2.3. Khả năng chịu muối mật............................................................... 46


3.2.4. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột.................. 47
3.2.5. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày
và ruột....................................................................................................... 49
3.2.6. Khả năng chịu kháng sinh............................................................ 51
3.3. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng của hai
chủng Bifidobacterium..........................................................................................53

3.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp.................................... 53
3.3.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp................................................ 54
3.3.3. Lựa chọn pH nuôi thích hợp.........................................................55
3.3.4 Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp................................................56
3.3.5. Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp.................................................... 57
3.3.6. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp...............................................58
3.4. Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium
trên thiết bị lên men 5 lít......................................................................................59

3.4.1. Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp................................................. 59
3.4.2. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp...............................................61
3.4.3. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp...............................................62
3.5. Lựa chọn chất mang thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium...............63
KẾT LUẬN................................................................................................................64
KIẾN NGHỊ.............................................................................................................. 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 66
PHỤ LỤC.................................................................................................................. 75


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Môi trường sống của các loài thuộc chi Bifidobacterium....................... 10
Bảng 1.2: Khả năng sinh trưởng của B. longum NCC2705 trên 23 loại
carbohydrate...............................................................................................................14
Bảng 3.1: Danh sach cac chung phân lâp nghi ngờ thuôc chi Bifidobacterium......37
Bảng 3.2: Độ tương đồng về trình tự rDNA 16S của các chủng vi khuẩn phân lập
với các chủng chuẩn trên GenBank........................................................................... 41
Bảng 3.3: Khả năng sinh enzyme của 20 chủng vi khuẩn Bifidobacterium............. 43
Bảng 3.4: Khả năng sinh trưởng và sinh axit hữu cơ của 20 chủng vi khuẩn......... 45
Bảng 3.5: Khả năng chịu muối mật của 20 chủng vi khuẩn..................................... 46
Bảng 3.6: Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 20 chủng vi khuẩn................48
Bảng 3.7: Khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn trong điều kiện đường tiêu hóa
của dịch dạ dày và ruột mô phỏng............................................................................. 50
Bảng 3.8: Khả năng chịu kháng sinh của các chủng vi khuẩn Bifidobacterium......52
Bảng 3.9: Khả năng tồn tại của 2 chủng nghiên cứu trên 4 loại chất mang............63


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Các con đường chuyển hóa Fructose 6-Phosphat ...................................12
Hình 1.2: Sơ đồ khác quá trình sự chuyển hóa đường của bifidobacteria theo
Meulen và cộng sự .....................................................................................................13
Hình 1.3: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium......................................6
Hình 1.4: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA
16S.................................................................................................................................8
Hình 1.5: Bifidobacterium adolescentis ...................................................................18
Hình 1.6: Bifidobacterium animalis .........................................................................19
Hình 1.7: Bifidobacterium bifidium ......................................................................... 20
Hình 1.8: Bifidobacterium breve ..............................................................................20
Hình 1.9: Bifidobacterium longum ...........................................................................21
Hình 3.1: Đoan gen F-6-PPK (591 bp) ơ cac chung vi khuân phân lâp đươc
khuyếch đai vơi căp môi đăc hiêu UR1 va UL2........................................................39

Hình 3.2: Vị trí phân loại của các chủng Bifidobacterium phân lập và các loài có
quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự rDNA 16S..................................................... 40
Hình 3.3: Lựa chọn môi trường nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium.... 54
Hình 3.4: Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium......... 54
Hình 3.5: Lựa chọn pH nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium................. 55
Hình 3.6: Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho các chủng Bifidobacterium........56
Hình 3.7: Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho các chủng Bifidobacterium............. 57
Hình 3.8: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 3.1............................... 58
Hình 3.9: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 9.2............................... 58
Hình 3.10: Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bf 3.1............................... 60
Hình 3.11: Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bf 9.2............................... 60
Hình 3.12: Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp cho các chủng Bifidobacterium.....61
Hình 3.13: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 3.1 quy mô 5 lít.........62
Hình 3.14: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 9.2 quy mô 5 lít.........62


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

MỞ ĐẦU
Probiotic là các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp
mang lại lợi ích cho sức khoẻ, đã được nghiên cứu rộng rãi và sản xuất thương mại
thành nhiều sản phẩm khác nhau trên thế giới. Lợi ích của chúng đối với sức khoẻ
con người và động vật đã được chứng minh trong hàng trăm nghiên cứu khoa học.
Ruột con người có một hệ sinh thái vi sinh vật rất lớn và đa dạng. Có hàng trăm loài
vi khuẩn thường gặp và tổng khối lượng hệ vi sinh vật sống trong đại tràng ước tính
khoảng vài trăm gram. Mật độ vi khuẩn trong đường ruột của con người ước tính lên
đến 1013-1014, nghĩa là gấp khoảng 10 đến 20 lần tổng số các tế bào trong toàn bộ cơ

thể. Hầu hết là các loại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, bao gồm Clostridia, Eubacteria,
nhóm Bacteroides và các chi Bifidobacterium: như Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium

infantis,

Bifidobacterium

longum,

Bifidobacterium

breve,...

bifidobacteria có tự nhiên trong hệ vi sinh vật đường ruột, chiếm đến 25% số lượng
vi khuẩn ở người lớn và 80% ở trẻ em, cho thấy sự phân bố của các loài
bifidobacteria trong hệ vi sinh vật đường ruột của người lớn như thế nào.
Bifidobacterium đã được chứng minh có các đặc tính probiotic, sử dụng chúng hiệu
quả trong việc phòng ngừa và điều trị các tiệu chứng rối loạn tiêu hóa ở con người và
động vật như: táo bón, nhiễm trùng đường ruột, u đại tràng và ung thư. Ngoài ra,
bifidobacteria đã được cấp chứng chỉ GRAS (Generally Recognised As Safe) để
chứng minh tính an toàn của chúng. Nhờ đó, Bifidobacterium được sử dụng phổ biến
trong các sản phẩm sữa lên men, thực phẩm chức năng và dược phẩm dùng cho cả
con người cũng như động vật.
Hiện nay, đã có mặt nhiều chế phẩm chứa Bifidobacterium trên thị trường Việt
Nam, nhưng đa số là nhập khẩu, hoặc đóng gói tại Việt Nam nhưng nguyên liệu nhập
khẩu từ nước ngoài. Mặc dù đã có những chế phẩm chứa Bifidobacterium xuất xứ từ
Việt Nam, tuy nhiên các nghiên cứu về nguồn gốc, đặc tính probiotic, quy trình sản
xuất chủng vẫn còn chưa nhiều.

1

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Từ những đặc điểm trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu:
 Phân lập và tuyển chọn được các chủng Bifidobacterium có các đặc tính
probiotic tốt, từ những nguồn gốc khác nhau ở Việt Nam.
 Phân loại và lựa chọn các chủng vi khuẩn Bifidobacterium có đặc tính sinh
học an toàn.
 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy cho sinh khối cao, qua đó ứng
dụng trong sản xuất các chế phẩm probiotic cho động vật cũng như con người.
Ngoài ra việc phân lập được các chủng Bifidobacterium cũng giúp phong phú
thêm bộ sưu tập nguồn gen Quốc Gia ở Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) –
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội còn hạn chế về
số lượng.

2

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Định nghĩa probiotic
Probiotic xuất phát từ tiếng Hy Lạp và có nghĩa là "cho cuộc sống", ban đầu
được nó được sử dụng với ý nghĩa trái ngược với từ "kháng sinh". Tuy nhiên, định
nghĩa này đã được cải tiến trong những năm qua. Ban đầu, probiotic được mô tả là
chất tăng cường sức khoẻ của bệnh nhân suy dinh dưỡng, kích thích sự phát triển
của các vi sinh vật khác, hoặc góp phần vào cân bằng vi khuẩn đường ruột. Các
định nghĩa gần đây cho thấy rằng probiotic bao gồm các vi sinh vật sống [62].
Trong đó, định nghĩa của Fuller (1992) được sử dụng rộng rãi: “Probiotic như là
một chất bổ sung vi sinh vật sống, tác động có lợi đến vật chủ bằng cách cải thiện
sự cân bằng vi khuẩn đường ruột”. Theo khuyến cáo của một nhóm làm việc cho
FAO / WHO về việc đánh giá probiotic trong thực phẩm, probiotic được định nghĩa
là "các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp mang lại lợi ích
cho sức khoẻ"[23].
1.2. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic [62]
Tiêu chuẩn an toàn
 Có nguồn gốc rõ ràng.
 Xác định chính xác về phân loại.
 Không độc hại, không gây bệnh, đạt tiêu chuẩn GRAS.
 Đặc tính chủng: Chịu kháng sinh ở nồng độ thấp và có hoạt động trao đổi chất
trong cơ thể vật chủ.
Tính phù hợp về công nghệ
 Có khả năng sản xuất và bảo quản số lượng lớn
 Mật độ cao (ưu tiên 106 -108 CFU/ml,g).
 Mang lại các tính chất cảm quan mong muốn (hoặc không có những phẩm
chất không mong muốn).
 Ổn định di truyền.
 Kháng Phage.

3

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Tiêu chuẩn chức năng
 Kháng với muối mật và axit.
 Bám dính được vào bề mặt niêm mạc.
 Có khả năng sống sót, tăng sinh và hoạt động trao đổi chất ở vị trí mục tiêu
trong cơ thể sống.
 Có khả năng sinh bacteriocin, axit hữu cơ và một số các chất kháng khuẩn để
cạnh tranh với các vi khuẩn khác.
 Có khả năng mang lại một hoặc nhiều lợi ích về sức khoẻ được kiểm chứng
lâm sàng.
Tiêu chuẩn sinh lý và ảnh hưởng đến sức khỏe mong muốn
 Phản ứng đối với vi khuẩn gây bệnh / ung thư.
 Sản sinh các chất chống vi khuẩn (bacteriocin, hydrogen peroxide, axit hữu cơ
hoặc hợp chất ức chế khác).
 Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vắc-xin, peptide).
 Cải thiện các phản ứng miễn dịch.
 Giảm dị ứng lactose.
 Giảm cholesterol huyết thanh.
 Phòng ngừa một số loại bệnh tiêu chảy.
1.3. Lợi ích của probiotic

Các tác động có lợi cho sức khoẻ của probiotic, được ghi nhận đối với một số
chủng nhất định, bao gồm ngăn ngừa một số loại bệnh tiêu chảy, đặc biệt do
rotavirus, giảm các triệu chứng liên quan đến việc sử dụng kháng sinh quá nhiều,
giảm tỷ lệ dị ứng ở người dễ bị dị ứng, cải thiện đáp ứng miễn dịch, giảm hiện
tượng không dung nạp lactose và giảm các chất chuyển hóa không có lợi. Một số
ảnh hưởng có lợi khác liên quan đến sức khoẻ, thông qua việc sử dụng probiotic
như sau: phòng ngừa hoặc giảm triệu chứng viêm ruột mạn tính, giảm nguy cơ tiêu
chảy cấp ở trẻ em, giảm nguy cơ nhiễm trùng đường hô hấp, ức chế Helicobacter
pylori và giảm cholesterol huyết thanh [45].

4

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Hơn nữa, probiotic có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột và các cơ
quan khác bằng cách điều biến các thông số miễn dịch, tính thấm qua ruột hoặc
bằng cách cung cấp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học. Các cơ chế được
nghiên cứu bởi De Vrese và Schrezenmeir (2008) bao gồm: Giảm pH ruột; Sản xuất
các chất diệt khuẩn (ví dụ axit hữu cơ, H2O2 và bacteriocin); Sự kết tụ các vi sinh
vật gây bệnh; Tăng cường sự vững chắc cho các chất nền lên men hoặc thụ thể trên
bề mặt tế bào niêm mạc ruột; Hấp thu và chuyển hóa các chất có khả năng gây bệnh,
độc hại hoặc ung thư; Điều biến các cơ chế miễn dịch; Kích thích nhu động ruột và
sản xuất chất nhầy [16].
1.4. Bifidobacteria

1.4.1. Giới thiệu
Năm 1899, Tissier quan sát và phân lập vi khuẩn hình chữ Y trong phân của
trẻ sơ sinh bú mẹ và gọi nó là "Bacillus bifidus communis" (Lat. Bifidus: đứt đoạn,
phân nhánh). Tuy nhiên, do sự tương đồng với lactobacilli, bifidobacteria đã được
đưa vào chi Lactobacillus. Và mãi cho đến khi đến khi hệ thống phân loại vi khuẩn
mới của Bergey ra đời trong ấn bản cùng tên tái bản lần thứ VIII, chúng mới được
phân loại lại và công nhận là một chi riêng. Khác với Lactobacillus, bifidobacteria có
fructose-6-phosphate phosphoketolase, không có aldolase hoặc glucose-6-phosphate
dehydrogenase và có hàm lượng G+C trong DNA cao nằm trong khoảng từ 55 đến
67%. Bifidobacteria catalase âm tính, ngoại trừ B. indicum và B. asteroids [6;11].
Chi Bifidobacterium, gồm 42 loài, thuộc Họ Bifidobacteriaceae, Bộ
Bifidobacteriales, Phân lớp Actinobacteridae, Lớp Actinobacteria, Ngành Firmicutes,
Giới Vi khuẩn[7].
1.4.2. Phân loại
1.4.2.1. Hình thái
Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, sống kỵ khí, không di động, không
hình thành bào tử , tế bào thường cong, hình que phân nhánh, dạng đơn lẻ, xếp chuỗi
hoặc tạo thành các cụm, dạng chữ “Y” hoặc “V” (Hình 1.3) [6].

5

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Hình 1.1: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium [71]

1.4.2.2. Sinh học phân tử
Phân loại đến chi
Bifidobacteria có enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK)
(EC 4.1.2.22), tham gia vào quá trình phân huỷ glucose qua con đường
phosphoketolase hay còn gọi là "bifid shunt" thông qua erythrose-4-phosphate và
acetyl-phosphate, đây là điểm khác biệt với vi khuẩn đường ruột khác. Do đó enzyme
này cũng như gen mã hóa cho nó được dùng để làm phân tử chỉ thị cho nhóm này [5].
Phân loại đến loài
Sự khác biệt của các loài trong chi thường dựa vào sự đồng nhất DNA-DNA
hoặc các đặc tính hình thái khác nhau. Trong những năm gần đây, sự chú ý của nhiều
nhà khoa học về mặt phân loại đã được thu hút vào các đầu dò DNA và gen rRNA.
Các chuỗi DNA được sử dụng phổ biến nhất để nhận diện bifidobacteria ở chi và
mức độ loài là gen 16S rRNA và 23S rRNA, cũng như vùng gen internal transcribed
spacer (ITS) nằm giữa các gen rRNA 16S và 23S. Đặc biệt, trình tự rDNA 16S có 9
vùng biến đổi, đặc biệt thích hợp để thiết kế oligonucleotides dùng để định danh đến
loài nhóm bifidobacteria. Ngoài ra, ưu điểm của việc sử dụng các gen rRNA là số
lượng bản sao của chúng trong một tế bào vi khuẩn khá cao. Roy và cộng sự (1996)
đã nghiên cứu thiết kế được các oligonucleotides dựa trên chuỗi 16S rDNA sử dụng
cho B. breve, B. infantis, và B. longum. Sau đó, Matsuki và cộng sự (1998, 1999) đã
6

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

thiết kế được các cặp primer đặc hiệu cho hầu hết các loài Bifidobacterium sống ở

đường ruột của con người như: B. adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, B.
catenulatum, B. longum, B. infantis, B. dentium và B. gallicum [10] (Hình 1.4).
Ngoài phân tích trình tự rDNA 16S, SR 23S và 16S-23S, hiện nay để phân
biệt các loài có mối quan hệ gần gũi cùng thuộc chi Bifidobacterium, trình tự gen của
protein ưa nhiệt 60 kDa (HSP60) được sử dụng. HSP60 là một protein thuộc họ
chaperonin, thành viên họ này có trong tất cả các vi khuẩn và tế bào eukaryote ở các
cơ quan như ty thể và lục lạp, gen HSP60 không dễ dàng chuyển từ một vi khuẩn này
sang vi khuẩn khác, tính bảo thủ cao và có một bản sao trong gần như tất cả các loài
vi khuẩn, do đó rất đặc trưng cho từng loài vi khuẩn. Những đặc điểm trên cho thấy
HSP60 một đại phân tử thích hợp cho nghiên cứu phát sinh loài của các loài vi khuẩn
có mối quan hệ gần gũi với nhau.

7

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Hình 1.2: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA
16S [24]

8

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24

Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

1.4.3. Môi trường sống
Môi trường sống của bifidobacteria chủ yếu là trong đường ruột của động vật
máu nóng. Đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh ở con người (chủ yếu là sâu răng)
nhưng thường chúng được coi là không gây bệnh. Thông thường, các loài
Bifidobacterium là đặc trưng đối với người và động vật; Ngoài ra, đã có nghiên cứu
chứng minh rằng bifidobacteria có trong nước thải và trong các sản phẩm sữa lên
men [6].
Ruột của trẻ sơ sinh bị xâm chiếm bởi vi sinh vật từ hệ sinh dục của người mẹ
và môi trường bên ngoài. Ngoài ra, các nghiên cứu mới cho thấy việc di chuyển vi
khuẩn từ tuyến ruột sang tuyến vú của người mẹ có thể là nguồn lây nhiễm cho sữa
mẹ và dẫn đến sự lây lan sang ruột của trẻ sơ sinh [47]. Các nghiên cứu sử dụng công
nghệ lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) cho thấy bifidobacteria chiếm tới 75% tổng số
vi khuẩn trong phân của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và đến 91% trẻ bú sữa mẹ [28]. Theo
thời gian số lượng bifidobacteria trong đường tiêu hoá của con người giảm dần, các
vi sinh vật trong phân của trẻ em tương tự như người lớn sau hai năm đầu đời. Ở
người cao tuổi, số lượng bifidobacteria thấp hơn, trong khi số lượng Clostridium
trong phân tăng lên [51].

9

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Bảng 1.1: Môi trường sống của các loài thuộc chi Bifidobacterium
Loài

Chủng

Nguồn

ATCC15703T

Phân, ruột thừa, răng bị sâu và âm
đạo người lớn

Phân lập từ người
B. adolescentis

Phân người lớn

B. angulatum
B. bifidum

DSM 20215

Phân trẻ sơ sinh và phân, âm đạo

JCM 1254

người trưởng thành

NCIMB
41171
B. longum bv. infantis

ATCC 15697

Phân và âm đạo trẻ sơ sinh

B. breve

UCC2003

Phân và âm đạo trẻ sơ sinh
Phân người trưởng thành

B. catenulatum
Phân lập từ động vật
B.animalis ssp. animalis

Phân, ruột chuột, gà, thỏ và phân bê

B. longum bv. suis

Phân lợn con

B. asteroides

Ruột ong mật

B. bouom

Phân lợn

B. choerimum

Phân lợn con

B. coryneforme
B. pullorum

ATCC 49618

Phân gà

Phân lập từ nguồn gốc khác
B. animalis ssp. lactis

Sữa lên men

B. minimum

Nước thải

B. subtile
Nguồn: [9; 63; 36; 33]

10

Nước thải

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

1.4.4. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
1.4.4.1. Sự trao đổi carbohydrate
Bifidobacteria thuộc nhóm chemoorganotrophs (là những sinh vật làm oxy
hóa các liên kết hóa học trong các hợp chất hữu cơ làm nguồn năng lượng). Chúng
sinh axit từ nhiều loại carbohydrate, chủ yếu là acid acetic và axit lactic, và không tạo
khí. Sự phân giải hoá học các hexoses trong các loài Bifidobacterium liên quan đến
một con đường đặc trưng được gọi là con đường fructose 6-phosphate (F-6-P) [19].
Enzyme chính của con đường này là fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK)
(EC 4.1.2.2) xúc tác sự phân hủy của phosphat pentose, acetyl phosphate và
glyceraldehyde-3-phosphate [9].
Fructose-6-phosphate phosphoketolase được mã hoá bởi gen xfp [43]. Hexose
trải qua một loạt các phản ứng phân tách và phản ứng đồng phân hóa học để tạo ra
phosphat pentose. Acetyl phosphate được chuyển thành axetat, sản sinh ra một ATP,
trong khi glyceraldehyde-3-phosphate được chuyển thành pyruvate và tiếp tục tạo ra
lactate để tái tạo NAD [17]. Tỷ lệ lý thuyết tính toán của con đường F-6-P là 3:2
(acetate/lactate) (Hình 1.1). Tuy nhiên, pyruvate cũng có thể được chuyển đổi thành
formate và acetyl-CoA sau đó được tạo ra ethanol bằng cách oxy hóa một NADH sản
sinh ra trong quá trình trao đổi chất. (Hình 1.2) [19].

11

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa Fructose 6-Phosphat [6]

12

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Hình 1.4: Sơ đồ sự chuyển hóa đường của bifidobacteria được điều chỉnh theo Van
der Meulen và cộng sự (2006) [61]
Việc kiểm soát sự phân hủy pyruvate thành lactate hoặc ethanol không rõ ràng,
nhưng nó có thể tùy thuộc vào sự sẵn có của carbohydrate [17;18]. Nghiên cứu của
Degnan và cộng sự (1995) chỉ ra rằng pyruvate được chuyển hóa ưu tiên thành
axetyl-CoA và formate vì một ATP được tạo ra, nhưng khi sự hình thành ATP dư
thừa quá mức và pyruvate được chuyển hóa thành lactate. Van der Meulen và cộng
sự (2006) chỉ ra rằng khi mức tiêu thụ đường tăng lên, nhiều axit lactic và ít axit
acetic hơn, axit formic và ethanol được ưu tiên sản xuất và ngược lại [60].

13

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2017

Bifidobacteria có thể phát triển trên nhiều nguồn carbon bao gồm cả
saccharide mono-, di-, tri- và oligo. Điều này cho bifidobacteria một lợi thế sinh thái
trong môi trường ruột, nơi có nguồn carbohydrate phức tạp. B. longum thích ứng với
nhiều nguồn carbohydrate phức tạp bởi trong bộ gen của chúng mã hóa trên 40
glycosylhydrolases có liên quan đến sự biến đổi của các oligosaccharide bậc cao hơn.
Bảng 1.2: Khả năng sinh trưởng của B. longum NCC2705 trên 23 loại carbohydrate
Nguồn carbon

Sinh trưởng

Monocarbohydrate
Monocarbohydrate

++

ArabinoseFructose

+

Galactose

+++

Glucose

+++

Glycerol

-

Mannose

-

Mannitol

-

N-acetylglucosamine

-

Rhamnose

-

Ribose

+

Sorbitol

-

Xylitol

-

D-Xylose

++

Di / trisaccharides

14

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24


Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học
Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội

Maltose

++

Melibiose

++

Salicine

-

Sucrose

++

Trehalose

2017

-

Lactose

+++

Raffinose

+++

Oligosaccharides
Arabinogalactan

+

Raftilose (oligofructose) *

++

Tinh bột

-

Khả năng sinh trưởng: sinh trưởng chậm (+), sinh trưởng vừa phải (++) và sinh trưởng nhanh (+++)
* Thành phần của raftilose là 93,2% oligofructose và tới 6,8% glucose, fructose và sucrose [44].

1.4.4.2. Nhiệt độ và pH sinh trưởng tối ưu
Bifidobacteria là vi khuẩn đường ruột của các động vật máu nóng, nhiệt độ
sinh trưởng tối ưu của chúng dao động từ 37 đến 41°C và pH tối ưu cho sự sinh
trưởng là giữa 6,5 và 7,0 [6]. Hầu hết các loài không phát triển dưới 20°C và trên
46°C và pH thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 8,5, ngoại trừ B. thermacidophilum, có thể
phát triển ở pH 4,0 và ở 49°C [20].
1.4.4.3. Độ nhạy cảm oxy
Bifidobacteria là các vi sinh vật kỵ khí nghiêm ngặt và nhạy cảm với oxy. Tuy
nhiên, độ nhạy cảm với oxy khác nhau giữa các loài và chủng [6]. Một số chủng
Bifidobacterium có thể phát triển trong môi trường dịch thể có sự hiện diện của oxy.
Ví dụ, B. lactis dung nạp 10% oxy trong lớp khí quyển ở trên môi trường lỏng [42]. B.
thermophilum ít nhạy cảm tiếp xúc với không khí và có thể phát triển trong điều kiện
nồng độ oxy thấp [3;64]. Tuy nhiên gần đây, B. psychraerophilum được phát hiện là

15

| Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24