Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN








NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
CELLULOSE TRONG RƠM RẠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN








NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
CELLULOSE TRONG RƠM RẠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung

Hà Nội, 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS Đinh
Thị Kim Nhung, người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và
nghiên cứu đề tài này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn
Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian tôi thực hiện đề
tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa
Sinh -KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm VSV Trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những
người luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập,
tiến hành và hoàn thiện đề tài.
Hà Nội, Ngày 23 Tháng 05 Năm 2018

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Ánh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, tất cả những
số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không
có số liệu sao chép. Đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên cứu
của các tác giả khác.
Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác làm dẫn
chứng, tôi xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, Ngày 23 Tháng 05 Năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Ánh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn............................................................................. 2
5. Đóng góp của đề tài............................................................................................. 2
NỘI DUNG ................................................................................................................ 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
1.1. Tổng quan về cellulose trong rơm rạ ............................................................... 3
1.1.1. Thành phần các chất trong rơm rạ................................................................. 3

1.1.2. Tính chất và cấu trúc cellulose...................................................................... 3
1.1.3. Hiện trạng sử dụng rơm rạ ở Việt Nam ........................................................ 4
1.2. Hệ VSV phân giải cellulose trong rơm rạ ........................................................ 5
1.2.1 Vi khuẩn ......................................................................................................... 5
1.2.2. Xạ khuẩn ....................................................................................................... 5
1.2.3. Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ ............. 6
1.2.4. Sơ lược về chủng nấm mốc Trichoderma ..................................................... 9
1.2.5. Ứng dụng của Trichoderma ........................................................................ 15
1.3. Thực tế nghiên cứu về phân giải cellulose trong rơm rạ nhờ VSV ............... 17
1.4. Một số biến đổi trong quá trình phân giải cellulose....................................... 18
1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm mốc ................................. 22
1.6. Yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme cellulase.......................... 23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 26
2.1 Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 26


2.2 Vật liệu ............................................................................................................ 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 27
2.3.1. Lấy mẫu ....................................................................................................... 28
2.3.2. Phân lập VSV từ các khối ủ ........................................................................ 28
2.3.3 Phương pháp cấy truyền tuyển chọn từng giống và bảo quản giống ............ 29
2.3.4 Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại ............................................. 29
2.3.5 Xác định khả năng phân giải cellulose của VSV ......................................... 31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 33
3.1. Diễn thế sinh thái của VSV trong quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm rạ ... 33
3.2. Các chủng nấm phân lập được từ quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm rạ ..... 35
3.3. Tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính enzyme ngoại bào phân giải tốt
cellulose................................................................................................................. 37
3.4. Đặc điểm sinh học của các chủng nấm có hoạt tính enzyme ngoại bào
tuyển chọn ............................................................................................................. 40

3.5. Tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính enzyme nội bào phân giải tốt
cellulose................................................................................................................. 43
3.6. Nghiên cứu tính đối kháng của các chủng nấm mốc tuyển chọn................... 45
3.7. Đánh giá khả năng phân giải rơm rạ của một số chủng nấm mốc tiềm
năng tuyển chọn .................................................................................................... 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 53
1. Kết luận ............................................................................................................. 53
2. Kiến nghị ........................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 54


DANH MỤC VIẾT TẮT
1.

BG

: Bột giấy

2.

CMC

: Cacboxyl Methyl Cellulose

3.

dd

: dung dịch

4.

g

: gram

5.

KL

: khuẩn lạc

6.

RBBR

: Remazol Brilliant Blue R

7.

VSV

: VSV

8.

T.reesei

: Trichoderma reesei

9.

MT

: môi trường

10.

CHB

: cellobiohydrrolase

11.

E.M

: Effective Microorganisms


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc của cellulose............................................................................ 3
Hình 1.2 Sơ đồ phân loại nấm .............................................................................. 8
Hình 3.3.1 Vòng hoạt tính của chủng nấm mốc N1 MT bổ sung cơ chất là
bột giấy ................................................................................................................... 37
Hình 3.3.2 Vòng hoạt tính của chủng nấm mốc N3 MT bổ sung cơ chất là
bột giấy ................................................................................................................... 37
Hình 3.3.3 Vòng hoạt tính của chủng nấm mốc N1 và N3 MT bổ sung cơ chất
là CMC ................................................................................................................... 38
Hình 3.4.1 KL chủng nấm mốc N1 ...................................................................... 40
Hình 3.4.2 Bông nấm của chủng nấm mốc N1 .................................................... 40

Hình 3.4.3 Bọng đỉnh giá của chủng nấm mốc N1 ............................................. 40
Hình 3.4.4 Bào tử của chủng nấm mốc N1 .......................................................... 40
Hình 3.4.5 KL chủng nấm mốc N3 ...................................................................... 41
Hình 3.4.6 Bông nấm của chủng nấm mốc N3 .................................................... 41
Hình 3.4.7 Bọng đỉnh giá của chủng nấm mốc N3 ............................................. 42
Hình 3.4.8 Bào tử của chủng nấm mốc N3 .......................................................... 42
Hình 3.5.1 Vòng hoạt tính enzyme nội bào của chủng nấm mốc
Trichoderma N1 MT bổ sung cơ chất là CMC .................................................... 44
Hình 3.5.2 Vòng hoạt tính enzyme nội bào của chủng nấm mốc
Trichoderma N3 MT bổ sung cơ chất là CMC .................................................... 44
Hình 3.6 Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng nấm tuyển chọn
với chủng vi khuẩn và xạ khuẩn .......................................................................... 45
Hình 3.7.1 Thùng xốp có bổ sung các chủng nấm mốc ...................................... 46
Hình 3.7.2 Thùng xốp không bổ sung các chủng nấm mốc ............................... 46
Hình 3.7.3 Biến thiên nhiệt độ trung bình của các khối ủ (thể tích 1m3) ......... 48
Hình 3.7.4 Luống rau trồng thí nghiệm .............................................................. 50


Hình 3.7.5 Luống rau trồng đối chứng................................................................ 50
Hình 3.7.6 So sánh kích thước của cây rau cải sau khi trồng 15 ngày ............. 50


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.2.1 MT phân lập và nuôi cấy VSV .......................................................... 25
Bảng 2.2.2 Thành phần MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào .......................... 25
Bảng 2.3 Thành phần của các khối ủ................................................................... 27
Bảng 3.1.1 Sự thay đổi một số trạng thái rơm trong các khối ủ U1 và U2 ....... 32
Bảng 3.1.2 Sự thay đổi độ mủn của rơm rạ các khối ủ ...................................... 34
Bảng 3.2 Nấm mốc phân lập được ở các mẫu khối ủ ......................................... 34
Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc phân lập ....... 36

Bảng 3.5 Hoạt tính enzyme nội bào của các chủng nấm mốc phân lập ........... 42
Bảng 3.7.1 Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ .......................................... 46
Bảng 3.7.2 So sánh sự sinh trưởng của cây rau cải trồng trên có và không
bổ sung nguồn nấm mốc tuyển chọn (trong 15 ngày) ........................................ 49


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hiện nay tình trạng ngộ độc diễn ra ngày càng phổ biến trong đó các trường
hợp ngộ độc do sử dụng nguồn rau không đảm bảo ngày càng gia tăng đã gây nên
nỗi hoang mang lo lắng cho người tiêu dùng. Trước tình hình đó một nhucầu mới
của người tiêu dùng là được sử dụng một nguồn rau sạch đảm bảo antoàn, không
chứa các chất gây độc, các chất có hại cho sức khoẻ. Mặt khác, nhiều chủ cửa
hàng đã vì mục đích lợi nhuận mà bày bán lẫn lộn giữa hai loại rau sạch và rau bẩn
trên cùng một sạp hàng khiến người tiêu dùng dễ bị nhầm lẫn khi lựa chọn. Bên
cạnh đó vẫn còn rất nhiều người tiêu dùng có nhu cầu sử dụng sản phẩm rau sạch
nhưng lại không biết loại rau nào mới đảm bảo an toàn do hình thức và mẫu mã
của hai loại rau là hoàn toàn giống nhau, giải pháp tức thời là tự trồng rau trong
vườn nhà mình bằng nguồn đất và mùn hữu cơ sạch.
Nước ta là một nước nông nghiệp, cây lương thực chủ yếu là lúa gạo. Hằng
năm lượng rơm rạ thu được sau thu hoạch là rất lớn. Rơm rạ được người dân sử
dụng một phần làm thức ăn cho gia xúc và đun nấu còn lại đa số được đốt ngay
trên đồng ruộng. Việc này gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến môi trường xung
quanh và các hoạt động sinh hoạt của con người nếu biết tận dụng nguồn rơm rạ ủ
mùn hữu cơ sẽ tạo ra nguồn lợi về nhiều mặt.
Hiện nay các công trình nghiên cứu về các chủng VSV đặc biệt là nấm mốc
có khả năng phân giải rơm rạ ngày càng nhiều và có những thành quả nổi bật như:
Chế phẩm sinh học Bokashi, Chế phẩm E.M, Chế phẩm Vixura, Chế phẩm sinh
học BIMA (Trichoderma).....tuy nhiên vẫn còn rất nhiều chủng nấm mốc ngoài tự
nhiên có khả năng cho hoạt tính phân giải rơm rạ tốt vẫn chưa được xác định vì vậy

tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả
năng phân giải cellulose trong rơm rạ”.

1


2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn được các chủng nấm có hoạt tính phân giải cellulose cao và
nghiên cứu được một số đặc tính sinh học bao gồm: đặc điểm hình thái, điều kiện
nuôi dưỡng, hoạt tính enzyme ngoại bào và nội bào, hoạt tính đối kháng của các
chủng nấm trên.
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng tạo mùn hữu cơ của một số chủng
nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng cơ sở khoa học của quá trình phân giải cellulose để nghiên cứu các
đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học của một số chủng nấm mốc khả năng phân
giải cellulose trong rơm rạ. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu góp phần bổ sung cho các
nghiên cứu và ứng dụng của chủng nấm mốc trên trong đời sống.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu góp phần tìm hiểu quá trình tạo mùn hữu cơ từ nguồn nguyên
liệu sẵn có ở Việt Nam.
5. Đóng góp của đề tài
Tuyển chọn được 2 chủng Trichoderma N1 và Trichoderma N3 Bước đầu
đánh giá khả năng sinh trưởng của cây rau cải trên mùn khối ủ rơm rạ đã bổ sung
các chủng nấm mốc tuyển chọn.

2

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cellulose trong rơm rạ
1.1.1. Thành phần các chất trong rơm rạ
Theo giáo sư tiến sĩ sinh học Nguyễn Lân Dũng thành phần hóa học của rơm
rạ nếu tính theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hyđro (H) chiếm 5%, oxy
(O) chiếm 49% và nitơ (N) chiếm khoảng 0,92%, một lượng rất nhỏ còn lại là
photpho (P), lưu huỳnh (S) và kali (K).
Thành phần chính của rơm rạ tính theo khối lượng khô là: cellulose (34 38%), hemicellulose (32 - 40%), lignin (12%), và hàm lượng tro (oxit silic) cao (từ
14 - 18%). Tỷ lệ lignocellulose cao (78 - 90%) gây cản trở việc sử dụng rơm, rạ
một cách kinh tế. Thành phần lignocellulose trong rơm rạ, trong đó có cenllulose,
rất khó bị phân hủy bởi hóa chất và VSV nhưng nếu sử dụng tập hợp các chủng
nấm mốc phân giải thích hợp thì sẽ tạo thành nguồn mùn hữu cơ sinh học tốt.
1.1.2. Tính chất và cấu trúc cellulose
Tính chất và cấu trúc cellulose:
Cellulose có công thức tổng quát là
(C6H10O5)n, có phân tử khối rất lớn
khoảng 1.000.000 − 2.400.0001.000.000
−

2.400.000).

Cellulose

là

các

polysaccharid mạch thẳng được cấu tạo

từ 3000 – 10.000 đơn vị β•D•Glucose
nối với nhau bằng liên kết 1,4-β-Dglucoside, phân tử cellulose không phân nhánh, không xoắn. Mỗi mắt xích C6H10O5
có 3 nhóm OH tự do. Cellulose chủ yếu được tạo thành trong cây xanh nhờ quá
trình quang hợp theo phương trình sau:
3


6nCO2+5nH2O-->(C6H10O5)n +6nO2 trong điều kiện có ánh sáng.
1.1.3. Hiện trạng sử dụng rơm rạ ở Việt Nam
Phế phẩm chủ yếu từ lúa gạo là rơm, rạ. Rơm rạ là phần thân và gốc của cây
lúa sau khi tách hết phần hạt. Việt Nam là quốc gia đứng thứ hai về sản xuất lúa
gạo sau Thái Lan. Theo thống kê của Tổ chức phát triển Hà Lan, mỗi năm Việt
Nam sản xuất ra xấp xỉ 40 triệu tấn sinh khối từ phụ phẩm lúa gạo, bao gồm 32
triệu tấn rơm rạ và 8 triệu tấn trấu. Lượng rơm rạ sau thu hoạch chủ yếu được nông
dân đốt ngay trên đồng ruộng gây lãng phí về nhiều mặt.
Ngoài ra,việc đốt rơm rạ sau thu hoạch không những không cải thiện tình
trạng đất mà còn ảnh hưởng tới MT và tài nguyên đất tại nơi đốt, khiến cho đất tại
vị trí đốt nóng trở nên trơ ảnh hưởng xấu tới sinh vật trong đất. Nguồn dinh dưỡng
bị mất dần, năng suất cây trồng giảm. Bên cạnh đó, khói tỏa ra từ những nơi đốt
ảnh hưởng tới sức khỏe người dân trong khu vực và những vùng phụ cận làmkhông
khí trở nên ngột ngạt, gây ra hiện tượng khó thở và gây ra các bệnh về đường hô
hấp. Không chỉ như vậy, việc đốt rơm rạ còn ảnh hưởng tới con người vàphương tiện
tham gia giao thông trên đường. Trên một số tuyến đường quốc lộ, đường liên
huyện, liên xã…bà con nông dân chất rơm rạ thành đống để đốt. Khói bụi mù mịt
làm giảm tầm nhìn của người tham gia giao thông là nguyên nhân gây ra rất nhiều
vụ tai nạn thương tâm.
Thành phần của rơm, rạ là cellulose và hemicellulose và một số hợp chất hữu
cơ khác, khi bị đốt, những chất này tạo ra CO2, gây ra ô nhiễm MT không khí. CO2
là một trong những chất khí cơ bản gây ra hiệu ứng nhà kính, nguyên nhân của việc
làm cho Trái Đất nóng lên. Hằng năm, sau mỗi mùa vụ rất nhiều tấn CO2 được thải

vào MT vì nguyên nhân trên. Thực tế, chỉ có một phần nhỏ rơm rạ được sử dụng
làm phân bón sinh học, còn lại chủ yếu là đốt bỏ ngay trên đồng ruộng gây ra lãng

4


phí và ảnh hưởng tới MT. Do đó, nếu biết tận dụng nguồn rơm rạ này sẽ có ý nghĩa
về nhiều mặt.
1.2. Hệ VSV phân giải cellulose trong rơm rạ
Hệ VSV phân giải cellulose trong rơm rạ: Hệ VSV phân giải cellulose rất đa
dạng bao gồm cả VSV kị khí và VSV hiếu khí. Các vi khuẩn phân giải cellulose kị
khí Clostridium trong đất hoặc phân chuồng, phân xanh. Các VSV phân giải
cellulose hiếu khí gồm: Nấm mốc (Trichoderma, Apergillus, Penicillium,
Cladosporium, Botrytis, Furaium,…), Vi khuẩn (Bacillus, Cellivibrio,..), Xạ khuẩn
(Streptomyces..) [2].
1.2.1 Vi khuẩn
Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides genes, Butyri
vibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium,
Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans,
Ochrobactrum cylisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia
riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides Citrobacte
freundii và Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm VSV kị
khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột những loài động vật sử dụng gỗ làm
nguồn thức ăn [10], [14], [18].
Trong lòng đất người ta cũng phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu
khí như Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus. Đối với các dòng ưa
ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme cacbonmethyl cellulose của chúng hoạt
động là 5,5 và 550C, còn đối với các dòng ưa nhiệt pH là 5 và nhiệt độ là 750C [15].
1.2.2. Xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm. Chúng

là VSV hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên. AND của xạ khuẩn rất giàu G+C
chiếm 57-75% [13]. Chúng chiếm ưa thế trong đất phèn khô [11]. Xạ khuẩn còn
5


được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyên hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng
sinh như streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin. Ngoài ra xạ khuẩn
còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông
nghiệp.
Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là VSV sản sinh
cellulose được quan tâm nghiên cứu. Một số loài đáng chú ý thuộc giống này như
Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans [12], [19],
[17]. Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương,
Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khả năng phân hủy
cellulose [9], [7], [21].
1.2.3. Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ
Nấm mốc còn được gọi là nấm sợi là tất cả các nấm không phải là nấm men và
cũng không sinh mũ nấm như ở các nấm lớn [3]. Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa
độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai. Đặc biệt, đây là nhóm
được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose. Các cellulase từ nấm
thường có hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạpnhư enzyme
này từ vi khuẩn. Các chủng tiêu biểu như Acremonium spp., Chaetomium spp.,
Trichoderma reesei, Trichoderma viride, penicillium pinophilum, Phanerochaete
chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii,
Fusarium oxysporium, Aspergillus niger. Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae
có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy cellulose ở nhiều môi trường khác
nhau [19], [16].
Phân loại
Ban đầu, hệ thống phân loại nấm chia thành 4 ngành: Chytridiomycota,
Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota. Tiến bộ của Sinh học phân tử và kỹ

6


thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân
loại và sinh lý học nấm. Nấm được chia thành 10 dưới ngành trong đó Ascomycota
và Basidimycota được xếp vào một dưới ngành Dikarya, Chytridiomycota được xếp
vào một dưới ngành riêng biệt, ngoài ra một số Chytridiomycota và Zygomycota
được xếp ngoài bảng phân loại [1].

7


Hình 1.2 Sơ đồ phân loại nấm

8


Trong đó chủng nấm Trichoderma là chủng nấm có khả năng phân giải
cellulose tốt.
1.2.4. Sơ lược về chủng nấm mốc Trichoderma
1.2.4.1. Ví trí phân loại
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc
định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại
vẫn chưa được biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự
khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cuống sinh bào tử và quá trình
sinh sản vô tính bằng bào tử. Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma
thuộc giới fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomyceies, bộ Hypocreales, họ
Hypocreaceae, chi Trichoderma (trích dẫn của Clipson, N. và cs, 2001). Đã có hơn
50 loại Trichoderma khác nhau đã được tìm thấy. Trichoderma được phân thành 5
nhóm:

Trichoderma,

Longibrachiatum,

Saturnisporum,

Pachyhasium

và

Hypocreanum. Trong đó, nhóm Saturnisporum không tìm thấy giai đoạn
teleomorph (giai đọan sinh sản hữu tính, đây là một dạng biến dị từ sự tái tổ hợp do
lai chéo ngoại huyết như trong chu kì cận giới tính) và nhóm Hypocreanum hiếm
khi gặp có giai đoạn này độc lập, chi có 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium,
Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph nên được gọi là Hypocrea, thường không
được dùng với mục đích kiểm soát sinh học (Gary I. Samuels, 2004).
1.2.4.2. Đặc điểm hình thái
Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên
trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động.Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng
vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông
thường là 5-10µm).

9


Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối
nhóm phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn,
không màu, liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Ở một số
loài Trichoderma cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Một số loài

khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần mọc theo sợi nấm
hoặc ở khu vực tỏa ra của KL, có kích thước từ 1-7 µm, có hình đệm rất rắn chắc
hoặc dạng bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề
mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm.
Bào tử của Trichoderma là khối tròn mọc lên đầu ở đầu cuối cuống sinh bào
tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không
màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhày. Đặc điểm nổi bật của nấm
Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng, vàng hay
xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài : rộng từ 11,1µm) hay hình chữ nhật (với ti lệ dài : rộng là hơn 1,4µm), đa số các bào tử tròn
láng. Kích thước không quá 51,4µm.
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone).
Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30µm. Dưới phần nàythành
tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường
bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu
gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên
thể (lomasome).
Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleoltit) được bao bọc bởi màng nhân có nhiều
lỗ thủng. Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn của sợi nấm và ít hơn trong các tế bào
phía sau ngọn (1,2 nhân). Nhân nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi
quang học. Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương
đối ít (6 ở T.reesei).
10


Trong đó, T.reesei là một loài nổi bật trong chi Trichoderma. Tế bào nấm
chứa các bào quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân thực (Eukaryote)
khác. Ribosome của T.reesei thuộc loại 80S (S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có
đường kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị (subunit): bán đơn vị lớn (large
subunit) 60S (gồm 3 loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein). Bán
đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24 loại protein) [1].

Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ
nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn về tế bào chất về phía
đỉnh ngọn sợi nấm. Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan
(autolysis) hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzyme) do các
VSV khác sinh ra. Cũng có những phần nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợp
với thành tế bào tạo nên một màng dày hình thành những bào tử áo
(chlamydopspore). Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua những điều
kiện MT khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh
(endospore).
Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên MT
đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiều- mycelia), sau 3-5 ngày
có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là KL (colony). Giai đoạn cuối của sự
phát triển KL sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau tạo
hệ thống liên thông thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ
sợi nấm.
1.2.4.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
1.2.4.3.1. Đặc điểm sinh thái
Nấm Trichoderma thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi
Imperfecti), trong đó KL của Trichoderma có màu lục (khi tăng trưởng dưới nắng
mặt trời). Đây là nhóm nấm bất toàn nên chúng là những nấm sinh sản vô tính bằng
11


bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi
(đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử [4]. Chúng có tốc độ phát triển nhanh có
thể đạt đường kính KL từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 200C. Chúng phát triển
nhanh ở nhiệt độ 25-300C, chậm ở 35-370C chúng tạo ra những KL rắn dị thường
với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường.Trong khi ở 37 0C, bào tử không
xuất hiện sau 7 ngày nuôi cấy.
1.2.4.3.2. MT sống

Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm. Hầu hết chúng là VSV hoại
sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm
thấy ở thực vật sống hay sống nội kí sinh với thực vật. Chúng có mặt khắp mọi nơi
trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Chúng phổ biển trong những khu rừng nhiệt
đới ẩm hoặc cận nhiệt đới. Nhu cầu nhiệt độ tối đa của MT sống đặc trưng cho từng
loài. Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid và Trichoderma sử dụng
nhiều nhất nguồn thức ăn khác nhau từ cacbohydrat, amoni acid đến ammonia.
Trichoderma có thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương dứa(6pentyl-pynone dễ bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của
Trichoderma.
1.2.4.3.3. Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh
Trichoderma sản xuất rất nhiều các loại kháng sinh: glioviridin,
sespuiterpenoids, trichothecenes, cyelic peptides, isocyanid.
Trichoderma có khả năng sản xuất đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp:
anthroquinon, emodin.
1.2.4.3.4. MT nhân sinh khối
Trichoderma phát triển và hình thành bào tử trên MT có nhiều cellulose như:
rơm rạ, bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia…
12


1.2.4.3.5. Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma
Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều “hoạt
động” khác nhau, chúng có thể sử dụng các cơ chế:
+ Kháng sinh là chất tiết ra có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác
nhân gây bệnh.
+ Cạnh tranh: Trichoderma sử có cùng MT sống và nguồn dinh dưỡng với các
VSV gây bệnh nhưng chúng có khả năng sinh trưởng phát triển trước lấn át các VSV
gây bệnh.
+ Kí sinh: Tức là giết chết các loài gây bệnh bằng cách xâm nhập vào bên
trong loài nấm gây hại hoặc tiết ra enzyme để phân hủy chúng.

1.2.4.3.6. Hệ enzyme trong nấm mốc
Trong nấm mốc có đầy đủ các enzyme để phân giải các thành phần chính
trong rơm rạ và quan trọng nhất là chúng có enzyme có hoạt tính tốt phân giải
cellulose trong rơm rạ.
Enzyme phân giải cellulose
Liên kết chủ yếu trong của polysaccharide này cần có một hệ enzyme cellulase
với những tác động đặc trưng riêng biệt. Dựa theo nghiên cứu về hệ enzyme
cellulase của nấm Trichoderma reesei, hệ enzyme thủy phân cellulose gồm 3 loại
enzyme:
(1) Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy
phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong phân tử cellulose ở các điểm ngẫu nhiên
bên trong chuỗi polyme hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi
oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể
13


hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ
tiếp cận.
(2) Exoglucanase bao gồm các 1,4- β -D-glucan glucanohydrolase, giải
phóng

D-glucose

từ

β-glucan

và

cellodextrin;

và

các

1,4-β-D-glucan

cellobiohydrolase, thủy phân D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân của enzyme
cellobiohydrolase bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu khử của mạch cellulose.
(3) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử Dglucose từ cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác.
Rất ít sinh vật có khả năng phân giải cellulose để làm nguồn cung cấp thức ăn.
Vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng cao; chúng chỉ có tác dụng điều hòa
hệ thống tiêu hóa, làm giảm lượng mỡ, cholesterol trong máu và tăng cường đào thải
chất cặn bã. Vi khuẩn trong dạ cỏ của các động vật nhai lại và các động vật nguyên
sinh trong ruột mối là những VSV có khả năng sinh enzyme phân giải cellulose.
Ngoài ra, một số VSV đất cũng có khả năng này giúp phân hủy cellulose tạo mùn
hữ cơ.
Enzyme phân giải hemicellulose
Xylan là cơ chất điển hình trong nhóm hemicellulose của thực vật. Enzyme
xylanase, thủy phân xylan, được sản xuất chủ yếu từ VSV. Các VSV có khả năng
sinh enzyme xylanase ngoại bào bao gồm chủ yếu là nấm mốc.
Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân đòi hỏi một hệ thống
enzyme phức tạp. Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme cắt mạch chính
không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse và β-xylosidase) và enzyme cắt mạch nhánh
(α-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase acid
phenolic). Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển đổi xylan thành các
14


cấu tử đường của nó. Hệ thống các enzyme thủy phân xylan đa chức năng như vậy

khá phổ biến ở nấm mốc.
Enzyme phân giải lignin
Lignin cấu trúc từ nhiều đơn phân có vòng thơm, có đặc tính không ưa nước.
Do đó rất khó phân huỷ.
Về cấu tạo, lignin gồm các mạch phenylpropanoid phức tạp, cấu trúc không
đồng nhất. Chính vì tính chất đó nên việc phân huỷ sinh học lignin đòi hỏi hệ
enzyme oxy hóa khử mạnh.
1.2.5. Ứng dụng của Trichoderma
1.2.4.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và nâng cao năng suất cây trồng
+ Bảo vệ thực vật: Một trong những ứng dụng được tìm hiểu nhiều nhất của
Trichoderma là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số
nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều loại Trichoderma khác
để kiểm soát hiệu quả của các nấm gây bệnh. Cụ thể nấm Trichoderma được sử
dụng để chống lại nấm Pythiam spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp.,
Sclerotinia spp., Botrytis spp., Fusariam spp. và Crinipellis spp. Gây bệnh khô vằn
ở lúa, bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, bệnh thối góc ở một số loại cây trồng như
tiêu, bông, nho, ngô, đậu nành, mận, táo, cà rốt, hành, rau diếp,.. do chúng có tính
đối kháng với các nấm hại bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, kí sinh với nấm hại
hoặc tiết kháng sinh, enzyme (chitinase, ß-1,3-glucanase) phân hủy vách tế bào
nấm gây bệnh cây trồng (Gary J. Samuels, 2004).
Nhóm nấm Trichderma hiện đang được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghệ
sản xuất phân hữu cơ sinh học hiện nay ở Việt Nam. Phân hữu cơ sinh học có phối
trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là loại phân có tác dụng rất tốt trong việc
phòng trừ các bệnh vàng lá chết nhanh, còn được gọi là bệnh thối rễ do nấm
15