Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
------------------

TRẦN THỊ THOA

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG RƠM RẠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
------------------

TRẦN THỊ THOA

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG RƠM RẠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Người hướng dẫn khoa học
PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS
Đinh Thị Kim Nhung, người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian
học tập và nghiên cứu đề tài này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
em thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh - KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh
vật Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân,
những người luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập, tiến hành và hoàn thiện đề tài.
Hà Nội, Ngày 09 Tháng 05 Năm 2018
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thoa


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất cả
những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn
toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không trùng
với công trình nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác, em

xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, Ngày 09 Tháng 05 Năm 2018
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thoa


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................ 2
3. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................. 2
5. Đóng góp của đề tài ................................................................................. 3
NỘI DUNG ..................................................................................................... 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1. Tổng quan về cellulose trong rơm rạ .................................................... 4
1.1.1. Thành phần các chất trong rơm rạ ................................................. 4
1.1.2. Tính chất và cấu trúc của cellulose ................................................ 4
1.1.3. Hiện trạng sử dụng rơm rạ ở Việt Nam .......................................... 4
1.2. Hệ VSV phân giải cellulose trong rơm rạ ............................................. 5
1.2.1. Nấm ................................................................................................. 6
1.2.2. Vi khuẩn .......................................................................................... 6
1.2.3. Các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong rơm
rạ

........................................................................................................ 6

1.2.4. Sơ lược về chủng xạ khuẩn Streptomyces ....................................... 7

1.2.5. Ứng dụng của xạ khuẩn Streptomyces .......................................... 14
1.3. Thực tế nghiên cứu về phân giải cellulose trong rơm rạ nhờ VSV ... 15
1.4. Một số biến đổi trong quá trình phân giải cellulose............................ 16
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến đời sống của xạ khuẩn .............................. 18
1.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến
khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn ....................................... 18
1.6.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................ 18
1.6.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ...................................................... 18
1.6.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ............................................................ 19
1.6.4. Ảnh hưởng của nồng độ pH .......................................................... 19


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 21
2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 21
2.2. Vật liệu ................................................................................................ 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 22
2.3.1. Lấy mẫu ......................................................................................... 23
2.3.2. Phân lập VSV từ các khối ủ .......................................................... 23
2.3.3. Đếm số lượng tế bào VSV sống trên đĩa thạch ............................. 24
2.3.4. Phương pháp cấy truyền tuyển chọn từng giống và bảo quản
giống ..................................................................................................... 24
2.3.5. Quan sát hình thái hiển vi các chủng xạ khuẩn nghiên cứu ......... 24
2.3.6. Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại............................ 25
2.3.7. Xác định khả năng phân giải cellulose của VSV .......................... 25
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 27
3.1. Diễn thế sinh thái của VSV trong quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm
rạ

............................................................................................................ 27

3.2. Các chủng xạ khuẩn phân lập được từ quá trình mùn hóa tự nhiên của
rơm rạ ......................................................................................................... 30
3.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào phân
giải tốt cellulose ......................................................................................... 32
3.4. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại
bào tuyển chọn ........................................................................................... 33
3.5. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme nội bào phân
giải tốt cellulose ......................................................................................... 35
3.6. Nghiên cứu tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn ........ 37
3.7. Tối ưu hóa điều kiện môi trường nuôi dưỡng của các chủng xạ khuẩn
có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ ............................................ 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 47


DANH MỤC VIẾT TẮT

1.

BG

: Bột giấy

2.

CMC

: Cacboxyl Methyl Cellulose

3.

dd

: dung dịch

4.

g

: gram

5.

KL

: khuẩn lạc

6.

RBBR

: Remazol Brilliant Blue R

7.

VSV

: Vi sinh vật

8.

CKS

: Chất kháng sinh


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Rơm rạ được ủ trong thùng xốp ........................................................ 27
Hình 3.3.1. Vòng hoạt tính của chủng xạ khuẩn X1 môi trường bổ sung cơ
chất là bột giấy .................................................................................. 33
Hình 3.2.2. Vòng hoạt tính của chủng xạ khuẩn X1 môi trường bổ sung cơ
chất là CMC ...................................................................................... 33
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào với độ phóng đại 1000x của chủng
xạ khuẩn X1 ...................................................................................... 35
Hình 3.5. Vòng hoạt tính enzyme nội bào của chủng xạ khuẩn
Streptomyces X1 môi trường bổ sung cơ chất CMC......................... 36
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn .... 37
Hình 3.7.1. Biến thiên nhiệt độ trung bình của các khối ủ................................ 40
Hình 3.7.2. So sánh kích thước của 2 cây xà lách sau khi trồng....................... 45


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.2.1. Môi trường phân lập và nuôi cấy VSV .......................................... 21
Bảng 2.2.2. Thành phần môi trường thử hoạt tính enzyme ngoại bào .............. 21
Bảng 3.1. Sự thay đổi một số trạng thái rơm rạ trong các khối ủ U1 và U2 ...... 28
Bảng 3.1.1. Sự thay đổi độ mủn của rơm rạ các khối ủ .................................... 29
Bảng 3.2. Xạ khuẩn phân lập được trong 2 đợt phân lập các mẫu của
khối ủ (U1 vàU2) ................................................................................................ 31
Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn Streptomyces
tuyển chọn ....................................................................................... 32

Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn X1 ..................................... 34
Bảng 3.5. Hoạt tính enzyme nội bào của các chủng xạ khuẩn phân lập được.. 36
Bảng 3.7.1. Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ........................................ 39
Bảng 3.7.2. Thời gian sinh trưởng phát triển của cây xà lách (ngày) ............... 42
Bảng 3.7.3. So sánh chiều cao trung bình của cây xà lách sau khi trồng
(cm) ................................................................................................. 42
Bảng 3.7.4. So sánh số lá trung bình trên cây xà lách sau khi trồng (lá/cây) ... 43
Bảng 3.7.5. So sánh kích thước chiều dài trung bình của lá cây xà lách
(cm) ................................................................................................. 44
Bảng 3.7.6. So sánh kích thước chiều rộng trung bình của lá cây xà lách (cm)
......................................................................................................... 44
Bảng 3.7.7. So sánh đường kính trung bình của gốc của cây xà lách (cm) ...... 45


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trước đây nhu cầu về thực phẩm sạch của người tiêu dùng không cao vì
thị trường thực phẩm chưa bị biến động, nguồn thực phẩm chủ yếu được đưa
ra là do người sản xuất trong nước dưới nền kinh tế tự cung tự cấp. Ngày nay
khi mà tràn lan các thực phẩm kém chất lượng được đẩy tới tay người tiêu
dùng, các bệnh nan y mà nguồn thực phẩm bẩn gây ra ngày càng nhiều. Vì
vậy nhu cầu về thực phẩm sạch ngày càng cao lên, một trong số đó là nhu cầu
về rau sạch. Như vậy, làm thế nào để có nguồn rau sạch đảm bảo để sử dụng?
Nhiều người cho rằng liệu pháp tốt nhất hiện nay là mỗi nhà nên tự trồng để
cung cấp rau sạch cho nhà mình. Nhưng làm sao để có nguồn đất vừa sạch
vừa đảm bảo cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho cây trồng? Hiện nay người ta
cho rằng nguồn mùn hữu cơ đang là giải pháp cho vấn đề trên. Nguồn phân
hữu cơ này chủ yếu được ủ từ rơm rạ và lá khô.
Việt Nam là nước đang phát triển có dân số đông, trên 80% dân số sống
bằng nghề nông nghiệp. Lúa gạo là cây lương thực chủ yếu và ngày càng có

vai trò quan trọng trong xuất khẩu. Năm 2014 tổng diện tích lúa gieo trồng đạt
hơn 7,8 triệu ha, năng suất đạt 57,4 tạ/ha sản lượng lúa đạt trên 44,84 triệu tấn
như vậy lượng rơm rạ sau thu hoạch là rất lớn, ước tính khoảng gần 46 triệu
tấn/năm. Sau khi thu hoạch, bình quân 1 ha thu được 6 tấn rơm rạ trong đó
bao gồm 51,5 kg N - 25,4 kg P2O5 - 137,4 kg K2O. Đa số bà con nông dân vẫn
tiến hành đốt rơm rạ sau thu hoạch. Việc làm này không những làm mất đi các
vi tố hữu cơ có ích mà còn gây tổn hại đến môi trường. Theo tính toán, lượng
CO2 thải vào môi trường do đốt rơm rạ tại Đồng bằng Sông Hồng là 1,2 đến
4,7 triệu tấn/năm, lượng khí nhà kính thải vào môi trường do việc đốt rơm rạ
này gây thiệt hại về môi trường tương đương với 19,05 - 200,3 trUSD/năm.

1


Bên cạnh đó, việc lấy đi rơm rạ khỏi đồng ruộng đã làm giảm nguồn cacbon
hữu cơ một cách đáng kể. Nếu hàm lượng cacbon ban đầu là 3,56%, sau 10
năm canh tác 2 vụ lúa/năm hàm lượng cacbon chỉ còn 3,03%, sau 50 năm là
1,59% và sau 100 năm là 0,71%, như vậy độ phì nhiêu cũng như hàm lượng
dinh dưỡng trong đất sẽ giảm đi rất nhiều.
Trên thế giới đã có nhiều quy trình ủ và chế phẩm sinh học để ủ rơm rạ
như: Chế phẩm sinh học Bokashi, Chế phẩm E.M...... còn ở Việt Nam có: Chế
phẩm Vixura, Chế phẩm sinh học BIMA (Trichoderma)..... Như vậy nếu biết
cách xử lý rơm rạ thành mùn hữu cơ sẽ tăng hàm lượng mùn cho đất, mùn
hữu cơ có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của cây. Sử dụng sản phẩm mùn
hữu cơ trong trồng trọt đặc biệt đối với những nông phẩm trực tiếp làm thức
ăn cho con người sẽ an toàn cho sức khỏe của con người và giảm ô nhiễm môi
trường. Bởi vậy, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ
khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ.’’
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose

cao và nghiên cứu được một số đặc tính sinh học bao gồm: đặc điểm hình
thái, điều kiện nuôi dưỡng, hoạt tính enzyme ngoại bào và nội bào, hoạt tính
đối kháng của các chủng xạ khuẩn trên.
3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu đặc tính sinh học và điều kiện môi trường nuôi dưỡng tối ưu
của một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
+Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng cơ sở khoa học của quá trình phân giải cellulose để nghiên
cứu các đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn có
khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu góp

2


phần bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của chủng xạ khuẩn trên trong
đời sống.
+ Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu góp phần tìm hiểu quá trình tạo mùn hữu cơ từ nguồn
nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam.
5. Đóng góp của đề tài
Phân lập được 14 chủng xạ khuẩn. Trong đó tuyển chọn được 1 chủng xạ
khuẩn Streptomyces X1 có khả năng sinh enzyme ngoại bào và nội bào cao,
không có tính đối kháng nhau và với các chủng vi khuẩn và chủng nấm trong
cùng một môi trường sinh trưởng sử dụng được trong cùng khối ủ xử lý rơm
rạ thành mùn hữu cơ. Sử dụng sản phẩm mùn hữu cơ lấy từ khối ủ rơm rạ
được bổ sung chủng xạ khuẩn Streptomyces X1 trong trồng rau, kết quả cho
thấy khả năng sinh trưởng và phát triển của cây rất tốt.

3

NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cellulose trong rơm rạ
1.1.1. Thành phần các chất trong rơm rạ
Theo giáo sư tiến sĩ sinh học Nguyễn Lân Dũng thành phần hóa học của
rơm rạ nếu tính theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hyđrô (H) chiếm
5%. oxy (O) chiếm 49% và nitơ (N) chiếm khoảng 0,92%; một lượng rất nhỏ
còn lại là photpho (P), lưu huỳnh (S) và kali (K).
Thành phần chính của rơm rạ tính theo khối lượng khô là: cellulose (34 38%), hemicellulose (32 - 40%), lignin (12%), và hàm lượng tro (oxit silic)
cao (từ 14 - 18%). Tỷ lệ lignocellulose cao (78 - 90%) gây cản trở việc sử
dụng rơm rạ một cách kinh tế. Thành phần lignocellulose trong rơm rạ, trong
đó có cellulose rất khó bị phân hủy bởi hóa chất và VSV nhưng nếu sử dụng
tập hợp các chủng xạ khuẩn phân giải thích hợp thì sẽ tạo thành nguồn phân
hữu cơ sinh học tốt.
1.1.2. Tính chất và cấu trúc của cellulose
Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n, có phân tử khối rất lớn
(khoảng 1.000.000 − 2.400.000). Cellulose là một polime hợp thành từ các
mắt xích β−glucozơ nối với nhau bởi các liên kết β−1,4glicozit, phân tử
cellulose không phân nhánh, không xoắn. Mỗi mắt xích C6H10O5 có 3 nhóm
OH tự do.
1.1.3. Hiện trạng sử dụng rơm rạ ở Việt Nam
Phế phẩm chủ yếu từ lúa gạo là rơm rạ,.. Rơm rạ là phần thân và gốc của
cây lúa sau khi tách hết phần hạt. Việt Nam là quốc gia đứng thứ hai về sản
xuất lúa gạo sau Thái Lan. Do đó, hàng năm lượng rơm rạ sau vụ thu hoạch
mỗi năm là rất lớn. Theo thống kê của Tổ chức phát triển Hà Lan, mỗi năm

4

Việt Nam sản xuất ra xấp xỉ 40 triệu tấn sinh khối từ phụ phẩm lúa gạo, bao
gồm 32 triệu tấn rơm rạ và 8 triệu tấn trấu. Tổng năng lượng lý thuyết tiềm
năng từ phụ phẩm lúa gạo tương đương 13,34 Mtoe (trong đó toe là đơn vị
tính năng lượng lý quy đổi tương đương với 1 tấn dầu). So với tổng tiêu thụ
năng lượng sơ cấp của Việt Nam năm 2010 là 47 Mtoe, thì riêng rơm rạ có thể
đáp ứng được gần 28% nhu cầu. Tuy có nguồn sinh khối dồi dào, nhưng thiếu
sự quan tâm, do đó trong những năm gần đây, sau mỗi vụ thu hoạch lúa, tại
các đô thị lớn lại chứng kiến cảnh khói bay mịt mù từ những cánh đồng ven
đó. Căn nguyên là từ việc người nông dân đốt rơm rạ. Hiện tượng này càng
ngày càng phổ biến.
Người dân cho rằng việc đốt rơm rạ lấy tro bón ruộng sẽ bổ sung dinh
dưỡng cho đất. Nhưng thực tế, việc đó không cải thiện tình trạng đất là bao
nhiêu thậm chí ảnh hưởng tới môi trường và tài nguyên đất tại nơi đốt.
Thành phần của rơm rạ là cellulose, hemicellulose và một số hợp chất
hữu cơ khác, khi đốt những chất này bị phân hủy tạo thành CO 2, gây ra ô
nhiễm môi trường khí. CO2 là một trong những chất khí cơ bản gây ra hiệu
ứng nhà kính, nguyên nhân của việc làm cho Trái Đất nóng lên. Hằng năm,
sau mỗi mùa vụ không biết bao nhiêu tấn CO2 được thải vào môi trường vì
nguyên nhân trên.
Hiện nay, chỉ một phần nhỏ rơm rạ được sử dụng làm phân bón sinh học,
còn lại chủ yếu là bị đốt bỏ ngay trên đồng ruộng gây ra lãng phí và ảnh
hưởng tới môi trường. Vì vậy, nếu biết tận dụng nguồn rơm rạ này sẽ có ý
nghĩa về nhiều mặt.
1.2. Hệ VSV phân giải cellulose trong rơm rạ
Trong tự nhiên, khu hệ VSV có khả năng phân giải cellulose vô cùng
phong phú bao gồm xạ khuẩn, nấm và vi khuẩn.

5

1.2.1. Nấm
Nấm là những VSV thuộc nhóm không có diệp lục, sống hoại sinh ở
trong đất. Chúng tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các tàn
dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho
đất trở nên màu mỡ hơn [12], [20]. Trong thực tế không có một loại nấm hay
VSV nào có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho
quá trình chuyển hoá cellulose mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài
loại enzyme. Các nấm ưa nhiệt cũng có thể tổng hợp các enzyme bền nhiệt
hơn, chúng sinh trưởng và phân giải cellulose nhanh nhưng hoạt tính cellulose
của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất cellulase tối
ưu ở pH khoảng từ 3,5 - 6,6 [20].
1.2.2. Vi khuẩn
Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nhận thấy một số VSV kị khí có khả
năng phân giải cellulose. Nhóm vi khuẩn phân giải cellulose phần lớn thuộc
nhóm VSV kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động
vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn [9], [19], [20].
Trong lòng đất cũng có các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose như
Bacillus Brevibacllus,… Chúng phần lớn có hình que nhỏ hơi uốn cong, thành
tế bào mỏng, khi nhuộm bắt màu kém và nhận năng lượng khi oxy hoá các
sản phẩm của quá trình phân giải cellulose thành CO2 và H2O [20].
Đối với các loài ưu ấm thì pH và nhiệt độ tối ưu cho enzyme
carbonmethyl cellulose của chúng hoạt động là khoảng 5,5 và 55 oC, còn đối
với các loài ưu nhiệt thì pH là 5,0 và nhiệt độ là 75oC [9].
1.2.3. Các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân
nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm về
nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng:

6

- Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt nhất ở nhiệt độ khoảng từ 25 oC - 30oC
- Xạ khuẩn ưa nhiệt: phát triển tốt nhất ở nhiệt độ khoảng từ 50oC 70oC
Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt là trong đất. Cellulose của xạ
khuẩn là enzyme ngoại bào [13]. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác
nhau về dinh dưỡng và nhiều nhóm xạ khuẩn đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao.
Các môi trường có dịch chiết pepton, nấm men, dịch thuỷ phân cazêin thường
thuận lợi cho sinh trưởng của xạ khuẩn. Xạ khuẩn thường sinh sản bằng cách
đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Bào tử của xạ khuẩn thường có
hình bầu dục hay hình cầu chứa axitdipicolinic, canxi và một số ít magie là
chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng. Khi thêm các nguyên tố vi lượng
thì việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn [17].
1.2.4. Sơ lược về chủng xạ khuẩn Streptomyces
1.2.4.1. Vị trí phân loại
Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi
thuộc nhánh Streptomycetaceae. Có hơn 500 loài xạ khuẩn Streptomyces đã
được mô tả. Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman
và Henrici đặt tên năm 1943 [21]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn
nhất. Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không
lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm [6].
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi
khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có
những hình dạng khác nhau tùy loài: lượn sóng, thẳng, có móc, vòng, xoắn,...
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp là phân
đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình lăng trụ, hình cầu, hình bầu dục,
với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng bào tử có thể có nếp nhăn, nhẵn, gai,
khối u,... tùy thuộc vào từng loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy xạ khuẩn.
Thông thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza thì các
bào tử sẽ thể hiện các đặc điểm rất rõ rệt. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí

7


sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này có thể biến
đổi khi xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường khác nhau.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gram+, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường khoảng
25°C - 30°C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao
hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh). Xạ khuẩn chi Streptomyces
có khả năng tạo thành số lượng lớn các enzyme để phân giải cellulose trong
rơm rạ. Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các
nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác
nhau [14], [16].
1.2.4.2. Đặc điểm hình thái và kích thước
Xạ khuẩn là VSV quá độ giữa vi khuẩn và nấm vì nó có đặc điểm vừa
giống vi khuẩn lại vừa giống nấm: kích thước nhỏ bé, là VSV đơn bào, nhân
chưa phân hóa rõ rệt, màng tế bào không chứa cellulose và kitin, sự phân chia
tế bào theo kiểu của vi khuẩn, không có giới tính.
Khuẩn ty
Xạ khuẩn có kết cấu tế bào dạng sợi - khuẩn ty, có đường kính trong
khoảng 1-1.5 µ. Đa số xạ khuẩn khuẩn ty không có vách ngăn, màu sắc của
khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú: màu trắng, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen,... Hệ
sợi xạ khuẩn mảnh, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [5],[7].
Nuôi cấy trên môi trường đặc có thể phân biệt được ba loại khuẩn ty:
- Khuẩn ty cơ chất (ăn sâu vào trong môi trường làm nhiệm vụ hấp thụ
chất dinh dưỡng) còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng.
- Khuẩn ty trên cơ chất phát triển trên bề mặt môi trường.
- Khuẩn ty khí sinh mọc lộ ra khỏi bề mặt môi trường.
Đôi khi khuẩn ty không có khuẩn ty cơ chất hoặc khuẩn ty khí sinh.

Khuẩn ty cơ chất hoặc khí sinh thường phân hóa thành các cành bào tử (sinh

8


ra các bào tử theo kiểu kết đoạn và cắt khúc) và chúng tạo thành khuẩn lạc
của xạ khuẩn.
Khuẩn lạc
Tập hợp của một nhóm xạ khuẩn riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc. Khuẩn lạc
của xạ khuẩn khá đặc biệt so với khuẩn lạc của vi khuẩn, vi nấm thông
thường, đó là không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà có dạng thô ráp,
dạng phấn không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra hình phóng xạ.
Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng
phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước bào tử. Trường hợp
không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Kích thước khuẩn lạc thay
đổi tuỳ loài xạ khuẩn và tuỳ điều kiện nuôi cấy.
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng
sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất
kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong
sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường.
Độ dài của khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11m/giờ [15]
và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi. Do
đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện
thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN,
nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy
sợi được hình thành và phát triển. Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên
trong chứa các bào tử nang [3].
1.2.4.3. Cấu tạo tế bào
Xạ khuẩn cũng có cấu tạo tương tự như vi khuẩn:

Thành tế bào: cấu tạo tương đối dày và khá vững chắc, gồm có 3 lớp:
Lớp ngoài dày khoảng 60 - 120Ao, lớp trong dày khoảng 50Ao và lớp giữa

9


chắc hơn, dày khoảng 50Ao. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ glucopeptide bao
gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các
liên kết 1,4 - glucozit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cenllulose và kitin
nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận
chuyển vật chất qua màng tế bào [9], [13], [17], [15] [12]. Thành tế bào được
tạo thành từ protein, lipit, mucopolysaccharit, ngoài ra còn chứa cả photpho
và axit teichoic.
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4
nhóm chính [3], [4].
Nhóm 1: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6
diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm 2: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.
Nhóm 3: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic.
Nhóm 4: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinose và galactose [4], [2].
Bên ngoài thành tế bào còn có thể có vỏ nhầy cấu tạo từ polysaccarit và
thường rất mỏng.
Màng nguyên sinh chất: dày khoảng 7,5 - 10 nm. Chức năng chủ yếu của
màng nguyên sinh chất xạ khuẩn là điều hoà sự hấp thu chất dinh dưỡng vào
tế bào và tham gia vào quá trình hình thành bào tử.
Nguyên sinh chất và nhân: Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng
chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu
với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch
lugol). Khi nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường đặc, xạ khuẩn cũng tạo thành
khuẩn lạc.

10


Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương, ngoài yếu tố di truyền trong
nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự
nhân lên và được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào
nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp
chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển
gene, sản xuất các CKS trong đất và môi trường tuyển chọn [1].
1.2.4.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
1.2.4.4.1. Đặc điểm sinh thái
Xạ khuẩn tiết ra chất hóa học gọi là geosmens…, do đó chúng đóng một
vai trò quan trọng trong sự phân giải các chất hữu cơ, thường có nhiều trong
các đống phân ủ.
Một vài loài xạ khuẩn có liên quan đến quan hệ cộng sinh với loài kiến
chi Attini. Kiến Attini được ứng dụng để trồng nấm, chúng sống tại các vườn
nấm. Chúng thực hiện tất cả các hoạt động của một người nông dân như làm
cỏ và nuôi dưỡng [18].
1.2.4.4.2. Kháng sinh
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành kháng sinh. Trong số 8000 kháng sinh hiện nay thì trên thế giới có
trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn do các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ
khuẩn có tính phổ kháng khá rộng. Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh phụ
thuộc vào cơ chế điều chỉnh đa gene, ngoài ra còn có các enzyme chịu trách
nhiệm tổng hợp các tiền chất và CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng
tương tự nhau [18].
Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỉ lệ mắc
bệnh của cây. Thông thường một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một
vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt động rộng có thể ức chế

nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất.
Tại Ấn Độ vào năm 2002 đã phân lập được chủng Streptomyces.sp 201

11


có khả năng sinh kháng sinh mới là z - methylheptyl iso- nicotinate, chất
kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như
Furasium oxysporum, F. solina….. [18].
Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực
vật và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có khả năng chống
Pyricularia oryae gây bệnh đạo ôn và F. oxysporum gây bệnh thối rễ ở cây
trồng [18].
Việc sử dụng kháng sinh trong trồng trọt nhằm mục đích chống bệnh do
nấm gây ra với thực vật, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ
dại, hạn chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất,…. So với thuốc hóa học, dùng các
CKS trong bảo vệ thực vật có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn
lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, có khả năng ức chế các
VSV đã kháng thuốc hóa học. CKS và dịch lên men các chủng CKS còn được
dùng để xử lý các hạt giống để tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và bên trong
hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất [12].
1.2.4.4.3. Môi trường nhân sinh khối
Streptomyces phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều
cellulose như: rơm rạ, lõi ngô, bã mía, …
1.2.4.4.4. Hệ enzyme trong xạ khuẩn
Trong xạ khuẩn có đầy đủ các enzyme để phân giải các thành phần chính
trong rơm rạ và quan trọng nhất là chúng có enzyme có hoạt tính tốt phân giải
cellulose trong rơm rạ.
Enzyme phân giải cellulose
Liên kết chủ yếu trong của polysaccharide này cần có một hệ enzyme

cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt. Dựa theo nghiên cứu về hệ
enzyme cellulase của chủng xạ khuẩn Streptomyces, hệ enzyme thủy phân
cellulose gồm 3 loại enzyme sau:
(1) Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme

12


thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong phân tử cellulose ở các điểm
ngẫu nhiên bên trong chuỗi polyme hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các
chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose
tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình
tương đối dễ tiếp cận.
(2) Exoglucanase bao gồm các 1,4- β -D-glucan glucanohydrolase (EC 3.
2. 1. 74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và các 1,4- β -Dglucan cellobiohydrolase (EC 3. 2. 1. 91), thủy phân D-cellobiose. Tỷ lệ thủy
phân của enzyme cellobiohydrolase bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu khử của
mạch cellulose.
(3) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3. 2. 1. 21)
giải phóng phân tử D-glucose từ cellodextrin hòa tan và một loạt các
glucoside khác.
Rất ít sinh vật có khả năng phân giải cellulose để làm nguồn cung cấp
thức ăn. Vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng cao, chúng chỉ có tác
dụng điều hòa hệ thống tiêu hóa, làm giảm lượng mỡ, cholesterol trong máu
và tăng cường đào thải chất cặn bã. Vi khuẩn trong dạ cỏ của các động vật
nhai lại và các động vật nguyên sinh trong ruột mối là những VSV có khả
năng sinh enzyme phân giải cellulose. Ngoài ra, một số VSV đất cũng có khả
năng này.
Enzyme phân giải hemicellulose
Xylan là cơ chất điển hình trong nhóm hemicellulose của thực vật. Enzyme
xylanase thủy phân xylan, được sản xuất chủ yếu từ VSV. Các VSV có khả năng

sinh enzyme xylanase ngoại bào bao gồm xạ khuẩn, nấm, vi khuẩn.
Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân đòi hỏi một hệ thống
enzyme phức tạp. Enzyme này thường bao gồm hai loại:
- Enzyme cắt mạch chính không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse và β-

13


xylosidase)
- Enzyme cắt mạch nhánh (α-arabinofuranosidase, α-glucuronidase,
esterase xylan acetyl và esterase axit phenolic).
Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển đổi xylan thành các
cấu tử đường của nó. Hệ thống các enzyme thủy phân xylan đa chức năng như
vậy khá phổ biến ở xạ khuẩn.
Enzyme phân giải lignin
Lignin được cấu trúc từ nhiều đơn phân có vòng thơm, có đặc tính không
ưa nước. Do đó rất khó phân huỷ.
Về cấu tạo, lignin gồm các mạch phenylpropanoid phức tạp, cấu trúc
không đồng nhất. Chính vì tính chất đó nên việc phân huỷ sinh học lignin đòi
hỏi hệ enzyme oxy hóa khử mạnh.
1.2.5. Ứng dụng của xạ khuẩn Streptomyces
Xạ khuẩn tham gia vào các quá trình phân giải mạnh các hợp chất hữu
cơ trong đất như cellulose, tinh bột, kitin, pectin,… trong đất bùn do đó làm
tăng độ phì của đất và góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự
nhiên.
Đặc tính này của xạ khuẩn còn được ứng dụng vào quá trình chế biến và
phân hủy rác,…
Một số xạ khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh các chất sinh học như:
vitamin nhóm B, một số acid hữu cơ hay các enzyme (proteaza, ammylaza,
kitinaza,...)

Nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh CKS, nhiều kháng sinh quan trọng hiện
nay được chiết suất từ xạ khuẩn như: tetraciclin, streptomycin,... một số kháng
sinh sản xuất từ xạ khuẩn có tác dụng trong nông nghiệp (diệt côn trùng, tuyến
trùng,..), trong y học và bảo quản thực phẩm.

14


1.3. Thực tế nghiên cứu về phân giải cellulose trong rơm rạ nhờ VSV
Hệ VSV phân giải cellulose trong rơm rạ: Các vi khuẩn phân giải
cellulose kị khí Clostridium trong đất hoặc phân chuồng, phân xanh. Các
VSV phân giải cellulose hiếu khí: Xạ khuẩn (Streptomyces…), nấm mốc
(Tricodema, Apergillus, Penicillium, Cladosporium, Botrytis, Furaium,…) Vi
khuẩn (Bacillus, Cellivibrio,..)
Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu các chủng VSV để phân giải rơm
rạ hay các phế phẩm nông nghiệp làm mùn hữu cơ (phân bón hữu cơ) đang rất
phát triển và có nhiều thành tựu:
Trên thế giới:
Chế phẩm E.M (Effective Microorganisms - VSV hữu hiệu) được sản
xuất từ Nhật Bản do Giáo sư Tiến sĩ Teuro Higa - Trường Đại học tổng hợp
Ryukyus, Okinawa sáng chế và được áp dụng vào thực tiễn năm 1980. Chế
phẩm E.M được tạo ra từ việc phân lập và lựa chọn các chủng VSV khác nhau
có sự tương hợp về sinh lý. Chúng sống cộng sinh và phát triển có ích nhằm
phân giải triệt để các hợp chất hữu cơ. Các nhóm VSV chính trong chế phẩm
E.M là: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc.
Dùng E.M để ủ phân compost với nguyên liệu là lá cây, vỏ trái ca cao, rơm
rạ,… rất hữu hiệu.
Chế phẩm sinh học Bokashi: Bokashi là một phương pháp sử dụng kết
hợp của các VSV để phân hủy chất thải thực phẩm và giảm mùi. Bokashi
trong thuật ngữ của Nhật Bản là cho "che đi" hoặc "phân cấp". Nó bắt nguồn

từ thực tế của nông dân thế kỷ trước Nhật Bản các chất thải thực phẩm sẽ làm
đất đai màu mỡ, nơi có chứa các VSV sẽ lên men các chất thải tạo phân hữu
cơ. Sau một vài tuần, họ sẽ chôn các chất thải xuống tạo mùn. Các sản phẩm
có các VSV như EM1. EM1 được trộn với các chất carbon (ví dụ mùn cưa
hoặc cám) và thực phẩm (ví dụ như mật đường). Hỗn hợp được xếp lớp trong
một hộp kín và sau một vài tuần thì được đem chôn lấp.

15


Ủ thêm trà
Trà trong phân hữu cơ được hiểu là chất chiết xuất từ nước ủ từ vật liệu ủ
và có thể có được từ quá trình hiếu khí hoặc kỵ khí. Trà thường được sản xuất
từ cách thêm một khối lượng phân để tích nước. Phương pháp này cũng đã
được chứng minh là có tác dụng về việc làm giảm các mầm bệnh thực vật.
Tại Việt Nam:
Chế phẩm Vixura: là chế phẩm dạng bột chứa 12 - 15 loại VSV được
phân lập, tuyển chọn tại Viện Công nghệ Sinh học, trong đó có các chủng
Bacillus và xạ khuẩn có khả năng sinh ra các enzyme khác nhau để phân huỷ
chất hữu cơ trong rác và rơm rạ. Ngoài ra, còn có một số VSV có chức năng
đối kháng với một số bệnh của cây trồng (Bacillus sp.), VSV cố định đạm
(Azotobacter sp.) và VSV phân huỷ photphat khó tan (Bacillus sp.)... giúp cho
cây trồng dễ dàng hấp thụ dinh dưỡng.
Chế phẩm sinh học BIMA (Trichoderma): Do Trung tâm Công nghệ
sinh học TP.HCM đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học
BIMA có chứa vi nấm Trichoderma là loại nấm đối kháng có tác dụng cao
trong việc thúc đẩy quá trình phân huỷ chất hữu cơ và có nhiều tác dụng,
được dùng cho các loại cây trồng.
Thực tiễn nghiên cứu: nhóm nghiên cứu nghiên cứu chuyên sâu trên
một đối tượng có khả năng phân giải cellulose đặc biệt đó là các chủng xạ

khuẩn có khả năng phân giải cellulose.
1.4. Một số biến đổi trong quá trình phân giải cellulose
Reese và các cộng sự lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải cellulose như
sau (năm 1952):

16