Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu nhân giống cây dã yên thảo rũ hồng đậm (petunia hybrida l ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
==  ==

VŨ THỊ MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÃ YÊN
THẢO RŨ HỒNG ĐẬM (Petunia hybrida L.)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

HÀ NỘI – 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
==  ==

VŨ THỊ MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÃ YÊN
THẢO RŨ HỒNG ĐẬM (Petunia hybrida L.)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

Người hướng dẫn khoa học

TS. PHAN THỊ THU HIỀN

HÀ NỘI – 2018

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Thị Thu Hiền giảng
viên Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban
Chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều
kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận
tình của cô Phạm Phương Thu- Phòng thí nghiệm Di truyền học, thầy La
Việt Hồng và cô Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã
giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi
cũng xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ
Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm sinh
lí thực vật- trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị,
phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong
quá trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, ngày 2 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
VŨ THỊ MAI

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai
công bố.
Hà Nội, ngày 2 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
VŨ THỊ MAI


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP:

6-Benzyl amoni purin

NAA:

Napthlacetic acid

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

Cs:

Cộng sự


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cụm chồi của cây hoa Dã
yên thảo .......................................................................................................... 29
Bảng 2.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo cụm chồi của cây hoa
Dã yên thảo ..................................................................................................... 30
Bảng 2.2.3. Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi
của cây Dã yên thảo ........................................................................................ 30
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây hoa Dã yên thảo
in vitro ............................................................................................................ 31
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dã yên thảo .......... 32
Bảng 3.1. Tỷ lệ nảy chồi của Dã yên thảo được khử trùng trong các ............ 34
công thức ........................................................................................................ 34
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Dã yên thảo
sau 5 tuần nuôi cấy ......................................................................................... 36
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Dã yên thảo
sau 4 tuần nuôi cấy ......................................................................................... 39
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh của Dã
yên thảo in vitro sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................. 41
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến chồi in vitro cây Dã yên thảo sau
4 tuần nuôi cấy................................................................................................ 43
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của Dã yên thảo .......... 45
in vitro ............................................................................................................ 45
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dã yên thảo in
vitro................................................................................................................. 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hoa Dã yên thảo ............................................................................... 4
Hình 1.2. Một số loài Dã yên thảo trong tự nhiên ............................................ 8
Hình 3.1. Chồi của cây Dã yên thảo ............................................................... 35
Hình 3.2. Cụm chồi Dã yên thảo sau 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung
BAP ................................................................................................................ 38
Hình 3.3. Cụm chồi Dã yên thảo sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ
sung kinetin .................................................................................................... 40
Hình 3.4. Chồi của Dã yên thảo rũ hồng đậm trên môi trường MS bổ sung
BAP + kinetin sau 4 tuần nuôi cấy ................................................................. 42
Hình 3.5. Chồi của Dã yên thảo rũ hồng đậm trên môi trường MS được bổ
sung BAP và NAA ......................................................................................... 44
Hình 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của Dã yên thảo in vitro
sau 4 tuần nuôi cấy ......................................................................................... 46
Hình 3.7. Cây Dã yên thảo rũ hồng đậm trong các giai đoạn rèn luyện......... 49


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài .......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................... 2
3. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 2
4. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................... 2
5. Ý nghĩa của đề tài ......................................................................................... 2
6. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 3
NỘI DUNG .............................................................................................. 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 4
1.1.Giới thiệu về cây Dã yên thảo rũ hồng đậm ............................................... 4
1.1.1.Vị trí, phân loại ........................................................................................ 4

1.1.2. Mô tả ....................................................................................................... 4
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố ................................................................................ 6
1.1.4. Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo ............................................. 6
1.1.4.1. Các loại Dã yên thảo............................................................................ 6
1.1.4.2. Cách trồng Dã yên thảo ....................................................................... 8
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................. 9
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................... 9
1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào .................................................................... 9
1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ............................................... 10
1.2.2. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................... 11
1.2.2.1. Khử trùng mẫu và nuôi cấy khởi đầu ................................................ 11
1.2.2.2. Giai đoạn nhân nhanh chồi ................................................................ 11


1.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh ............................................................................ 12
1.2.2.4. Giai đoạn huấn luyện cây in vitro ở ngoài môi trường tự nhiên........ 12
1.2.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 12
1.2.3.1. Thành phần môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô.................... 12
1.2.3.2. Các loại muối khoáng ........................................................................ 13
1.2.3.3.Nguồn cacbon ..................................................................................... 15
1.2.3.4. Chất điều hòa sinh trưởng.................................................................. 16
1.2.3.5. Các nhóm chất bổ sung...................................................................... 19
1.2.3.6. Chất độn – thạch (Agar) .................................................................... 20
1.3. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trong và ngoài nước 21
1.3.1. Nghiên cứu ngoài nước ........................................................................ 21
1.3.2. Tình hình nuôi cấy mô ở Việt Nam ...................................................... 22
1.3.3. Tình hình nuôi cấy in vitro cây Dã yên thảo ở thế giới ........................ 23
1.3.4. Tình hình nuôi cấy in vitro cây Dã yên thảo ở Việt Nam..................... 23
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 25
2.1. Vật liệu nuôi cấy ...................................................................................... 25

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 25
2.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 25
2.4. Môi trường nuôi cấy cây Dã yên thảo ..................................................... 26
2.5. Điều kiện nuôi cấy in vitro ...................................................................... 26
2.6. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 26
2.6.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 26
2.6.2. Tạo vật liệu nuôi cấy ............................................................................ 27
2.6.3. Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụm chồi in vitro29
2.6.4. Tạo rễ cây hoa Dã yên thảo in vitro...................................................... 31


2.6.5. Bước đầu huấn luyện cây Dã yên thảo in vitro ngoài môi trường tự
nhiên ............................................................................................................... 32
2.7. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 33
3.1. Khử trùng tạo mẫu sạch in vitro ...................................................... 33
3.2. Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụm chồi in
vitro................................................................................................................. 35
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Dã
yên thảo .......................................................................................................... 35
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Dã
yên thảo .......................................................................................................... 39
3.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi
Dã yên thảo in vitro ........................................................................................ 40
3.2.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
in vitro cây Dã yên thảo.................................................................................. 43
3.3. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro cây Dã yên
thảo ................................................................................................................. 45
3.4. Bước đầu huấn luyện cây dã yên thảo in vitro ở môi trường tự nhiên. ... 47
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................... 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 51


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay xã hội phát triển, các khu đô thị mọc lên ở khắp nơi. Từ
thành thị đến nông thôn đều phát triển theo mô hình đô thị hóa. Đời
sống người dân cũng được cải thiện rõ rệt. Những ngôi nhà mái ngói
phủ rêu được thay thế bằng những ngôi nhà cao tầng san sát nhau làm
thu hẹp diện tích đất trồng các loại cây. Ví dụ như diện tích đất canh
tác, hoa màu và diện tích trồng trọt các loại thực vật nói chung tại các
khu đô thị đều giảm. Do đó đã có rất nhiều hộ gia đình đã tận dụng
khoảng ban công để trồng hoa, cây cảnh để tô điểm thêm cho ngôi nhà
của mình. Hiện nay, để đáp ứng nhu cầu trồng hoa ngày càng tăng
nhanh, nhiều loài hoa ban công được ưa chuộng như Dã yên thảo, đồng
tiền, hoa hồng, hoa nhài…. Đã được thị trường hoa cảnh coi là nhân tố
chính cần được đầu tư, phát triển để mang lại lợi ích kinh tế.
Dã yên thảo được biết đến là nữ hoàng hoa ban công. Dã yên thảo
có 2 dạng rủ và đứng để mọi người lựa chọn cho phù hợp với góc ban
công mỗi căn hộ. Với ưu điểm màu sắc hoa phong phú, Dã yên thảo
mang lại rất nhiều sự lựa chọn cho người tiêu dùng. Chỉ cần khéo léo
kết hợp ban công sắt với cây cảnh, hoa lá bạn sẽ sở hữu một không gian
độc đáo ấn tượng.
Tuy nhiên giá thành của các loài hoa, cây cảnh khá cao trong đó có
Dã yên thảo. Dã yên thảo được du nhập vào nước ta hiện nay chủ yếu là
nhân giống từ hạt. Theo Verdork (2005), cây Dã yên thảo có hạt nhỏ và
rất chậm để xử lý hạt giống. Đối với nhân giống bằng cành thì hệ số
nhân thấp, không đồng đều nên chưa đáp ứng nhu cầu khi cần trồng cây
có số lượng lớn, đồng loạt [7]. Trong khi đó nuôi cấy mô là một
phương pháp hiệu quả trong nhân giống. Nó giúp cây Dã yên thảo tăng

1


nhanh về số lượng và cả chất lượng. Điều quan trọng, phương pháp này
sản xuất ra một số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn, cây sạch
bệnh và trồng được quanh năm. Để chủ động trong việc sản suất cây
giống và giảm giá thành nên tôi chọn đề tài này: “NGHIÊN CỨU
NHÂN GIỐNG CÂY DÃ YÊN THẢO RŨ HỒNG ĐẬM (Petunia
hybrida L.) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC
VẬT”.
2. Mục đích nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của một số nhân tố bổ sung vào môi trường
nuôi cấy đến sinh trưởng của cây Petunia hybrida L. môi trường in
vitro, đồng thời tìm hiểu ảnh hưởng của một số giá thể tới sự sinh
trưởng của Petunia hybrida L. cấy mô khi chuyển ra ngoài tự nhiên.
3. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cây hoa Dã yên thảo (Petunia hybrida L.) - hoa màu hồng
được mua ở chợ Hoàng Hoa Thám, khi đỉnh sinh trưởng cao từ 6-8 cm
thì tiến hành cắt mẫu để nuôi cấy.
4. Phạm vi nghiên cứu
Thực hiện các thí nghiệm trong điều kiện nuôi cấy in vitro tại
Phòng thí nghiệm di truyền, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa của đề tài
+ Ý nghĩa lý luận: nhằm bổ sung vào nguồn tư liệu khoa học cho
nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô cây Dã yên thảo.
+ Ý nghĩa thực tiễn: đưa ra cơ sở phục vụ cho nhu cầu nhân nhanh
số lượng cây hoa Dã yên thảo. Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả
cao, chất lượng tốt.

2


6. Nội dung nghiên cứu
- Tạo vật liệu in vitro từ đoạn thân cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cụm chồi của
cây Dã yên thảo in vitro
- Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo cụm chồi của
cây Dã yên thảo in vitro
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP + kinetin đến khả năng tạo
cụm chồi của cây Dã yên thảo in vitro
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP + NAA đến khả năng tạo
cụm chồi của cây Dã yên thảo in vitro
- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây Dã
yên thảo in vitro

3


NỘI DUNG
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Giới thiệu về cây Dã yên thảo rũ hồng đậm
1.1.1.Vị trí, phân loại
Giới:

Plantae (thực vật)

Giới phụ:

Tracheobionta

Ngành:

Magnoliophyta

Ngành phụ:

Spermatophyta

Lớp:

Magnoliopsida

Lớp phụ:

Asteridae

Bộ:

Solanales

Họ:

Solanaseae

Giống:

Petunia

Hình 1.1. Hoa Dã yên thảo

Tên khoa học: Petunia hybrida L.
Tên thông thường:Petunia
Tên Việt Nam: Dã yến thảo, Dạ yến thảo hay Dã yên thảo [32].
1.1.2. Mô tả
Cây Dã yên thảo rũ hồng đậm có tên khoa học là Petunia hybrida L.,
Dã yên thảo có nguồn gốc từ các nước Nam Mỹ [33].
Đặc điểm hình thái, sinh lý:
Thân, tán, lá: Cây hoa Dã yên thảo là cây thân cỏ, sống hằng năm, cây
cao 15- 30 cm. Thân mềm, phủ đầy lông dính, nhánh cây được phân ra từ
các nách lá thật, một nách lá có thể phân nhiều nhánh. Lá đơn, mọc cách,
mặt trên và mặt dưới của lá có lớp lông phủ mịn. Lá hình trái xoan, thuôn
đều, mềm mại, mép nguyên không răng cưa, màu xanh bóng.

4


Hoa: nhỏ, đơn độc mọc ở nách lá, trên một cọng dài 2-3 cm, đài hoa
cao 1-2,5 cm. Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống
vành [5]. Cánh đài hợp ở gốc, còn lại ở quả, cánh tràng hợp thành ống loe
rộng ở đỉnh, nổi rõ các gân thùy. Quả nang hai mảnh, nhiều hạt [33].
Tốc độ sinh trưởng của hoa Dã yên thảo nhanh. Hoa Dã yên thảo có
hình phễu, nhưng các loại Dã yên thảo lai tạo có hình dáng đa dạng và
phong phú hơn nhiều. Ví dụ như hoa cánh đơn, hoa cánh kép với mép có
viền và gợn sóng, mép dúng hình cung nhọn ở giữa. Hoa có thể có sọc,
đốm hoặc viền quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tía, màu
hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng, tím, vàng, cam. Dã yên thảo rũ
hồng đậm có mùi thơm dịu dàng, khi chạm và lá và cuống hoa sẽ thấy hơi
dính.
Dã yên thảo là cây nhất niên, nở hoa vào mùa hè. Dã yên thảo ưa sáng,

sẽ trở nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối. Cây thích hợp với điều
kiện độ ẩm vừa phải, có thể sống trong điều kiện hơi khô nhưng không
thích ứng với điều kiện ngập úng. Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm,
không chịu được nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng. Dã yên thảo trồng được
trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đất màu mỡ, đất có pH từ 6.0 –
7.0. Bấm đọt để kích thích cây đâm nhánh tạo độ rũ cho cây, nếu cây ốm
yếu hay sau khi cho hoa rộ thì cũng nên tỉa lá bớt để cây phục hồi lại.
Dã yên thảo thường bị chết vì úng nước, vì vậy cần tưới nước đúng
liều lượng, không tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện
điều kiện vệ sinh và duy trì ẩm độ thích hợp. Ngoài ra, Dã yên thảo thường
bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn cũng như sâu, sên, rệp cắn phá.
Một số bệnh virus cũng ảnh hưởng nhiều đến cây như làm biến dạng lá,
cây chậm phát triển, hoa không có màu và hình dạng thay đổi, thân tàn lụi

5


liên tục, thối đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có khi
kết dính thành cụm [31].
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố
Hoa Dã yên thảo thuộc chi 35 của một loài thực vật có hoa, liên
quan chặt chẽ với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà
(Solanaceae)[7].
Cây hoa Dã yên thảo có nguồn gốc từ các nước miền Nam châu
Mỹ, hiện nay được gây trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất rộng,
vườn hoa khắp nước ta. Ở miền bắc, hoa nở vào dịp hè thu, còn ở miền
nam, hoa nở vào dịp Tết. Cây có nhiều tên gọi khác nhau, theo Phạm
Hoàng Hộ (2000) cây có tên là Dã yên [7], theo Trần Hợp (2000) có tên
là cây hoa cà [8]. Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều loài
khác của chi petunia, ví như P.axillaris BSP (Large White Petunia) hoa

dạng ống hẹp, màu trắng hoặc p.virolacea Lindl. (Violet-flowered
Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím. Ngày nay, các nhà vườn
từ loài lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất
đẹp [8].
1.1.4. Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo
1.1.4.1. Các loại Dã yên thảo
Grandifloras: hoa lớn, nhiều hoa có đường kính đến 12,5 cm, gồm cả
dạng hoa đơn hoặc hoa kép. Một vài giống hoa đơn có cánh gợn sóng hoặc
viền, thân leo, có xu hướng lan rộng ra xung quanh. Do hoa lớn , nhiều và
thường úp xuống nên dễ bị thối trong thời tiết nóng và ẩm, nếu muốn trồng
loại này thì phải chăm sóc kĩ. Những giống hoa Grandifloras phổ biến:
Supercascade, Super magric, Ultra, Storm và Falcon [19].
Multifloras: hoa nhỏ, đường kính khoảng 5 - 7,5 cm, nhiều hoa, gồm
cả dạng hoa đơn và hoa kép. Multiflora sống mạnh mẽ, chịu được nhiệt độ

6


cao lẫn sương giá, kháng được bệnh thối cánh hoa. Những dạng hoa
Multifloras đẹp như: Carpet, Primetime, Heavenly Lavender [19].
Floribundas: đây là dạng trung gian giữa Grandifloras, Multifloras.
Nhóm này trổ hoa nhiều như Multifloras và kích thước hoa trung bình. Một
số dạng hoa phổ biến: Celebrity, Madness, Double Madness [19].
Millifloras: cây nhỏ, dạng bụi rậm rạp, cho nhiều hoa có đường kính từ
2,5 – 3,5 cm. Chúng thích hợp để trồng trên các ụ đất hoặc trong giỏ treo.
Fantasy là một dạng trong nhóm này [19].
Spreading Petunias: loại này phát triển chậm nhưng có thể trải rộng ra
từ 0,9 – 1,2 cm. Hoa có nhiều màu sắc, thích hợp để trồng ở bồn hoa cửa
sổ hoặc trong các giỏ treo. Spreading Petunias chịu được khô hạn và rất dễ
trồng. Phổ biến nhất trong nhóm này là “Purple Wave”. Ngoài ra trong

nhóm này còn có “Wave”và “Laura Bush” [19].

7


Hình 1.2. Một số loài Dã yên thảo trong tự nhiên
1.1.4.2. Cách trồng Dã yên thảo
Dã yến thảo là loài hoa rất dễ trồng, dễ sống nhưng cũng rất dễ bị lụi
tàn nếu không được chăm sóc cẩn thận. Hoa khỏe mạnh, cứng cáp, liên
tục nở thêm nhiều hoa mới trong thời gian trung bình là 3 – 4 tháng. Hoa
mang vẻ đẹp tinh tế, sang trọng, rất thích hợp trồng trên ban công, tán hoa
có thể rủ xuống từ 40 cm.
Khi gieo hạt cần phải gieo hạt trong nhà vào những khay nhỏ và
mang trồng ngoài vườn khi hết sương giá. Khi trồng ngoài vườn nhớ để

8


khoảng cách giữa các cây 30 – 45 cm. Nếu không có khoảng không gian
rộng thì người trồng cũng có thể gieo hạt và trồng luôn trong chậu. Tuy
nhiên, đối với Dã yến thảo dạng bụi người trồng chú ý nên chọn những
chiếc chậu có kích thước lớn. Sau đó nên ngắt ngọn để kích thích cây
mọc thành bụi. Khi cây có dấu hiệu già hóa, người trồng cần cắt thân
khoảng 15 cm tính từ cuống hoa khi thấy các cành lan dài, hoặc mọc
không đều, xô lệch vào giữa mùa hoa. Dã yến thảo là cây ưa sáng. Tưới
nước thường xuyên và vừa phải, không nhiều quá nhưng cũng không để
đất khô quá. Dã yến thảo có hoa liên tục, hết đợt này đến đợt khác, dễ tìm
các loại giống, dễ trồng và dễ chăm sóc [33].
Mỗi buổi sáng, nên tưới cây, nhặt lá dạ yến thảo khô, héo vì để lâu sẽ
dễ khiến cây bị úng. Khi trồng cây, bạn cũng nên quan tâm một chút đến

thời tiết trong ngày, nếu trời nắng to hoặc mưa to, bạn nên "di dời" cây
vào trong nhà để đảm bảo cây và hoa được tốt tươi lâu hơn [33].
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào
Cơ sở nền tảng của nuôi cấy mô, tế bào thực vật là học thuyết về tính
toàn năng của tế bào do nhà thực vật học người Đức Haberland đưa ra vào
năm 1902. Kế thừa quan điểm của ông, các nhà sinh học hiện đại cho rằng
tất cả các tế bào cấu tạo nên cơ thể thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di
truyền đủ để mã hóa hình thành một cơ thể. Các nhà nghiên cứu cho rằng
mỗi tế bào thực vật khi tách ra khỏi cơ thể nếu được nuôi trong điều kiện
thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Từ đó đến nay,
rất nhiều các công trình nghiên cứu đã tạo ra được cây hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng lẻ, một khối mô hay từ một phần của cơ quan. Điều đó khẳng

9


định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa học của nuôi cấy mô,
tế bào thực vật [23].
Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh
trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine
hoặc tổ hợp cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như
NAA, IAA,...[23].
Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy mô in vitro:
+ Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy
phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng
của tế bào thực vật.
+ Khả năng biểu hiện tính toàn năng của các tế bào, mô của cơ thể là khác
nhau.

+ Tính toàn năng của tế bào nuôi cấy in vitro biểu hiện trải qua 3 giai đoạn:
- Tế bào phản biệt hóa với sự phát sinh tế bào khả biến
- Định hướng phân hóa tế bào
- Phát sinh hình thái, phát sinh cơ quan
Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus
và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên
cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin [23].
1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
thực chất là kết quả phân hóa và phản phân hóa tế bào.
Quá trình phân hóa tế bào bao gồm 3 giai đoạn: giai đoạn phân bào,
giai đoạn giãn và giai đoạn phân hóa. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các
tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng
khác nhau của cơ thể.

10


Sự phản phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là các tế
bào đã phân hóa chức năng sẽ bị phản biệt hóa tạo thành các tế bào mô sẹo.
Sau đó, các tế bào mô sẹo tái sinh tạo thành chồi hay phôi soma và từ đó tái
tạo thành cây hoàn chỉnh.

tế bào
phân hóa
chức năng

tế bào
giãn

Tế bào
mô
sẹo

1.2.2. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.2.1. Khử trùng mẫu và nuôi cấy khởi đầu
Giai đoạn này là giai đoạn quan trọng trong nuôi cấy in vitro, quyết
định toàn bộ quy trình nhân giống. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra
nguồn nguyên liệu vô trùng có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt, để có
thể chủ động nguồn mẫu trong việc nhân giống.
Sau khi khử trùng, mẫu thu được phải đảm bảo các tiêu chí sau: tỉ lệ sống
cao, tỉ lệ nhiễm (chết) thấp, mẫu sinh trưởng và phát triển với tốc độ nhanh.
Kết quả cuối cùng của giai đoạn này là tạo được mẫu sạch, điều này
phụ thuộc vào khả năng chọn mẫu, nồng độ và thời gian xử lí diệt khuẩn.
Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng, chồi
nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ [3]. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ
đưa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc độ nhân nhanh
cao [3].
1.2.2.2. Giai đoạn nhân nhanh chồi
Mục đích của nhân nhanh chồi là nhằm kích thích vật liệu nuôi cấy
phát sinh được chồi nhiều nhất trong thời gian ngắn nhất. Từ đó tìm được
môi trường thích hợp cho khả năng nhân chồi. Đây là giai đoạn cực kì quan
trọng, nó quyết định tốc độ và hiệu quả của quá trình nhân giống in vitro.

11


Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: tạo ra được hệ số nhân giống
cao, quy trình nhân phải có hiệu quả kinh tế, chồi tạo ra có tỉ lệ sống cao,
sinh trưởng và phát triển bình thường, không dị dạng, chồi khỏe, cứng cáp.

Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy
các chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch
chiết nấm men… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ và ánh sáng [3].
1.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro với mục
đích để tạo cây con hoàn chỉnh với tiêu chí cây khỏe mạnh, có bộ rễ cứng
cáp để có thể sinh trưởng và phát triển tốt khi đưa ra ngoài vườn ươm.
Sau 3-4 tuần nuôi trên môi trường nhân nhanh chồi, các chồi được loại
bỏ bớt những đoạn già ở phần gốc chồi, rồi cấy chuyển sang môi trường tạo
rễ. Trong giai đoạn này thường bổ sung thêm các chất kích thích sinh
trưởng như NAA, IAA, IAB, 2,4-D để kích thích tạo rễ cho chồi.
1.2.2.4. Giai đoạn huấn luyện cây in vitro ở ngoài môi trường tự nhiên
Huấn luyện là giai đoạn tạo điều kiện cho cây con trong bình làm quen
dần với môi trường tự nhiên bên ngoài, để tạo cho cây cứng cáp, khỏe
mạnh, khi đưa ra cấy ngoài vườn ươm đạt tỉ lệ sống cao. Đây được coi là
bước thuần hóa trước khi tách khỏi điều kiện in vitro.
Ở giai đoạn này, cây con đang ở trong môi trường nhân tạo được đem
ra ngoài tự nhiên nên cần đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp như
ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để cây phát triển tốt nhất.
1.2.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.3.1. Thành phần môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô
Trong nuôi cấy mô tế bào, môi trường nuôi cấy và môi trường xung
quanh là 2 vấn đề chính quyết định đến sự thành bại của quá trình nuôi
cấy. Môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự

12


tăng trưởng và phân hóa mô trong suốt quá trình nuôi cấy. Cơ sở của
việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần

cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Cho đến nay, rất
nhiều môi trường dinh dưỡng đã lần lượt được tìm ra và chúng đều
mang tên tác giả đề xuất như: White (1934), Knudson (1964),
Murashige – Skoog (MS 1962), Knop (1974)… Tuy nhiên mỗi môi
trường chỉ thích hợp với vài loài cây nhất định nên trong nuôi cấy in
vitro tùy thuộc vào quá trình phát triển mà chọn môi trường dinh dưỡng
phù hợp. Tùy từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí tùy cơ
quan khác nhau trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng
tối ưu của chúng là khác nhau. Trong môi trường nuôi cấy số lượng và
các loại hóa chất phải cực kỳ chính xác với từng đối tượng cụ thể.
Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đều bao gồm:
 Các chất khoáng đa lượng và vi lượng
 Nguồn cacbon
 Vitamin
 Các chất điều hòa sinh trưởng
 Các nhóm chất bổ sung
 Chất nền [2]
Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không
giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản. Môi
trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển
của mẫu cấy [8].
1.2.3.2. Các loại muối khoáng
 Khoáng đa lượng
Được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, tức là trên 30 mg/l. Những
nguyên tố N, S, P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi tùy theo đối tượng

13


nuôi cấy. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi

trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng.
- Nitơ (N): Được sử dụng ở dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp
với nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành
ammonium thông qua hệ thống nitrat reductase (NR). Ammonium được
tế bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm
hữu cơ như axit amin. Nhưng điều đáng lưu ý là nếu chỉ dùng
ammonium (không có nitrat) thì sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí
ngừng hoàn toàn. Vì vậy, hầu hết các loại môi trường đều dùng nitrat
và ammonium dạng phối hợp, nhưng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của
loài cây đó mà phối hợp theo tỉ lệ thích hợp [2].
- Môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn
môi trường giàu kali sẽ xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất [2].
- Photpho (P) là nguyên tố mà mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu
cầu rất cao, thường được đưa vào môi trường ở dạng ortophotphat hoặc
đường photpho. Photpho là một trong những thành phần cấu trúc của
phân tử acid nucleic. Ngoài ra, khi photpho ở dạng H2PO4- và HPO42còn có tác dụng như một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trường
trong quá trình nuôi cấy [2].
- Lưu huỳnh (S) được sử dụng chủ yếu và tốt nhất là ở dạng muối SO 42với nồng độ thấp. Các dạng khác nhau như SO 32- hoặc SO2 thường kém
tác dụng, thậm chí còn độc [2].
- Các ion Na+ và Cl- cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường
cùng các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường [2].
 Khoáng vi lượng:
Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm,
nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể

14


thiếu được đối với sự phát triển của mô là sắt, đồng, kẽm, mangan,
molybden, bo, coban, iot. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng

trong các hoạt động của enzyme, chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn
nhiều so với các nguyên tố đa lượng.
- Sắt (Fe): Thiếu sắt thì tế bào sẽ mất khả năng phân chia. Thiếu Fe làm
giảm lượng ARN và sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng lượng ADN
và axit amin tự do dẫn đến giảm phân bào. Fe thường được tạo phức
hợp với thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi, phức hợp này
thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong
tế bào [2].
- Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các axit amin tự do
và ADN tăng lên, nhưng ARN và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến
kém phân bào [2].
- Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin
vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm.
Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là loại mô
sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh [2].
- Molypden (Mo): là ion đóng vai trò co-factor trong hệ thống nitrat
reductase, như vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm
trong tế bào thực vật [2].
1.2.3.3.Nguồn cacbon
Cây in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù dưới
ánh sáng nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp
nhưng bị hạn chế cho việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon
dưới dạng hữu cơ bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối.
Tùy thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô trong trường hợp
đặc biệt có thể dùng các loại đường khác nhau: Sucrose, Maltose,

15