Nghiên cứu sự phân bố và tác dụng kháng ung thư của kháng thể đơn dòng Nimotuzumab gắn 131I trên chuột mang khối ung thư đầu cổ người (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN THỊ KIM HƢƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ VÀ TÁC DỤNG
KHÁNG UNG THƢ CỦA KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG
NIMOTUZUMAB GẮN 131I TRÊN CHUỘT
MANG KHỐI UNG THƢ ĐẦU CỔ NGƢỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN THỊ KIM HƢƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ VÀ TÁC DỤNG
KHÁNG UNG THƢ CỦA KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG
NIMOTUZUMAB GẮN 131I TRÊN CHUỘT
MANG KHỐI UNG THƢ ĐẦU CỔ NGƢỜI
Chuy n ng nh: KHOA HỌC Y SINH

M số: 9720101

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. PHẠM HUY QUYẾN
2. PGS. TS. HỒ ANH SƠN

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y; Phòng Sau
đại học - Học viện Quân y; Trung tâm Y dược học quân sự - Học viện Quân
y; Trung tâm ung bướu, khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Qn y 103; Phịng
thí nghiệm trọng điểm Gen-Protein Đại học khoa học tự nhiên, Đại học quốc
gia Hà Nội; Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y, cơ sở đào tạo đã tạo mọi
điều kiện và giúp đỡ để tơi hồn thành luận án này.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới:
- PGS.TS Phạm Huy Quyến và PGS.TS Hồ Anh Sơn, người Thầy hướng
dẫn trực tiếp, đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận án, đồng thời là người Thầy đã định
hướng và truyền cho tơi lịng say mê và những kinh nghiệm quý báu trong
nghiên cứu khoa học.
- PGS.TS. Nguyễn Lĩnh Tồn, ngun chủ nhiệm bộ mơn Sinh lý bệnh Học viện Quân y đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tơi trong q
trình học tập và thu thập số liệu tại bộ môn để tơi có thể hồn thành luận án.
in chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận án đã cho
tơi những đóng góp q báu để hồn ch nh luận án này.
in được chân thành cảm ơn các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn giúp
đỡ, động viên tơi trong suốt q trình học tập và hồn thành luận án.
Cuối cùng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với bố mẹ và đặc biệt là chồng

và hai con đã luôn là chỗ dựa vững chắc của tơi, ln thương u, khuyến
khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tình cảm, tinh thần cho tơi để
hồn thành tốt chương trình học tập và thực hiện thành công luận án này.
Hà Nội, tháng 09 năm 2018
Tác giả
Nguyễn Thị Kim Hƣơng


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây l cơng trình nghi n cứu của tôi với sự hướng
dẫn khoa học của cán bộ hướng dẫn.
Các kết quả nêu trong luận án là trung thực v được công bố một phần
trong các bài báo khoa học. Luận án chưa từng được cơng bố. Nếu có điều gì
sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm.

Tác giả

Nguyễn Thị Kim Hƣơng


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
DANH MỤC CÁC HÌNH -ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................

Chƣơng 1

1

TỔNG QUAN.....................................................................................

3

1.1

Dịch tễ học ung thƣ đầu cổ..............................................................

3

1.1.1

Trên thế giới................................................................................................

3

1.1.2

Tại Việt Nam...............................................................................................

4

1.2

Các yếu tố nguy cơ và cơ chế bệnh sinh................................

5

1.2.1

Vai trò của thuốc lá trong ung thư đầu cổ.................................

5

1.2.2

Vai trò của rượu trong ung thư đầu cổ.........................................

6

1.2.3

Vai trò của Humanpapilloma virus trong ung thư đầu cổ

8

1.2.4

Vai trò của Epstein Barr virus trong ung thư đầu cổ...........

9

1.3

Yếu tố của thụ thể tăng trƣởng biểu bì..................................

11

1.3.1

Cấu trúc của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì.....................

11

1.3.2

Vai trị của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì trong
truyền tín hiệu tế bào..............................................................................

12

1.3.3

Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì trong ung thư.................

15

1.4

Kháng thể đơn dịng gắn đồng vị phóng xạ trong
điều trị ung thƣ........................................................................................

18

1.4.1

Kháng thể đơn dịng................................................................................

18

1.4.2

Đồng vị phóng xạ.....................................................................................

20


1.4.3

Kháng thể đơn dịng (nimotuzumab) gắn đồng vị phóng
xạ (131I) trong điều trị ung thư...........................................................

1.5

21

Sử dụng mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch trong
tạo và ứng dụng thử nghiệm điều trị các khối ung
thƣ của ngƣời...........................................................................................

1.5.1

Các dòng chuột thiếu hụt miễn dịch sử dụng cho nghiên
cứu tạo các khối u của người trên thực nghiệm.....................

1.5.2

24

29

Tạo các khối ung thư có nguồn gốc từ người lên chuột
thiếu hụt miễn dịch.................................................................................

31

Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....

33

2.1

Đối tƣợng - vật liệu - thời gian nghiên cứu.........................

33

2.1.1

Đối tượng nghiên cứu............................................................................

33

2.1.2

Vật liệu - phương tiện nghiên cứu..................................................

33

2.1.3

Địa điểm, thời gian nghiên cứu ......................................................

34

2.2

Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................

35

2.2.1

Thiết kế nghiên cứu.................................................................................

35

2.2.2

Nội dung nghiên cứu..............................................................................

35

2.2.3

Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu..........................

37

2.3

Xử lý số liệu................................................................................................

51

2.4

Đạo đức nghiên cứu trên động vật............................................

52

2.5

Sơ đồ nghiên cứu....................................................................................

52

Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................

53

3.1

Đánh giá tác dụng ức chế tế bào Hep-2 của
Nimotuzumab và 131I-nimotuzumab in vitro….................

53

3.1.1

Kết quả nuôi cấy tế b o Hep-2.........................................................

53

3.1.2

Kết quả đánh giá tác dụng kháng ung thư của
Nimotuzumab và

131

I-Nimotuzumab trên dòng tế b o

Hep-2…………………………………………………………………………

54


3.1.3

Kết quả đánh giá tác dụng gây chết tế b o theo chương
trình thử nghiệm apoptosis tr n dịng tế b o Hep-2 với

56

phức hợp 131I-Nimotuzumab, Nimotuzumab và 131I........
3.2

Đánh giá phân bố của 131I-nimotuzumab trên chuột ..

3.2.1

Kết quả tạo mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang
khối ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dịng Hep-2.........

3.2.2

Kết quả phân bố sinh học

131

59

I-nimotuzumab ở mô/cơ

quan chuột.....................................................................................................
3.2.3

59

Kết quả phân bố to n thân chuột của phức hợp

131

I-

60

65

nimotuzumab bằng chụp xạ hình SPECT ……………
3.3

Kết quả tác dụng kháng ung thƣ của phức hợp

131

I-

nimotuzumab trong cơ thể động vật mang ung thƣ ....

70

3.3.1

Đánh giá sự phát triển khối u sau điều trị..................................

71

3.3.2

Đánh giá khối lượng chuột thí nghiệm sau điều trị..............

77

3.3.3

Thời gian sống trung bình của các nhóm chuột điều trị ..

78

Chƣơng 4 BÀN LUẬN.............................................................................................

81

4.1

Tác dụng kháng tế bào Hep-2 của

131

I-

82

Nimotuzumab in vitro………………………………
4.1.1

Lựa chọn kháng thể đơn dịng Nimotuzumab v đồng

82

vị phóng xạ 131I tạo th nh phức hợp để điều trị ……..
4.1.2

Phức hợp

131

I-Nimotuzumab có tác dụng ức chế tế

87

bào Hep-2 in vitro……………………………………
4.1.2.1

Khả năng ức chế tế bào Hep-2 qua thử nghiệm MT

87

4.1.2.2

Bước đầu xác định cơ chế gây chết tế bào Hep-2 theo

88

con đường apoptosis…………………………………
4.2

Sự phân bố của phức hợp

131

I-nimotuzumab trên

mơ hình chuột mang khối ung thƣ biểu mô tế bào
vảy đầu cổ ngƣời dòng Hep-2……………………...

90


4.2.1

4.2.2

Tế b o ung thư biểu mô tế b o vảy đầu cổ người
dòng Hep-2 …………………………………………..

90

Tạo khối ung thư biểu mơ tế bào vảy đầu cổ người

91

dịng Hep-2 trên chuột thiếu hụt miễn dịch …………
4.2.3

Phân bố sinh học của phức hợp

131

I-Nimotuzumab

95

tr n cơ thể chuột thí nghiệm ………………………...
4.3.2.1

Phân bố sinh học

131

I-Nimotuzumab trong các tạng

96

chuột thí nghiệm ……………………………………
4.2.3.2

Sử dụng SPECT đánh giá phân bố sinh học

131

I-

97

Nimotuzumab trên chuột mang khối ung thư đầu cổ người
4.3

Hiệu quả điều trị của

131

I-nimotuzumab trên mơ

100

hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung
thƣ biểu mô vảy đầu cổ ngƣời……………………..
4.3.1

131

Phức hợp

I-nimotuzumab có tác dụng hạn chế sự

100

phát triển khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ người
4.3.2

Phức hợp

131

I-nimotuzumab có tác dụng kéo dài thời

105

gian sống của chuột mang khối ung thư biểu mô vảy
đầu cổ người …………………………………………
KẾT LUẬN............................................................................................

107

KIẾN NGHỊ...........................................................................................

109

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................
PHỤ LỤC

110
111


CHỮ VIẾT TẮT

STT

Phần

Phần viết đầy đủ

viết tắt

1

ADN

Acid Deoxyribonucleic

2

EBV

Epstein Barr virus

3

EGF

Epidermal growth factor (Yếu tố tăng trưởng biểu bì)

4

EGFR

Epidermal growth factor receptor
Thụ thể của Yếu tố tăng trưởng biểu bì

5

HE

11

HNSCC

Hematoxylin Eosin
Head and neck squamous cell carcinoma
Ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ

6

HPV

Human Papilloma Virus

8

mAbs

Monoclonal antibodies (Kháng thể đơn dòng)

10

mRNA

messenger RNA

9

MTT

7

NK-κB

15

PS

Phosphatidyl serine

16

RIT

Radioimmunotherapy (Miễn dịch xạ trị)

17

SPECT

(3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium
bromide)
Nuclear factor kappa B

Single Photon Emission Computed Tomography
Chụp cắt lớp phát xạ đơn photon

13

TGF-

Transforming growth factor alpha
Yếu tố tăng trưởng chuyển hóa alpha

12

TNF

Tumor necrosis factor alpha
Yếu tố hoại tử khối u alpha

14

VGFR

Vascular endothelial growth factor
Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Số ước tính các ca ung thư mới ở nam và nữ, tỉ lệ mắc thô
và tỉ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi trên 100.000 dân

3

3.1

Kết quả tỷ lệ % ức chế tế b o Hep-2 tại thời điểm 48 giờ
dưới tác dụng của 131I-Nimotuzumab, Nimotuzumab

54

3.2

Trung bình hiệu suất gắn 131I với nimotuzumab

60

3.3

So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với máu tại thời
điểm 24 giờ sau ti m.

61

3.4

So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với các mô v cơ
quan chuột tại thời điểm 24 giờ sau tiêm.

61

3.5

So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với máu tại thời
điểm 48 giờ sau ti m.

62

3.6

So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với các mô v cơ
quan chuột tại thời điểm 48 giờ sau ti m

63

3.7

So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với máu tại thời
điểm 72 giờ sau ti m

63

3.8

So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với các mô v cơ
quan chuột tại thời điểm 72 giờ sau tiêm.

64

3.9

So sánh tỷ lệ % số đếm xung gamma của các mô - cơ quan
so với máu tr n các nhóm chuột thí nghiệm

65

3.10

So sánh hoạt độ phóng xạ bằng chụp SPECT tại vùng đầu

cổ v khối u của chuột thí nghiệm sau 24 giờ ti m 131Inimotuzumab

67


Bảng

Tên bảng

Trang

3.11

So sánh hoạt độ phóng xạ bằng chụp SPECT tại vùng đầu

67

cổ v khối u của chuột thí nghiệm sau 48 giờ ti m

131

I-

nimotuzumab
3.12

So sánh hoạt độ phóng xạ bằng chụp SPECT tại vùng đầu
cổ v khối u của chuột thí nghiệm sau 72 giờ ti m

131

70

I-

nimotuzumab
3.13

So sánh thể tích trung bình khối u chuột ng y đầu điều trị

71

3.14

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 1 tuần điều trị

71

3.15

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 2 tuần điều trị

72

3.16

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 3 tuần điều trị

72

3.17

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 4 tuần điều trị

73

3.18

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 5 tuần điều trị

74

3.19

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 6 tuần điều trị

74

3.20

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 7 tuần điều trị

75

3.21

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 8 tuần điều trị

76

3.22

So sánh khối lượng trung bình chuột trước điều trị

77

3.23

So sánh khối lượng trung bình chuột sau 8 tuần điều trị

77

3.24

Thời gian sống trung bình của các nhóm chuột điều trị.

78

3.25

Thời gian sống tích lũy của chuột thí nghiệm giữa nhóm

79

chứng v nhóm điều trị (ng y)


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ

Tên biểu đồ

Trang

3.1

Mối liên quan giữa mức độ ức chế tế bào Hep-2 (Y, %)

55

và nồng độ Nimotuzumab (X, µg/ml) sau 48 giờ
3.2

Mối liên quan giữa mức độ ức chế tế bào Hep2 (Y, %)

56

và nồng độ 131I-Nimotuzumab (X, µg/ml) sau 48 giờ.
3.3

Kết quả tỷ lệ % apoptosis của tế bào Hep-2 tại thời
điểm 24 giờ dưới tác dụng của

131

56

I-Nimotuzumab,

Nimotuzumab, 131I so với nhóm chứng
3.4

Kết quả tỷ lệ % apoptosis của tế bào Hep-2 tại thời
điểm 48 giờ dưới tác dụng của

131

57

I-Nimotuzumab,

Nimotuzumab, 131I so với nhóm chứng
3.5

Kết quả tỷ lệ % apoptosis của tế bào Hep-2 tại thời
điểm 72 giờ dưới tác dụng của

131

58

I-Nimotuzumab,

Nimotuzumab, 131I so với nhóm chứng
3.6

Thể tích trung bình khối u chuột thí nghiệm trong 8

76

tuần điều trị
3.7

Khối lượng chuột của nhóm chứng và nghiệm sau 8

78

tuần điều trị
3.8

Thời gian sống của nhóm chuột thí nghiệm sau điều trị

79


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Sơ đồ tổng quan về tác dụng của rượu và thuốc lá trên sự
tiến triển của ung thư đầu cổ

8

1.2

Sơ đồ tổng quan sự tiến triển ung thư dưới tác dụng của
yếu tố nguy cơ cao HPV v EBV trong ung thư biểu mô
đầu cổ

10

1.3

Cấu trúc đồng nhị trùng hóa của EGFR

12

1.4

Con đường tín hiệu của EGFR trong tiến trình ung thư
biểu mơ tế bào vảy đầu cổ

14

1.5

Các con đường dẫn tín hiệu tế bào của thụ thể yếu tố
tăng trưởng biểu bì

15

2.1

Máy đếm xung gamma camera

34

2.2

P1 l vùng tế b o đơn. Những đánh giá tiếp theo sẽ được
thực hiện tr n P1. Tỉ lệ P1 (> 99%) được xác định trong
bảng thống k của phần mềm FACS DIVA II

41

2.3

P2 v P4 l vùng âm tính, P3 v P5 l vùng dương tính
lần lượt với PE và PerCP-Cy5-5-A. Tỉ lệ của P2, P4 (0%
với control unstain) được xác định trong bảng thống kế
được xác định trong bảng thống k của phần mềm FACS
DIVA II

42

2.4

Vùng giá trị huỳnh quang mới (P3 và P5) xuất hiện ở
mẫu tế b o được ủ với kháng thể kháng Anexin V và
7AAD. Tỉ lệ P3, P5 được xác định trong bảng thống kê
của phần mềm FACS DIVA II

42

Hình

Tên hình

Trang

2.5

Sự phân bố của các tế bào trong trong vùng tín hiệu

43

huỳnh quang khác nhau của PerCp-Cy5-5A và PE. Tỉ lệ
Q1, Q2, Q3, Q4 được xác định trong bảng thống kê của
phần mềm FACS DIVA II
2.6

Hệ thống chuồng nuôi chuột lưu thơng khí độc lập

44

2.7

Hình ảnh buồng đếm Neubauer

47

2.8

Que thử Chromatography strip

48

2.9

Chuột thiếu hụt miễn dịch được uống nước pha với dung

50

dịch lugol 1%
2.10

Chụp SPECT cho chuột

50

2.11

Tiêm 131I-nimotuzuamb vào tính mạch đi chuột

51

3.1

Tế b o ung thư biểu mơ tế bào vảy đầu cổ người dịng

53

Hep-2 được ni cấy v tăng sinh
3.2

Tế b o Hep-2 ở thử nghiệm MTT

55

3.3

Mô bệnh học khối ung thư ghép tr n chuột

59

3.4

Bố trí chuột chụp (A) và kết quả SPECT chuột sau 24h

66

tiêm 131I-nimotuzumab (B)
3.5

Bố trí chụp chuột (A) và kết quả SPECT chuột sau 48h

68

tiêm 131I-nimotuzumab (B)
3.6

Bố trí chụp chuột (A) và kết quả SPECT chuột sau 72h

tiêm 131I-nimotuzumab (B)

69


Luận án đủ ở file: Luận án full