Nghiên cứu xây dựng quy trình realtime RT PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN VĂN THỊNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
REALTIME RT-PCR CHẨN ĐOÁN VI RÚT EV71
GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN VĂN THỊNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
REALTIME RT-PCR CHẨN ĐOÁN VI RÚT EV71
GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC
MÃ SỐ: 60420121
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ THỊ HỘI
TS. NGUYỄN VĂN SÁNG

HÀ NỘI, NĂM 2017

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tâm của các
thầy, cô,đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.Lê Thị Hội, Khoa
Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng, ngƣời hƣớng dẫn trực tiếp, đã
tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực
hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Sáng,
Bộ mộ Di truyền, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội,
là thầy đồng hƣớng dẫn, đã luôn luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên tôi
trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Chủ nhiệm đề tài, Ban điều hành, các anh chị đồng nghiệp đã cùng tôi tham gia
thực hiện đề tài Tay Chân Miệng cấp Thành phố và đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thu
thập số liệu nghiên cứu.
- Các anh chị em đồng nghiệp tại khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
Trung ƣơng.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn chân thành đến tập thể Giáo sƣ,
Tiến sĩ trong Hội đồng khoa học chấm luận văn.
Tôi vô cùng biết ơn gia đình và những ngƣời bạn thân thiết đãđộng viên, chia
sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn
này.
Xin trân trọng cảm ơn!

Trần Văn Thịnh


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. Khái niệm về bệnh Tay Chân Miệng ............................................................... 3
1.2.Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới và Việt Nam .......................... 3
1.2.1. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới ........................................ 3
1.2.2. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam ........................................ 4
1.3. Cấu trúc phân tử và cơ chế gây bệnh Tay Chân Miệng của vi rút EV71 ........ 6
1.3.1. Cấu trúc phân tử của vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng ................. 6
1.3.2. Phƣơng thức truyền bệnh của EV71 ......................................................... 8
1.4. Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng hiện nay và các ƣu,
nhƣợc điểm..................................................................................................... 8
1.5. Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe ............................................. 9
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 11
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 11
2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 11
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị ................................................................................... 11
2.4. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman probe đểkhuếch đại gen đặc
trƣng của Vi rút EV71 .................................................................................. 12
2.4.1.Các nguyên tắc thiết kế mồi .................................................................... 12
2.4.2. Các nguyên tắc thiết kế Probe ................................................................ 12
2.4.3. Các phần mềm sử dụng .......................................................................... 13
2.4.4. Phƣơng pháp tiến hành ........................................................................... 13
2.5. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số từ chủng vi rút EV71 ........................ 14
2.6.Phản ứng Realtime RT-PCR ........................................................................... 15
2.7. Phƣơng pháp điện di ...................................................................................... 16
2.8. Tối ƣu hóa phản ứng Realtime RT-PCR để chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh
Tay Chân Miệng........................................................................................... 16
2.8.1. Phƣơng pháp RT-PCR nhân gen đặc trƣng của virus EV71 .................. 16
2.8.2. Tối ƣu nhiệt độ kéo dài ........................................................................... 17
2.8.3. Tối ƣu nồng độ Magie ............................................................................ 17

2.9. Xác định độ nhạy của phản ứng Realtim RT - PCR ...................................... 17
2.9.1. Phƣơng pháp đo nồng độ xác định số bản sao plasmid .......................... 17
2.9.2. Phƣơng pháp xác định độ nhạy của phản ứng RT-PCR ......................... 18
2.10.Xác định độ đặc hiệu của phản ứng trên các chủng vi rút khác nhau........... 19
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................... 21
3.1. Phân tích, so sánh trình tự bằng phần mềm ClustalX .................................... 21
3.2. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò ..................................................................... 22
3.3. Kết quả khảo sát hoạt động của hệ mồi trên thực nghiệm ............................. 25
3.4. Kết quả tối ƣu nhiệt độ của phản ứng RT-PCR ............................................. 26
3.5. Kết quả tối ƣu nồng độ Magie của phản ứng RT-PCR.................................. 28
3.6. Kết quả khuếch đại và đƣờng chuẩn của phản ứng RT-PCR ........................ 30
3.7. Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng............................... 31
3.8. Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên virut EV71 nuôi cấy ........................... 32
3.9. Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtimr RT- PCR trên các
chủng vi rút khác nhau ................................................................................. 33
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 41
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1:

Thành phần phản ứng Realtime RT-PCRkhuếch đại vùng gen đặc
trƣng của EV71.....................................................................................15

Bảng 2.2:

Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại gen EV71 .........................16

Bảng 2.3:

Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại gen EV71 .........................18

Bảng 3.1:

Mã số truy cập các trình tự gene của EV71. .........................................21

Bảng 3.2:

Trình tự cặp mồi và mẫu dò thiết kế......................................................22

Bảng 3.3:

Các thông số đặc tính của mồi và mẫu dò .............................................23

Bảng 3.4:

Chu kỳ ngƣỡng của RT-PCR ở nồng độ Magie khác nhau ...................29

Bảng 3.5:

Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng ......................31

Bảng 3.6:

Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên vi rút nuôi cấy ............................32

Bảng 3.7:

Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR ...........................33


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:

Sơ đồ cấu trúc bộ gen EV71 ...................................................................7

Hình 3.1:

Kết quả sắpdóng cột các trình tự của EV71 ..........................................22

Hình 3.2:

Kết quả BLAST trình tự mồi xuôi trên NCBI .......................................23

Hình 3.3:

Kết quả BLAST trình tự mồi ngƣợc trên NCBI ....................................24

Hình 3.4:

Kết quả BLAST trình tự mẫu dò trên NCBI .........................................24

Hình 3.5:

Kết quả phản ứng Realtime RT-PCR trên 10 chủng vi rút nuôi cấy .....25

Hình 3.6:

Kết quả điện di sau khi chạy PCR trên 10 chủng vi rút nuôi cấy..........26

Hình 3.7:

Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 52oC .....................................................26

Hình 3.8:

Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 55oC .....................................................27

Hình 3.9:

Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 58oC .....................................................27

Hình 3.10: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 60oC .....................................................28
Hình 3.11: Đƣờng khuếch đại RT-PCR ở nồng độ Magie khác nhau .....................29
Hình 3.12: Đồ thị khuếch đại của mẫu plasmid pha loãng ......................................30
Hình 3.13: Đƣờng chuẩn RT-PCR từ plasmid pha loãng ........................................30
Hình 3.14: Điệndi đồ sản phẩm RT-PCR từ plamid tách dòng pha loãng ..............31
Hình 3.15: Đồ thị khuếch đại của mẫu vi rút nuôi cấy pha loãng ...........................32
Hình 3.16: Điện đi đồ sản phẩm RT-PCR từ vi rút nuôi cấy pha loãng ..................33
Hình 3.17: Đồ thị phản ứng RT-PCR xác định tính đặc hiệu..................................34


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
µl

Microlit

Aci

Acinetobacter baumannii

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

bp

Base pairs

CA

Coxsackievirus A

CA16

Coxsackievirus A16

CB

Coxsackievirus B

CMV

Cytomegalovirus

Ct

Threshold Cycle

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTPs

Deoxyribonucleotide Triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EV71

Enterovirus 71

HSV

Hepes simplex virus

IDT

Integrated DNA Technologies

IFA

Indirect Immunofluorescence Assay

IgM

Immunoglobulin M

kb

Kilobase pairs

Kp

Klebsiella pneumoniae

ml

Millilit

mM

Millimol

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic Acid

RT-PCR

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

TPHCM

Thành phốHồ Chí Minh

UTRs

Untranslated Regions

UV

Ultra violet


MỞ ĐẦU
Tay Chân Miệnglà bệnh truyền nhiễm lây từ ngƣời sang ngƣời, dễ gây thành
dịch. Bệnh do các vi rút đƣờng ruột (enterovirus) gây ra. Trong những năm gần đây,
bệnh Tay Chân Miệng là một trong những bệnh truyền nhiễm mới nổi và đƣợc đặc
biệt quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Các vụ dịch Tay
Chân Miệng thƣờng xảy ra hằng năm trên toàn quốc bao gồm cả hai miền Bắc và
Nam từ tháng 3 đến tháng 11. Các biến chứng nhƣ: hôn mê, co giật, phù phổi cấp,
viêm cơ tim nếu không đƣợc điều trị kịp thời sẽ có tỷ lệ tử vong cao. Hơn nữa, các
biến chứng thần kinh do EV71 gây nên kéo theo di chứng tàn tật suốt đời cho trẻ sẽ
là gánh nặng cho bệnh nhân, gia đình và xã hội.

Xét nghiệm chẩn đoán xác định vi rút EV71 bằng phƣơng pháp nuôi cấy,
phân lập thƣờng đòi hỏi thời gian và kỹ thuật cao. Tại Việt Nam chỉ có một vài đơn
vị có đủ điều kiện thực hiện đƣợc kỹ thuật này. Vì vậy, rất khó thực hiện rộng rãi tại
các cơ sở y tế và bệnh viện, gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị kịp thời.
Hiện nay, khi các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời, mở ra một kỷ nguyên
mới cho việc chẩn đoán các căn nguyên gây bệnh nói chung và bệnh Tay Chân
Miệng nói riêng. Công nghệ chẩn đoán dựa trên kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng
công nghệ Taqman probe chẩn đoán đặc hiệu EV71 không những cho kết quả
nhanh, chính xác mà nó còn có thể xác định đƣợc từ bệnh phẩm là vết loét trên bệnh
nhân[50]. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật
PCR thông thƣờng. Ngoài ra kỹ thuật Realtime RT-PCR cho phép chúng ta chẩn
đoán các ca bệnh ở giai đoạn sớm và rút ngắn rất nhiều thời gian xét nghiệm so với
phƣơng pháp PCR thông thƣờng và các phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch kháng
nguyên - kháng thể. Với những đặc điểm nổi trội nhƣ vậy, kỹ thuật này nên đƣợc áp
dụng ở các bệnh viện đặc biệt là ở các bệnh viện có khoa truyền nhiễm, viện vệ sinh
phòng dịch, giúp chẩn đoán sớm và định hƣớng cho điều trị bệnh nhân, tránh đƣợc
những biến chứng đáng tiếc xảy ra do chậm trễ trong quá trình chẩn đoán và điều
trị. Ngoài ra việc chẩn đoán bệnh sớm giúp cho các cơ sở y tế có các biện pháp
phòng bệnh hiệu quả, giám sát chặt chẽ tình hình dịch bệnh xảy ra. Việc phòng
chống bệnh Tay Chân Miệng đã đƣợc Bộ Y tế chính thức đƣa vào nhóm các bệnh
truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo. Và trong những năm gần đây, số ca mắc, chết
do bệnh Tay Chân Miệng tăng lên nhanh chóng.

1


Hiện nay ở Việt Nam, việc chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân
Miệng đều sử dụng các bộ kit thƣơng mại thƣờng đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài, có
giá thành cao và nhiều khi chẩn đoán không chính xác các chủng vi rút đang lƣu
hành ở Việt Nam. Ở trong nƣớc chƣa có đơn vị nào xây dựng và phát triển quy

trìnhkỹ thuật One-Step Realtime RT - PCR chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng. Đây
là một hạn chế trong việc chủ động và nhanh chóng phòng chống dịch bệnh trong
nƣớc, tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân. Các bộ kit thƣơng mại sử dụng test nhanh
cho tỉ lệ dƣơng tính giả hoặc âm tính giả cao và chỉ xét nghiệm đƣợc ở bệnh phẩm
là máu. Kỹ thuật chẩn đoán bằng nuôi cấy và phân lập chỉ đƣợc thực hiện ở một vài
cơ sở có phòng xét nghiệm an toàn cấp 3. Do vậy việc nghiên cứu xây dựng quy
trình Realtime RT-PCR là một bƣớc tiến trong công nghệ chẩn đoán giúp chẩn đoán
nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh và giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân. Đề
tài nghiên cứu sẽ tập trung vào mục tiêu:Nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime
RT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em, có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao.
Để đạt đƣợc các mục tiêu trên, góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và
phòng bệnh kịp thời dịch bệnh Tay Chân Miệng do EV71 gây nên, chúng tôi tiến
hành đề tài với các mục tiêu nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman Probe để khuếch
đại gen đặc trƣng của vi rút EV71 bằng kỹ thuật Realtime RT - PCR.
-Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng Realtime RT - PCR.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái niệm về bệnh Tay Chân Miệng
Bệnh Tay Chân Miệng là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút gây nên, hay
gặp ở trẻ em. Bệnh lây truyền qua đƣờng tiêu hóa, có thể lây do tiếp xúc trực tiếp
với niêm mạc, nƣớc bọt và phân của ngƣời bệnh. Đặc điểm thƣờng thấy của bệnh
bao gồm sốt, phát ban dạng phỏng nƣớc ở tay, chân và trong niêm mạc miệng. Bệnh
có thể tự hồi phục, tuy nhiên trong các vụ dịch có một tỷ lệ ngƣời bệnh có bệnh
cảnh lâm sàng nặng, với các biến chứng về thần kinh, tim mạch và dẫn đến tử vong
nhanh sau vài giờ cho đến vài ngày.

Bệnh Tay Chân Miệng do một nhóm vi rút thuộc chi Enterovirus gây
nên.Enteroviruslà thành viên của họ Picornaviridae. Chi Enterovirus bao gồm
Enterovirus 68 đến 71, Coxsackie A vi rút (CA), Coxsackie B vi rút (CB), polio vi
rút và echo vi rút. Tác nhân thƣờng gặp nhất là Coxsackie A16 (CA16) và
Enterovirus 71 (EV71), chúng là tác nhân gây nên các đại dịch Tay Chân Miệng lớn
ở các nƣớc trên thế giới.
1.2.Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới
Trong những năm gần đây, các vụ dịch Tay Chân Miệng do EV71 đã đƣợc
ghi nhận ở Trung Quốc, Hồng Kông, Macao, Đài Loan, Mông Cổ, Việt Nam,
Malaysia và Singapore. Tại Singapore, tỷ lệ mắc Tay Chân Miệng tăng dần theo
từng năm. Năm 2000 có 3.790 trƣờng hợp mắc và đã tăng lên đến 16.228 trƣờng
hợp vào năm 2002 [40]. Theo các báo cáo, chỉ trong vòng 8 tháng năm 2008,
Singapore có 29.686 ca bệnh, trong đó có 4 trƣờng hợp viêm não và 1 trƣờng hợp tử
vong [47]. Tại Đài Loan, trong vụ dịch năm 1998, có 129.106 trƣờng hợp mắc với
405 ca nặng và 78 ca tử vong [7],[11],[28]. Năm 2006-2007, tại Đài Loan cũng xảy
ra một vụ dịch với tỷ lệ tử vong cao [21].
Tại Malaysia, trƣờng hợp Tay Chân Miệng phát hiện đầu tiên vào năm 1997,
tại Sarawak. Các vụ dịch do EV71 cũng xảy ra vào năm 1997, 2000, 2003 và 2006.
Năm 2006 có 14.875 ca mắc với 13 ca tử vong [39]. Từ năm 2011-2012, gần 2.000
bệnh nhân chủ yếu từ 1-3 tuổi bị bệnh tay chân nhập viện ở Trung Quốc [29].

3


Các số liệu nghiên cứu cho thấy trẻ em dƣới 5 tuổi có nguy cơ nhiễm bệnh
cao nhất. Trẻ trai thƣờng có tỷ lệ mắc cao hơn trẻ gái. Một nghiên cứu ở Singapore
cho thấy có 1/124 (0,8%) mẫu huyết thanh có kháng thể kháng EV71 ở trẻ từ 1-23
tháng và tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính tăng lên 12%/năm ở trẻ từ 2-5 tuổi, điều này
gợi ý rằng hầu hết các trƣờng hợp bị nhiễm đều xảy ra ở trẻ trong độ tuổi trƣớc khi

đi học[25]. Một số nghiên cứu đã tìm hiểu về các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm
và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến mức độ nặng của bệnh. Nghiên cứu tại
Singapore trong vụ dịch năm 2000 cho thấy các dấu hiệu: nôn, bạch cầu tăng và một
số biểu hiện không điển hình khác nhƣ phát ban trên da nhƣng không loét miệng,
sốt, tiêu chảy có liên quan với tình trạng nặng [30],[36],[37]. Một nghiên cứu ở Đài
Loan cho thấy có sự khác biệt lâm sàng giữa EV71 với CA16 [12].
Kể từ lần đầu tiên đƣợc phân lập tại Mỹ năm 1969, EV71 đã đƣợc xác định
là một căn nguyên phổ biến của bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em và trẻ nhỏ. Các vụ
dịch lớn liên quan đến EV71 đã đƣợc công bố ở Mỹ, châu Âu, Úc, châu Á đã cho
thấy vai trò quan trọng của vi rút này đối với vấn đề sức khỏe toàn cầu [6],[50].Mặc
dù nhiễm trùng do EV71 hầu hết biểu hiện ở dạng nhẹ, tự khỏi với biểu hiện là sốt,
tổn thƣơng dạng nốt phỏng ở tay, chân, niêm mạc họng miệng. Một tỷ lệ nhất định
các trƣờng hợp cấp tính có liên quan đến các tổn thƣơng hệ thần kinh, thậm chí gây
tử vong nhƣ viêm não, viêm màng não vô khuẩn, hội chứng liệt giống bại liệt [9],
[10], [13], [17], [24], [40], [52]. Những tổn thƣơng nặng nhƣ vậy đã đƣợc báo cáo
lần đầu tiên tại Bulgari vào năm 1975 và Hungary năm 1978 [32]. Tuy nhiên, các
vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao xuất hiện vào những năm 1990 nhƣ ở Malaysia
năm 1997 [3],[11],[18],[30].Vụ dịch tại Đài Loan năm 1998 đƣợc coi là vụ dịch lớn
với hơn 100.000 ngƣời mắc, hơn 400 trẻ phải nhập viện với các biến chứng ở hệ
thần kinh trung ƣơng, 78 trẻ tử vong [7], [17].
Nhƣ vậy, với tất cả các vụ dịch xảy ra ở vùng châu Á - Thái Bình Dƣơng
trong 10 năm qua do các dƣới nhóm EV71 gây ra làm tăng sự lo ngại về nguồn gốc,
đặc điểm di truyền và dịch tễ học của vi rút này.
1.2.2. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam
Bệnh Tay Chân Miệng đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm
2003 [4]. Năm 2008, Bộ Y tế chính thức đƣa bệnh Tay Chân Miệng vào nhóm các

4

bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo và số ca mắc, chết do bệnh Tay Chân
Miệng tăng lên nhanh chóng.
Theo số liệu của Bộ Y tế, năm 2006 có 2.284 trƣờng hợp, năm 2007 có
2.988 trƣờng hợp, và chỉ trong 4 tháng đầu năm 2008 đã có gần 3.000 trƣờng hợp
mắc bệnh. Ở Việt Nam, bệnh Tay Chân Miệng xảy ra rải rác quanh năm nhƣng cao
điểm nhất là vào mùa hè và mùa thu [1]. Bệnh thƣờng xảy ra ở trẻ dƣới 6 tuổi [25],
tỷ lệ nam nhiều hơn nữ 1,5 lần, biểu hiện lâm sàng nhẹ, có thể tự khỏi và còn ít
đƣợc quan tâm.
Tại Bệnh Viện Bệnh nhiệt đới TPHCM, năm 2008 có 328 ca, năm 2009 có
255 ca nhập viện điều trị. Tỷ lệ các biến chứng chiếm 15-40% số trƣờng hợp, bao
gồm viêm não - màng não, phù phổi cấp, sốc, liệt mềm,…
Một nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi đồng 1 vào năm 2005 [43] cho thấy:
trong số 764 trẻ nhập viện với chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng có 53.8% (411 trẻ)
phân lập đƣợc vi rút đƣờng ruột từ các bệnh phẩm dịch nốt phỏng, dịch họng và
phân, trong đó có 173 (42.1%) là EV71 và 214 (52.1%) là CA16. Trong số trẻ
nhiễm EV71 có 51 (29.5%) trẻ có biến chứng thần kinh và 3 (1.7%) trẻ tử vong.
Phân tích 23 trƣờng hợp nhiễm EV71 của năm 2005, cho thấy trong nửa đầu năm là
do 3 dƣới nhóm gen C1, C4 và C5 và nửa thời gian sau của năm là do dƣới nhóm
gen C5 của EV71.
Một nghiên cứu khác tại Bệnh viện Nhi đồng 1 từ 3/2007-3/2008, sàng lọc
449 ca mắc Tay Chân Miệng có 419 (93,3%) có kết quả RT-PCR dƣơng tính. Trong
số đó có 180 (43%) có biến chứng, bao gồm viêm não, phù phổi và viêm cơ tim và
có 6 ca tử vong (1.4%).
Nghiên cứu của Ngô Văn Huy về đặc điểm dịch tễ, lâm sàng, cận lâm sàng
viêm não do Enterovirus ở trẻ em trong 2 năm 2006-2008 tại Bệnh viện Nhi Trung
ƣơng (dựa vào xét nghiệm PCR trong dịch não tủy) có nhận xét căn nguyên
Enterovirus chiếm 8%.
Theo số liệu của Cục Y tế Dự phòng – Bộ Y Tế, trong 9 tháng đầu năm
2011, cả nƣớc đã ghi nhận 61.805 trƣờng hợp mắc bệnh tay - chân - miệng tại 61
địa phƣơng, trong đó đã có 114 trƣờng hợp tử vong tại 24 tỉnh, thành phố.

5


Do tầm quan trọng của dịch Tay Chân Miệng, nhiều đơn vị nghiên cứu trong
cả nƣớc trong đó có Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ƣơng đã triển khai nghiên
cứu về vi rút này. Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng phối hợp với nhiều bệnh
viện trên toàn quốc thực hiện đề tài nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng,
phƣơng pháp chẩn đoán, điều trị, dự phòng bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam.
Các chủng vi rút gây bệnh Tay Chân Miệng trên cả nƣớc đã đƣợc phân lập và nuôi
cấy, chuẩn bị cho việc sản xuất vaccine. Đặc điểm dịch tễ học phân tử, lâm sàng của
bệnh Tay Chân Miệng ở Việt Nam đã đƣợc xác định. Bên cạnh đó phƣơng pháp
chẩn đoán sớm, quy trình điều trị có hiệu quả, phƣơng pháp dự phòng bệnh Tay
Chân Miệng đang đƣợc xây dựng. Đây là những thông tin quan trọng và là cơ sở
khoa học cho tính khả thi của đề tài này.
1.3. Cấu trúc phân tử và cơ chế gây bệnh Tay Chân Miệng của vi rút EV71
1.3.1. Cấu trúc phân tử của vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng
EV-71 là thành viên chi Enterovirus thuộc họ Picornaviridae. Cùng với các
coxackie vi rút nhóm A, EV71 là một loại vi rút đƣờng ruột đƣợc xếp vào mức loài
A. Vi rút hình cầu 20 mặt, kích thƣớc nhỏ, không có vỏ bao, bên trong chứa RNA,
là thành phần di truyền, nhân lên và gây nhiễm của vi rút. RNA là một sợi dƣơng có
khoảng 7.400 base.
Vi rút có lớp capsid hình cầu đối xứng, đƣợc tạo bởi 60 đơn vị giống nhau,
mỗi một đơn vị gồm 4 protein cấu trúc (từ VP1-VP4). Trình tự nucleotide hoàn
chỉnh của chủng EV71 đã đƣợc xác định. Khung đọc mở mã hóa một polyprotein
gồm 2.194 acid amin và đƣợc hỗ trợ bởi vùng không dịch mã (UTRs) tại đầu 5’ và
3’, và có một nhánh poly-A nằm ở điểm cuối của vùng 3’. Mỗi Polyprotein đƣợc
chia thành 3 phần nhỏ hơn là P1, P2 và P3. P1 mã hóa cho 4 protein cấu trúc 1A-1D
(VP1-VP4); P2 và P3 mã hóa cho 7 protein không cấu trúc 2A-C và 3A-D. 11
protein của EV71 dễ phân biệt với vi rút polio và các vi rút đƣờng ruột khác (Sơ đồ

cấu trúc bộ gen của EV71 ở Hình 1).

6


Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc bộ gen EV71[41]
EV71 đƣợc chia thành 3 nhóm di truyền (genogroup) ký hiệu là A, B và C.
Ngoài ra, trong nhóm B và C có một số dƣới nhóm khác. Khi nghiên cứu 628 trình
tự gen VP1 của các chủng EV71 trong giai đoạn 1970-2008, nhóm B và C có một
số dƣới nhóm khác là B1 đến B5 và C1 đến C5 [10],[11],[14],[38],[46]. Nhìn chung
dƣới nhóm gen C thƣờng xuất hiện ở Trung Quốc và Việt Nam, dƣới nhóm gen B
phổ biến ở Malaysia và Singapore, trong khi cả hai dƣới nhóm gen B và C là những
tác nhân gây dịch ở Đài Loan [10],[21],[30].
Protein VP1 bộc lộ ra phía ngoài và là đích tác động của các kháng thể trung
hòa khiến cho gen VP1 chịu áp lực chọn lọc của hệ miễn dịch. Sự chọn lọc này làm
cho vi rút có những sự thay đổi ở vùng capsid dẫn đến sự ấn định trình tự acid amin
trong những quần thể vi rút. Vì gen VP1 của Enterovirus đƣợc cho là đóng vai trò
quan trọng trong cơ chế bệnh sinh và độc lực của vi rút [8],[35],[55], sự hiểu biết về
nhịp độ cũng nhƣ cách thức tiến hóa của protein capsid có thể cung cấp những hiểu
biết mới về biến đổi dịch tễ học của EV71 [38],[45]. Điều này nhằm dự đoán các
thay đổi về di truyền cũng nhƣ qui luật của các vụ dịch do EV71 gây ra trong tƣơng
lai. Nghiên cứu của Tee và cộng sự năm 2010 đã làm sáng tỏ một số vấn đề liên
quan đến động học tiến hóa và lịch sử di truyền của các chủng EV71. Qua nghiên
cứu này, các nhà khoa học có thể ƣớc đoán thời điểm xuất hiện các dƣới nhóm của
EV71 đƣợc xác định trong những vụ dịch Tay Chân Miệng gần đây.

7


1.3.2. Phương thức truyền bệnh của EV71

Trong các nghiên cứu trƣớc đây, tỷ lệ phân lập đƣợc EV71 trong dịch hầu
họng thƣờng cao hơn so với dịch ngoáy trực tràng hoặc bệnh phẩm phân ở các bệnh
nhân nhiễm EV71 thể nặng, ngoài ra, ngƣời ta còn có thể phân lập đƣợc EV71 ở
trong phân của các bệnh nhân sau đó 5 tuần [11]. Điều này cho thấy, cả hai con
đƣờng truyền bệnh miệng – miệng và miệng – phân đều là những phƣơng thức
truyền bệnh tiềm tàng, một quá trình ủ bệnh lâu dài cũng có thể tạo ra một đợt
truyền bệnh Tay Chân Miệng trên quy mô lớn, mà chủ yếu là các trƣờng hợp nhiễm
polio và coxsackie vi rút [12],[13],[14]. Các tài liệu ghi nhận rằng, việc truyền bệnh
ở môi trƣờng gia đình đóng vai trò vô cùng quan trọng trong công việc phát tán của
EV71 ra cộng đồng, và tỷ lệ truyền bệnh ở môi trƣờng gia đình của EV71 rất cao
đối với trẻ em, nhƣng thấp hơn đối với ngƣời lớn [17],[18]. Vì vậy, việc không
kiểm soát đƣợc các nguồn gây bệnh từ khu vực gia đình, đi cùng với nồng độ vi rút
cao và thời gian ủ bệnh dài cũng có thể là nguyên nhân gây ra tỷ lệ truyền bệnh cao
cho trẻ em.
1.4. Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng hiện nay và các ƣu,
nhƣợc điểm
- Các xét nghiệm nuôi cấy, phân lập vi rút thƣờng đòi hỏi thời gian và kỹ
thuật cao. Để thực hiện đƣợc kỹ thuật này yêu cầu các cán bộ phải đƣợc đào tạo
nâng cao và có kiến thức chuyên sâu. Ngoài ra, kỹ thuật này phải đƣợc thực hiện ở
các phòng xét nghiệm an toàn cấp 3 trở lên với các điều kiện thực hiện nghiêm ngặt.
- Kỹ thuật phát hiện kháng thể IgM kháng EV71 đang tiếp tục đƣợc phát
triển nhƣng có thể cho kết quả dƣơng tính giả.
- Kỹ thuật nuôi cấy virút: các mẫu bệnh phẩm dùng để nuôi cấy virút bao
gồm dịch ngoáy họng, dịch nốt phỏng, phân, dịch não tủy và huyết thanh. Các kỹ
thuật xác định EV71 sau khi nuôi cấy bao gồm:
- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)sử dụng kháng thể đơn
dòng kháng EV71 cho kết quả chẩn đoán nhanh. Đây là một kỹ thuật đơn giản
nhƣng giá thành cao.
-Kỹ thuật RT-PCR sử dụng các gen đích khác nhau (5’UTR, VP1, VP4).

8


-Kỹ thuật Realtime RT-PCR: có thể sử dụng đƣợc với các loại bệnh phẩm
khác nhau. Kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng công nghệ Taqman probe hiện đang
là kỹ thuật chẩn đoán và xác định các căn nguyên gây bệnh tiên tiến nhất trên thế
giới. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao so với các phƣơng pháp khác.
Ngoài ra kỹ thuật Realtime RT-PCR cho phép chúng ta chẩn đoán các ca bệnh ở
giai đoạn rất sớm và rút ngắn rất nhiều thời gian xét nghiệm. Xét nghiệm sử dụng
kỹ thuật này không những cho kết quả nhanh, chính xác mà nó còn có thể xác định
đƣợc từ các loại bệnh phẩm. Điều này giúp chúng ta chẩn đoán sớm và định hƣớng
cho điều trị bệnh nhân, tránh đƣợc những biến chứng đáng tiếc xảy ra do chậm trễ
trong quá trình chẩn đoán và điều trị. Ngoài ra việc xác định căn nguyên gây bệnh ở
giai đoạn sớm giúp cho các cơ sở y tế có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả, giám
sát chặt chẽ tình hình dịch bệnh xảy ra.
1.5. Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe
Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe là kỹ thuật khuếch đại đoạn
ADN đích sử dụng probe có thể phát huỳnh quang. Taqman Probe là những đoạn
Oligonucleotid có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên AND đích và trình
tự này có chiều dài khoảng từ 24-30 nucleotid với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh
quang gọi là reporter, đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh quang phát ra từ reporter gọi
là quencher. Ngoài ra kỹ thuật này còn phải sử dụng enzyme Taq polymerase có
hoạt tính 5’-3’ exonuclease để cắt bỏ probe sau khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn.
Sau mỗi chu kỳ nhiệt nếu chƣa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ
sợi AND đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do huỳnh quang phát ra từ đầu
5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ hấp phụ. Phản ứng sẽ không phát huỳnh quang khi nhận
nguồn ánh sáng kích thích. Khi có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì
Taqman probe bắt cặp đặc hiệu vào sợi khuôn ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp thì sẽ bị
enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để cắt bỏ để kéo dài mồi
tổng hợp. Khi đó reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát

huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn ánh sáng kích thích. Càng nhiều sản phẩm
khuếch đại xuất hiện thì cƣờng độ phát huỳnh quang càng nhiều và máy sẽ ghi nhận
đƣợc tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận đƣợc nguồn ánh sáng
kích thích.

9


Tại Thành phố Hồ Chí Minh đã có một công trình nghiên cứu về phát hiện
Enterovirus 71 bằng phƣơng pháp Realtime RT- PCR. Tuy nhiên phƣơng pháp này
sử dụng công nghệ two-step real-time PCR. Hạn chế của phƣơng pháp này là thời
gian thực hiện xét nghiệm lâu hơn, dễ bị nhiễm chéo trong quá trình thực hiện phản
ứng do phải thực hiện phản ứng nhiều bƣớc, độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn.

10


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân (dịch ngoáy họng) đã đƣợc chẩn đoán dƣơng
tính với vi rút EV71, đã kiểm tra bằng giải trình tự gen.
- 10 chủng vi rút đƣợc nuôi cấy và phân lập từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung
ƣơng trong đề tài cấp Nhà nƣớc nghiên cứu về bệnh Tay Chân Miệng “Nghiên cứu
đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, dịch tễ học, phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị
bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em tại Việt Nam” của Bộ Khoa học và Công nghệ
(2011 – 2014).
- Mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với Cytomegalovirus (CMV), Hepes simplex
virus (HSV), vi khuẩn Acinetobacter baumannii (Aci), Klebsiella pneumoniae (Kp),
E. coli đƣợc Khoa Xét nghiệm-Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ƣơng cung cấp.
2.2. Vật liệu nghiên cứu

- Cặp mồi và probe nhân gen đặc trƣng của hãng IDT.
- Kit tách chiết RNA của QIAGEN (QIAamp RNA Mini Kit).
- Kit One-step RT-PCR của Invitrogen.
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị
- Trang phục bảo hộ: mũ, khẩu trang, kính, áo, quần, găng tay, bao giầy
- Tủ lạnh 4°C, Tủ lạnh -20°C, Tủ lạnh -80°C
- Đầu côn có lọc loại 20 μl, 200 μl và 1000 μl
- Máy vortex BR-2000
- Dụng cụ để làm lạnh các ống PCR
- Máy Realtime PCR 7500 Fast
- Máy ly tâm 5424 của Eppendorf

11


2.4. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman probe đểkhuếch đại gen đặc
trƣng của Vi rút EV71
2.4.1.Các nguyên tắc thiết kế mồi
Việc thiết kế mồi phải tuân thủ theo một số nguyên tắc nhƣ sau:
- Phải bắt cặp với trình tự đích 80% trở lên
- 5 nucleotide ở đầu 3’ phải bắt cặp hoàn toàn với trình tự đích
- Thành phần G-C từ 40-60%
- Chiều dài mồi từ 18-25 nucleotide
- Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”
- Tránh cấu trúc kẹp tóc trong thành phần mỗi mồi
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi dao động trong khoảng 55- 65°C. Tm của
mồi xuôi và mồi ngƣợc không cách nhau quá 5°C.
- 5 nucleotide cuối cùng ở đầu 3’ không nên chứa hơn 2 G hoặc C nhằm tránh
hiện tƣợng nhân bản kí sinh trong phản ứng PCR.
2.4.2. Các nguyên tắc thiết kế Probe

Việc thiết kế probe phải tuân thủ một số nguyên tắc sau đây:
- Thành phần G-C khoảng 40-60%
- Chiều dài dƣới 30 nucleotide
- Tránh nucleotide loại G ở đầu 5’ vì G có thể hấp thụ ánh sáng huỳnh quang
ngay cả khi mẫu đã bị thủy giải bởi Taq polymerase.
Nếu phải chọn mẫu dò trong vùng có nhiều GC thì nên chọn mạch bổ sung của
mẫu dò có nhiều C hơn G.
- Nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò lớn hơn Tm của mồi từ 5 đến 100C nhằm
đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với mạch DNA khuôn trong bƣớc bắt cặp và
kéo dài của chu kỳ PCR.

12


2.4.3. Các phần mềm sử dụng
- ClustalX 2.0.10 (EMBL, Châu Âu)
- Annhyb 4.943 (Olivier Friard, Hoa Kỳ)
- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ)
- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ)
2.4.4. Phương pháp tiến hành
Chúng tôitải các trình tự gen của vùng gen VP1 của Enterovirus 71từ ngân
hàng dữ liệu NCBI. Tiếp theo, tiến hành sắp dóng cột các trình tự tải về bằng phần
mềm ClustalX. Sử dụng chƣơng trình BioEdit để chọn ra các vùng bảo tồn đặc
trƣng cho Enterovirus 71 và tiến hành thiết kế mồi và mẫu dò.
Dựa vào kết quả sắp dóng cột trình tự gen VP1 của EV71 và CA16 từ
chƣơng trình ClustalX, chúng tôi thiết kế mồi ngƣợc, mồi xuôi và mẫu dò. Trong
quá trình thiết kế có sử dụng các nucleotit thay thế để đảm bảo sự bắt cặp đặc hiệu
với tất cả các chủng. Hiệu quả đặc hiệu của các cặp mồi sẽ đƣợc đánh giá chính xác
hơn trong quá trình thực nghiệm.
Sau đó, chúng tôi dùng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer (IDT) để kiểm

tra và chỉnh sửa các mồi và mẫu dò cho phù hợp với các tiêu chuẩn (kích thƣớc,
%GC, Tm, các cấu trúc thứ cấp). Hiệu quả của mồi và taqman probe sẽ đƣợc đánh
giá thông qua việc xác định giá trị Ct của phản ứng Realtime RT-PCR từ 10 chủng
vi rút đƣợc nuôi cấy và phân lập tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng.
Ct: là chu kỳ ngƣỡng mà máy ghi nhận đƣợc tín hiệu huỳnh quang phát ra từ
ống phản ứng và vƣợt tín hiệu huỳnh quang nền. Sự sai khác về giá trị Ct của cùng
1 mẫu thử nghiệm < 3 chu kỳ là điều kiện lý tƣởng cho việc đánh giá sự ổn định,
cũng nhƣ hiệu quả của phản ứng trong các điều kiện khác nhau.
Để kiểm tra đặc tính của mồi và mẫu dò về nhiệt độ lai, kích thƣớc mồi, các
cấu trúc thứ cấp,… chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb và phần mềm trực tuyến
Oligo Analyzer 3.1 (IDT, Hoa Kỳ).
Sau đó, chúng tôi sử dụng công cụ BLAST trên NCBI để kiểm tra độ đặc
hiệu của mồi và mẫu dò. Chƣơng trình này cho phép tìm kiếm toàn bộ cơ sở dữ liệu
nucleotide của tất cả các ngân hàng gen nổi tiếng trên thế giới để tìm ra tất cả những

13


trình tự tƣơng đồng với những trình tự mồi và mẫu dò của chúng tôi (nếu có). Từ
kết quả này, chúng tôi xác định đƣợc mồi và mẫu dò có đặc hiệu hay không.
2.5. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số từ chủng vi rút EV71
Chứng âm là nƣớc cất đƣợc khử trùng đƣợc tiến hành tách chiết đồng thời
với các mẫu bệnh phẩm để đảm bảo quá trình tách không bị nhiễm.
RNA tổng số của chủng vi rút dƣơng tính và mẫu bệnh phẩm đƣợc tách chiết
theo kít QIAamp Viral RNA Mini Kit của QIAGEN. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
-

Hút 560 µl lysis buffer AvL vào ống eppendorf 2 ml đã có sẵn 5.6µl carrier
RNA.

-

Cho 140 µl bệnh phẩm vào ống eppendorf có chứa hỗn hợp Buffer AVL carrier RNA. Trộn đều bằng cách votex trong 15 giây.
Chú ý: Để đảm bảo cho quá trình ly giải đạt hiệu quả tối đa, quá trình vortex

phải đƣợc làm cẩn thận.
-

Ủ ở nhiệt độ 560C trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

-

Ly tâm nhẹ để đẩy những dung dịch bám ở nắp ống xuống phía dƣới.

-

Bổ sung thêm 560µl ethanol (96 – 100%), trộn đều bằng máy votex trong
15 giây. Sau khi trộn, ly tâm nhẹ để đẩy lƣợng dung dịch nhỏ bám ở nắp
ống xuống phía dƣới.

-

Cẩn thận chuyển toàn bộ dung dịch ở bƣớc 5 lên cột lọc (đã có ống hứng
loại 2 ml ở dƣới). Đóng nắp và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại
bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mới.

-

Lặp lại bƣớc 6 đến khi cho hết dịch lên cột.

-

Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa bằng 500 µl Wash buffer AW1. Đóng nắp và
ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ ống hứng có chứa dịch,
chuyển cột lọc sang một ống hứng mới.

-

Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa lại bằng 500 µl Wash buffer AW2. Đóng nắp
và ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ ống hứng có chứa dịch,
chuyển cột lọc sang một ống hứng mới.

-

Đặt cột lọc vào một ống hứng mới, ly tâm khô ở 14.000 vòng/phút trong
1 phút.

14


-

Đặt cột lọc vào một ống eppendorf 1,5 ml mới và loại bỏ ống hứng có chứa
dịch. Mở nắp cột lọc cẩn thận và cho 50 µl Elution buffer AE. Đóng nắp và
ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở 8.000 vòng/ phút trong 1 phút.
Mẫu ARN sau khi tách đƣợc bảo quản ở -800C đến khi thực hiện các thí

nghiệm tiếp theo.
2.6.Phản ứng Realtime RT-PCR
Nguyên tắc của Real-time PCR cũng dựa trên PCR thƣờng, nhƣng phƣơng

pháp này cho phép phát hiện và định lƣợng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi
phản ứng đang xảy ra.
Phản ứng RT-PCR đƣợc thực hiện một bƣớc từ RNA tổng số bằng kit
SuperScript® III One-Step RT-PCR của Invitrogen.
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCRkhuếch đại vùng gen
đặc trưng của EV71
Thành phần

Thể tích (l)

Nƣớc khử ion vô trùng

16

2X reaction mix

25

SuperScript® III RT/ Platinum® Taq Mix

1,0

Primer F

1,0

Primer R

1,0

Probe

1,0

RNA tổng số

5,0

Tổng thể tích

50

Chu trình nhiệt chạy RT-PCR: 1 chu kỳ ở 52oC – 15 phút, 95°C- 2 phút, tiế p
theo là 45 chu kỳ (95°C – 30 giây, 55°C – 30 giây: đọc kết quả tại bƣớc này). Vùng
gen đặc trƣng của virus EV71 sẽ đƣợc phát hiện bằng cách đo mật độ quang sau
mỗi chu kỳ của phản ứng
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc điện di trên gel agarose 2%, để kiểm tra kích
thƣớc của sản phẩm khuếch đại có đúng nhƣ thiết kế mồi không.

15


2.7. Phƣơng pháp điện di
Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các
nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi
chịu tác động của điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng.
Sự phát hiện đƣợc quan sát bằng mắt thƣờng dƣới đèn UV nhờ sự phát màu của
ethidium bromide gắn xen trong DNA.
+Cách tiến hành: Sản phẩm RT-PCR đƣợc điện di trong gel agarose 1,5% sử
dụng thuốc nhuộm GelRed 1X.

-

Chuẩn bị Agarose 1,5% có bổ sung GelRed.

-

Đun nóng chảy agarose bằng lò vi sóng (2-3 phút), để nguội đến 55600C, đổ bản điện di. di đã khô, có thể tiến hành điện di.

+Thành phần 1 giếng điện di
Sau khoảng 20 phút, bản điện i nhƣ sau:
-

4 µl sản phẩm PCR (hoặc thang marker)

-

1 µl Loading Dye

Trộn đều và tra lần lƣợt mẫu vào các giếng
Sản phẩm đƣợc chụp ảnh điện di và nhận định kết quả.
2.8. Tối ƣu hóa phản ứng Realtime RT-PCR để chẩn đoán vi rút EV71 gây
bệnh Tay Chân Miệng
2.8.1. Phương pháp RT-PCR nhân gen đặc trưng của virus EV71
Phản ứng RT-PCR đƣợc thực hiện một bƣớc từ RNA tổng số bằng kit
SuperScript® III One-Step RT-PCR của Invitrogen. Thành phần phán ứng theo
hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau:
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại gen EV71
Thành phần

Thể tích (l)

Nƣớc khử ion vô trùng

5,5

2X reaction mix

12,5

SuperScript® III RT/ Platinum® Taq Mix

0,5

Primer F

0,5

Primer R

0,5

Probe

0,5

Plasmid 105 bản sao

5,0

Tổng thể tích

25

16


Chu trình nhiệt chạy RT-PCR: 1 chu kỳ ở 52oC – 15 phút, 95°C- 2 phút, tiế p
theo là 45 chu kỳ (95°C – 30 giây, 60°C – 30 giây) và đọc huỳnh quang ở bƣớc 60°C.
2.8.2. Tối ưu nhiệt độ kéo dài
Chƣơng trình luân nhiệt real-time PCR dùng taqman probe thƣờng chỉ có 2
giai đoạn nhiệt độ là: biến tính 94-95oC trong 15-30 giây, kế đó là giai đoạn vừa bắt
cặp vừa kéo dài ở 60oC trong 30-60 giây và thiết bị thu tín hiệu huỳnh quang sẽ hoạt
động ở bƣớc này. Ở giai đoạn nhiệt độ 60oC thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi
đích trƣớc vì đây là nhiệt độ bắt cặp tối ƣu của Taqman probe (thấp hơn Tm của
Taqman probe là 65-70oC, nhƣng cao hơn hoặc bằng Tm của mồi là (55-60oC) rồi
sau đó mồi mới bắt cặp vào. Chính nhờ vậy mà khi Taq polymerase tổng hợp sợi bổ
sung, enzyme này mới có cơ hội thuỷ giải Taqman probe cản đầu nó. Nếu mồi bắt
cặp trƣớc vào sợi đích thì sẽ không có cơ hội để Taqman probe bắt cặp vào sợi đích,
và nhƣ vậy nó không bị thuỷ giải khi enzyme Taq polymerase kéo dài tổng hợp sợi
bổ sung (nghĩa là máy sẽ không thu đƣợc tín hiệu huỳnh quang nào từ reporter của
Probe). Điều này giải thích tại sao phải thiết kế mồi có Tm khoảng 55-60oC và thấp
hơn Tm của Taqman probe 5-10oC.
Dựa vào Tm của Taqman probe và Tm của cặp mồi đã đƣợc thiết kế, chúng
tôi tiến hành tối ƣu nhiệt độ của RT-PCR nhằm tìm ra nhiệt độ tốt nhất cho sự bắt
cặp của Taqman probe mà không ảnh hƣởng đến sự bắt cặp của primer. Chúng tôi
tối ƣu nhiệt độ ở bƣớc kéo dài và đọc huỳnh quang là 52oC, 55oC, 58oC và 60oC.
2.8.3. Tối ưu nồng độ Magie
Theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất trong 2X reaction mix đã bao gồm magie
ở nồng độ cuối cùng là 3mM, nồng đồ này là cần thiết cho hầu hết các tác nhân
đích. Tuy nhiên trong từng đối tƣợng cụ thể có thể tối ƣu nồng độ magie trong

ngƣỡng từ 3-6mM. Trong nghiên cứu này chúng tôi tối ƣu nồng độ magie ở 3
ngƣỡng nồng độ cuối cùng là 4mM, 5mM và 6mM.
2.9. Xác định độ nhạy của phản ứng Realtim RT - PCR
2.9.1. Phương pháp đo nồng độ xác định số bản sao plasmid
Plasmid pCR2.1 mang gen đặc trƣng của EV71 (pCR2.1/EV71) đƣợc chúng
tôi xác định nồng độ trên máy đo Qubit 2.0. Qubit là hệ thống máy huỳnh quang để
bàn thế hệ mới, cho phép định lƣợng nhanh, chính xác DNA, RNA, Protein và có

17