Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU & PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-oOo-

ĐÀO THỊ TUYẾT THANH

TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa
L.) ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA (60CO)
TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành: 62 42 02 01

Cần Thơ - 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU & PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-oOo-

ĐÀO THỊ TUYẾT THANH

TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa
L.) ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA (60CO)
TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành: 62 42 02 01

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGS. TS. Nguyễn Bảo Toàn

Cần Thơ - 2018


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

Luận án “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia
gamma (60Co) trong điều kiện in vitro” do nghiên cứu sinh Đào Thị Tuyết
Thanh thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Bảo Toàn.

Tác giả luận án

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

i

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn thầy, PGS.TS. Nguyễn Bảo Toàn, đã tận tình
hƣớng dẫn khoa học, tƣ vấn thiết kế các thí nghiệm, hƣớng dẫn cách tiếp cận
các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, từ đó giúp tôi hoàn thành
luận án nghiên cứu sinh.
Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu & Phát triển
Công nghệ Sinh học, Trại Nghiên cứu & Thực nghiệm Nông nghiệp thuộc
Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Khoa Sau Đại Học đã tạo điều kiện
thuận lợi trong thực hiện các thủ tục, hỗ trợ hóa chất và trang thiết bị cho các
nghiên cứu của Luận án.
Chân thành cảm ơn quý thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc
Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học và Khoa Nông nghiệp &
Sinh học Ứng dụng đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn chú Nguyễn Thƣợng Hiền đã hỗ trợ nguồn giống
hoa huệ. Đồng thời, tôi cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến các em học viên
cao học đã cộng tác trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Trung Tâm Dạy nghề &
Hỗ trợ Nông dân tỉnh Tiền Giang, các anh chị em đồng nghiệp đã hỗ trợ trong
công tác để tôi có thời gian hoàn thành đƣợc khóa học.
Sau cùng tôi xin đƣợc cảm ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình đã
luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.

Đào Thị Tuyết Thanh

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT
Nghiên cứu “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng
tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro” đƣợc thực hiện nhằm (1) xác định
đƣợc môi trƣờng nuôi cấy để tạo vật liệu cho các thí nghiệm; (2) xác định
đƣợc hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) trên mô sẹo và cụm chồi hoa
huệ thông qua liều gây chết LD50; (3) xác định sự đa dạng về mặt hình thái của
cây giai đoạn thuần dƣỡng; (4) chọn đƣợc một đến hai giống hoa huệ tăng về
số lƣợng cánh hoa, kích thƣớc hoa và hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp
truyền thống. Nghiên cứu bao gồm tạo nguồn vật liệu cho thí nghiệm trên hai
giống/dòng hoa huệ đơn và hoa huệ kép; xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co)
ở các liều khác nhau; xác định giá trị tổn thƣơng LD50; đánh giá sự sinh trƣởng
của mô sẹo và cụm chồi in vitro; thuần dƣỡng và đánh giá sự thay đổi về mặt
hình thái lá và hoa rồi chọn ra ít nhất hai dòng có kiểu hình trội. Kết quả thí
nghiệm cho thấy môi trƣờng cơ bản bổ sung 1,0 mg/l NAA và 4,0 mg/l BA
thích hợp cho tạo mô sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co).
Liều gây chết LD50 của các giống/dòng hoa huệ đơn khi xử lý tia gamma
(60Co) khoảng 10-15 Gy (giá trị tính là 10,96 ± 2,96 Gy) trong khi LD50 của
các giống/dòng hoa huệ kép khoảng 20-25 Gy (giá trị tính là 22,91 ± 4,01 Gy).
Theo dõi sự sinh trƣởng chồi in vitro, khi xử lý liều chiếu xạ càng cao thì số
chồi, chiều cao chồi và số lá càng giảm ở cả hai giống và các dòng hoa huệ.
Giai đoạn này ghi nhận đƣợc các dạng bất thƣờng về hình thái ở lá và chồi.
Giai đoạn thuần dƣỡng, các cây còn nhỏ, sự khác biệt về hình thái lá và chồi

không nhận thấy rõ ràng. Ở giai đoạn ngoài đồng, các chỉ tiêu sinh trƣởng đều
bị ảnh hƣởng bởi các liều chiếu xạ ở các dòng hoa huệ. Có sự xuất hiện các
dạng bất thƣờng về hình thái lá, thân và số cánh hoa. Đặc biệt, trên cùng một
phát hoa huệ đơn có sự gia tăng số lƣợng cánh hoa lên 7 và 8 cánh (thay vì hoa
có 6 cánh). Hầu hết các dòng hoa huệ đơn đƣợc xử lý tia gamma (60Co) đều có
mùi thơm, trừ dòng hoa huệ với liều xử lý 5 Gy với đặc điểm hoa không nở
hoàn toàn. Ở hoa huệ kép chọn đƣợc 2 dòng đột biến tiềm năng nhất về đặc
điểm hoa to và có mùi thơm với 22 và 36 cánh.

Từ khóa: cánh hoa, chiếu xạ, đột biến, hoa huệ, in vitro, LD50, gamma.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

ABSTRACT

The study on "Inducing of mutation tuberose (Polianthes tuberosa L.)
lines by irradiating with 60Co gamma rays in vitro" was carried out (1) to
determine culture medium to create materials for experiments on two
tuberoses, single petals and double petals; (2) to determine the effects of
different irradiated doses on calli and shoot clumps of tuberose through LD50;
(3) to determine morphological diversities at acclimatization stage; (4) to

select two new tuberose lines having bigger flower size, larger number of
petals and aromatic odour. The obtained results included producing materials
for experiments on two tuberose cultivars; treating irradiation of 60Co gamma
rays at different doses and determining LD50values; evaluating the growth of
calli and shoot clumps in vitro; acclimatizing and evaluating changes on
morphologies and petals, and selecting, at least, two lines with better
phenotypes. The implemented experiments showed that the base medium
supplemented with 1.0 mg/l NAA and 4.0 mg/l BA was very suitable for
inducing calli and shoot clumps as experimental materials. The LD50 value of
single petal tuberose variety was obtained about 10-15 Gy (the counting value
was 10.96±2.96 Gy), whereas that of double petal oneabout 20-25 Gy (the
counting value was 22.91±4.01 Gy). At the in vitro stage, the higher radiation
doses were, the lower number of shoot got, shoot height and the number of
leaves were the same as in all varieties/lines. There were also appearances of
the abnormal structures or disappearance of the chlorophyll in leaves. At the
acclimatization stage, the lethal rates of plantlets were significantly different
from each other for the irradiation doses, and the variations of leaves and
shoots were not clearly recognized. At the field stage, the growth parameters
such as the number and diameter of bulbs, the height of inflorescences, the
number of flowers and the days to flowering in all varieties/lines were affected
by irradiated doses. There were appearances of variability of leaves, trunks
and petal number. In single petal tuberose, there was an increase of petal
number (up to 7 or 8) in each inflorescence. Almost single petal tuberose
cultivars irradiated with 60Co gamma were fragrant lines, except for the
tuberose lines irradiated at 5 Gy. In double petal tuberoses, among the
variations of phenotypes were the two fragrant mutant lines with 22 and 36
petals, having the most potential ability for production.

Key words: gamma, in vitro, irradiation, LD50, mutation, petal, tuberose.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iv

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận án “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột
biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro” này đƣợc hoàn thành dựa
trên các kết quả nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS.
Nguyễn Bảo Toàn. Các kết quả của công trình nghiên cứu này chƣa đƣợc
dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác.

Tác giả luận án

Đào Thị Tuyết Thanh

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

v

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC

Trang
TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC.................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii
TÓM TẮT ......................................................................................................... iii
ABSTRACT...................................................................................................... iv
CAM KẾT KẾT QUẢ ....................................................................................... v
MỤC LỤC ........................................................................................................ vi
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... xii
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................... xiv
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ xvi
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu ....................................................................................................... 2
1.2.1 Mục tiêu chính .......................................................................................... 2
1.2.2 Mục tiêu cụ thể ......................................................................................... 2
1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 2
1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................... 2
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 2
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ..................................................... 2
1.4.1 Ý nghĩa khoa học ...................................................................................... 2
1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn....................................................................................... 3
1.5. Điểm mới của luận án ................................................................................. 3
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................. 5

2.1 Giới thiệu về cây hoa huệ ............................................................................ 5
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật cây hoa huệ .......................................... 5
2.1.2 Đặc điểm thực vật cây hoa huệ ................................................................. 5
2.1.3 Tình hình sản xuất hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam .......................... 7
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vi

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

2.1.3.1 Trên thế giới ........................................................................................... 7
2.1.3.2 Ở Việt Nam ............................................................................................ 7
2.1.4 Tầm quan trọng và mục đích sử dụng hoa huệ ......................................... 8
2.1.5 Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển .......................................................... 9
2.1.6 Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển
của cây ............................................................................................................... 9
2.1.6.1 Nhiệt độ.................................................................................................. 9
2.1.6.2 Độ sâu khi trồng................................................................................... 10
2.1.6.3 Các chất dinh dƣỡng ............................................................................ 10
2.2 Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây hoa huệ ................................................... 11
2.2.1 Chuẩn bị giống ........................................................................................ 11
2.2.2 Chuẩn bị đất ............................................................................................ 12
2.2.3 Chăm sóc................................................................................................. 12
2.2.4 Sâu bệnh trên cây hoa huệ ...................................................................... 12
2.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong chọn tạo giống cây trồng đột biến .......... 13

2.3.1 Các giai đoạn của nuôi cấy thực vật in vitro .......................................... 13
2.3.2 Các loại mẫu cấy trong nuôi cấy in vitro ở cây hoa huệ......................... 13
2.3.3 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (meristem culture) ......................... 14
2.3.4 Môi trƣờng nuôi cấy thực vật in vitro ..................................................... 15
2.3.4.1 Dinh dƣỡng khoáng và vitamin trong nuôi cấy thực vật in vitro ........ 15
2.3.4.2 Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong nuôi cấy thực vật in vitro
.......................................................................................................................... 16
2.3.4.3 Các chất bổ sung khác trong nuôi cấy thực vật in vitro....................... 17
2.3.5 Sự hình thành mô sẹo và chồi (cụm chồi) trong nuôi cấy thực vật in vitro
.......................................................................................................................... 17
2.3.5.1 Sự hình thành mô sẹo trong nuôi cấy in vitro ...................................... 17
2.3.5.2 Sự hình thành chồi trong nuôi cấy in vitro .......................................... 18
2.4 Phƣơng pháp xử lý đột biến bằng kỹ thuật chiếu xạ trong chọn tạo giống
cây trồng .......................................................................................................... 19
2.4.1 Sơ lƣợc về đột biến bằng kỹ thuật chiếu xạ ............................................ 19
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

2.4.2 Đặc điểm của tia phóng xạ gamma ......................................................... 19
2.4.2.1 Cơ chế tạo đột biến của tia gamma (60Co) ........................................... 19
2.4.2.2 Hiệu quả của tia gamma trong chọn giống cây trồng .......................... 20
2.4.2.3 Liều chiếu xạ ........................................................................................ 20

2.4.2.4 Liều gây chết LD50 ............................................................................... 21
2.4.2.5 Tần số đột biến in vitro ........................................................................ 21
2.4.3 Ý nghĩa của phƣơng pháp chọn giống đột biến ...................................... 22
2.4.4 Tình hình tạo giống ở hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam ................... 22
2.4.4.1 Trên thế giới ......................................................................................... 22
2.4.4.2 Ở Việt Nam .......................................................................................... 23
2.5 Sự kết hợp của chọn giống đột biến bằng nuôi cấy thực vật in vitro và
chiếu xạ tia gamma .......................................................................................... 23
2.5.1 Nguồn vật liệu để tạo đột biến in vitro ................................................... 23
2.5.2 Ƣu điểm và khuyết điểm của phƣơng pháp chọn giống bằng kỹ thuật
nuôi cấy in vitro và xử lý đột biến bằng tia gamma ........................................ 23
2.5.3 Một số kết quả nghiên cứu về sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy thực vật in
vitro và xử lý đột biến bằng tia gamma ở các loại cây trồng........................... 24
2.5.4 Một số nghiên cứu về xử lý đột biến bằng nuôi cấy thực vật in vitro và
chiếu xạ tia gamma ở cây hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam ...................... 25
2.6 Ứng dụng chỉ thị di truyền để chọn lọc dòng đột biến trong chọn giống cây
trồng và hoa huệ bằng xử lý tác nhân vật lý .................................................... 25
2.6.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp ....................................................................... 26
2.6.2 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter Simple Sequence RepeatISSR) ................................................................................................................ 26
2.6.3 Một số nghiên cứu về sử dụng PCR-ISSR trong chọn giống cây trồng
bằng xử lý đột biến .......................................................................................... 27
2.6.4 Một số nghiên cứu ở cây hoa huệ sử dụng phƣơng pháp PCR-ISSR ..... 27
2.6.5 Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên gen ITS (Internal Transcribed
Spacer) ............................................................................................................. 28
2.7 Địa lý và điều kiện tự nhiên ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long... 29
2.7.1 Tiền Giang .............................................................................................. 29
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

viii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

2.7.2 Cần Thơ .................................................................................................. 30
2.7.3 An Giang ................................................................................................. 30
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 31
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................. 31
3.1.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................. 31
3.1.2 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................. 31
3.1.3 Trang thiết bị và hóa chất ....................................................................... 32
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 33
3.2.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) trong
điều kiện in vitro .............................................................................................. 34
3.2.1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng cây hoa huệ ............................................... 34
3.2.1.2 Tạo mô sẹo và cụm chồi hoa huệ cho xử lý chiếu xạ .......................... 35
3.2.2 Nội dung 2: Xác định hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) trên hai
giống/dòng hoa huệ bằng liều gây chết 50% (LD50) in vitro........................... 36
3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của liều lƣợng tia (60Co) gamma đến sự sinh
trƣởng và phát triển của cụm mô sẹo ở giống/dòng hoa huệ đơn .................... 37
3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh
trƣởng và phát triển của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép......................... 38
3.2.2.3 Nhân chồi và tạo rễ thành cây hoa huệ hoàn chỉnh ............................. 39
3.2.3 Nội dung 3: Xác định sự đa dạng về mặt hình thái của cây con giai đoạn
thuần dƣỡng trong nhà lƣới ............................................................................. 39
3.2.4 Nội dung 4: Chọn các dòng hoa huệ tăng về số cánh hoa, kích thƣớc hoa
và hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống ...................................... 40

3.2.4.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của giống/dòng
hoa huệ đơn sau khi xử lý tia gamma (60Co) ở ngoài đồng ............................. 40
3.2.4.2 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của giống/dòng
hoa huệ kép sau khi xử lý tia gamma (60Co) ở ngoài đồng ............................. 42
3.2.4.3 Đánh giá đa dạng ADN ở giống/dòng hoa huệ đột biến...................... 43
3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu ......................................................................... 45
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 47

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ix

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

4.1 Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in
vitro .................................................................................................................. 47
4.1.1 Tỷ lệ sống khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (ĐST) hai giống hoa huệ ...... 47
4.1.2 Nhân cụm mô sẹo (callus) và cụm chồi .................................................. 47
4.2 Xác định hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) trên hai giống/dòng
hoa huệ bằng liều gây chết 50% (LD50) in vitro .............................................. 48
4.2.1 Hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát
triển của mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn ....................................................... 48
4.2.1.1 Tỷ lệ tái sinh chồi ở cụm mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn ................. 48
4.2.1.2 Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn .............. 49
4.2.1.3 Liều gây chết LD50 của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn. 50

4.2.1.4 Số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ đơn ................ 52
4.2.1.5 Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma (60Co) trên các cấu trúc bất
thƣờng ở giống/dòng hoa huệ đơn ................................................................... 53
4.2.2 Hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát
triển của cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép .................................................... 54
4.2.2.1 Tỷ lệ chết của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép ............................ 54
4.2.2.2 Liều gây chết LD50 của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép ............. 55
4.2.2.3 Số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ kép ................ 57
4.2.2.4 Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma (60Co) trên các cấu trúc bất
thƣờng ở giống/dòng hoa huệ kép ................................................................... 59
4.2.3 Nhân chồi và tạo rễ thành cây hoa huệ hoàn chỉnh ................................ 61
4.3 Xác định sự đa dạng về mặt hình thái của cây con giai đoạn thuần dƣỡng
trong nhà lƣới ................................................................................................... 62
4.3.1 Tỷ lệ chết của các giống/dòng hoa huệ đơn giai đoạn thuần dƣỡng ...... 62
4.3.2 Tỷ lệ chết của các giống/dòng huệ kép giai đoạn thuần dƣỡng.............. 63
4.3.3 Các dạng bất thƣờng về kiểu hình của các giống/dòng hoa huệ đơn và
kép giai đoạn thuần dƣỡng ............................................................................... 64
4.4 Chọn các dòng hoa huệ tăng về số cánh hoa, kích thƣớc hoa và hoa có mùi
thơm theo phƣơng pháp truyền thống .............................................................. 64
4.4.1 Trồng lần 1 (M1)..................................................................................... 64

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

x

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

4.4.1.1 Các đặc điểm sinh trƣởng và ra hoa ở giống/dòng hoa huệ đơn ......... 64
4.4.1.2 Các đặc điểm sinh trƣởng và ra hoa ở các giống/dòng hoa huệ kép ... 75
4.4.2 Trồng lần 2 (M2)..................................................................................... 90
4.4.3 Đánh giá đa dạng di truyền các giống/dòng hoa huệ bất thƣờng chọn
đƣợc ................................................................................................................. 92
4.4.3.1 Đánh giá sự đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp đánh dấu phân tử
ISSR-PCR ........................................................................................................ 92
4.4.3.2 Giải trình tự vùng ITS các giống/dòng hoa huệ .................................. 96
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 101
5.1 Kết luận .................................................................................................... 101
5.2 Đề nghị ..................................................................................................... 103
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN...................................................................................................... 104
LÝ LỊCH TRÍCH NGANG ........................................................................... 105
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 106
PHỤ LỤC BẢNG .......................................................................................... 131
PHỤ LỤC HÌNH ........................................................................................... 140

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

xi

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG

Trang
Bảng 2.1: Một số nghiên cứu về liều gây chết LD50 khi xử lý chiếu xạ ở các
loại cây trồng ................................................................................................... 21
Bảng 3.1: Bố trí các liều chiếu xạ và nghiệm thức ở giống hoa huệ đơn ........ 37
Bảng 3.2: Bố trí các liều chiếu xạ và nghiệm thức ở giống hoa huệ kép ........ 39
Bảng 3.3: Danh sách các mồi ISSR sử dụng đánh giá đa dạng ADN các
giống/dòng huệ ................................................................................................ 44
Bảng 4.1: Tỷ lệ sống của đỉnh sinh trƣởng ở hai giống hoa huệ đơn và hoa huệ
kép ở 30 ngày sau khi cấy ................................................................................ 47
Bảng 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở cụm mô sẹo ở giống/dòng hoa huệ đơn ......... 49
Bảng 4.3: Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150
ngày nuôi cấy ................................................................................................... 50
Bảng 4.4: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết ở giống/dòng hoa huệ đơn ở các liều
chiếu xạ ............................................................................................................ 51
Bảng 4.5: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ đơn đã xử
lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy ..................................................... 52
Bảng 4.6: Phần trăm xuất hiện cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ đơn
đã xử lý tia gamma (60Co) sau 100 ngày nuôi cấy ........................................... 53
Bảng 4.7: Tỷ lệ chết của giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy ...... 55
Bảng 4.8: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết ở giống/dòng hoa huệ kép ở các liều
chiếu xạ ............................................................................................................ 56
Bảng 4.9: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ kép đã xử
lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy ..................................................... 59
Bảng 4.10: Phần trăm xuất hiện cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ kép
đã xử lý tia gamma (60Co) sau 100 ngày nuôi cấy ........................................... 60
Bảng 4.11: Tỷ lệ chết của cây sau 30 ngày thuần dƣỡng ở giống/dòng huệ đơn
.......................................................................................................................... 63

Bảng 4.12: Tỷ lệ chết của cây sau 30 ngày thuần dƣỡng ở giống/dòng huệ kép
.......................................................................................................................... 63
Bảng 4.13: Tỷ lệ chết của giống/dòng huệ đơn sau 60 ngày trồng ................. 64
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

xii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 4.14: Các chỉ tiêu sinh trƣởng của các giống/dòng hoa huệ đơn sau 180
ngày trồng ........................................................................................................ 66
Bảng 4.15: Đặc điểm ra hoa của giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 .... 68
Bảng 4.16: Tần số các dạng bất thƣờng ở lá của các dòng hoa huệ đơn sau 60
ngày trồng ........................................................................................................ 70
Bảng 4.17: Tần số các dạng bất thƣờng ở thân và củ của các dòng hoa huệ đơn
sau 60 ngày trồng ............................................................................................. 72
Bảng 4.18: Tần số các dạng hoa bất thƣờng trên cùng phát hoa của các dòng
hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 ............................................................................ 73
Bảng 4.19: Đánh giá mức độ mùi thơm ở các giống/dòng hoa huệ đơn khi ra
hoa lần 1 ........................................................................................................... 75
Bảng 4.20: Tỷ lệ chết của các giống/dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng..... 76
Bảng 4.21: Các chỉ tiêu sinh trƣởng của các giống/dòng hoa huệ kép sau 180
ngày .................................................................................................................. 77
Bảng 4.22: Đặc điểm ra hoa của giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 .... 79
Bảng 4.23: Tần số các dạng bất thƣờng ở lá của các dòng hoa huệ kép sau 60

ngày trồng ........................................................................................................ 81
Bảng 4.24: Tần số các dạng bất thƣờng ở thân và củ của các dòng hoa huệ kép
sau 60 ngày trồng ............................................................................................. 83
Bảng 4.25: Tần số các dạng bất thƣờng ở hoa của các dòng hoa huệ kép khi ra
hoa lần 1 ........................................................................................................... 86
Bảng 4.26: Tần số các dạng hoa bất thƣờng trên cùng một phát hoa của các
dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 ................................................................... 89
Bảng 4.27: Đánh giá mức độ mùi thơm của các giống/dòng hoa huệ kép khi ra
hoa lần 1 ........................................................................................................... 90
Bảng 4.28: Đặc điểm nông học của các giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc sau khi
trồng lần 2 ........................................................................................................ 91
Bảng 4.29: Sự đa hình của chỉ thị ISSR ở các giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc
.......................................................................................................................... 93
Bảng 4.30: Hệ số tƣơng đồng di truyền của các giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc
với 4 cặp mồi ISSR .......................................................................................... 95
Bảng 4.31: Kết quả BLAST đoạn gene ITS các mẫu lá hoa huệ trên cơ sở dữ
liệu của ngân hàng gene NCBI6 ....................................................................... 99
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

xiii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH

Trang
Hình 2.1: Hoa huệ đơn (trái) và kép (phải)........................................................ 6
Hình 2.3: Đỉnh sinh trƣởng thực vật1............................................................... 14
Hình 3.1: Giống hoa huệ đơn và kép đang canh tác ở tỉnh An Giang ............. 32
Hình 3.2: Quy trình thực hiện tạo dòng hoa huệ đột biến bằng phƣơng pháp
nuôi cấy in vitro và xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) ...................................... 34
Hình 3.3: Đỉnh sinh trƣởng cây hoa huệ .......................................................... 35
Hình 3.4: Môi trƣờng túi nylon đƣợc chuẩn bị trƣớc khi cấy mẫu .................. 36
Hình 3.5: Đĩa petri đƣợc cấy mẫu trƣớc khi xử lý tia gamma (60Co) .............. 37
Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng của giống/dòng hoa huệ đơn và
kép thế hệ M1 tại Cần thơ và Tiền Giang ........................................................ 43
Hình 4.1: Đỉnh sinh trƣởng phát triển sau 30 ngày nuôi cấy ........................... 47
Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo (a) và cụm chồi (b) ở giống hoa huệ đơn ..... 48
Hình 4.3: Đồ thị tƣơng quan và hồi quy để xác định LD50 của các liều chiếu xạ
khác nhau ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy ......................... 51
Hình 4.4: Các dạng cấu trúc bất thƣờng của cụm chồi giống/dòng hoa huệ đơn
ở các liều chiếu xạ khác nhau sau 150 ngày nuôi cấy ..................................... 54
Hình 4.5: Đồ thị tƣơng quan hồi quy để xác định LD50 của các liều chiếu xạ
khác nhau ở giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy ......................... 57
Hình 4.6: Các dạng cấu trúc bất thƣờng của cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép
ở các liều chiếu xạ khác nhau sau 150 ngày nuôi cấy ..................................... 61
Hình 4.7: Giai đoạn ra rễ giống hoa huệ đơn................................................... 62
Hình 4.8: Đƣờng kính củ ở giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 ............ 67
Hình 4.9: Chiều cao phát hoa của các giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1
.......................................................................................................................... 69
Hình 4.10: Các dạng lá bất thƣờng của các dòng hoa huệ đơn đã xử lý chiếu xạ
sau 60 ngày trồng ............................................................................................. 71
Hình 4.11: Các dạng thân và củ bất thƣờng ở các giống/dòng hoa huệ đơn sau
60 ngày trồng ................................................................................................... 72
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

xiv

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 4.12: Các dòng hoa huệ đơn có số cánh hoa tăng khi ra hoa lần 1 ......... 73
Hình 4.13: Các dạng hoa huệ đơn với số cánh hoa tăng khi ra hoa lần 1........ 74
Hình 4.14: Số củ của các giống/dòng hoa huệ kép khi trồng lần 1 ................ 78
Hình 4.15: Chiều cao phát hoa của các giống/dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần
1........................................................................................................................ 80
Hình 4.16: Các dạng lá bất thƣờng của các dòng hoa huệ kép sau 60 ngày
trồng ................................................................................................................. 82
Hình 4.17: Các dạng thân và củ bất thƣờng của các dòng hoa huệ kép sau 60
ngày trồng ........................................................................................................ 83
Hình 4.18: Các bất thƣờng về hình thái hoa ở các giống/dòng hoa huệ kép khi
ra hoa lần 1 ....................................................................................................... 87
Hình 4.19: Dạng hoa bất thƣờng với hoa nở và có mùi thơm ở các giống/dòng
hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 ............................................................................ 87
Hình 4.20: Hình thái cánh hoa các dạng hoa bất thƣờng với số cánh hoa nhiều
hơn 12 cánh và có mùi thơm............................................................................ 88
Hình 4.21: Các dạng hoa bất thƣờng trên cùng một phát hoa ở các dòng hoa
huệ kép khi ra hoa lần 1 ................................................................................... 89
Hình 4.22: Các giống hoa huệ địa phƣơng và dòng hoa huệ đột biến chọn đƣợc
khi trồng lần 2 .................................................................................................. 92
Hình 4.23: Phổ điện di sản phẩm PCR của các dòng hoa huệ đột biến và giống

gốc với một số mồi ISSR ................................................................................. 94
Hình 4.24: Sơ đồ hình nhánh về mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gen hoa
huệ dựa trên dữ liệu ISSR ................................................................................ 96
Hình 4.25: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 ...................... 96
Hình 4.26: So sánh các trình tự nucleotide của vùng ITS trên các giống/dòng
hoa huệ chọn đƣợc ......................................................................................... 100
Hình 5.1: Quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến bằng tia gamma (60Co) trong
điều kiện in vitro ............................................................................................ 102

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

xv

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
60

Co

Cobalt 60

ADN (Acid deoxyribo nucleic)

Axít Đêôxiribônuclêic

BA

Benzyl adenine

BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool)

Công cụ tìm kiếm trình tự cơ bản

BM (Base medium)

Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản

ĐC

Đối chứng

Df

Bậc tự do df

EMS

Ethyl methane sulphonate

F

Giá trị thống kê F

GA3

Gibberellic acid

GR50 (50% growth reduction)

Sự giảm sinh trƣởng 50%

Gy

Đơn vị phóng xạ Gray

HĐ

Giống hoa huệ đơn

HK

Giống hoa huệ kép

IAA

Indole -3-acetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

in vitro

Trong ống nghiệm

in vivo

Quá trình diễn ra trong cơ thể sống

ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa

ITS (Internal Transcribed Spacer)

Kỹ thuật phân tích vùng đệm trong đƣợc
sao mã

LD50 (Median lethal dose)

Liều gây chết 50%

M0

Cá thể đột biến từ vật liệu đƣợc chiếu xạ

M1

Cây con sống ở thế hệ đột biến đầu tiên

M2

Cây đột biến ở thế hệ đột biến thứ 2

MS

Murashige & Skoog,1962

NAA

1-Naphthaleneacetic acid

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

xvi

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

NCBI (National Center for
Biotechnology Information)

Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh
học Quốc gia, Mỹ

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng chuỗi trùng hợp

RFLP (Restriction fragment length
polymorphism)

Kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều
dài của các phân đoạn DNA dựa trên
điểm cắt các enzym giới hạn

rRNA

RNA ribosome

Sig. (Significance)

Mức ý nghĩa

TB bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

M1VĐ

Giống hoa huệ đơn trồng ngoài đồng lần 1

M2VĐ

Giống hoa huệ đơn trồng ngoài đồng lần 2

M1VK

Giống hoa huệ kép trồng ngoài đồng lần 1

M2VK

Giống hoa huệ kép trồng ngoài đồng lần 2

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

xvii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề
Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là một trong những cây hoa cắt cành
phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây hoa huệ là loại cây
trồng mang lại thu nhập cao hơn so với lúa hoặc các cây trồng khác. Vì vậy, cây
hoa huệ đã đƣợc đƣa vào chƣơng trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng và đƣợc xem
là cây trồng xóa đói giảm nghèo ở các tỉnh nhƣ Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ
và An Giang. Hiện nay, chỉ có hai giống hoa huệ với một tràng hoa gồm 6 cánh
hoặc với hai tràng hoa gồm 12 cánh đƣợc canh tác chủ yếu ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long.
Tuy nhiên, việc nhân giống hoa huệ chủ yếu bằng củ qua nhiều thế hệ dẫn
đến giống bị thoái hóa nghiêm trọng, dễ bị sâu bệnh tấn công và làm giảm năng

suất đáng kể. Do đó, nhu cầu về giống mới để thay thế đang rất cần thiết. Mặt
khác, việc lai tạo giống mới ở cây hoa huệ theo kiểu truyền thống gặp phải một
số hạn chế do tính bất tƣơng hợp cao vì hoa có nhụy và nhị chín không cùng lúc
và hạt không tạo đƣợc trong điều kiện tự nhiên (Estrada-Basaldua et al., 2011).
Hơn nữa, chỉ có giống hoa đơn thì tạo đƣợc hạt nhƣng hạt khó nẩy mầm. Có lẽ
tạo đột biến là cách tốt nhất trong việc tạo giống hoa huệ mới. Trong các tác nhân
đột biến vật lý, tia gamma đƣợc sử dụng rộng rãi và có hiệu quả nhất (Matsumara
et al., 2010). Kỹ thuật này làm tăng biến dị di truyền ở một số loài hoa nhƣ sự
thay đổi về màu sắc, hình dạng, đặc tính sinh trƣởng… của hoa (Xu et al., 2012).
Bên cạnh đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần đƣợc áp dụng để tăng số mẫu đƣợc
chiếu xạ. Sự nhân giống cây hoa huệ in vitro đã đƣợc nghiên cứu (Huỳnh Thị
Huế Trang và ctv., 2007; Hutchinson et al., 2004). Trong đó, nuôi cấy đỉnh sinh
trƣởng và chiếu xạ là phƣơng pháp hiệu quả để làm cây sạch bệnh, nhân nhanh
và có đƣợc biến dị. Sự kết hợp này đƣợc áp dụng thành công trên cọ, táo, khoai
tây, khoai lang và khóm (Ulukapi and Nasircilar, 2015) và hoàn toàn có thể áp
dụng trong việc chọn tạo giống hoa huệ.
Mặt khác, cánh hoa có vai trò quan trọng trong sự nở hoa, sự thụ phấn và
giao phấn… Đối với cây hoa kiểng, số lƣợng cánh hoa có liên quan lớn đến kiểu
hình hoa. Khi xử lý tia gamma riêng lẻ và nuôi cấy in vitro kết hợp xử lý tia
gamma đã làm thay đổi số lƣợng cánh hoa hồng, sự gia tăng số lƣợng cánh hoa
cúc (Usenbaevard and Imankulova, 1974; Kahrizi et al., 2012; Nagatomi, 2001).
Do đó, ở hoa huệ khả năng gây đột biến tạo nguồn biến dị mới về đặc điểm tăng
số lƣợng cánh hoa rất cao khi nuôi cấy in vitro và xử lý tia gamma. Cho đến nay,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

ở Việt Nam, chƣa có giống hoa huệ mới với nhiều cánh hoa đƣợc tạo ra theo
phƣơng pháp truyền thống cũng nhƣ các phƣơng pháp chọn giống bằng kỹ thuật
công nghệ sinh học hiện đại khác. Nhƣ vậy, cần thiết phải thực hiện nghiên cứu
“Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co)
trong điều kiện in vitro”.
1.2 Mục tiêu
1.2.1 Mục tiêu chính
Chọn đƣợc giống hoa huệ có số lƣợng cánh hoa nhiều hơn giống làm vật
liệu nghiên cứu, có kích thƣớc hoa to hơn và có hƣơng thơm.
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
(1) Đánh giá kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để tạo nguồn vật liệu mô
sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co).
(2) Xác định liều gây chết 50% (LD50) của tia gamma (60Co) trên mô sẹo và
cụm chồi hoa huệ sau 150 ngày nuôi cấy.
(3) Xác định các dạng bất thƣờng về kiểu hình của cây giai đoạn thuần
dƣỡng.
(4) Chọn đƣợc một đến hai dòng hoa huệ tăng về số lƣợng cánh hoa (nhiều
hơn 12 cánh), kích thƣớc hoa to hơn và có mùi thơm theo phƣơng pháp nhân
giống truyền thống.
1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu
- Hai giống hoa huệ đang đƣợc canh tác ở tỉnh An Giang.
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu
- Số giống nghiên cứu: giống hoa huệ đơn và kép.
- Thời gian nghiên cứu: Tháng 10 năm 2013 đến tháng 8 năm 2017.
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học
- Nghiên cứu đã kết hợp kỹ thuật nuôi cấy in vitro và xử lý chiếu xạ bằng
tia gamma (60Co). Cụ thể, đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để tạo
vật liệu khởi đầu cho quy trình chọn giống. Về mặt lý thuyết, nuôi cấy đỉnh sinh
trƣởng tạo đƣợc nguồn mẫu sạch bệnh.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

- Cung cấp số liệu về đặc điểm sinh trƣởng; xác định đƣợc liều gây chết
50% của tia gamma (60Co) và các dạng bất thƣờng về hình thái của lá trên cụm
mô sẹo (giống hoa huệ đơn) và cụm chồi (giống hoa huệ kép) giai đoạn in vitro.
- Cung cấp số liệu nông học về đặc điểm sinh trƣởng, ra hoa, các dạng bất
thƣờng về lá, thân, củ, hoa và mùi thơm của hoa giai đoạn thuần dƣỡng và ngoài
đồng.
- Bên cạnh đó, nghiên cứu đã đánh giá sự đa dạng về mặt di truyền bằng
một số kỹ thuật ADN nhƣ PCR-ISSR và giải trình tự đoạn gen vùng ITS1/4 của 2
dòng hoa huệ đột biến chọn đƣợc và 2 giống hoa huệ đối chứng.
- Kết quả của Luận án là tài liệu khoa học để tham khảo cho công tác
nghiên cứu và giảng dạy ở các Trƣờng đại học và Viện nghiên cứu.
1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng đã tạo ra một lƣợng lớn

mẫu cấy sạch bệnh làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu. Phƣơng pháp này ít tốn
kém hơn phƣơng pháp xử lý bằng củ.
- Xác định liều gây chết 50% cũng nhƣ quy trình chọn tạo giống hoa huệ rất
cần thiết cho các nghiên cứu sau này.
- Các kết quả của luận án góp phần cải tiến gen và đa dạng nguồn gen hoa
huệ; đã tạo đƣợc nhiều dòng hoa huệ có đặc tính nổi trội, trong đó chọn đƣợc 2
dòng hoa huệ đột biến có các đặc tính hình thái khác biệt và có ƣu điểm hơn so
với 2 giống ban đầu nhƣ hoa to, nhiều cánh (22 và 36 cánh) và có hƣơng thơm.
1.5. Điểm mới của luận án
- Luận án chọn cây hoa huệ là cây hoa có giá trị kinh tế cao nhƣng chƣa
đƣợc nghiên cứu trong việc tạo giống mới ở Việt Nam. Luận án đã sử dụng kỹ
thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để làm vật liệu khởi đầu để xử lý chiếu xạ bằng
tia gamma (60Co); xác định đƣợc liều gây chết 50% (LD50) của tia gamma (60Co)
trên mẫu mô sẹo giống hoa huệ đơn và cụm chồi giống hoa huệ kép trong điều
kiện in vitro.
- Ở hai giống/dòng hoa huệ, xác định các dạng bất thƣờng về hình thái lá và
chồi sau 150 ngày nuôi cấy in vitro; xác định các dạng bất thƣờng về hình thái lá,
thân và củ sau 60 ngày trồng ngoài đồng; xác định đặc điểm sinh trƣởng cũng
nhƣ các dạng bất thƣờng về hình thái hoa và mùi thơm giai đoạn sau 180 ngày
trồng ngoài đồng.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

- Chọn đƣợc 2 dòng hoa huệ đột biến có đặc tính khác so với giống ban đầu
nhƣ tăng số cánh hoa lên 22 và 36 cánh, kích thƣớc hoa to và hoa có mùi thơm
sau 2 thế hệ trồng ngoài đồng.
- Đánh giá đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp PCR-ISSR để chứng minh
sự khác biệt về gen giữa hai dòng hoa huệ đột biến so với hai giống hoa huệ đối
chứng, cụ thể là có sự xuất hiện hoặc mất đi băng ADN; tiếp tục giải trình tự gen
để so sánh trình tự ADN vùng ITS1/4 các dòng/giống hoa huệ này để thấy đƣợc
các dạng đột biến nhƣ thay thế, mất hoặc thêm một/một đoạn nucleotide.
- Luận án đã xây dựng đƣợc quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến bằng tia
gamma (60Co) trong điều kiện in vitro.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây hoa huệ
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật cây hoa huệ
Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) có nguồn gốc từ Mexico, đƣợc trồng
phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, thuộc lớp phụ Lilidae, bộ Liliales và

họ Agavaceae với bộ nhiễm sắc thể 2n = 30. Tổng cộng gồm 12 loài và có 9 loài
với đặc điểm hoa màu trắng (Khandagale et al., 2014; Rodrigo et al., 2012;
Mohammadi et al., 2012).
2.1.2 Đặc điểm thực vật cây hoa huệ
Cây hoa huệ là loài đơn tử diệp, thân thảo, rễ chùm, ƣa sáng, ƣa nhiệt và nở
hoa quanh năm (Sangavai and Chellapandi, 2008; Ahmad et al., 2013). Loại hoa
này còn đƣợc gọi là dạ lai hƣơng (thơm ban đêm) hoặc vũ lai hƣơng (thơm lúc
mƣa) do đặc điểm hoa nở về đêm, có khả năng tỏa hƣơng về ban đêm với mùi
hƣơng ngào ngạt.
* Thân: Hoa huệ thuộc cây thân thảo sống nhiều năm. Thân hành hay còn
gọi là thân giả đƣợc kết bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trƣớc phủ lên bẹ
lá sau. Thân thẳng không phân nhánh, gốc mọc lá thành chùm. Cây hoa huệ có
thân thẳng đứng, tròn, màu xanh thẫm, yếu, không phân nhánh vƣơn lên thành
một ngồng hoa (Đặng Phƣơng Trâm, 2005).
* Củ và rễ: Cây hoa huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu
ở lớp đất mặt 1,0-15,0 cm. Có hai loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu là rễ sơ cấp và
rễ mọc từ củ con gọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây,
củ hình tròn dài giống cây tỏi. Củ giữ chức năng dự trữ các chất dinh dƣỡng để
nuôi cây (Trần Văn Mão, 2006).
* Lá: Cây hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá gốc
rộng và to thành hình để bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ
ràng. Lá dài, không có răng cƣa, mọc lệch. Chiều dài lá khoảng 20,0-30,0 cm, bề
rộng của lá từ 0,5-1,0 cm (Sangavai and Chellapandi, 2008).
* Hoa: Cây hoa huệ ra hoa không chịu ảnh hƣởng bởi quang kỳ. Sự tạo
mầm hoa và hình thành phát hoa cần nhiệt độ cao sau khi củ đạt đúng kích cỡ.
Nhìn chung, có mối tƣơng quan tuyến tính cao giữa thời gian ra hoa và số lá ở
cây hoa huệ (Rodrigo et al., 2012). Cây hoa huệ cho hoa quanh năm, nhƣng hoa

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017

Trường Đại học Cần Thơ

nở chủ yếu vào mùa hè, còn mùa đông tỷ lệ ra hoa ít, hoa nhỏ và bông ngắn hơn
(Trần Văn Mão, 2006).
Phát hoa huệ thẳng và hoa mọc ở đỉnh có màu trắng, bao hoa hình phễu,
hoa có vị ngọt, hơi chát, thơm, không độc… Mặc dù hoa hoàn toàn màu trắng
nhƣng những nụ hoa có thể có màu hồng nhạt khi đƣợc trồng dƣới điều kiện lạnh
(Solano, 2000). Phát hoa huệ thƣờng dài, ở nách mỗi lá có 2 hoa màu trắng, có
tràng hoa đơn hoặc kép, nhị ở giữa. Một nhánh hoa huệ dài 100 cm có thể cho
20-25 hoa màu trắng, nở từ dƣới lên. Trong canh tác còn gặp một số biến dị hoa
nhiều tràng, đài hoa màu tím nhạt, hƣơng vị nhạt hơn, nhƣng nhiều hoa, mỗi cây
có 24-32 bông, cây cao và to hơn (Cuc and Pilon, 2007; Trần Văn Mão, 2006;
Jitendriya and Mohammad, 2013). Cùng với mùi hƣơng thì phát hoa dài cũng đã
góp phần tạo nên giá trị của hoa huệ trên thị trƣờng hoa cắt cành (Benschop,
1993). Phát hoa huệ đơn có 10-20 cặp hoa. Hoa thƣơng phẩm dài từ 60,0-90,0
cm, đƣợc thu hoạch khi 2 hoặc 3 hoa ở dƣới cùng nở và chỉ có khoảng 50,0% hoa
trên phát hoa nở sau khi thu hoạch (Kimani et al., 2001) (Hình 2.1).

Hình 2.1: Hoa huệ đơn (trái) và kép (phải)
(Nguồn: Kainthura and Srivastava, 2015)
Ở hoa huệ, thƣờng có sự lẫn lộn về tên gọi. Chẳng hạn, nhiều giống ở các
vùng địa lý khác nhau vẫn đƣợc gọi chung là huệ đơn hoặc kép mặc dù trong
dạng hoa đơn sẽ có nhiều giống và hoa kép cũng có nhiều giống (Kameswari et

al., 2014; Khandagale et al., 2014). Có giả thuyết cho rằng dạng hoa đơn và kép
có thể tiến hóa từ kiểu gen khác nhau và cả hai đều duy trì đặc điểm nhận dạng
riêng (Bharti et al., 2012).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học