Nghiên cứu sản xuất Oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------

VŨ THỊ HOAN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG
TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN
LIỆU SAU THU HOẠCH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

KHÁNH HÒA - 2018


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................xii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................xvii
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................... xix
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN ..................... 3
1.1.1. Giới thiệu về chitin, chitosan và oligochitosan........................................................... 3
1.1.1.1. Chitin và chitosan .................................................................................................... 3
1.1.1.2. Oligochitosan ........................................................................................................... 5
1.1.2. Phương pháp sản xuất chitin và chitosan.................................................................... 6
1.1.3. Phương pháp sản xuất oligochitosan ........................................................................ 19
1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN .............................................. 30
1.3. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ BIẾN ĐỔI VÀ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN TÔM SAU THU
HOẠCH.......................................................................................................................................... 32

1.3.1. Cơ sở lý thuyết về biến đổi của tôm sau thu hoạch .................................................. 32
1.3.2. Phương pháp bảo quản tôm sau thu hoạch ............................................................... 34
1.4. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT BỨC XẠ ............................................................................... 37
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 39
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................................................ 39
2.1.1. Đầu vỏ tôm dùng sản xuất oligochitosan .................................................................. 39
2.1.2. Tôm bạc biển ............................................................................................................ 39
2.1.3. Enzyme protease ....................................................................................................... 39
2.1.4. Nguyên vật liệu để xác định độc chất học ................................................................ 39
2.1.5. Giống vi khuẩn ......................................................................................................... 40
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 40
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................................. 40
2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa học ......................................................................... 46
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease ...................................................... 48
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn ........................................................................... 48
2.2.4.1. Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic........................................................... 48


2.2.4.2. Phương pháp phân tích vi sinh vật........................................................................ 49
2.2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan.................. 49
2.2.5. Phương pháp xác định độc chất học ......................................................................... 50
2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ............ 51
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................... 52
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 53
3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA PHẾ LIỆU ĐẦU VỎ TÔM ...... 53
3.2. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ TẠP
CHẤT Ở ĐẦU VỎ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TRONG SẢN XUẤT CHITIN .................... 53
3.2.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ
DỤNG ENZYME PROTEASE ..................................................................................................... 53
3.2.1.1. Nghiên cứu lựa chọn enzyme protease .................................................................. 53

3.2.1.2. Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng và khử khoáng
bằng HCl loãng ................................................................................................................... 60
3.2.1.3. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme
flavourzyme khử protein..................................................................................................... 63
3.2.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ
DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ CÁC TẠP CHẤT ................................ 65
3.2.2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp ............................................................. 65
3.2.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic
L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất ................................................ 70
3.2.2.3. Nghiên cứu khử protein còn lại ở bán chế phẩm chitin bằng enzyme flavourzyme ... 80
3.2.2.4. Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl ......................................... 82
3.2.2.5. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn
lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất ...................................... 84
3.2.2.6. Đánh giá chất lượng chitin sản xuất theo quy trình sử vi khuẩn lactic để khử
proteinvà các tạp chất ......................................................................................................... 86
3.3. NGHIÊN CỨU DEACETYL CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ
DEACETYL CAO ......................................................................................................... 88
3.3.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NAOH THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH DEACETYL CHITIN. 88
3.3.2. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN DEACETYL .............................................................................. 89
3.3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO ............ 93


3.4. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM OLIGOCHITOSAN BẰNG KỸ THUẬT
BỨC XẠ COBAN 60 .................................................................................................... 97
3.4.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ HÒA TAN CỦA CHITOSAN TRONG DUNG DỊCH ACID ............... 97
3.4.2. XÁC ĐỊNH LIỀU XẠ THÍCH HỢP CHO VIỆC CẮT MẠCH CHITOSAN TẠO
OLIGOCHITOSAN ....................................................................................................................... 99
3.4.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITOSAN SAU KHI CHIẾU XẠ ................................ 102
3.4.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
CHIẾU XẠ SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA CO-60 .................................................................. 103

3.4.5. NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA
OLIGOCHITOSAN SẢN XUẤT BẰNG CÁCH SỬ DỤNG BỨC XẠ ĐỂ PHÂN CẮT
CHITOSAN ................................................................................................................................. 105
3.4.5.1. Đánh giá thành phần các phân đoạn của chế phẩm chiếu xạ chitosan ................ 105
3.4.5.2. Sử dụng phổ FTIR để đánh giá cấu trúc của sản phẩm sau chiếu xạ chitosan ............. 106
3.4.5.3. Xác định khối lượng phân tử và cấu trúc của oligochitosan................................ 109
3.4.6. NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA OLIGOCHITOSAN 114
3.4.6.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp MIC... 114
3.4.6.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp
nuôi cấy trên đĩa thạch ...................................................................................................... 115
3.4.7. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH HOÀN THIỆN SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA COBAN 60................................................. 116
3.4.8. THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN CHUỘT LANG
THÍ NGHIỆM ........................................................................................................................... 117
3.5. SỬ DỤNG OLIGOCHITOSAN TRONG BẢO QUẢN TÔM BẠC NGUYÊN LIỆU ..... 125
3.5.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ OLIGOCHITOSAN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH BẢO
QUẢN TÔM ................................................................................................................................ 125
3.5.2. XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU BẰNG OLIGOCHITOSAN 129
3.5.2.1. Xác định thời gian nhúng tôm nguyên liệu bằng dung dịch oligochitosan ......... 129
3.5.2.2. Xác định chế độ bao gói thích hợp để bảo quản tôm bạc bằng oligochitosan ..... 134
3.5.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BẢO QUẢN TÔM BẰNG OLIGOCHITOSAN .................... 140
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN.......................................................................... 142
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 145


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan ........................................................4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của oligochitosan ...............................................................6
Hình 1.3. Phương trình phản ứng deacetyl chitin..........................................................13
Hình 1.4. Quy trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học.................16

Hình 1.5. Sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp sinh học ...............................17
Hình 1.6. Một số phương pháp tạo oligochitosan từ chitosan .......................................20
Hình 1.7. Quy trình sản xuất oligochitosan theo phương pháp hóa học .......................22
Hình 1.8. Sơ đồ thủy phân chitin và chitosan bằng enzyme .........................................23
Hình 1.9. Quá trình biến đổi của chitosan khi chiếu xạ ................................................26
Hình 1.10. Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl ..........................................26
Hình 1.11. Sự suy giảm khối lượng phân tử của chitosan được chiếu xạ tia gamma Co60 theo liều xạ................................................................................................................27
Hình 1.12. Cơ chế hình thành biến đen của tôm ...........................................................33
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ...........................................................................41
Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khử protein và tạp chất ở đầu vỏ tôm bằng enzyme protease .42
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm khử protein bằng lên men vi khuẩn lactic .........................43
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm so sánh khả năng khử protein............................................43
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm deacetyl chitin để thu nhận chitosan .................................44
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp sử dụng
bức xạ Co -60 ................................................................................................................45
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm bảo quản tôm nguyên liệu .................................................45
Hình 2.8. Quy trình hoạt hóa vi khuẩn lactic ................................................................ 48
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sử dụng
enzyme flavourzyme......................................................................................................63
Hình 3.2. Bán chế phẩm chitin sau khi khử protein bằng enzyme flavourzyme ..........65
Hình 3.3. Sản phẩm chitin sản xuất bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme ....65
Hình 3.4. Sự thay đổi độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn theo thời gian......................66
Hình 3.5. Dịch vi khuẩn L. plantarum sau 28 h nuôi cấy .............................................66
xii


Hình 3.6. Khuẩn lạc vi khuẩn L. plantarum mọc trên đĩa thạch ...................................66
Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch sinh khối vi khuẩn đến hàm lượng protein còn lại ở
đầu vỏ tôm .....................................................................................................................67
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm .....68

Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm .........69
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 bổ sung đến
hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm .................................................................71
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu
vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431........................................................72
Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường tới hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ
tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 .............................................................73
Hình 3.13. Ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường bổ sung đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu
vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431........................................................75
Hình 3.14. Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ dịch vi
khuẩn đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum .......................................78
Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ dịch vi khuẩn đến hiệu quả khử protein
bằng vi khuẩn L. plantarum...........................................................................................78
Hình 3.16. Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên
men đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum ..........................................79
Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên men đến hiệu quả khử protein
bằng vi khuẩn L. plantarum...........................................................................................79
Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme flavourzyme bổ sung đến hàm lượng protein
còn lại ở chitin thô .........................................................................................................81
Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian khử protein bằng enzyme flavourzyme đến hàm
lượng protein còn lại ở chitin thô ..................................................................................82
Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hàm lượng khoáng còn lại ở chế phẩm chitin ......83
Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl ...84
Hình 3.22. Quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn
lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất .................................85
Hình 3.23. Chitin sản xuất theo quy trình khử protein chỉ bằng enzyme flavourzyme ...87
xiii


Hình 3.24. Chitin sản xuất theo quy trình khử protein và tạp chất bằng vi khuẩn lactic ........87

Hình 3.25. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl của chitosan ....................88
Hình 3.26. Ảnh hưởng của thời gian xử lý NaOH đến độ deacetyl của chitosan .........89
Hình 3.27. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH
50% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................90
Hình 3.28. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH
45% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................90
Hình 3.29. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH
40% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................91
Hình 3.30. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH
35% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................91
Hình 3.31. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH
30% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường............................................................................92
Hình 3.32. Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin trong 120 giờ
bằng NaOH ở các nồng độ: a: NaOH 50%; b: NaOH 45%; c: NaOH 40%; d: NaOH
35%; e: NaOH 30% .......................................................................................................92
Hình 3.33. Phổ 1H-NMR chế phẩm chitosan thu được khi xử lý bằng NaOH nồng độ
50% trong 120 giờ .........................................................................................................93
Hình 3.34. Quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90% từ đầu vỏ tôm ..........94
Hình 3.35. Ảnh hưởng của các acid và nồng độ acid đến khả năng hòa tan của chitosan .......97
Hình 3.36. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng hòa tan của chitosan trong
dung dịch CH3COOH 1% ..............................................................................................98
Hình 3.37. Ảnh hưởng của liều xạ đến độ nhớt của dung dịch chế phẩm sau chiếu xạ
(chitosan dạng vẩy) ........................................................................................................99
Hình 3.38. Ảnh hưởng của liều xạ đến độ nhớt dung dịch chế phẩm sau chiếu xạ
(chitosan dạng dung dịch) .............................................................................................99
Hình 3.39. Ảnh hưởng của liều xạ đến khối lượng phân tử chế phẩm sau chiếu xạ
(chitosan dạng vẩy) ......................................................................................................100
Hình 3.40. Ảnh hưởng của liều xạ đến khối lượng phân tử chế phẩm sau chiếu xạ
(chitosan dạng dung dịch) ...........................................................................................100
xiv

Hình 3.41. Hình ảnh về các phân đoạn oligochitosan với liều chiếu 50 kGy .............103
Hình 3.42. Quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60...104
Hình 3.43. Phổ FTIR của chitosan ..............................................................................106
Hình 3.44. Phổ FTIR của oligochitosan phân đoạn 1 .................................................107
Hình 3.45. Phổ FTIR của oligochitosan phân đoạn 3 .................................................107
Hình 3.46. Phổ 1H-NMR chế phẩm oligochitosan phân đoạn 2..................................111
Hình 3.47. Phổ 13C-NMR ............................................................................................112
Hình 3.48. Phổ HSQC .................................................................................................112
Hình 3.49. Phổ COSY .................................................................................................113
Hình 3.50. Cấu trúc hóa học của oligochitosan ...........................................................113
Hình 3.51. Một số hình ảnh về khả năng ức chế vi khuẩn của oligochitosan .............116
Hình 3.52. Quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60...117
Hình 3.53. Trọng lượng tươi trung bình của gan, lách, thận (chuột lang nhóm I) ......123
Hình 3.54. Trọng lượng tươi trung bình của gan, lách, thận (chuột lang nhóm II) ....123
Hình 3.55. Hình ảnh vi thể của gan, lách, thận chuột lang uống oligochitosan ..........124
Hình 3.56. Hình ảnh dạ dày chuột đối chứng (Bên ngoài bình thường, bên trong bình thường) ....124
Hình 3.57. Hình ảnh dạ dày chuột uống oligochitosan (Bên ngoài bình thường, bên trong
bình thường) ................................................................................................................124
Hình 3.58. Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến chất lượng cảm quan của tôm .........126
Hình 3.59. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch oligochitosan đến hàm lượng NH3 trong
tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh ............................................................127
Hình 3.60. Sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng của tôm nguyên liệu được xử lý
bằng oligochitosan ở các nồng độ, sau 6 ngày bảo quản.............................................128
Hình 3.61. Sự biến đổi pH của tôm được xử lý bằng oligochitosan ở các nồng độ, sau 6
ngày bảo quản ..............................................................................................................129
Hình 3.62. Ảnh hưởng của thời gian nhúng đến chất lượng cảm quan tôm bảo quản bằng
oligochitosan 1% .........................................................................................................130
Hình 3.63. Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi hàm lượng

NH3 của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0-4oC.........................................131

xv


Hình 3.64. Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi hoạt tính chống
oxy hóa của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0 – 4oC ................................133
Hình 3.65. Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi pH của tôm
nguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0 – 4oC............................................................134
Hình 3.66. Ảnh hưởng của chế độ bao gói đến các tổng điểm cảm quan chung của tôm
nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh ....................................................................135
Hình 3.67. Ảnh hưởng của chế độ bao gói đến sự biến đổi hàm lượng NH3 của tôm
nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh ....................................................................136
Hình 3.68. Ảnh hưởng của chế độ bao gói đến sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa của
tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh ............................................................137
Hình 3.69. Ảnh hưởng chế độ bao gói đến sự biến đổi pH của tôm theo thời gian bảo
quản ở 0 – 4oC .............................................................................................................138
Hình 3.70. Sự thay đổi tổng số vi sinh vật hiếu khí trên tôm sau 6 ngày bảo quản nếu
bảo quản có và không có oligochitosan bề mặt ...........................................................140
Hình 3.71. Sơ đồ quy trình bảo quản tôm nguyên liệu bằng oligochitosan ................141

xvi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lượng chitin và canxi carbonat trong một số loại tôm............................3
Bảng 1.2. Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguồn phế liệu tôm ..7
Bảng 1.3. Các điều kiện để khử khoáng trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm ..10
Bảng 1.4. Điều kiện tẩy màu chitin từ phế liệu tôm thẻ ................................................12
Bảng 1.5. Điều kiện deacetyl thường dùng đối với chitin từ phế liệu tôm ..................14

Bảng 2.1. Thiết kế nghiên cứu độc tính của oligochitosan ...........................................50
Bảng 2.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính ..............................51
Bảng 3.1. Thành phần hoá học cơ bản của phế liệu tôm thẻ .........................................53
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của enzyme và tỷ lệ enzyme đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm ..54
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của enzyme và pH đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm thẻ chân trắng 56
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của enzyme và nhiệt độ đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm .57
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của enzyme và thời gian đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm 59
Bảng 3.6. Chất lượng của chitinsản xuất theo quy trình sử dụng enzyme protease để khử protein ...60
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian xử lý đến hàm lượng protein còn
lại ở đầu vỏ tôm .............................................................................................................61
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ acid HCl và thời gian xử lý đến hàm lượng khoáng
còn lại ở đầu vỏ tôm ......................................................................................................62
Bảng 3.9. Chất lượng cơ bản của chitin thu được theo quy trình kết hợp sử dụng enzyme
flavourzyme ...................................................................................................................64
Bảng 3.10. Quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố theo mô hình Box - Behnken .................75
Bảng 3.11. Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của quá trình lên
men khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B431 .........................................76
Bảng 3.12. Quy hoạch thực nghiệm với biến thật của quá trình lên men khử protein đầu
vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum ..............................................................................77
Bảng 3.13. Tiên đoán một số thí nghiệm tối ưu cho quá trình lên men ........................79
Bảng 3.14. Kết quả tối ưu theo tiên đoán và kết quả thực nghiệm kiểm chứng số liệu tối
ưu hóa ............................................................................................................................80
Bảng 3.15. So sánh chất lượng chitin sản xuất theo các quy trình đã nghiên cứu và quy
xvii


trình tham khảo ..............................................................................................................86
Bảng 3.16. So sánh đánh giá chất lượng chitosan sản xuất theo quy trình đã đề xuất và
quy trình tham khảo .......................................................................................................96
Bảng 3.17. Kết quả tách phân đoạn chế phẩm oligochitosan sau chiếu xạ .................102

Bảng 3.18. Kết quả tách phân đoạn chế phẩm chitosan sau chiếu xạ .........................105
Bảng 3.19. Đặc trưng nhóm chức của các mẫu chitin, chitosan và phân đoạn
oligochitosan ................................................................................................................108
Bảng 3.20. Kết quả xác định phổ sắc ký gel thấm qua (GPC) chế phẩm chitosan chiếu
xạ với liều xạ khác nhau ..............................................................................................109
Bảng 3.21. Kết quả xác định nồng độ pha loãng thấp nhất ức chế vi khuẩn phát triển.... 114
Bảng 3.22. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch ............................115
Bảng 3.23. Trọng lượng trung bình của chuột lang nhóm I (đánh giá độc tính cấp) ..118
Bảng 3.24. Trọng lượng trung bình của chuột lang nhóm II (giai đoạn hồi phục) .....118
Bảng 3.25. Kết quả sinh hóa nước tiểu của chuột lang nhóm I ...................................119
Bảng 3.26. Kết quả sinh hóa nước tiểu của chuột lang nhóm II .................................120
Bảng 3.27. Kết quả sinh hóa huyết học của chuột lang nhóm I ..................................121
Bảng 3.28. Kết quả sinh hóa huyết học của chuột lang nhóm II .................................122

xviii


TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo
quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch
Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản
Mã số: 9540105
Nghiên cứu sinh: ThS. Vũ Thị Hoan
Khóa: 2011
Người hướng dẫn: GS. TS. Trần Thị Luyến
PGS. TS. Vũ Ngọc Bội
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang
Nội dung:
Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất
và ứng dụng oligichitosan:

1) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitin
bằng phương pháp sinh học sử dụng phối hợp giữa vi khuẩn lactic L. plantarum VTCCB 431 lên men khử protein, khoáng chất của đầu vỏ tôm thẻ và enzyme flavourzyme khử
protein còn lại ở vỏ đầu tôm: vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 nuôi hoạt hóa
trong 28 giờ và thu dịch sinh khối có mật độ tế bào 2.109 cfu/ml, tỷ lệ nước/nguyên liệu
là 1/1, tỷ lệ rỉ đường bổ sung 11,15% (w/w), tỷ lệ dịch vi khuẩn L. plantarum VTCC-B
431 bổ sung 11,20% (v/w), lên men ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 6,19 ngày với pH
ban đầu là 7,0; Sử dụng enzyme flavourzyme khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm thẻ chân
trắng sau lên men với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,06%, nhiệt độ thủy phân 50oC ở pH 7,5,
trong thời gian 8h. Sử dụng acid HCl 3% khử khoáng còn lại ở chitin thô với tỷ lệ dung
dịch acid/chitin thô: 2/1. Quá trình khử khoáng còn lại thực hiện ở nhiệt độ phòng trong
thời gian 10h. Chitin sản xuất có chi phí nguyên vật liệu là 111.000 đồng/kg.
Quy trình sản xuất này giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng nên giảm nguy cơ gây ô
nhiễm môi trường. Mặt khác sản phẩm phụ: protein, astaxanthin,.. tách ra từ quá trình
lên men đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B431 hoàn toàn có thể sử dụng
làm thức ăn chăn nuôi. Do vậy, quy trình sản xuất này vừa có ý nghĩa khoa học và vừa có

xix


ý nghĩa thực tiễn lớn trong bảo vệ môi trường đồng thời tạo ra sản phẩm chitin theo sản
xuất theo phương pháp sinh học “xanh” và “sạch” hơn.
2) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan
có độ deacetyl trên 90%: deacetyl chitin bằng NaOH 50% ở nhiệt độ phòng trong thời
gian 120h và tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1. Chitosan sản xuất theo quy trình
có độ deacetyl trên 93% và có chi phí nguyên vật liệu là 361.365 đ/kg.
Đóng góp mới của kỹ thuật này ở chỗ quá trình deacetyl chitin thành chitosan
được tiến hành ở nhiệt độ phòng mà không sử dụng nhiệt độ cao như các phương pháp
khác. Vì thế về mặt công nghệ, quy trình sản xuất sẽ đơn giản và dễ thực hiện hơn. Do
vậy, công nghệ này có thể dễ dàng triển khai trong thực tế sản xuất ở quy mô lớn - đây
chính là điều các doanh nghiệp chế biến chitosan từ đầu vỏ tôm đang mong muốn.

3) Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng
cách sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy với cường độ
166kGy. Oligochitosan thu được sau khi chiếu xạ có 3 phân đoạn và có khả năng kháng
5 loại vi khuẩn: E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S. aureus, B. subtilis và
Listeria monocytogenes.
Việc sản xuất oligochitosan theo kỹ thuật sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân
cắt chitosan dạng vẩy có ưu điểm là sản phẩm sau phân cắt không cần phải kết tủa bằng
cồn, tinh sạch và sấy khô như các phương pháp phân cắt chitosan thành oligochitosan
bằng enzyme và hóa học. Mặt khác, sản phẩm oligochitosan lại có khả năng kháng 5
loại vi khuẩn và dễ bảo quản, vận chuyển. Do vậy về mặt công nghệ, phương pháp này
có tính khả thi cao và dễ dàng triển khai sản xuất đại trà chế phẩm oligochitosan.
4) Luận án đã xác định được cấu trúc phân tử của oligochitosan có 13 monomer.
5) Luận án đã tiến hành thử nghiệm độc tính của oligochitosan trên chuột thí
nghiệm và phân tích máu, nước tiểu, giải phẫu, cắt lát quan sát vi thể gan thận, lách
của chuột sử dụng oligochotosan cho thấy oligochitosan hoàn toàn an toàn và không
gây độc cho chuột qua con đường tiêu hóa cũng như không có bất cứ một ảnh hưởng
nào tới các nội quan của chuột.
Đây là nghiên cứu đầu tiên tiến hành thử nghiệm oligochitosan trên chuột thí
nghiệm. Việc thử nghiệm đã chứng minh rằng chế phẩm oligochitosan sản xuất theo kỹ
thuật phân cắt chitosan bằng bức xạ gamma coban 60 hoàn toàn an toàn với chuột thí

xx


nghiệm tức là an toàn với con người - đây chính là một hướng mới trong sản xuất và sử
dụng oligochitosan cho lĩnh vực thực phẩm và dược học.
6) Luận án đã nghiên cứu và xây dựng quy trình bảo quản tôm bạc biển bằng cách
nhúng chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% trong thời gian 1 phút. Tôm bạc nguyên
liệu sau xử lý oligochitosan 1% có thể bảo quản 6 ngày trong điều kiện mát mà vẫn đạt
tiêu chuẩn chất lượng dùng làm nguyên liệu chế biến.

Nghiên cứu này cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan trong bảo quản
thủy sản - nghiên cứu này nếu được triển khai trong thực tế sẽ góp hạn chế việc lạm
dụng hóa chất trong bảo quản nguyên liệu thủy sản.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

GS. TS. Trần Thị Luyến

NGHIÊN CỨU SINH

PGS. TS. Vũ Ngọc Bội

xxi

Vũ Thị Hoan


MỞ ĐẦU
Những năm qua, ngành thuỷ sản đã phát triển và vươn lên thành một trong những
ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước. Chiến lược phát triển xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam
phấn đấu đến năm 2020 đạt mức 10 tỷ USD, đưa Việt Nam trở thành một trong bốn
cường quốc hàng đầu về xuất khẩu thuỷ sản. Theo định hướng này, chính phủ Việt Nam
có chiến lược tăng cường đầu tư cho khai thác, bảo quản nguyên liệu thủy sản đánh bắt
xa bờ vừa góp phần phát triển kinh tế biển vừa giữ vững chủ quyền biển đảo. Hiện nay
việc bảo quản nhiều loại nguyên liệu thủy sản như cá, tôm, mực... sau thu hoạch còn
nhiều hạn chế. Theo quy định HACCP, để đảm bảo chất lượng, nguyên liệu thủy sản
cần được bảo quản bằng phương pháp ướp đá đủ để giữ nhiệt độ của nguyên liệu ≤ 4oC.
Tuy vậy, người dân thường không có đủ dụng cụ, thiết bị và các điều kiện để bảo quản
nguyên liệu thủy sản đúng cách nên thường có xu thế lạm dụng các loại kháng sinh và
các loại phụ gia độc hại như hàn the, urea... trong bảo quản nguyên liệu thủy sản gây
nên tình trạng nguyên liệu thủy sản chứa dư lượng các chất bảo quản và không bảo đảm

yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm. Một trong các hướng bảo quản nguyên liệu thủy sản
đang được các nhà nghiên cứu quan tâm là sử dụng các tác nhân sinh học có nguồn gốc
tự nhiên, không độc hại và có khả năng ức chế sự sinh trưởng phát triển của các vi sinh
vật gây hư hỏng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản.
Oligochitosan là tác nhân sinh học có nguồn gốc từ vỏ tôm, không độc hại và có
khả năng kháng khuẩn. Oligochitosan đã được các nhà nghiên cứu nhất là các nhà nghiên
cứu tại Trường Đại học Nha Trang quan tâm nghiên cứu sử dụng trong bảo quản các
loại nguyên liệu thủy sản. Theo hướng nghiên cứu này, dưới sự tài trợ của đề tài cấp nhà
nước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm
oligosaccharide (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu
thuỷ sản đánh bắt xa bờ” và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn khoa học, tôi thực
hiện luận án “Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm
nguyên liệu sau thu hoạch”.
Mục tiêu của chung của luận án
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng công
nghệ bức xạ Coban 60 và ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc biển.
Mục tiêu cụ thể
- Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease
để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm
1


giảm thiểu hóa chất sử dụng trong quá trình này.
- Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao bằng NaOH nồng độ cao trong điều kiện
nhiệt độ thường để dễ dàng triển khai sản xuất ở quy mô lớn.
- Sản xuất được oligochitosan bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và sử dụng
oligochitosan sản xuất được trong bảo quản tôm biển.
Nội dung của luận án
1) Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học để khử protein và các tạp chất có
trong đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng trong sản xuất chitin.

2) Nghiên cứu deacetyl chitin để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao.
3) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60.
4) Sử dụng oligochitosan trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu.
Ý nghĩa khoa học của luận án
Luận án nghiên cứu một cách đầy đủ từ quá trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm thẻ
chân trắng bằng phương pháp sinh học đến sản xuất chitosan có độ deacetyl cao ở nhiệt
độ thường và sản xuất oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật bức xạ
Coban 60. Điểm mới của luận án là lần đầu tiên luận án công bố sản xuất chitosan có độ
deacetyl cao ở nhiệt độ thường và luận án cũng lần đầu tiên sản xuất oligochitosan bằng
kỹ thuật sử dụng bức xạ coban 60 để phân cắt chitosan và ứng dụng oligochitosan thu
được trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu. Ngoài ra, luận án cũng lần đầu tiên nghiên
cứu đánh giá độc tính của oligochitosan sau chiếu xạ trên chuột thí nghiệm. Kết quả
nghiên cứu của luận án đã góp phần làm phong phú thêm các hiểu biết về việc ứng dụng
kỹ thuật bức xạ coban 60 trong sản xuất oligochitosan dùng làm phụ gia trong bảo quản
tôm nguyên liệu. Mặt khác kết quả nghiên cứu của luận án còn là tài liệu tham khảo cho
nghiên cứu sinh, học viên cao học và những ai quan tâm, nghiên cứu về lĩnh vực này.
Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Kết quả của luận án cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan sản xuất bằng
kỹ thuật bức xạ Coban 60 để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc. Kết quả
nghiên cứu của luận án có ý nghĩa thực tiễn cao, góp phần tham gia giải quyết tình trạng
lạm dụng hóa chất trong bảo quản nguyên liệu thủy sản, đảm bảo an toàn vệ sinh thực
phẩm đồng thời góp phần bảo vệ môi trường do sử dụng phương pháp sản xuất sinh học
để sản xuất chitin nên thân thiện với môi trường.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN
1.1.1. Giới thiệu về chitin, chitosan và oligochitosan

1.1.1.1. Chitin và chitosan
Chitin là loại polysaccharide đầu tiên được con người sản xuất từ nấm vào năm
1811, trước khi phát hiện ra cellulose khoảng 30 năm [37, 76]. Năm 1859, Giáo sư C.
Rouget lần đầu tiến hành xử lý chitin bằng kiềm đặc và thu được một chất mới không
giống như chitin, có khả năng hòa tan được trong acid, sau này được người ta gọi là
“chitosan”. Thuật ngữ “chitosan” lần đầu tiên được Hoppe Seiler công bố vào năm 1894
khi ông tiến hành deacetyl chitin thành “chitosan” [83]. Trong một thời gian dài sau đó,
mặc dù chitin vẫn là một polysaccharid tự nhiên, ít được sử dụng thì chitosan lại là một
polymer được nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính sinh học, khả năng dễ dàng thủy
phân thành các đơn chất của nó [35, 74, 75, 125].
Chitin có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng hiện nay
phế liệu vỏ tôm, cua, tôm hùm, nhuyễn thể, mực trong công nghiệp chế biến thủy sản
vẫn là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin [118]. Do quá trình chế biến tôm,
cua, tôm hùm, ... thường tạo ra một lượng lớn phế liệu, chiếm tới 45% trọng lượng của
giáp xác [71, 115, 134]. Hàng năm có khoảng hơn hai mươi triệu tấn phế thải từ thủy
sản thải ra môi trường, tương đương với khoảng 25% tổng sản lượng thủy sản được chế
biến [52].
Tỷ lệ chitin từ nguồn phế liệu thủy sản có thể khác nhau, tùy theo mùa và loài
nhưng nhìn chung, xương, vỏ thủy sản chứa khoảng 15% - 40% chitin, 20% - 40%
protein, 20% - 50% canxi carbonat và thành phần rất ít các chất khác như sắc tố, chất
béo và muối kim loại khác [70].
Bảng 1.1. Hàm lượng chitin và canxi carbonat trong một số loại tôm [70]
Loài
Crangon sp. và Pandalus sp.
Penaeus sp.
Nephrops sp. và Homarus sp.

Chitin (%)

CaCO3 (%)

Vị trí

17 – 40

20 – 30

Vỏ

~ 40

20 – 30

Vỏ

60 – 75

20 – 30

Vỏ

3


Chitin có chứa hàm lượng nitơ hơn 7% khối lượng hoặc khi độ deacetyl của chitin
trên 60% thì được gọi là chitosan [56, 98]. Chitosan là một dẫn xuất của chitin, được
hình thành khi thực hiện quá trình deacetyl hoá chitin (tách nhóm acetyl) khỏi chitin.
Chitosan là một polyme sinh học gồm các nhóm D-glucosamine (80%) và N-acetylD-glucosamine (20%) liên kết với nhau nhờ liên kết β(1 →4) và được mô tả là “vật
liệu sinh học đa năng nhất của tạo hóa” là một dẫn xuất chứa rất nhiều nhóm amin. Công
thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa

nhóm amin ở cacbon thứ 2 [107]. Ở mức độ phân tử, chitin và chitosan có cấu trúc gần
giống nhau, cả hai đều có phản ứng hydroxyl và có nhóm amino nhưng chitosan dễ tham
gia các phản ứng hơn có thể là do cấu trúc tinh thể của nó ít hơn. Trong khi chitin chỉ
hòa tan trong một vài dung môi đặc biệt còn chitosan có khả năng hòa tan trong nhiều
loại dung dịch acid, chẳng hạn acid formic, acid acetic,... [85, 106, 121].
Chitin

Nhóm N-acetyl

Chitosan

Nhóm amin

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan [81]
Độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến tính
chất của chúng. Chitin có độ deacetyl thấp, chitosan có độ deacetyl cao, có nghĩa là
chitosan chứa nhiều nhóm amin hơn chitin [26].
Phân tử lượng của chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, quyết định tính
chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu,
đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Phân tử lượng của chitosan nằm trong khoảng
4


từ 100.000 ÷1.200.000 dalton. Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì có độ nhớt càng
cao và phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin cũng như điều kiện
deacetyl chitin. Chitosan có phân tử lượng thấp, có chứa nhiều nhóm amin tự do sẽ có
hoạt tính sinh học cao hơn, khả năng kháng khuẩn tốt hơn và có nhiều ứng dụng trong
nông nghiệp, y học, công nghệ sinh học. Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử
lượng của nó, chẳng hạn chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 30-200 cPs và
chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3.000-4.000 cPs.

Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, lực ion, pH, nhiệt độ [26].
Chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ như acid formic, acid acetic, acid propionic,
acid citric, acid lactic và không tan trong nước, kiềm, cồn. Khi hoà tan chitosan trong
môi trường acid loãng tạo thành keo dương - đây là một đặc điểm rất đặc biệt của
chiotsan do đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm. Chitosan tích điện dương
sẽ có khả năng kết dính bề mặt với các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các
ion kim loại, tương tác tốt với các polyme tích điện âm [26].
Chitosan có một số tính chất như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu,
kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang ADN … khả năng này
phụ thuộc vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ
chất màu, tạo phức với kim loại, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao hơn. Cụ thể,
chitosan có độ deacetyl trên 85% có khả năng kháng khuẩn tốt hơn các loại chitosan có
độ deacetyl thấp hơn 80% [26].
1.1.1.2. Oligochitosan
Oligosaccharide là nhóm glucide có từ hai đến vài chục gốc monosaccharide,
thường có vị ngọt, kết tinh được và có khả năng tan trong nước. Trong tự nhiên, phổ
biến nhất là các disaccharide, còn các oligo chứa vài gốc đến hàng chục gốc
monosaccharide thường là sản phẩm thuỷ phân chưa hoàn toàn của các polysaccharide
[4]. Oligochitosan thu được nhờ thủy phân chitosan, là một loại oligosaccharide có chứa
một số lượng có hạn các phân tử D-glucosamine.
Chitosan có khối lượng phân tử trung bình (Mw) từ khoảng 10.000 đến 100.000
dalton được xem là chitosan khối lượng phân tử thấp, trong khi đó khối lượng phân tử
trung bình của oligochitosan thường nhỏ hơn 10.000 dalton [4]. Chitosan khối lượng
phân tử thấp và oligochitosan có một số hoạt tính sinh học khác biệt với chitosan khối

5


lượng phân tử cao như tính chống oxi hóa, tính kháng khuẩn, hoạt tính chống ung thư,
kích thích hệ miễn dịch chống nhiễm bệnh đối với vật nuôi, cây trồng… [72, 132].

Chitosan chỉ tan trong acid, oligochitosan có thể tan trong nước. Do đó người ta
có thể sử dụng oligochitosan làm phụ gia bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm nhằm
kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm.
O
H
OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH
H
O

H

O
H
OH

O

H

H

O

H

NH2

H

H

NH2

OH

H

H

OH

H
OH

H

NH2

n

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của oligochitosan
Chitooligosaccharide là tên gọi chung cho loại oligosaccharide sản xuất từ
chitin/chitosan. Đây là oligosaccharide của liên kết β-1,4 với các đơn vị N-acetyl-Dglucosamine (đối với chitin) và với D-glucosamine (đối với chitosan).
Chitin

Chitosan

Chitin oligosaccharide
(Oligochitin)

Chitosan oligosacharide
(Oligochitosan)

N-acetyl-D-glucosamine

D-glucosamine

Chitooligosaccharide với ưu điểm vượt trội hơn so với chitin, chitosan, là có trọng
lượng phân tử thấp và khả năng hòa tan cao. Chính vì thế, các chitooligosaccharide mở
ra tiềm năng ứng dụng rộng lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau [4].
1.1.2. Phương pháp sản xuất chitin và chitosan
Quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản phụ thuộc nhiều vào hàm lượng chitin
của phế liệu và khác nhau tùy theo loài, giai đoạn trưởng thành, điều kiện nuôi dưỡng
và thu hoạch. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng chitin trong thủy sản cấu tạo từ thể vi sợi có
liên kết cộng hóa trị với α- amino acid như là tyrosine cũng giống như peptide và protein
biểu bì được muối khoáng làm cho rắn chắc lại [35, 73]. Hơn nữa, chitin liên kết với
protein tạo thành các glycoprotein bền vững thông qua liên kết cộng hóa trị giữa chitin
với acid aspartic và histidine nằm trong cấu trúc của phần protein [106].
Khi nghiên cứu về cấu trúc của vỏ giáp xác (tôm, cua...), nhiều dẫn liệu cho thấy
vỏ tôm, cua có cấu trúc bao gồm bộ khung cơ bản là chitin, ngoài bộ khung này còn có

6

các thành phần protein, lipid, muối khoáng, sắc tố... tạo nên lớp vỏ bền vững không thấm
nước để bảo vệ các lớp cơ thịt bên trong. Do vậy, muốn tách được chitin từ các loại vỏ
này phải bao gồm các bước: khử protein, khử khoáng và các chất phi chitin khác. Thông
thường, quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản bao gồm ba bước: khử protein, khử
khoáng và tẩy màu [108].
1.1.2.1. Quá trình khử protein
Hiện có nhiều phương pháp khác nhau để khử protein từ đầu vỏ tôm đã được
nghiên cứu. Nhìn chung, đầu tiên protein được tách ra từ vỏ ngoài của đầu vỏ tôm bằng
cách xử lý với dung dịch NaOH loãng hoặc KOH loãng ở nhiệt độ cao. Nồng độ kiềm
sử dụng trong khoảng 1% ÷ 10% ở dải nhiệt độ 10oC ÷ 100oC, phụ thuộc vào nguồn
nguyên liệu với thời gian xử lý rất khác nhau [87]. Một số nghiên cứu trước đây cho
thấy khi khử protein bằng dung dịch NaOH 10% ở 100oC trong 72 giờ có hiện tượng cắt
mạch và deacetyl [134]. Phương pháp tối ưu để khử protein của phế liệu vỏ cua và vỏ
tôm được một số nghiên cứu cho rằng dùng KOH 1%÷2% ở 90oC với tỷ lệ vỏ và dung
dịch kiềm là 1:20 (w/v), thời gian tối thiểu 1 giờ để khử 90% protein và tối thiểu 2 giờ
để khử hoàn toàn protein từ vỏ [108].
Bảng 1.2. Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguồn phế
liệu tôm [92, 113]
Nguồn phế
liệu

Tôm thẻ

Chế độ khử protein
Nồng độ NaOH (%)

Nhiệt độ (oC)

5

Hồi lưu

2

1:15 ÷ 20

5

100

0,5

1:1

0,5

Đun sôi

0,5

2:3

15

65

3

1:10

Phương trình khử protein như sau:

7

Thời gian (h) Tỷ lệ (w/v)


Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản
ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:

Triglyceride

Glycerol

Xà phòng

Đối với quá trình khử protein, nhiệt độ đóng vai trò quan trọng. Ở nhiệt độ phòng,
quá trình tách protein diễn ra chậm, thời gian khử protein từ một ngày đến vài ngày. Khi
nâng nhiệt độ xử lý thì thời gian khử protein giảm đáng kể, ở nhiệt độ 100oC thời gian
khử protein chỉ cần vài giờ để đạt hàm lượng protein còn lại <1%. Tuy nhiên, cần phải
lưu ý là sử dụng kiềm để tủa protein ở đầu vỏ tôm ở nhiệt độ cao trong thời gian dài sẽ
dẫn đến quá trình cắt mạch của sản phẩm chitin. Mặt khác, sử dụng kiềm để tủa protein
ở đầu vỏ tôm ở nhiệt độ cao còn dẫn tới lão hóa và hư hỏng các thiết bị chứa đựng bằng
nhựa hoặc inox,…
Nồng độ kiềm được sử dụng cũng ảnh hưởng đến chất lượng chitin và chitosan thu
được. Nồng độ kiềm cao thì khả năng khử protein cao, thời gian xử lý ngắn, hàm lượng
protein còn lại trong sản phẩm chitin thấp. Tuy nhiên, sử dụng nồng độ kiềm cao lại gây
ra hiện tượng cắt mạch chitin và chitosan. Tỷ lệ giữa dung dịch kiềm và phế liệu cũng
ảnh hưởng lớn đến hiệu quả tách protein, tỷ lệ 5/1 đối với nguyên liệu tươi và 15/1 đối
với nguyên liệu khô thường được sử dụng. Để tăng cường hiệu quả của quá trình tách

protein cần thực hiện khuấy đảo trong quá trình xử lý. Ngoài ra, kích thước của nguyên
liệu cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách protein khỏi đầu vỏ tôm, do đó trong nhiều quy
trình sản xuất chitin, phế liệu tôm được nghiền nhỏ đến kích thước từ 2 ÷ 5 mm. Để đáp
ứng yêu cầu chất lượng của chitosan công nghiệp, hàm lượng protein còn lại trong sản
phẩm chitin phải nhỏ hơn 1%. Để tăng hiệu quả tách protein, quá trình tách protein được
lặp lại nhiều lần [26].
Chiếu xạ tia gamma được nghiên cứu kết hợp với NaOH để tăng quá trình loại
protein ra khỏi vỏ tôm. Kết quả khảo sát cho thấy chiếu xạ Coban-60 với liều chiếu 3 ÷
5 kGy và NaOH 1N, nhiệt độ 95oC đã loại bỏ hoàn toàn protein sau 0,5 giờ. Nguyên
nhân là do tia năng lượng cao gamma của Coban-60 đã cắt các liên kết của protein với
các thành phần trong cấu trúc vỏ như chitin, canxi, phosphate. Vì vậy dễ dàng loại bỏ
protein ra khỏi nguyên liệu [5].
8


Một phương pháp có nhiều ưu điểm hơn phương pháp hóa học là dùng enzyme để
tách chiết chitin, chitosan và chitooligosaccharide, tuy nhiên protein còn lại thường cao
và thời gian phản ứng dài hơn đáng kể so với các phương pháp hóa học. Hơn nữa, giá
thành enzyme cao, làm hạn chế ứng dụng của phương pháp enzyme trong công nghiệp
[97]. Enzyme khử protein thương mại có sẵn như alcalase, chymotrypsin và papain đã
được sử dụng để tách protein ra khỏi phế liệu vỏ trong sản xuất chitin [58, 126]. Một số
nghiên cứu còn cho rằng có thể sử dụng bromelain từ thân cây dứa và papain từ đu đủ
trong thủy phân chitin từ mai mực để sản xuất chitooligosaccharide và thủy phân bằng
bromelain tốt hơn nhiều so papain với nồng độ tối ưu 0,1% [127]. Một nghiên cứu còn
cho rằng sử dụng alcalase khử protein từ phế liệu tôm (Crangon crangon) cho phép thu
hồi chitin với hàm lượng protein còn lại khoảng 4,4% - 7,9% [117]. Sử dụng alcalase
hoặc enzyme của tụy tạng với tỷ lệ enzyme/cơ chất là 3% và nhiệt độ 60°C để thu hồi
chitin, protein và astaxanthin từ vỏ của tôm Xiphopenaeus kroyeri. Dùng alcalase để
khử protein hiệu quả hơn enzyme của tụy tạng mặc dù hàm lượng protein còn lại cao
gấp đôi so với xử lý bằng NaOH [48].

Sử dụng enzyme alcalase để khử protein phế liệu tôm Crangon có thể giúp thu hồi
được 64,3% protein của đầu vỏ tôm để sử dụng trong thức ăn chăn nuôi. Sử dụng
protease để thay thế cho NaOH khắc phục được các hạn chế của việc sử dụng hóa chất.
Tại Việt Nam, một số công trình nghiên cứu đã thực hiện sử dụng enzyme protease
(papain, alcalase, protamex, flavourzyme) hoặc vi sinh vật để khử protein trong công
nghệ sản xuất chitin từ phế liệu tôm [11, 24, 25].
Các enzyme trypsin, pepsin và papain cũng được nghiên cứu để xử lý vỏ tôm
Metapenaeus monoceros nhằm có thể thu nhận carotenoprotein từ vỏ tôm này trong sản
xuất thức ăn nuôi động vật thủy sản và kết quả cho thấy sử dụng trypsin có hiệu suất thu
hồi carotenoid cao nhất là 55% trong 4 giờ ở 28oC, còn sử dụng pepsin và papain chỉ
thu được 50% [39].
Như vậy, hiện đã có một số nghiên cứu sử dụng protease để khử protein của đầu
vỏ tôm trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản. Tuy nhiên, các kết quả nghiên
cứu cho thấy sử dụng enzyme không thể khử triệt để protein từ phế liệu thủy sản. Vì vậy,
muốn triển khai ở quy mô sản xuất công nghiệp cần nghiên cứu thêm các giải pháp khử
protein bằng tác nhân sinh học khác như vi sinh vật để làm giảm giá thành và nâng cao
hiệu quả khử protein từ phế liệu đầu, vỏ tôm.
9


1.1.2.2. Quá trình khử khoáng
Phế liệu thủy sản (tôm, cua) thường chứa một lượng khoáng khá cao (chủ yếu là
muối canxi cacbonat và một lượng nhỏ canxi phosphate). Vì vậy, một trong những công
đoạn quan trọng trong quy trình sản xuất chitin là khử khoáng. Việc loại bỏ canxi
cacbonat, canxi phosphat và các loại muối khoáng khác trong phế liệu vỏ tôm cua
thường được thực hiện bằng acid loãng. Tỷ lệ acid phải đủ lớn để khử tất cả các muối
khoáng có trong vỏ tôm, cua để bảo đảm tách khoáng hoàn toàn [108]. Để sự thay đổi
của chitin tự nhiên là nhỏ nhất, sử dụng EDTA (Ethylene Diamine TetraAcetate) để khử
khoáng hoặc khử khoáng và khử protein đồng thời [33, 55].
Quá trình khử khoáng có thể thực hiện bằng cách xử lý vỏ tôm, cua bằng các acid

sau: HCl, HNO3, H2SO4. Tương tự như quá trình khử protein, chế độ khử khoáng bằng
acid cũng rất đa dạng, nồng độ HCl từ 0,5N đến 2N, ở nhiệt độ rất thấp đến nhiệt độ
phòng. Thời gian khử khoáng từ 1/2h đến 48h [91, 26].
Phương trình phản ứng của quá trình khử khoáng bằng HCl:
CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O
Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4
Bảng 1.3. Các điều kiện để khử khoáng trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu
tôm [92]
Chế độ khử khoáng
Nguồn
Nồng độ HCl

Nhiệt độ (oC)

Thời gian (h)

5%

Nhiệt độ phòng

2

1:15 – 20

5%

Nhiệt độ phòng

1

1:2

1,25N

Nhiệt độ phòng

1

-

1N

Nhiệt độ phòng

2

1:15

Tỷ lệ (w/v)

Tôm thẻ

Tốc độ phản ứng của quá trình khử khoáng ở vỏ tôm, cua diễn ra rất nhanh ở thời
gian đầu (trong vòng 30 phút) với hàm lượng khoáng giảm đến 90%, sau đó quá trình
diễn ra rất chậm. Theo kết quả nghiên cứu, sau 30 giây, 98% lượng acid HCl cho vào đã
phản ứng, thể hiện quá trình khử khoáng diễn ra rất nhanh ở giai đoạn đầu [97]. Ngoài
ra, khi thực hiện công đoạn khử khoáng, cần lưu ý đến tỷ lệ giữa nguyên liệu/acid vì nó
ảnh hưởng quyết định đến hiệu quả khử khoáng. Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch acid tương
10

ứng 1:15 là tốt nhất khi nồng độ acid sử dụng là 4%. Trong quá trình ngâm acid ở nhiệt
độ phòng, kết hợp với khuấy đảo, quá trình khử khoáng chưa đạt nếu vỏ còn cứng và
không thấy bọt khí nổi lên, cần bổ sung thêm acid [26].
Tùy theo từng loại nguyên liệu và yêu cầu chất lượng của chitin mà chế độ khử
khoáng áp dụng khác nhau (bảng 1.3). Thông thường đối với vỏ tôm thì nồng độ HCl
sử dụng khoảng 4-5%, xử lý phế liệu cua, ghẹ nồng độ HCl khoảng 10%, có thể phải
khử khoáng nhiều lần [26].
Trong quá trình khử khoáng thường xảy ra quá trình cắt mạch chitin nên quá trình
tách khoáng chỉ thực hiện ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ thấp hơn để hạn chế quá trình
cắt mạch [103]. Gần đây, một số nghiên cứu đã ứng dụng các acid hữu cơ để tách khoáng
như acid formic, acid acetic và acid lactic [42]. Ở các nghiên cứu này, nồng độ acid
được sử dụng nhỏ hơn 1M đối với acid formic và acid lactic. Người ta cũng có thể sử
dụng các acid này riêng rẽ hoặc kết hợp các acid này với nhau để khử protein vỏ tôm,
cua. Khi sử dụng acid hữu cơ để tách khoáng, chitin và chitosan thu được có độ tinh
sạch cao, có thể đáp ứng được yêu cầu độ tinh sạch của chitin trong y dược, thực phẩm.
Ngoài ra, chitin và chitosan thu được có phân tử lượng lớn và độ nhớt cao, đây là phương
pháp khử khoáng thân thiện hơn với môi trường.
Phương trình phản ứng của quá trình khử khoáng bằng acid acetic:
CaCO3 + 2CH3COOH = (CH3COO)2Ca + CO2 + H2O
Phương trình phản ứng của quá trình khử khoáng bằng acid lactic:
CaCO3 + 2 CH3 – CHOH – COOH = (CH3 – CHOH – COO)2Ca + CO2 + H2O
Trong sản xuất chitin, thực hiện công đoạn khử khoáng sau khi tách protein thì sản
phẩm chitin cuối cùng sẽ có hàm lượng khoáng còn lại thấp hơn so với sản phẩm chitin
trong quy trình mà công đoạn tách khoáng được thực hiện trước tiên [26]. Kết quả này
có thể giải thích là khi tách protein trước, HCl sẽ tiếp xúc tốt hơn với các chất khoáng
có trong phế liệu và dễ dàng tách khoáng ra dưới dạng hòa tan vào trong dung dịch.
Ngoài ra, để nâng cao chất lượng chitin, người ta có thể tiến hành khử khoáng nhiều lần
với nồng độ acid xử lý thấp [26].
1.1.2.3. Quá trình tẩy màu

Trong phế liệu tôm và cua có chứa một lượng lớn các chất màu, chủ yếu thuộc
nhóm carotenoid: astacene, astaxanthin, canthaxanthin, lutein và β-carotene. Việc liên
11