Báo cáo thực tập nuôi cấy mô đh dược HN cao học 22

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BỘ MÔN THỰC VẬT
--------

(Họ và tên)
(Mã sinh viên)

BÁO CÁO THỰC TẬP

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
LỚP CAO HỌC 22

HÀ NỘI, 2018

1


BÁO CÁO THỰC TẬP
MÔN: NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Thời gian thực tập: 19/9/2018
Lớp: Cao học 22
Nơi thực tập: Phòng nuôi cấy mô, Bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội.

BÀI 1: KỸ THUẬT VÔ TRÙNG VÀ PHA CHẾ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

1. Kỹ thuật vô trùng:
- Vô trùng vòng thí nghiệm và box cấy: phòng và box cấy được vệ sinh thường xuyên.
 Cá nhân: Cần rửa tay xà phòng trước khi vào phòng, đeo găng tay (trường hợp tiếp
xúc HgCl2 thì cần phải đeo 2 găng, bên trong là găng nilon), đeo khẩu trang, áo blue

cần được khử trùng trước, thay dép khi vào phòng.
 Vệ sinh box cấy trước sử dụng: Bật box cấy. Sử dụng ethanol 96% để xịt và lau (sử
dụng bông, lau 1 chiều) toàn bộ bề mặt trong của box cấy. Lau ít nhất 2 lần. Sau đó
lau đèn UV bằng ethanol 96% (chú ý lau sạch đáy), đặt đèn trong box cấy (bên
ngoài, hướng lên), phủ vải đen, bật đèn UV khoàng 30-60 phút trước khi sử dụng
buồng.
 Sau sử dụng, vệ sinh lại box cấy tương tự.
 Kiểm tra cồn trong đèn cồn, đổ đầy.
 Bộ dụng cụ cấy: Thay dao. Thêm cồn vào khay đựng dụng cụ, đốt ethanol.
 Đốt đèn cồn. Chuẩn bị các ống cồn. Sau mỗi thao tác, nhúng các dụng cụ cấy vào
ống cồn, đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Các ống/lọ/thớt cắt được hơ trên ngọn lửa đèn
cồn để khử trùng (có thể xịt ngoài và lau với cồn trước).
 Bất cứ phần nào tiếp xúc với da người/tay cầm/nền box cấy đều coi như nhiễm bẩn.

1


2. Pha chế và tiệt trùng môi trường cấy:
+ Công thức pha chế môi trường thực tế đã sử dụng: Công thức MS1
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11

Thành phần
Stock đa lượng
Stock vi lượng
Stock Vitamin
Stock Sắt
Mio inositol
Đường
Thạch
BAP 1mg/ml
NAA 1mg/ml
Kinetin 1mg/ml
Nước cất vừa đủ
pH

Thể tích/khối lượng
200 ml
10 ml
10 ml
4 ml
200 g
60 g
11 g
4 ml
0,2 ml
1 ml
2.000 ml
5,7

Cách thức pha chế:
Cách thức pha chế:
- Đong 200ml Stock đa lượng vào ống đong 1.000ml
- Thêm 10ml Stock vi lượng và 10ml Stock Vitamin, 4ml Stock Sắt (sử dụng ống đong
25ml) vào lượng 200ml Stock đa lượng trong ống đong 1.000ml trên.
- Cân Mio inositol ra cốc có mỏ, hòa tan bằng nước cất (khoảng 100ml), khuấy, thêm
vào ống đong 1.000 trên. Sau đó tráng lại cốc 3 lần, mỗi lần 50ml.
- Cân 60g đường ra cốc có mỏ đã dùng ở trên, hòa tan bằng nước cất (khoảng 100ml),
khuấy, thêm vào ống đong 1.000 trên. Sau đó tráng lại cốc 3 lần, mỗi lần 50ml.
- Dùng pipet hút BAP, NAA, Kinetin vào ống đong 1.000ml trên.
- Thêm nước cất đến vạch 1.000ml.
- Đổ toàn bộ vào nồi, đun trên bếp hồng ngoại (đặt mức nhiệt 1500W).
- Cân thạch vào cốc cỏ mỏ đã dùng trước đó. Thêm 400ml nước cất vào cốc trên., khuấy
đều.
- Đổ toàn bộ vào bếp đun hồng ngoại, khuấy nhanh, mạnh, một chiều.
- Rửa lại cốc trên 3 lần, mỗi lần với 200ml nước cất để lấy hết thạch. Mỗi lần rửa làm
lại thao tác khuấy nhanh, mạnh, một chiều như trên.
- Rửa cả cốc vào trong nồi để đảm bảo lấy hết thạch.
2


- Sau khi hỗn hợp đồng nhất (khoảng 60-70 độ), để ra ngoài cho nguội bớt (khoảng 50
độ), tiến hành đo pH (hiệu chỉnh bằng HCl loãng, sử dụng máy đo pH đã hiệu chỉnh lần
lượt bằng các dung dịch 7pH7,0; 4,1; 10,8 trước khi đo). Chỉnh đến pH 5,7.
- Đun nóng lại hỗn hợp, đổ vào các lọ (độ cao khoảng 1-2cm), đóng nắp.
- Ghi nhãn: MS1, 19/9/2018.
- Tiệt trùng tại nhiệt độ 121 độ C trong 15 phút (cài máy).
- Cất các bình môi trường vào buồng nuôi mẫu (ngăn dưới cùng).
- Dọn, rửa dụng cụ.

3


BÀI 2:
NHÂN NHANH VÀ RA RỄ CÂY LAN KIM TUYẾN IN VITRO

1. Tiến hành
- Khử trùng buồng cấy và các dụng cụ.
- Tiệt trùng găng tay với ethanol 96.
- Lấy bình nuôi cấy, tiệt trùng nắp và cổ lọ. Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng các mẫu cây con ra
ngoài thớt cắt (chú ý không kẹp quá mạnh).
- Tiệt trùng lại kẹp và dao trước khi cắt.
- Dùng kẹp và dao cắt các đoạn thân mang lá thành từng đoạn 1-2 đốt. Tách và để riêng
1 bên sạch. Loại các lá úa vàng khi cắt.
- Mở bình môi trường cây và khử trùng miệng bình cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
- Tiệt trùng kẹp.
- Dùng kẹp chuyển các đoạn thân cây đã cắt vào bình cấy nhẹ nhàng, dứt khoát, khoảng
1-5mm thân dưới ngập dưới môi trường.
- Tiệt trùng lại nắp và miệng bình cấy.
- Đóng bình cấy, ghi nhãn (tên sinh viên, ngày, môi trường, ký hiệu mẫu (L)).
- Tiệt trùng lại dụng cụ và vệ sinh tại chỗ.
- Chụp ảnh và đưa bình cấy vào buồng nuôi cấy.
2. Kết quả
(ảnh)
Hình 2.1. Tiến hành nuôi cấy mô vào môi trường MS1
(ảnh)
Hình 2.2. Mẫu sau cấy – Ngày 19/9

(ảnh)
Hình 2.3. Mẫu sau cấy vào ngày 21/9

Nhận xét:
- Sau khi cấy mô 3 ngày có hiện tượng bị nấm mốc (dạng nấm màu trắng, lốm đốm),
trên bề mặt của thạch.
4


- Nguyên nhân: Có thể do khâu khử trùng chưa tốt, thao tác chưa quen tay nên chưa
được chuẩn. Phần tay mặc áo ngắn, đeo găng tay không che hết được, nên có thể
trong quá trình thao tác, các vi khuẩn và nấm, thậm chí các các vảy sừng ở da tay
(phần áo không che kín hoặc không có găng tay) đã rơi vào thới (miếng nhôm) khi
thao tác qua lại, hoặc khi di chuyển tay bên trên bề mặt
=> Khắc phục:
+ Cần chuẩn lại thao tác. Phải tiệt trùng cả phần cánh tay và có áo che lại khi tiến
hành làm trong tủ cấy. Thứ 2 là cần phải để tay khuỳnh ra, mở rộng ra, để không có
vật gì di chuyển qua lại phía trên thớt cắt trong quá trình thao tác.
+ Tiệt trùng áo blouse trước khi vào phong nuôi cấy, tiến hành khử trùng dụng cụ,
găng tay cẩn thận, theo đúng hướng dẫn.

5


BÀI 3: NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG CỦA CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
Thao tác chuẩn bị:
- Tại vườn thực vật, chọn các mẫu tươi sạch, không bị dính bùn đất, sâu bệnh trên
cây mẹ, cắt bằng kéo cắt, chuyển ngay đến phòng nuôi cấy mô.
- Rửa qua mẫu bằng nước sạch. Sau đó dùng kéo cắt các đoạn khoảng 5cm, mỗi
đoạn có 1 nách lá, cắt lá (chỉ để lại 1cm cuống).
- Rửa các đoạn trên dưới nước chảy 5 phút.
- Cho các mẫu vào dung dịch xà phòng loãng, lắc tròn trong 10 phút.
- Rửa sạch nước xà phòng dưới nước chảy 10 phút.

- Rửa sạch bằng nước cất.
- Chuyển mẫu vào cốc cỏ mỏ, đưa vào box cấy.
- Vệ sinh box cấy, chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, cốc hứng nước thải.
- Ngâm ngập mẫu với ethanol 70o , đóng chặt nắp, lắc đều tay trong 2 phút.
- Đổ sạch cồn (sử dụng kẹp đã tiệt trùng để giữ mẫu không trôi). Tráng lại 1 lượt
bằng nước cất (lắc đều tay 50 vòng).
- Ngâm ngập mẫu với nước oxi già, thêm 1 giọt Tween (để tăng khả năng thấm,
tăng hiệu quả làm sạch mẫu), đóng chặt nắp, lắc đều tay 10 phút.
- Rửa với nước cất 1 lần (lắc đều tay 50 vòng) cho đỡ bọt.
- Ngâm ngập mẫu lần 2 với nước oxi già, đóng chặt nắp, lắc đều tay 10 phút.
- Rửa sạch với nước cất ít nhất 3 lần (lắc đều tay 50 vòng).
- Chắt hết nước trong bình chữa các mẫu trên, đóng nắp, chú ý khử trùng cổ và nắp
bình trước khi đóng nắp.
Thao tác cấy:
- Tiệt trùng găng tay với ethanol 96.
- Lấy bình nuôi cấy, tiệt trùng nắp và cổ lọ. Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng các mẫu đoạn
thân HTO ra ngoài thớt cắt (chú ý không kẹp quá mạnh).
- Tiệt trùng lại kẹp và dao trước khi cắt.
- Dùng kẹp và dao cắt tỉa lại các đoạn thân (chú ý phần dưới dài khoảng 2cm, phần
trên có chứa bẹ chìa chỉ khoảng 1cm, cắt ngắn phần cuống lá khoảng 5mm). Tách và để
riêng 1 bên sạch. Loại các đoạn cành úa vàng khi cắt. Mỗi sinh viên làm 3-4 đoạn cành.
- Mở bình môi trường cây và khử trùng miệng bình cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
6


- Tiệt trùng kẹp.
- Dùng kẹp chuyển các đoạn cành đã cắt vào bình cấy nhẹ nhàng, dứt khoát,
khoảng 0,5-1cm cành dưới ngập dưới môi trường.
- Tiệt trùng lại nắp và miệng bình cấy.
- Đóng bình cấy, ghi nhãn (tên sinh viên, ngày, môi trường, ký hiệu mẫu (HTO))

- Tiệt trùng lại dụng cụ và vệ sinh tại chỗ.
- Chụp ảnh và đưa bình cấy vào buồng nuôi cấy.
- Vệ sinh toàn bộ phòng thực tập.

(ảnh)
Hình 3.1. Cắt thân cây Hà thủ ô thành các đoạn mang mấu thân
(ảnh)
Hình 3.2. Tiến hành rửa sạch, vô trùng sơ bộ mẫu

(ảnh)
Hình 3.3. Mẫu sau cấy – Ngày 19/9
Hằng ngày tiến hành theo dõi các mẫu. Mẫu nào bị nấm phải bị loại ngay.
(ảnh)
Hình 3.4. Các mẫu được bảo quản trong phòng nuôi
(ảnh)
Hình 3.5.. Mẫu sau cấy vào ngày 24/9/18
Nhận xét:
- Sau cấy 5 ngày cấy, xuất hiện dấu hiệu của nấm màu vàng, bắt đầu nấm từ phần
thân của mẫu, phát triển xung quanh chỗ cấy mẫu. Lý do nhiễm nấm có thể do rửa
mẫu bên ngoài chưa đạt, thao tác tẩy với nước oxy già chưa được (có thể do lắc tay
theo vòng tròn chưa tốt, hoặc thời gian lắc chưa đủ lâu), vi khuẩn và vi nấm có trong
các mô bên trong của mẫu chưa bị tiêu diệt hết. Cũng có thể do dụng cụ tiếp xúc với
mẫu (dao, kẹp, thớt cắt) bị dính khuẩn.
=> Khắc phục: tiệt trùng mẫu lâu hơn.
7


Hủy lọ đã bị nấm,

8