Đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh của nanochitosan đối với bệnh mốc cam (neurospora crassa) trên nấm bào ngư xám (pleurotus sajor caju)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA
NANOCHITOSAN ĐỐI VỚI BỆNH MỐC CAM (Neurospora crassa)
TRÊN NẤM BÀO NGƢ XÁM (Pleurotus sajor-caju)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA
NANOCHITOSAN ĐỐI VỚI BỆNH MỐC CAM (Neurospora crassa)
TRÊN NẤM BÀO NGƢ XÁM (Pleurotus sajor-caju)
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngành:

Công nghệ Sinh học

Mã số:

60420201

Quyết định giao đề tài:

551/QĐ-ĐHNT ngày 21/6/2017

Quyết định thành lập HĐ:
Ngày bảo vệ:

22/03/2018

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN VĂN HÒA
PGS.TS TRANG SĨ TRUNG
Chủ tịch Hội đồng:
PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa
Phòng Đào tạo Sau đại học:

KHÁNH HÒA - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Đánh giá hiệu quả phòng và trị
bệnh của nanochitosan đối với bệnh mốc cam (Neurospora crassa) trên nấm bào
ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju)” là công trình nghiên cứu của chính bản thân tôi và
chƣa từng công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho đến thời điểm này.
Khánh Hòa, ngày

tháng

Tác giả luận văn

iii

năm


LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận văn này:
Trƣớc hết tôi xin gửi đến Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nha Trang, Ban lãnh
đạo Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Ban lãnh đạo Viện CNSH&MT đã tạo mọi
điều kiện tốt nhất cho tôi đƣợc hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu của mình.
Sự biết ơn sâu sắc, kính trọng tôi xin đƣợc giành cho thầy PGS.TS Trang Sĩ
Trung và TS. Nguyễn Văn Hòa đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức,
kinh nghiệm quý báu trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học và
thực hiện đề tài này.
Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cám ơn!
Khánh Hòa, ngày tháng
Tác giả luận văn

iv

năm


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ iii
LỜI CÁM ƠN...............................................................................................................iv
MỤC LỤC ..................................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................ vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... x
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ...........................................................................................xi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về chitosan ............................................................................................................. 3
1.1.1. Cấu trúc của chitosan ........................................................................................... 3
1.1.2. Tính chất của chitosan ......................................................................................... 4
1.1.3. Ứng dụng của chitosan ........................................................................................ 7
1.2. Tổng quan về nanochitosan .................................................................................................... 9
1.2.1. Tính chất của nanochitosan .................................................................................. 9
1.2.2. Phƣơng pháp điều chế nanochitosan .................................................................. 10
1.2.3. Ứng dụng của nanochitosan ............................................................................... 12
1.3. Tổng quan về nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju và nấm mốc cam
Neurospora crassa ....................................................................................................... 17
1.3.1. Nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor -caju (Fr.) Sing . ......................................... 17
1.3.2. Giá trị dƣợc liệu của nấm bào ngƣ xám ( Pleurotus sajor-caju) ........................ 20
1.3.3. Giá trị dinh dƣỡng của nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju) ...................... 21
1.3.4. Nấm mốc cam Neurospora crassa ..................................................................... 23
1.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về ứng dụng phòng và trị bệnh nấm mốc
của chitosan và nanochitosan ....................................................................................................... 24
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 24
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ....................................................................... 25
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 26
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................................ 26
2.1.1. Chitosan ............................................................................................................. 26
2.1.2. Giống nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju .................................................. 26
2.1.3. Nấm mốc cam Neurospora crassa ..................................................................... 26
v

2.1.4. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị........................................................................ 26
2.1.5. Địa điểm thử nghiệm in vitro và in vivo ........................................................................ 27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 27
2.2.1. Điều chế nanochitosan ....................................................................................................... 27
2.2.2. Phân lập và định danh loài nấm Neurospora crassa gây bệnh trên bịch phôi nấm
bào ngƣ xám (Pleurotus cajor-sajo) ............................................................................ 30
2.2.3. Khảo sát hiệu quả của nanochitosan đến sự phát triển của Neurospora crassa
trên môi trƣờng PGA trong điều kiện in vitro ở các nồng độ, độ deacetyl và khối lƣợng
phân tử khác nhau ........................................................................................................ 30
2.2.4. Khảo sát hiệu quả của nanochitosan đến sự phát triển sinh khối của Neurospora
crassa trên môi trƣờng PG trong điều kiện in vitro ở các nồng độ, độ deacetyl và khối
lƣợng phân tử khác nhau.............................................................................................. 31
2.2.5. Khảo sát hiệu quả của nanochitosan đến khả năng phòng trị bệnh mốc cam
Neurospora crassa trên các bịch phôi bào ngƣ xám trong quá trình ra quả thể ở Co, độ DD
và Mw tốt nhất.................................................................................................................................... 32
3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 33
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 34
3.1. Phân lập và định danh nấm Neurospora crassa .............................................................. 34
3.2. Ảnh hƣởng của nanochitosan đến sự phát triển của Neurospora crassa trên môi
trƣờng PGA trong điều kiện in vitro ở các nồng độ, độ deacetyl và khối lƣợng phân tử
khác nhau .......................................................................................................................................... 35
3.3. Ảnh hƣởng của nanochitosan đến sự phát triển sinh khối của Neurospora crassa
trên môi trƣờng PG trong điều kiện in vitro ở các nồng độ, độ deacetyl và khối lƣợng
phân tử khác nhau ........................................................................................................................... 43
3.4. Khảo sát hiệu quả của nanochitosan+Ag+có DD >90% Mw=1,5.106 kDa ở nồng độ
150ppm đến khả năng phòng trị bệnh mốc cam trên các bịch phôi bào ngƣ xám trong
quá trình ra quả thể ......................................................................................................................... 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 56
KẾT LUẬN ................................................................................................................. 56

KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 57
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PG

: Potatoes Glucose

CTS : Chitosan
KLPT : Khối lƣợng phân tử

PGA : Potatoes Glucose Agar
Mw

: Molecular weight (Khối lƣợng phân tử)

kDa

DD

: Degree of Deacetylation (Độ deacetyl)

MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu

C0

: Concentration (Nồng độ)

MBC : Nồng độ ức chế tối đa

CNP : Chitosan nanoparticiples (Hạt nanochitosan)
TPP

: Tripolyphosphate

PSP

: Polysaccharide peptide

PSK : Polysacccharide krestin
PPO : Polyphenol oxidase
POD : Peroxidase
E.coli : Escherichia coli
S.typhimurium : Staphylococcus typhimurium
S.choleraesuis : Salmonella choleraesuis
S.aureus

: Staphylococcus aureus

N.crassa

: Neurospora crassa

P.sajor - caju : Pleurotus sajor – caju

vii

: Kilo Dalton


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan........................................................................ 3
Hình 1.2. Minh họa những cơ chế hấp thu dƣỡng chất ............................................... 15
Hình 1.3. Ảnh hiển vi nguyên tử lực (AFM) của tế bào S.choleraesuis sau khi xử lý
với nanochitosan theo thời gian. Chƣa xử lý (A), xử lý 30 phút (B), xử lý 1
giờ (C), xử lý 1,5 giờ (D), xử lý 2 giờ (E), xử lý 3 giờ (F) .......................... 17
Hình 1.4. Nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor – caju .................................................... 19
Hình 2.1. Chitosan ở các DD và Mw khác nhau. .......................................................... 26
Hình 2.2. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp tạo gel ion. ............................................... 27
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm điều chế nanochitosan. ........................................... 28
Hình 2.4. Nanochitosan có DD=70-80% và Mw=2,3.106KDa ..................................... 28
Hình 2.5. Nanochitosan có DD=80-90% và Mw=1,5.106KDa ..................................... 28
Hình 2.6. Nanochitosan có DD>90% và Mw= 2,3.106KDa.......................................... 29
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nanochitosan có Co, DD và M w hiệu quả nhất. 31
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nanochitosan có Co, DD và M

w

hiệu quả

nhất. ............................................................................................................. 32
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng PGA và hình thái hệ sợi, bào tử dƣới
kính hiển vi. ................................................................................................. 34
Hình 3.2. Kết quả chạy điện di và giải trình tự nucleotide của nấm N.crassa. ............. 34
Hình 3.3. So sánh ảnh hƣởng tới tốc độ lan tơ giữa 5 nồng độ và 10 môi trƣờng nuôi

cấy bằng phƣơng pháp Tukey. ..................................................................... 39
Hình 3.4. Trung bình đƣờng kính lan tơ cho từng nồng độ và từng môi trƣờng, ......... 39
Hình 3.5. Sự phát triển hệ sợi nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PGA có bổ
sung các nanochitosan+Ag+ ở các DD, Mw khác nhau và nồng độ 150ppm 41
Hình 3.6. Sự phát triển hệ sợi nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PGA có bổ
sung các nanochitosan ở các DD, Mw khác nhau và nồng độ 50ppm .......... 41
Hình 3.7. Thử nghiệm vòng kháng trên môi trƣờng PGA sử dụng nanochitosan ở
DD>90%, Mw=1,5.106 kDa nồng độ 150ppm .............................................. 43
Hình 3.8. Sinh khối nấm ở các nồng độ khác nhau trên môi trƣờng PGA có bổ sung
nanochitosan+Ag+ có DD=70-80% và Mw=2,3.106kDa. ............................. 46

viii


Hình 3.9. Sinh khối nấm ở các nồng độ khác nhau trên môi trƣờng PGA có bổ sung
nanochitosan +Ag+ có DD=80-90% và Mw=1,7.106 kDa............................. 47
Hình 3.10. Sinh khối nấm ở các nồng độ khác nhau trên môi trƣờng PGA có bổ sung
nanochitosan +Ag+ có DD>90% và Mw=1,5.106 kDa .................................. 47
Hình 3.11. Sự phát triển sinh khối của nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PG có
bổ sung các loại nanochitosan ở nồng độ 50ppm......................................... 48
Hình 3.12. Sự phát triển sinh khối của nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PG có
bổ sung các loại nanochitosan+Cu2+ ở nồng độ 50ppm ............................... 48
Hình 3.13. Sự phát triển sinh khối của nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PG có
bổ sung các loại nanochitosan+Ag+ ở nồng độ 50ppm ................................ 49
Hình 3.14. So sánh giữa năm nồng độ và 10 môi trƣờng bằng phƣơng pháp Tukey .. 49
Hình 3.15. Trung bình sự phát triển sinh khối cho từng nồng độ và môi trƣờng PG có
bổ sung các loại nanochitosan . ................................................................... 50
Hình 3.16.Trại nấm bị nhiễm bệnh mốc cam Neurospora crassa. ............................... 52
Hình 3.17. Gây bệnh mốc cam trên các bịch bào ngƣ xám và điều trị bằng
nanochitosan+Ag+ có DD >90% Mw=1,5.106 kDa....................................... 52

Hình 3.18. Khối lƣợng nấm thu đƣợc giữa nhóm bịch phôi gây bệnh đƣợc điều trị bằng
nanochitosan+Ag+ có DD>90% và Mw=1,5.106 kDa và nhóm bịch phôi không
bệnh.............................................................................................................. 55

ix


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các dung môi thƣờng sử dụng để hòa tàn chitosan ....................................... 5
Bảng 1.2. Một số ứng dụng chitosan trong thực phẩm .................................................. 8
Bảng 1.3. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan, nanochitosan .............. 16
Bảng 1.4. Một số chất khoáng trong nấm bào ngƣ và nấm rơm (mg/100g nấm khô) ......... 22
Bảng 2.1. Bảng đo các thông số đánh giá tính chất của nanochitosan ......................... 29
Bảng 3.1. Tóm lƣợc số liệu thí nghiệm tốc độ lan tơ của nấm mốc Neurospora crassa ...... 36
Bảng 3.2. Phân tích phƣơng sai sự khác biệt giữa các nồng độ và môi trƣờng đến tốc
độ lan tơ ....................................................................................................... 37
Bảng 3.3. Bảng phân tích phƣơng sai tƣơng tác giữa hai yếu tố nồng độ và môi trƣờng ..... 38
Bảng 3.4. Tóm lƣợc số liệu thí nghiệm sự phát triển sinh khối của nấm Neurospora
crassa .......................................................................................................... 44
Bảng 3.5. Bảng phân tích phƣơng sai sự khác biệt giữa các nồng độ và môi trƣờng PG
có bổ sung các loại nanochitosan đến sự phát triển sinh khối ...................... 45
Bảng 3.6. Phân tích phƣơng sai sự tƣơng tác giữa hai yếu tố nồng độ và môi trƣờng . 46
Bảng 3.7. Khối lƣợng nấm bào ngƣ xám thu đƣợc trên các bịch phôi gây bệnh đƣợc
điều trị bằng nanochitosan+Ag+ có DD>90% và Mw=1,5.106 kDa và nhóm
bịch phôi không gây bệnh ............................................................................ 53
Bảng 3.8. Bảng phân tích phƣơng sai sự khác biệt về năng suất nấm thu đƣợc ........... 54

x

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Chitosan (CTS) là một polymer sinh học có nhiều ứng dụng trong công nghiệp,
nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, y tế. Chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng
nấm nhƣng không hòa tan đƣợc trong nƣớc nên khả năng ứng dụng còn nhiều hạn chế.
Nanochitosan, nanochitosan mang các ion (đồng và bạc) đƣợc tạo ra bằng các phƣơng
pháp khác nhau, có kích thƣớc nhỏ (nanomet), diện tích và điện tích bề mặt lớn nên
hiệu quả kháng nấm vƣợt trội hơn nhiều so với chitosan..
Nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju) cũng giống nhƣ các đối tƣợng nông
nghiệp khác luôn bị các loại nấm bệnh gây hại ảnh hƣởng đến năng suất. Vì vậy ngƣời
trồng thƣờng sử dụng các loại hoá chất diệt nấm rất hiệu quả và thuận lợi nhƣng việc
lạm dụng quá mức đã ảnh hƣởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm, đến sức khỏe ngƣời
tiêu dùng, gây ô nhiễm môi trƣờng và quan trọng hơn hình thành các dòng nấm kháng
thuốc.
Mục tiêu của đề tài là đánh giá hiệu quả của việc phòng và điều trị bệnh nấm
mốc cam Neurospora crassa trên các bịch phôi nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajorcaju). Để đáp ứng đƣợc mục tiêu trên, đề tài đã tiến hành điều chế các loại
nanochitosan ở các độ deacetyl (DD), khối lƣợng phân tử (Mw) khác nhau và mang
thêm các ion bạc (Ag+) và ion đồng (Cu2+), sau đó pha loãng ở các nồng độ (C0) khác
nhau (50, 75, 100, 125, 150 ppm). Tiến hành khảo sát hoạt tính tới tốc độ lan tơ, sự
phát triển sinh khối, năng suất nấm thu đƣợc ở điều kiện in vitro và in vivo.
Kết quả đã định danh đƣợc loài Neurospora crassa gây bệnh trên nấm bào ngƣ
xám Pleurotus sajor-caju, điều chế đƣợc nanochitosan có kích thƣớc hạt nhỏ 386nm
có hiệu quả ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm mốc cam Neurospora crassa.
Kết quả thử nghiệm cho thấy nanochitosan+Ag+ có độ deacetyl (DD) >90%,
khối lƣợng phân tử (Mw) 1,5.106 kDa và ở nồng độ 150ppm có tác dụng ức chế sự phát
triển của đƣờng kính tản nấm, sinh khối nấm Neurospora crassa trong điều kiện in
intro và in vivo.
Từ khóa: nanochitosan, nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju, nấm mốc cam
Neurospora crassa

xi

MỞ ĐẦU
Nấm đƣợc xem là sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên và an toàn bởi vì
đƣợc sản xuất hoàn toàn hữu cơ thân thiện với môi trƣờng (Chiu et al. 2000) và đƣợc
trồng khắp nơi trên thế giới đặc biệt ở khu vực Đông Nam Á, Ấn Độ, Châu Âu và
Châu Phi. Các nghiên cứu cho thấy nấm chứa một lƣợng đáng kể chất xơ với hàm
lƣợng protein cao (30-40% trọng lƣợng khô) và đƣợc coi là thực phẩm tốt cho ngƣời
ăn chay (Manzi và ctv., 2001; Mattila và ctv., 2000). Kết quả nghiên cứu đã cho rằng
nấm có tác dụng làm giảm cholesterol, điều hòa hệ thống miễn dịch và ức chế sự phát
triển của khối u (Hossain và ctv., 2003; Zhang và ctv., 2001).
Sản lƣợng trồng nấm nấm Bào ngƣ (Pleurotus spp.) chiếm 14,2% (6.161.000 tấn)
tổng sản lƣợng nấm ăn trên thế giới (Chang, 1999). Tuy nhiên nấm bào ngƣ cũng nhƣ các
loại nấm ăn khác gặp một số bệnh nhƣ vi khuẩn, các loại nấm mốc, côn trùng… ảnh
hƣởng tới năng suất và chất lƣợng của nấm sau thu hoạch trong đó có bệnh nấm mốc cam
Neurospora spp. gây bệnh trên nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju) (Thắng, 2006).
Vì thế, để dập tắt nguồn bệnh ngƣời trồng thƣờng dùng thuốc trừ sâu tổng hợp và thuốc
diệt nấm vì đây là biện pháp rẻ nhất, hiệu quả nhất. Tuy nhiên, các báo cáo gần đây cho
thấy ảnh hƣởng xấu của việc sử dụng những hóa chất lên sức khỏe của ngƣời tiêu dùng và
hiện tƣợng kháng thuốc của nấm bệnh, nhu cầu đặt ra nghiên cứu các sản phẩm sinh học
có nguồn gốc tự nhiên nhằm mục đích an toàn cho ngƣời tiêu dùng và thân thiện với môi
trƣờng (Errampalli, 2004; Gea và ctv., 2005).
Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng, có nguồn gốc từ các thành phần
cấu trúc vỏ các loài giáp xác nhƣ tôm, cua… Hợp chất này có khả năng hòa hợp sinh
học và tự phân hủy cao (Richardson và ctv., 1999), có độc tính thấp, hoạt tính sinh học
cao và đa dạng nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, tăng sinh tế bào, tăng cƣờng khả năng
miễn dịch, giảm cholesterol trong máu, hạn chế sự phát triển của khối u, có tác dụng
nhanh trên các vết thƣơng, vết bỏng (Jing và ctv., 1997).
Theo một số công trình nghiên cứu đƣợc công bố trong những năm gần đây cho
thấy, vật liệu chitin/chitosan ở dạng nano có vai trò đặc biệt quan trọng trong lĩnh vực

y dƣợc và trong nông nghiệp. Việc sử dụng vật liệu nano trên cơ sở chitin/chitosan với
vai trò chất mang và giải phóng thuốc đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng khá rộng rãi
1


là do khả năng hấp thụ thuốc cao và dễ đi vào trong cơ thể do có kích thƣớc nhỏ, vì
vậy làm tăng hiệu quả của quá trình điều trị bệnh.
Nanochitosan là các hạt chitosan có kích thƣớc nanomet. Do có kích thƣớc siêu
nhỏ nên nanochitosan dễ dàng đi qua màng tế bào, diện tích và điện tích bề mặt cực
lớn nên đƣợc ứng dụng nhiều trong sinh y học mang thuốc, vaccine, trong công nghệ
sinh học làm vector chuyển gen (Agnihotri và ctv., 2004; Patel & Jivani, 2009;
Trapani và ctv., 2009; Zhang và ctv., 2010), trong việc xử lí kim loại nặng và chất ô
nhiễm hữu cơ trong nƣớc sinh hoạt (Ge & Huang, 2010; Tamura và ctv., 2010), trong
nông nghiệp cho lúa đã hạn chế sâu bệnh nên không cần sử dụng thuốc bảo vệ thực vật
(Thiện và ctv., 2010).
Xuất phát từ những lý do trên tôi quyết định thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu
quả phòng và trị bệnh của nanochitosan đối với bệnh mốc cam (Neurospora crassa)
trên nấm bào ngư xám (Pleurotus sajor-caju)” do TS. Nguyễn Văn Hòa và PGS.TS
Trang Sĩ Trung và hƣớng dẫn.

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chitosan
1.1.1. Cấu trúc của chitosan
Chitosan là một dẫn xuất của chitin đƣợc hình thành khi tách nhóm acetyl (quá
trình deacetyl hóa chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino.
Chitosan đƣợc phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859. Chitosan thƣờng ở

dạng vẩy hoặc dạng bột có màu trắng ngà.
1.1.1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan
Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng đƣợc cấu tạo bởi các hợp phần
glucosamin và N-acetylglucosamin thông qua liên kết β-glucozit-1,4. Chúng đƣợc tách
chiết từ vỏ động vật giáp xác, là một trong những polymer sinh học phổ biến trên thế
giới chỉ sau cellulose.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan (Trung, 2010).
Tên hóa học của chitosan là: Poly-β-(1,4)-D-glucosamin, hay còn gọi là poly-β
-(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose.
Công thức phân tử: (C6H11O4N)n (C6H11O4N)n
Phân tử lƣợng: Mchitosan= (161,07)n
Tuy nhiên trong thực tế thƣờng có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân
tử chitosan (khoảng 10%). Vì vậy công thức chính xác của chitosan đƣợc thể hiện nhƣ
sau :

Trong đó tỷ lệ

phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa
3


Độ deacetyl của chitosan
Độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng, đặc trƣng cho tỷ
lệ giữa 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose với 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose
trong phân tử chitin và chitosan. Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan có độ
deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amino.

D-D-A-D-D-A-A-D-D-D-A-D-D-A-D-D-A-APhân bố dạng random (rời rạc) của phân tử chitosan

D-D-D-D-D-D-D-D-D-A-A-A-A-A-A-A-A-APhân bố dạng block (dạng khối) của phân tử chitosan
Phân tử lƣợng của chitosan
Phân tử lƣợng của chitosan là một thông số cấu trúc rất quan trọng, nó quyết định
tính chất của chitosan nhƣ khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất
màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Chitosan có phân tử lƣợng càng lớn thì độ
nhớt càng cao. Thông thƣờng, phân tử lƣợng của chitosan nằm trong khoảng từ
100.000 dalton đến 1.200.000 dalton (Li và ctv., 2000). Phân tử lƣợng của chitosan
phụ thuộc vào nguồn chitin và điều kiện deacetyl và thƣờng rất khó kiểm soát. Tuy
nhiên, chitosan có phân tử lƣợng thấp thì thƣờng có hoạt tính sinh học cao hơn, thƣờng
có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Chitosan có phân
tử lƣợng lớn có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt. Độ
nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lƣợng. Chitosan có phân tử lƣợng thấp có độ
nhớt từ 30–200 cps và chitosan có phân tử lƣợng lớn hơn 1 triệu Dalton có độ nhớt lên
đến 3.000-4.000 cps. Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl,
cƣờng độ ion, pH và nhiệt độ.
1.1.2. Tính chất của chitosan
Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng vảy có màu đục.
Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hoà tan trong nƣớc, trong dung dịch kiềm.
Nhƣng hoà tan trong dung dịch acid loãng, tạo thành dung dịch keo dƣơng. Nhờ đó,
keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng nhƣ: Pb3+,
Hg+,…

4


Bảng 1.1. Các dung môi thƣờng sử dụng để hòa tàn chitosan
(Trung và ctv., 2010)
Dung môi

Nồng độ thƣờng sử dụng (%)

Acid acetic

1-2

Acid fomic

1-2

Acid lactic

1-2

Acid propionic

1-2

Acid clohydric

0,25-0,5

Acid citric

5-10

Acid glutamic

1-3

Acid ascorbic

1-2

Không độc, tính tƣơng ứng sinh học cao và có khả năng phân hủy sinh học nên
không dây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trƣờng.
Chitosan là một polymer mang điện tích dƣơng nên đƣợc xem là một
polycationic (pH < 6,5) có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm nhƣ protein,
alginate, acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (- NH2).
Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ
sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể (Bách, 2004; Trung, 2010;
Richardson và ctv., 1999).
Tính chất của chitosan nhƣ khả năng hút nƣớc, khả năng hấp phụ chất màu, kim
loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm… phụ thuộc rất lớn vào độ
deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức
với kim loại tốt hơn. Tƣơng tự, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan cao
hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl hóa cao.
Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan
Hoạt tính sinh học cao nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, tăng sinh tế bào, tăng
cƣờng khả năng miễn dịch (Jing và ctv., 1997; Trung, 2010).
5


Chitosan không những ức chế những vi khuẩn gram âm gram dƣơng mà cả nấm
men và nấm mốc (Devlieghere và ctv., 2004; Liu và ctv., 2001.; Tsai và ctv., 2004).
Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu tố nhƣ loại chitosan sử
dụng độ DD, Mw, pH môi trƣờng, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực
phẩm (No và ctv., 2002). Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã
đƣợc nghiên cứu bởi một số tác giả trong đó cơ chế kháng khuẩn cũng đã đƣợc giải
thích trong một số trƣờng hợp. Mặc dù chƣa có một giải thích đầy đủ cho khả năng
kháng khuẩn đối với tất cả các đối tƣợng vi sinh vật, nhƣng hầu hết đều cho rằng khả

năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào (Chung và
ctv., 2004; Liu và ctv., 2004). Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram
âm tốt hơn vi khuẩn gram dƣơng (Helander và ctv., 2001).
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó đối với cả vi khuẩn
Gram âm (Helander và ctv., 2001) và Gram dƣơng (Bae và ctv., 2006; Jeon và ctv.,
2001; Kumar và ctv., 2004) là cơ sở để ứng dụng chitosan để tạo ra các chế phẩm bảo
quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên (Aider, 2010). Hoạt tính kháng khuẩn của
chitosan phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử, độ acetyl hóa (Jeon và ctv., 2001), pH
(Holappa và ctv., 2006), nhiệt độ (Tsai và ctv., 1999), nồng độ (Wang và ctv., 2004)
và dung dịch hòa tan (Qin và ctv., 2006).
Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất của chitosan đối với các loài
nấm bệnh trên dâu tây sau thu hoạch đã đƣợc nghiên cứu bởi El Ghaout và cộng sự. Theo
nghiên cứu này thì chitosan với 7,2% nhóm –NH2 đã giảm đƣợc sự phát triển của Botrytis
cinerea và Rhizopus stolonifer, tác động kháng nấm rất tốt hơn ở nồng độ cao hơn.
Trong một nghiên cứu tƣơng tự, Cuero và cộng sự nhận thấy Ncarboxymethylchitosan làm giảm quá trình tạo độc tố aflatoxin ở Aspergillus flavus và
Aspergillus parasiticus hơn 90% , trong khi sự phát triển của nấm giảm đi ít nhất ½.
Khả năng tạo màng của chitosan
Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt, tính chất cơ lý của màng chitosan nhƣ
độ chịu kéo, độ rắn, độ ngậm nƣớc, phụ thuộc nhiều vào phân tử lƣợng và độ deacetyl
hóa của chitosan. Chitosan có độ deactyl cao có ứng suất kéo và độ giãn dài giới hạn
cao hơn màng chitosan có độ deacetyl thấp; tuy nhiên, chúng có độ trƣơng nở thấp
hơn.
6


1.1.3. Ứng dụng của chitosan
Khả năng ứng dụng của chitosan theo nhiều hƣớng khác nhau, chẳng hạn nhƣ
trong thực phẩm và dinh dƣỡng, công nghệ sinh học, khoa học vật liệu, thuốc và dƣợc
phẩm, nông nghiệp và bảo vệ môi trƣờng, gần đây đƣợc sử dụng rất tốt trong liệu pháp
gen. Mạng lƣới ion điện tích dƣơng cũng nhƣ sự hiện diện của nhiều nhóm chức năng

làm cho phân tử chitosan là phân tử sinh học đƣợc chào đón. Ý nghĩa đối với y sinh
học và điều trị của các dẫn xuất chitin/chitosan là một chủ đề quan tâm đáng kể của
nhiều ngƣời trên khắp thế giới.
Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dƣợc độn làm trong
cốm, tá dƣợc ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng. Hỗn hợp chitosancollagen làm giảm cholesterol trong máu, giảm sự hấp thụ lipid. Chitin đƣợc làm da
nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ tiêu trong phẫu thuật.
Trong nông nghiệp, chitosan đƣợc sử dụng để tăng cƣờng sự hoạt động của các
vi sinh vật có lợi trong đất, bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công
của nấm trong đất và tăng cƣờng khả năng nảy mầm của hạt, giảm stress cho cây, kích
thích sinh trƣởng và tăng năng suất thu hoạch. Đặc biệt chitosan đóng vai trò kích
thích hệ miễn dịch của cây và sự hoạt động của enzyme chitinase.
Trong nông nghiệp, oligochitosan làm thuốc tăng trƣởng thực vật và kích thích
gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc diệt nấm bệnh cho thực vật, gia tăng hệ số nhân và
sinh khối tƣơi cho cây nuôi cấy mô. Với tính năng kháng khuẩn, kháng nấm và mang
điện tích dƣơng, bề mặt tiếp xúc lớn nên chitosan liên kết với các điện tích âm trên bề
mặt và dễ dàng đi qua màng tế bào của các loài vi sinh vật. Do đó, chitosan làm thay
đổi tính thấm của màng tế bào dẫn đến màng vi sinh vật không thể trao đổi chất đƣợc
mà chết. Vì vậy chitosan đƣợc ứng dụng nhiều trong việc bảo quản, chế biến nông sản,
ví dụ nhƣ bảo quản thực phẩm và các loại hoa quả và rau (Duy và ctv., 2004), các loại
thịt cá (Miên và ctv., 2003) lọc trong nƣớc quả.
Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì hƣơng vị
tự nhiên, ổn định màu, nhũ tƣơng, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau quả tƣơi, làm
trong nƣớc ép, giữ màu sắc và hƣơng vị tự nhiên của sản phẩm.

7


Bảng 1.2. Một số ứng dụng chitosan trong thực phẩm
(Trung và ctv., 2010)
Ứng dụng

Đối tƣợng

Tạo màng chống Dâu, vải, nhãn, na,

Loại

Dạng

Chitosan

Dung dịch

Chitosan

Dung dịch

Chitosan

Dung dịch

biến nâu, chống mất thanh long, xoài, cà
nƣớc, hạn chế hao rốt, rau diếp.
hụt

lƣợng,

trọng

kháng

nấm,

bảo

quản trái cây, rau.
Kháng

khuẩn, Thịt bò tẩm gia vị,

kháng nấm, chống xúc xích heo, mực,
oxi hóa trong quá cá…
trình bảo quản và
chế biến thịt cá, đậu
phụ, bánh mì.
Chitosan làm chất Nƣớc táo, nƣớc vải,
trợ lắng, làm trong nƣớc chua, rƣợu…
công nghệ sản xuất
nƣớc quả và rƣợu.
Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệp
nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm.
Ngoài ra chitosan còn là vật mang các chất dinh dƣỡng cung cấp cho cây trồng.
Một đặc tính quan trọng của nanochitosan là dễ dàng tạo phức với các hợp chất kim
loại nhƣ Cu, Zn,… để hạn chế hoạt động của các chất này trong môi trƣờng hay liên
kết với mycotoxin là độc tố do nấm tiết ra để hạn chế tác hại của nấm bệnh. Hoạt chất
oligosaccharit, oligoglucan, peptidogulucan trong chitosan có vai trò bảo vệ cấu trúc
màng tế bào kháng lại các nấm bệnh.
Trong lĩnh vực thủy sản đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng chitin/chitosan,
đặc biệt trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, đây chỉ là một số nghiên cứu và
triển khai bƣớc đầu, còn hạn chế so với tiềm năng ứng dụng của chitin/chitosan trong

lĩnh vực thủy sản. Chitin và chitosan đƣợc nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá
8


để kích thích sinh trƣởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trƣờng ao nuôi (Anderson &
Siwicki, 1994; Wanichpongpan & Chandrkrachang, 2002). Ngoài ra, chitosan cũng
đƣợc ứng dụng làm màng bao, làm chất kết dính để tăng độ ổn định của thức ăn tôm
(Trung & Phƣợng, 2005; Phƣợng và ctv., 2008).
Trong khoa học kĩ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuếch đại của kính
hiển vi, xử lý nƣớc thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi in kim loại, protein, phenol,
thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm (Kumar, 2000; Rinaudo, 2006).
Trong công nghệ sinh học, chitin, chitosan và dẫn xuất đƣợc trong công nghệ nuôi
cấy mô tế bào động, thực vât, cố định enzyme, cố định tế bào, làm chất mang DNA.
Chitosan đƣợc ứng dụng khá phổ biến trong xử lý môi trƣờng nhờ khả năng hấp
phụ, tạo phức với các ion kim loại (Pb3+, Hg+, Cd2+, Fe2+, Cu2+ …), các chất màu, khả
năng keo tụ, tạo bông rất tốt với các chất hữu cơ. Do đó, chitin, chitosan đƣợc sử dụng
nhƣ là một trong các tác nhân chính để xử lý nƣớc thải.
1.2. Tổng quan về nanochitosan
1.2.1. Tính chất của nanochitosan
Chitosan đƣợc sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nanochitosan trong những
năm gần đây vì những tính chất ƣu việt của nó ở kích thƣớc nano. Với nhiều tính năng
nhƣ tƣơng thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở
thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dƣợc sinh học, hạt nanochitosan trở thành hệ
thống phân phối thuốc có tiềm năng lớn (Zhang và ctv., 2010).
Nanochitosan do có kích thƣớc siêu nhỏ (từ 10-1000nm) nên dễ dàng đi qua
màng tế bào, có thể đƣa vào cơ thể qua nhiều đƣờng khác nhau nhƣ dùng ngoài da,
dùng qua đƣờng miệng, qua mũi…Nanochitosan có diện tích và điện tích bề mặt cực
lớn nên đƣợc ứng dụng trong sinh y học nhƣ mang thuốc, vaccine, vector chuyển gen,
chống khuẩn, thuốc điều trị ung thƣ…Khi sử dụng nanochitosan làm chất dẫn thuốc,
thuốc điều trị đƣợc bảo vệ bởi những hạt nanochitosan khỏi sự phân hủy sinh học. Do

kích thƣớc rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, đƣa thuốc đến mục
tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị (Tiyaboonchai, 2003).
Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục tiêu
chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển vector
chitosan hƣớng đích thuốc trên những tế bào ung thƣ. Một số công trình tiêu biểu là
điều chế hạt chitosan composite với acid polyacrylic để điều khiển và kéo dài thời gian
9


phóng thích thuốc; điều chế nanochitosan với cholesterol để dẫn thuốc đến mắt; biến
tính với N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đƣờng mũi; tạo phức với
acid deoxycholic để dẫn truyền gen (Gan & Wang, 2007). Ngoài ra, nanochitosan còn
đƣợc nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn (Du và ctv., 2009; Qui và ctv., 2004), ứng
dụng trong thực phẩm chức năng (Chen và ctv., 2006; Chen và ctv., 2005). Nhiều công
trình cũng tiến hành nghiên cứu về kích cỡ, điện tích bề mặt hạt nanochitosan vì đây là
những đặc tính rất quan trọng quyết định hiệu quả gây nhiễm gen, mang kết các phân
tử protein trên hạt nano (Gan và ctv., 2005). Tuy nhiên, các kết quả đạt đƣợc rất khác nhau
(Dudhani, 2010; Mohammadpourdounighi và ctv., 2010).
Ở nƣớc ta, số lƣợng bài nghiên cứu về nanochitosan còn rất ít. Việc tiến hành
phun chất kích thích sinh trƣởng nanochitosan (kích thƣớc 150 nm) cho lúa đã hạn chế
sâu bệnh nên không cần sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (Thiện và ctv., 2010). Nhóm
nghiên cứu của Nguyễn Anh Dũng và ctv (2011) đã sử dụng nanochitosan (kích thƣớc
80 nm) làm tá chất kích thích miễn dịch cho vaccin cúm A/H1N1. Hoạt tính kháng
nấm của phức hệ nanochitosan-tinh dầu nghệ (kích thƣớc trên 100 nm) đã đƣợc thử
nghiệm thành công trên C. albicans, T. mentagrophyte, F. oxysporum và P. italicum
(Cúc và ctv., 2014).
Tại trƣờng đại học Nha Trang, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trang Sĩ Trung
đã có các nghiên cứu bƣớc đầu về chế tạo và ứng dụng nanochitosan từ các nguồn,
khối lƣợng phân tử, độ deacetyl của chitosan khác nhau. Ví dụ: nghiên cứu ứng dụng
nanochitosan thu nhận từ mai mực và vỏ tôm để ứng dụng làm chất bảo quản cho cá

Tra tẩm gia vị.
1.2.2. Phƣơng pháp điều chế nanochitosan
Hiện nay có nhiều phƣơng pháo tạo nanochitosan. Phƣơng pháp đƣợc sử dụng
nhiều nhất là tạo gel ion, ƣu điểm của phƣơng pháp này là quá trình chuẩn bị đơn giản
và không cần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do đó phƣơng
pháp này đƣợc nghiên cứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và thực phẩm chức
năng (Tiyaboonchai, 2003).
Theo Agnihotri (2004), có 5 phƣơng pháp chủ yếu để tạo hạt nanochitosan là:
Phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng (Emulsion cross-linking), phƣơng pháp giọt tụ/kết
tủa (Coacervation/Precipotation), phƣơng pháp hợp nhất giọt nhũ (Emulsion-droplet
coalescence), phƣơng pháp tạo gel ion (Ionic gelation) và phƣơng pháp mixen đảo
(Reverse micellar).
10


1.2.2.1. Phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng
Hỗn hợp nhũ tƣơng nƣớc trong dầu (w/v) đƣợc tạo ra bằng cách phân tán dung
dịch chitosan trong dầu. Những giọt lỏng đƣợc làm bền bởi chất hoạt động bề mặt.
Dung dịch nhũ tƣơng sau đó đƣợc khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợp nhƣ
glutaraldehyde. Hai nhóm –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –NH2 của
chitosan để khâu mạch tạo hạt nanochitosan (Agnihotri và ctv., 2004).
1.2.2.2. Phƣơng pháp giọt tụ/kết tủa
Phƣơng pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch
kiềm. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với
dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc ethandiamine.
Dung dịch chitosan sẽ đƣợc một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để chế tạo hạt
nano (Agnihotri và ctv., 2004).
1.2.2.3. Phƣơng pháp hợp nhất giọt nhũ tƣơng
Phƣơng pháp này lần đầu đƣợc sử dụng vào năm 1999. Phƣơng pháp này sử
dụng nguyên tắc của cả hai phƣơng pháp: tạo nối ngang nhũ tƣơng và kết tủa. Thay vì

sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan kết hợp
với các giọt NaOH. Một hệ nhũ tƣơng bền chứa dung dịch chitosan cùng với thuốc tạo
ra trong paraffin lỏng. Đồng thời, một hệ nhũ tƣơng bền khác chứa dung dịch chitosan
và NaOH cũng đƣợc tạo ra theo cách nhƣ trên. Khi cả hai hệ nhũ tƣơng này đƣợc trộn
lại với tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một cách ngẫu nhiên, hợp lại
và kết tủa thành những hạt nhỏ.
1.2.2.4. Phƣơng pháp tạo gel ion
Cơ chế của phƣơng pháp này dựa trên tƣơng tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện
dƣơng và một polyanion nhƣ tripolyphosphate. Kỹ thuật này có ƣu điểm là giai đoạn
chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trƣờng nƣớc. Đầu tiên chitosan đƣợc hòa tan
vào dung dịch acid acetic. Sau đó chitosa đƣợc trộn lẫn với polyanion để tạo hạt
nanochitosan dƣới điều kiện khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng. Kích thƣớc và điện tích
bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỉ lệ chitosan và polyanion khác nhau.

11


1.2.2.5. Phƣơng pháp mixen đảo
Trong phƣơng pháp này, ngƣời ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung môi
hữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo. Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc đƣợc
thêm từ từ với tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch. Pha lỏng đƣợc giữ
sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ trong suốt. Sau đó tác nhân tạo nối ngang dƣợc
thêm vào và khuấy qua đêm. Cô quay lại dung môi. Phần còn lại phân tán trong nƣớc.
Dung dịch muối thích hợp đƣợc thêm vào để kết tủa chất hoạt động bề mặt. Hỗn hợp
đƣợc ly tâm. Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang thuốc đƣợc chiết ra, cho qua
màng thấm tách 1 giờ. Đông cô chất lỏng thu đƣợc cho ta bột thuốc.
Những yếu tố ảnh hƣởng đến tính chất hạt nanochitosan nhƣ kích thƣớc hạt, sự
tích điện bề mặt là khối lƣợng phân tử và độ deacetyl hóa của chitosan.
Sự lựa chọn phƣơng pháp tổng hợp nanochitosan còn phụ thuộc vào bản chất
của những phân tử hoạt động cũng nhƣ những yêu cầu dẫn truyền khác nhau (Gan và

ctv., 2007).
1.2.3. Ứng dụng của nanochitosan
1.2.3.1. Chất mang dẫn truyền thuốc
Hạt nanochitosan có kích thƣớc nhỏ nên nó thích hợp cho nhiều con đƣờng sử
dụng thuốc khác nhau:
- Sử dụng bên ngoài đƣờng tiêu hóa: Dẫn truyền những dƣợc chất kháng bệnh
nhƣ là kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm và kháng kí sinh là một hƣớng sử dụng
khác của hạt nano (Bender, 1996; Page-Clisson, 1998; Soma, 2000). Chỉ số điều trị
của thuốc kháng nấm thấp, thời gian bán hủy của những dƣợc chất kháng virus và khả
năng thâm nhập vào tế bào bị bệnh trong khoang nội bào của thuốc kháng sinh kém
làm cho những hạt nano trở thành những ứng viên dẫn truyền lý tƣởng. Những hạt
nano một mặt nâng cao hiệu quả điều trị, mặt khác làm giảm tác dụng phụ độc hại của
thuốc. Trên lý thuyết, nanochitosan là hệ thống chất mang hấp dẫn cho những loại
thuốc này vì chúng có nhiều thuận lợi nhƣ có bề mặt ƣa nƣớc và kích thƣớc nano nhỏ
hơn 10nm.
- Sử dụng qua đƣờng uống: Ý tƣởng hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị
enzyme phân hủy trong bộ máy tiêu hóa dẫn đến sự phát triển các hạt nano thành
những hệ thống dẫn truyền những phân tử lớn, protein và polynucleotide. Phƣơng
pháp này đƣợc nghiên cứu rộng rãi sau một báo cáo rằng lƣợng đƣờng trong máu của
12


những con chuột mắc bệnh tiểu đƣờng giảm sau khi uống những hạt nano insulin
(Damgi, 1990). Kích thƣớc hạt nhỏ hơn 500nm là một yếu tố then chốt cho phép vận
chuyển qua niêm mạc ruột theo cơ chế endocyotic. Bên cạnh enzyme, màng nhầy ngăn
cản sự khuếch tán của thuốc và hạt nano, những rào cản hấp thụ biểu mô là chƣớng
ngại chính chống lại sự hấp thụ thuốc protein qua thành ruột. Do đó, hoạt tính của
thuốc có thể đƣợc cải thiện bằng cách kiểm soát kích thƣớc hạt cùng với kéo dài thời
gian thuốc trong bộ máy tiêu hóa. Trong số những hạt nano polymer, hạt nanochitosan
là chất dẫn thuốc lý tƣởng vì chúng làm tăng mức hấp thu thuốc (Tiyaboonchai, 2003).

- Sử dụng qua đƣờng mắt: Các hạt nano đƣợc nhận thấy là chất tiềm năng để
dẫn truyền qua đƣờng mắt. Nhiều thí nghiệm cho thấy hạt nano có khuynh hƣớng bám
chặt vào bề mặt biểu mô mắt. Kết quả kéo dài thời gian lƣu giữ, tốc độ đào thải thuốc
chậm hơn so với những phƣơng pháp điều trị mắt truyền thống, do đó cải thiện dƣợc
tính của thuốc. Vì vậy, những hạt nano đã đƣợc dùng để dẫn thuốc kháng viêm, kháng
dị ứng cho mục tiêu điều trị viêm mắt.
Chitosan đã đƣợc sử dụng nhƣ là chất mang dẫn thuốc điều trị chứng viêm
mắt bởi vì tác động thúc đầy mức hấp thu thuốc. Chitosan không chỉ gia tăng thời gian
tƣơng tác với giác mạc qua tƣơng tác tĩnh điện giữa điện tích dƣơng của nó và niêm
mạc tích điện âm, nó còn có khả năng xuyên qua lớp niêm mạc, nâng cao dƣợc tính
của thuốc. Nhóm của Felt (1999) tìm thấy dung dịch chitosan kéo dài thời gian lƣu giữ
thuốc kháng sinh trên giác mạc của thỏ. Những tác động tƣơng tự cũng đƣợc quan sát
thấy khi sử dụng những hạt nanochitosan. Những hạt này đƣợc giữ trên giác mạc và
kết mạc của thỏ ít nhất 24 giờ. Nhóm của De Campos (2001) phát hiện thấy sau khi sử
dụng những hạt nanochitosan trên thỏ, hầu hết thuốc đƣợc tìm thấy trong những mô
ngoài mắt, giác mạc và kết mạc trong khi chỉ một lƣợng thuốc nhỏ đƣợc tìm thấy trong
những mô trong mắt, mống mắt và chất dịch lỏng (Tiyaboonchai, 2003).
1.2.3.2. Phân loại theo ứng dụng trong điều trị bệnh
- Hoạt tính kháng ung thƣ:
L.Qi (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thƣ trực tiếp của hạt
nanochitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thƣ và hoạt tính
cảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thƣ là sarcoma S180 và hepatoma H22.
Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lƣợng tế bào ung thƣ với liều uống 2,5mg/kg

13


hạt nanochitosan trên S180 và H22 là 52-59% và liều 0,5mg/kg là 43-53% trong khi
đó chitosan chỉ là 30% (Dũng, 2010).
Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thƣ doxorubicin để ức chế

khối u trên chuột. Kết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicin độc lập thì khối u chuột vẫn
tăng lên 900mm3 sau 50 ngày là chết, trong khi đó ở thí nghiệm ly giải chậm
doxorubicin trong hạt nanochitosan kích thƣớc khối u giảm chỉ con 170mm3 và chuột
vẫn sống sau 90 ngày (Dũng, 2010).
Kết quả cho thấy kích thƣớc hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng ung thƣ
càng cao. Hoyoung (2008) nghiên cứu PEG-hạt nano chitosan làm tá chất thuốc chống
tới tế bào ung thƣ. Kích thƣớc hạt nano khoảng 350nm. Hiệu quả chống ung thƣ khi sử
dụng nano chitosan rất cao trên tế bào gây ung thƣ phổi ở chuột A549 đồng thời làm
giảm độc tính của thuốc chống ung thƣ.
- Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc:
Angela (2001) nghiên cứu thải chậm thuốc cyclosporine A (Cry A) bằng cách
hấp phụ trong dung dịch chitosan và hạt nanochitosan. Lƣợng thuốc phóng thích trong thí
nghiệm hấp phụ trên hạt nano chitosan luôn luôn gấp 2,5-3 lần so với đối chứng là dung
dịch Cry A. Kết quả là nông độ Cry A trong máu thỏ thí nghiệm luôn luôn cao hơn so với
nhóm đối chứng và hấp phụ trong dung dịch (Dũng, 2010).
El-Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nanochitosan để cố định thuốc
cyclosporine A để uống, kích thƣớc hạt nano là 150nm. Kết quả cho thấy hiệu suất
mang thuốc là 94%, nồng độ cyclosporine trong máu là 2760ng/ml cao gấp 2,5 lần so
với hạt nano sodium glycholate. Hoạt tính của cyclosporine A cố định trong hạt
nanochitosan tăng 72%, gelatin nanochitosan chỉ tăng 18%, riêng sodium glycholate
lại giảm tới 36% so với đối chứng (Dũng, 2010).
- Chất mang dẫn truyền vaccine: Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt
nanochitosan để mang vaccine tetanus qua niêm mạc mũi. Amadi (2007) nghiên cứu
sử dụng nano trimethyl chitosan làm tá chất cho một tiểu đơn vị (subunit) của vaccine
cúm H3N2. Các hạt nanochitosan cho thấy là chất dẫn truyền hiệu quả cho nhiều phân
tử lớn qua đƣờng mũi, khí quản, miệng và niêm mạc mắt (Janes, 2001; Lubben, 2001).
- Chất mang dẫn truyền gen: Những hạt nanochitosan có kích thƣớc từ 20500nm nhỏ hơn những hệ thống polymer khác nên thâm nhập vào tế bào thuận lợi hơn
qua cơ chế endocytosis hoặc pinocytosis, làm tăng tốc độ gây nhiễm (Mao, 1997; Sato,
2001).
14