NGHIÊN cứu THU NHẬN và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP gây BỆNH THỐI NHŨN TRÊN cà CHUA SAU THU HOẠCH của CHITOSAN từ MAI mực ỐNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG NGỌC CƢƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN
TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ
MAI MỰC ỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

KHÁNH HÒA - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG NGỌC CƢƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN
TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ
MAI MỰC ỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

NGÀNH ĐÀO TẠO : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN
MÃ SỐ

: 62540105

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG
PGS.TS. NGUYỄN ANH TUẤN

KHÁNH HÒA - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả
trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình.
Tác giả luận án
Hoàng Ngọc Cƣơng

i


LỜI CẢM ƠN
Luận án hoàn thành là nhờ có nhà trƣờng, các tổ chức có liên quan tạo điều kiện;
thầy cô, bạn bè, gia đình giúp đỡ và hỗ trợ. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
PGS. TS. Trang Sĩ Trung và PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn đã định hƣớng, chỉ
dẫn và động viên trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận án này.
Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, các Phòng, Ban, Khoa, Viện liên
quan đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án.
Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Bình Dƣơng, Lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh
học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án.
TS. Nguyễn Văn Hòa, Ths. Nguyễn Công Minh đã tận tình hƣớng dẫn, động
viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi trong quá trình thực hiện luận án.
TS. Huỳnh Thanh Tùng, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa, TS. Khổng Trung Thắng

đã giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quí báu.
Các cán bộ kỹ thuật của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, Trung tâm
Thí nghiệm Thực hành - Trƣờng Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện trong
quá trình tiến hành nghiên cứu.
Cuối cùng, xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình, những ngƣời thân yêu luôn là
nguồn động viên và chia sẻ mọi khó khăn để luận án đƣợc hoàn thành.
Nha Trang, ngày

tháng

Tác giả luận án

Hoàng Ngọc Cƣơng

ii

năm 2017


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT...................................................................vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................ix
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ......................................... xii
PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 5
1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU

NHẬN -CHITIN........................................................................................................... 5
1.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến ...... 5
1.1.2. Cấu trúc và thành phần hóa học của mai mực ống Loligo sp. .............................. 6
1.2. TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN ................................................... 15
1.2.1. Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin ............ 15
1.2.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan ........................................................ 19
1.2.3. Phƣơng pháp thu nhận chitin và chitosan ........................................................... 22
1.2.4. Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan .................................. 34
1.3. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH...... 37
1.3.1. Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch ......................... 37
1.3.2. Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch ............. 39
1.3.3. Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn ........................ 40
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 43
2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................................. 43
2.1.1. Mai mực ống Loligo sp....................................................................................... 43
2.1.2. Trái cà chua Lycopersicon esculetum ................................................................. 43
iii


2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu ........................................................................ 44
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 44
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................................................................ 44
2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin ...................................... 47
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan ......... 53
2.2.4. Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn ................ 60
2.2.5. Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối
nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch của β-chitosan ở điều kiện in vitro và in vivo ............. 62
2.3. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU ............................ 69
2.3.1. Phƣơng pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản ...................................... 69
2.3.2. Phƣơng pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng ................ 69

2.3.3. Phƣơng pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan .................................. 69
2.3.4. Phƣơng pháp cắt mạch chitosan ......................................................................... 70
2.3.5. Phƣơng pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn .................. 71
2.3.6. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora ......................... 72
2.3.7. Phƣơng pháp gây bệnh nhân tạo......................................................................... 73
2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro.... 73
2.3.9. Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo .... 73
2.3.10. Phƣơng pháp xác định tổng hàm lƣợng phenol tổng số trong trái cà chua ............. 74
2.3.11. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................ 74
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 75
3.1. Thành phần hóa học của mai mực LOLIGO SP ..................................................... 75
3.1.1. Thành phần hóa học cơ bản ................................................................................ 75
3.1.2. Thành phần khoáng ............................................................................................ 77
3.1.3. Thành phần acid amin ........................................................................................ 78
3.2. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN
TỪ MAI MỰC LOLIGO SP......................................................................................... 80
iv


3.2.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hƣởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá
trình khử protein trong mai mực Loligo sp. ................................................................. 80
3.2.2. Đánh giá ảnh hƣởng các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu
quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin ................................................ 82
3.2.3. Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống .............................................. 90
3.3. ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI
MỰC LOLIGO SP. ....................................................................................................... 99
3.3.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hƣởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian
đến hiệu quả deacetyl -chitin ...................................................................................... 99
3.3.2. Ảnh hƣởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu
quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan .................................................................102

3.3.3. Điều kiện deacetyl lần 2 ................................................................................... 108
3.3.4. Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan ...................................109
3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp. ..........116
3.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN ..........................................117
3.4.1. Nghiên cứu phân lập, xác định chủng Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà
chua sau thu hoạch ......................................................................................................117
3.4.2. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro ............................. 124
3.4.3. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo ....................................128
3.4.4. Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan từ mai
mực Loligo sp. .............................................................................................................136
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 138
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ .......................................140
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................141
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

AAS

Atomic absorption
spectrophotometric

Phổ hấp thu nguyên tử

AOAC

Association of Official Analytical
Chemists

Hiệp hội các nhà hoá phân tích

ANOVA

Analysis of Variance

Phân tích phƣơng sai

-chitosan

Chitosan from β-chitin

Chitosan từ β-chitin

χcr

Degree of crystallinity

Độ kết tinh

C95

Tomato C95

Giống cà chua C95

CrI

Crystalline Index

Chỉ số kết tinh

DA

Degree of acetyl

Độ acetyl

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

DD

Degree of deacetyl

Độ deacetyl

DP

Deproteinization

Quá trình khử protein

DM

Demineralization

Quá trình khử khoáng

DC

Decolorization

Quá trình khử màu

Ecc

Erwinia carotovora subsp.
carotovora

Erwinia carotovora subsp.
carotovora

Eca

Erwinia carotovora subsp.
atroseptica

Erwinia carotovora subsp.
atroseptica

Echr

Erwinia chrysanthemi

Erwinia chrysanthemi

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Ethylenediaminetetraacetic axit

FTIR

Fourier Transform Infrared

Quang phổ hấp thụ hồng ngoại

GlcN

D-glucosamine

D-glucosamine

GlcNAc

N-acetyl glucosamine

N-acetyl glucosamine

MIC

Minimum Inhibitory
Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

MHS

Mark-Houwink-Sakurada
equation

Phƣơng trình Mark-HouwinkSakurada

Mw

The average molecular weight

Khối lƣợng phân tử trung bình

NL/DM

Material / solvent

Nguyên liệu / dung môi
vi


Nd

Not detected

Không phát hiện

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

OD

Optical density

Độ hấp phụ quang học

Pl

Pectate lyases

Enzyme phân giải pectin

Pnl

Pectin lyases

Enzyme phân giải pectin

Pme

Pectin methylesterases

Enzyme phân giải pectin

PG

Potato glucose

Môi trƣờng potato glucose

PCR

Polymerase chain reaction

Phƣơng pháp khuếch đại gen

PDA

Potato dextrose agar

Môi trƣờng thạch khoai tây

rARN

Ribosomal ribonucleic

ARN riboxom

SEM

Scanning Electron Microscope

Kính hiển vi điện tử quét

Size-exclusion chromatographySEC-MALLS
Multi-angle static light scattering

Phƣơng pháp sắc ký loại trừ kết
hợp với phân tán ánh sáng tĩnh
đa góc

sp.

Species

Loài

spp.

Species pluriel

Nhiều loài

subsp.

Subspecies

Phân loài

SPSS

Statistical Package for the Social
Sciences

Phần mềm thống kê

SS

Sum of Squares

Tổng bình phƣơng độ lệch

TEM

Transmission Electron
Microscope

Kính hiển vi điện tử truyền qua

TLTK

References

Tài liệu tham khảo

VASEP

Vietnam Association of Seafood
Exporters and Producers

Hiệp hội chế biến và xuất khẩu
Thuỷ sản Việt Nam

VNF

Viet Nam Food

Công ty Cp Việt Nam Food

XRD

X-ray powder diffraction

Phổ nhiễu xạ tia X

wt.%

Weight percent

Phần trăm theo khối lƣợng

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong nguyên liệu của một số loại phế liệu thủy sản
thông dụng để sản xuất chitin ..........................................................................................7
Bảng 1.2. Thành phần hóa học trong một số mai mực ....................................................8
Bảng 1.3. Thành phần khoáng của nguyên liệu mai mực ...............................................8

Bảng 1.4. Các dung môi thƣờng sử dụng để hòa tan chitosan .....................................20
Bảng 1.5. Tính chất của chitosan ảnh hƣởng bởi độ deacetyl ......................................21
Bảng 1.6. Thành phần và tính chất của một số loại chitosan thƣơng mại ....................21
Bảng 1.7. Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguyên liệu
khác nhau .......................................................................................................................28
Bảng 1.8. Nguồn nguyên liệu thủy sản, điều kiện xử lý và loại chitin............................30
Bảng 1.9. Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ các nguồn chitin khác nhau ..........32
Bảng 1.10. Khối lƣợng phân tử trung bình (Mw) của chitosan ở các điều kiện deacetyl
khác nhau .......................................................................................................................34
Bảng 1.11. Bảng tổng hợp các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn (soft rot) ..............41
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của mai mực ống Loligo sp ..............................75
Bảng 3.2. Thành phần khoáng trong mai mực Loligo sp., các loại mực khác và vỏ tôm.....77
Bảng 3.3. So sánh thành phần acid amin trong mai mực ống Loligo sp. và kết quả tham khảo ....79
Bảng 3.4. Tính chất của mai mực ống và sản phẩm β-chitin ........................................92
Bảng 3.5. Thành phần khoáng trong mai mực và sản phẩm β-chitin ............................93
Bảng 3.6. Hàm lƣợng acid amin trong mai mực và sản phẩm β-chitin .........................93
Bảng 3.7. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 25oC của β-chitin ....98
Bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi chitin và chitosan ............................................................110
Bảng 3.9. So sánh chất lƣợng của thƣơng mại chitosan và β-chitosan .......................110
Bảng 3.10. Hàm lƣợng acid amin còn lại trong β-chitin và β-chitosan ......................111
Bảng 3.11. Thành phần khoáng và kim loại trong mai mực, β-chitin và β-chitosan ..... 113
Bảng 3.12. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 70oC của β-chitosan..115
Bảng 3.13. Mẫu cà chua thu nhận từ các chợ nông sản ..............................................118
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý của các dòng vi khuẩn ..........120
Bảng 3.15. Khả năng kháng khuẩn Erwinia carotovora của chitosan với khối lƣợng
phân tử khác nhau và chitosan thƣơng mại (C-120) ...................................................125
viii


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp. (b) Mai mực. .. 5
Hình 1.2. Mô hình cấu trúc chitin trong mai mực nguyên liệu .......................................9
Hình 1.3. Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với
astaxanthin và các phân tử khác trong nguyên liệu .......................................................10
Hình 1.4. Mô hình cấu trúc lớp vỏ tôm .........................................................................10
Hình 1.5. Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống ..................................11
Hình 1.6. Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. .........12
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học phân tử chitin .....................................................................16
Hình 1.8. Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, (b) β-chitin, (c) γ-chitin ...............16
Hình 1.9. Cấu trúc phân tử (a) α-chitin (b) β-chitin ......................................................17
Hình 1.10. Cấu trúc α-chitin và -chitin ......................................................................18
Hình 1.11. Phổ XRD của α-chitin và β-chitin. ..............................................................18
Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của chitosan. ....................................................................19
Hình 1.13. Sơ đồ quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủy sản .....................22
Hình 1.14. Phản ứng deacetyl chitin thu chitosan. ........................................................31
Hình 1.15. Cà chua bị bệnh thối nhũn (soft rot). ...........................................................39
Hình 2.1. Nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. ............................................................43
Hình 2.2. Nguyên liệu cà chua Lycopersicon esculentum. ............................................44
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. .................................................................45
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và
thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu. ...........................47
Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình khử
protein mai mực ống. .....................................................................................................49
Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của thời gian .....................................51
Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến quá trình khử
protein. ...........................................................................................................................52
Hình 2.8. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH
và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin. .................................................................54
ix

Hình 2.9. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình deacetyl
-chitin...........................................................................................................................55
Hình 2.10. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến quá trình
deacetyl -chitin. ...........................................................................................................57
Hình 2.11. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của yếu tố thời gian đến quá trình
deacetyl -chitin. ...........................................................................................................58
Hình 2.12. Sơ đồ thí nghiệm deacetyl lần 2. .................................................................59
Hình 2.13. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau
thu hoạch. .......................................................................................................................61
Hình 2.14. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây
bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan. ..............................................62
Hình 2.15. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. của chitosan
ở điều kiện in vitro.........................................................................................................64
Hình 2.16. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan ở
điều kiện in vivo. ............................................................................................................65
Hình 2.17. Sơ đồ thí nghiệm so sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan từ
mai mực ống và chitosan thƣơng mại............................................................................67
Hình 3.1. Hàm lƣợng protein còn lại sau quá trình khử protein dƣới tác động của 3 yếu
tố (nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian). ........................................................................81
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein
và sự cắt mạch β-chitin. ..................................................................................................84
Hình 3.3. (a) Ảnh của mực ống, (b) mai mực ống và (c) sản phẩm β-chitin. ...............90
Hình 3.4. Hình SEM chụp bề mặt cắt của (a) mai mực ống và (b) sản phẩm β-chitin. .....95
Hình 3.5. Phổ XRD của mai mực ống và sản phẩm β-chitin thu đƣợc từ mai mực......96
Hình 3.6. Phổ FTIR của nguyên liệu mai mực ống và sản phẩm β-chitin. ...................97
Hình 3.7. Phổ H1 NMR của β-chitin. ............................................................................98
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả deacetyl. ..101
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến DD và
Mw của chitosan. ..........................................................................................................104

Hình 3.10. Ảnh hƣởng của quá trình deacetyl lần 2 đến DD và Mw của chitosan. ..........108
Hình 3.11. Sản phẩm -chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp. ..............................109
x


Hình 3.12. Hình SEM của (a) mai mực ống, (b) β-chitin và (c) chitosan. ..................112
Hình 3.13. Phổ XRD của mai mực, β-chitin và β-chitosan. ........................................113
Hình 3.14. Phổ FTIR sản phẩm chitosan từ (a) β-chitosan, (b) α-chitosan thƣơng mại
và (c) β-chitin. .............................................................................................................114
Hình 3.15. Phổ H1-NMR của β-chitosan. ....................................................................114
Hình 3.16. Phổ SEC-MALLS của β-chitosan. ............................................................115
Hình 3.17. Quy trình thu nhận β-chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp. ................116
Hình 3.18. Mẫu trái cà chua bệnh thối nhũn thu nhận từ chợ nông sản. .....................118
Hình 3.19. (a) Mẫu khuẩn lạc đƣợc chọn; (b) Mẫu vi khuẩn nhuộm Gram. ...............119
Hình 3.20. Trình tự một đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Erwinia carotovora...121
Hình 3.21. Hình SEM chủng vi khuẩn Erwinia carotovora. ......................................122
Hình 3.22. Vết bệnh thối nhũn trên trái cà chua..........................................................122
Hình 3.23. Sơ đồ phát triển bệnh thối nhũn trên cà chua. ...........................................123
Hình 3.24. (a) Khả năng kháng khuẩn của S-655 và (b) của S-138 ở các nồng độ khác
nhau. C-120 là chitosan thƣơng mại với Mw là120 kDa. ............................................126
Hình 3.25. Hình TEM của vi khuẩn Erwinia sp. đƣợc xử lý trong dung dịch β-chitosan
1% (S-138) trong 60 phút. (a) Vi khuẩn Erwinia carotovora; (b) xử lý sau 15 phút; (c)
xƣ lý sau 30 phút; (d) kết quả sau 60 phút. .................................................................127
Hình 3.26. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-1740 ở điều kiện in vivo. .............129
Hình 3.27. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-655 ở điều kiện in vivo. ...............130
Hình 3.28. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-138 ở điều kiện in vivo. ...............131
Hình 3.29. Kích thƣớc vết bệnh bên trong đƣợc xử lý S-138 trong (a) 24 giờ , (b) 36 giờ. ..132
Hình 3.30. So sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn ở điều kiện In vivo của S-138 và
chitosan thƣơng mại C-120 (a) kích thƣớc vết bệnh bên ngoài và (b) kích thƣớc vết
bệnh bên trong. ............................................................................................................133

Hình 3.31. Kích thƣớc vết bệnh bên trong và bên ngoài khi xử lý chitosan S-138 và
chitosan thƣơng mại C-120 sau 36 giờ. .......................................................................134
Hình 3.32. Tổng hàm lƣợng phenol tổng số trong trái cà chua sau khi đƣợc xử lý các
loại chitosan có phân tử lƣợng khác nhau sau thời gian 24 và 72 giờ. .......................135
Hình 3.33. Quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng chitosan. ........................136

xi


TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án:

Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia
sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan
từ mai mực ống.

Ngành:

Công nghệ chế biến thủy sản

Mã số:

62540105

Nghiên cứu sinh:

Hoàng Ngọc Cƣơng

Khóa:

2011

Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Trang Sĩ Trung
PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn
Cơ sở đào tạo:

Trƣờng Đại học Nha Trang

Nội dung:
1. Đã xác định đƣợc thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp.
thải ra sau quá trình chế biến tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang,
làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo.
2. Đã xác định đƣợc điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn
thƣơng mại. Sản phẩm -chitin thu đƣợc có khối lƣợng phân tử trung bình lớn (Mw) và
là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực
kỹ thuật cao. Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn.
3. Đã xác định đƣợc điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu
chuẩn thƣơng mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lƣợng phân tử lớn.
Sản phẩm chitosan thu đƣợc là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo
chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao
nhƣ y dƣợc, y sinh và công nghệ thực phẩm. Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản
xuất ở qui mô lớn.
4. Đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái
cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng chitosan có khối
lƣợng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo
quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng
khuẩn của chitosan.
NGHIÊN CỨU SINH
Hoàng Ngọc Cƣơng
xii

KEY FINDINGS
Thesis title: Preparation of chitosan from squid pens and its antibacterial activity
against Erwinia sp. caused soft rot on tomato fruits.
Speciality

:

Aquatic Products Technology

Code

:

62540105

Ph.D Student :

Hoang Ngoc Cuong

Course

2011

:

Supervisors :

1. Assoc. Prof. PhD. TRANG SI TRUNG

2. Assoc. Prof. PhD. NGUYEN ANH TUAN

Intitution

:

Nha Trang University

Key findings:
- The chemical composition of the Loligo sp. squid pens from seafood
processing companies in Kien Giang province was reported that can be used for futher
various studies.
- The extraction conditions of -chitin with a commercial standard from squid
pens was reported. The obtained -chitin with a high molecular weight can be used to
prepare chitosan with a high purity and high molecular weight for various applications.
Those extraction conditions can be applied in large-scale production.
- The deacetylation conditions of -chitin for production of chitosan with a
commercial standard (Mw >6338 kDa, DD>90%) was reported. The obtained chitosan
can be used for medicine, pharmacy, food and agriculture applications. Those
deacetylation conditions can be applied in large-scale production.
- The antibacterial activity of chitosan against Erwinia carotovora caused soft
rot on tomato fruits in vitro and in vivo was reported. The lower moleculer weight of
chitosan is used, the higher activity is observed.
Ph.D Student

Hoang Ngoc Cuong

xiii

PHẦN MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển nhanh chóng về số lƣợng và chất lƣợng của ngành công
nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy sản, hằng năm Việt Nam đã thải ra hàng chục ngàn
tấn phế liệu sau chế biến. Hầu hết các phế liệu thủy sản chỉ đƣợc bán thô hoặc chế biến
để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế thấp, trong khi đây là nguồn nguyên liệu có
thể sản xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng và chất lƣợng cao. Vì vậy, hƣớng
nghiên cứu thu nhận và ứng dụng các polyme sinh học từ nguồn phế liệu thủy sản
đang đƣợc của các nhà quản lý, nhà khoa học và doanh nghiệp quan tâm.
Trong số nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu thủy sản, chitin và
chitosan (sản phẩm của quá trình deacetyl chitin) là 2 polyme sinh học có nhiều tính
chất đặc biệt nhƣ khả năng tƣơng thích sinh học cao, khả năng tạo màng, tạo gel, phân
giải chậm, kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn. Do đó, chitin và chitosan đã và
đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dƣợc, sinh học, công
nghệ thực phẩm, xử lý môi trƣờng, dệt nhuộm,... Ƣớc tính mỗi năm có khoảng 10.000
tấn chitin và chitosan đã đƣợc sản xuất, sử dụng trên toàn thế giới nhƣng hầu hết đƣợc
thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ. Tuy nhiên, α-chitin/chitosan thƣờng có độ rắn cao,
khối lƣợng phân tử thấp và độ tinh sạch chƣa cao vì bản chất của nguồn nguyên liệu
thu nhận là vỏ giáp xác có chức năng bảo vệ cơ thể sinh vật bên trong nên đƣợc cấu
tạo rất phức tạp và rắn chắc. Hơn nữa trong nguyên liệu vỏ giáp xác ngoài thành phần
chitin còn chứa nhiều khoáng, protein và chất màu nên quá trình sản xuất phải qua
nhiều công đoạn tách chiết, sử dụng nhiều hoá chất gây ô nhiễm.
Mai mực ống có chứa hàm lƣợng khoáng thấp, lƣợng β-chitin khá cao (> 35%),
chitin này có khối lƣợng phân tử lớn gấp 3 lần α-chitin và hầu nhƣ không chứa các
kim loại nặng nhƣ Pb, Hg, As nên có độ tinh khiết cao [36, 79, 95]. Do đó, đây là
nguồn nguyên liệu cần thiết để sản xuất ra loại β-chitin/chitosan có khối lƣợng phân tử
lớn và độ tinh khiết cao để ứng dụng trong lĩnh vực nhƣ tạo gel trong mỹ phẩm, màng
kháng viêm, màng phân giải thuốc, chỉ khâu cấy ghép trong phẫu thuật, kỹ thuật mô
cấy ghép da nhân tạo [54, 89, 151]. Ngoài ra, β-chitin/chitosan đã đƣợc chứng minh có
độ rắn thấp, độ xốp cao nên dễ dàng deacetyl và đƣợc ứng dụng trong nuôi cấy mô, cố
định tế bào và enzyme, phân giải thuốc chậm mà các tính chất này vƣợt trội so với αchitin/chitosan. Tại Việt Nam, nguồn phế liệu mai mực thải ra sau quá trình chế biến

1


ƣớc tính đạt khoảng 10-15 tấn/tháng [58, 8]. Tuy nhiên, nguồn phế liệu này chủ yếu là
phơi khô, bán thô với giá thành thấp, do đó gây lãnh phí tài nguyên. Trong khi, đây là
nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận β-chitin/chitosan chất lƣợng cao. Hơn nữa theo chúng
tôi tìm hiểu thì chƣa có một nghiên cứu chính thức và có hệ thống đầy đủ nào đƣợc công
bố tại Việt Nam về quy trình thu nhận, đánh giá tính chất và ứng dụng β-chitin/chitosan
tách chiết từ mai mực ống.
Xuất khẩu nông sản Việt Nam giai đoạn 2012-2016 ƣớc đạt 15 tỷ USD/năm,
góp phần đáng kể phát triển nền kinh tế. Tuy nhiên, công nghệ sau thu hoạch chƣa
đƣợc áp dụng hiệu quả nên chất lƣợng nông sản còn thấp, hạn chế khả năng xuất khẩu,
tỷ lệ thất thoát sau thu hoạch ở mức cao. Trong đó, bệnh thối nhũn trên trái cà chua do
vi khuẩn Erwinia sp. đã và đang gây thiệt hại 10-30% tổng sản lƣợng sau thu hoạch
[25, 77, 9]. Các hóa chất thƣờng dùng để kháng bệnh này là thủy ngân clorua, dung dịch
formaldehyde, dung dịch natri hypocloric 12%, hydroxymercurinitrophenol 12% và
hydromercurichloride phenol 2% [24, 25, 9]. Đây là các hóa chất độc hại đối với ngƣời
nông dân và ngƣời tiêu dùng nếu không đƣợc kiểm soát chặt chẽ. Ngoài ra, một số kỹ
thuật di truyền để kiểm soát bệnh trƣớc và sau thu hoạch cũng đƣợc áp dụng. Tuy
nhiên, các kỹ thuật này có giá thành cao và khó triển khai thực tế ở qui mô lớn. Do đó,
phƣơng pháp sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn nhƣ chitosan là
rất cần thiết. Thực tế, chitosan điều chế từ α-chitin đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng để
kháng khuẩn và kháng nấm có hiệu quả trong quá trình bảo quản sau thu hoạch trên
nhiều đối tƣợng nhƣ bơ, xoài, nho và ớt [25, 9]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy
chitosan thu đƣợc từ β-chitin có tính kháng khuẩn và kháng nấm cao hơn so với thu
đƣợc từ α-chitin [79, 134]. Do đó, chitosan này đƣợc kỳ vọng sẽ có hiệu quả kháng
khuẩn cao đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây ra bệnh thúi nhũn trên trái cà chua.
Từ những vấn đề thực tế đƣợc nêu, luận án này tiến hành nội dung “Nghiên cứu
thu nhận và đ nh gi

hả n ng h ng huẩn Erwinia sp. g

ệnh thối nh n tr n cà

chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống”. Đây là cơ sở khoa học cần thiết để
thu nhận các sản phẩm β-chitin và chitosan có giá trị cao từ mai mực ống ở Việt Nam và
nâng cao giá trị kinh tế của nguồn phế liệu mực ống. Đồng thời, chứng minh và bổ sung
đầy đủ hơn về khả năng kháng khuẩn của chitosan từ -chitin làm đa dạng hóa các ứng
dụng của chitosan trong sản xuất nông nghiệp bền vững.
2


Mục ti u nghi n cứu:
1. Thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thƣơng mại từ nguồn phế liệu mai mực
Loligo sp. thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu.
2. Sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn thƣơng mại từ -chitin thu nhận ở trên.
3. Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chitosan đối với bệnh thối nhũn trên trái
cà chua sau thu hoạch do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra.
Đối tƣợng nghi n cứu: Luận án nghiên cứu trên đối tƣợng phế liệu mai mực Loligo
sp. đƣợc thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang thải ra sau
quá trình chế biến mực ống xuất khẩu ở dạng tƣơi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,01,5 cm và độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm.
Phạm vi và nội dung nghi n cứu: Để đạt đƣợc 3 mục tiêu nghiên cứu, luận án tập
trung nghiên cứu, đánh giá làm rõ 4 nội dung:
1. Xác định thành phần hóa học cơ bản, các acid amin và kim loại của nguồn phế
liệu mai mực Loligo sp.
2. Khảo sát, đánh giá ảnh hƣởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl,
nhiệt độ và thời gian đến quá trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm chitin đạt tiêu chuẩn thƣơng mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitin trong quá trình thu nhận.
3. Khảo sát, đánh giá ảnh hƣởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian
đến quá trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan đạt tiêu chuẩn thƣơng mại và
hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình deacetyl.

4. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà
chua sau thu hoạch tại các chợ đầu mối nông sản. Khảo sát, đánh giá khả năng kháng
khuẩn của -chitosan với khối lƣợng phân tử khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp.
gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua ở điều kiện in vitro và in vivo.
Ý nghĩa hoa học và thực tiễn của Luận án:
1. Luận án đã xác định đƣợc thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực
Loligo sp. tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa
học cho các nghiên cứu tiếp theo.
3


2. Luận án đã xác định đƣợc điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn
thƣơng mại. Sản phẩm -chitin thu đƣợc có khối lƣợng phân tử lớn và là nguồn
nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật
cao. Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn.
3. Luận án đã xác định đƣợc điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt
tiêu chuẩn thƣơng mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lƣợng phân tử
lớn. Sản phẩm chitosan thu đƣợc là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo
chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao
nhƣ y dƣợc, y sinh và công nghệ thực phẩm. Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản
xuất ở qui mô lớn.
4. Luận án đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn
trên trái cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng -chitosan có
khối lƣợng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong
bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính
kháng khuẩn của chitosan.

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU
NHẬN -CHITIN
1.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến
Ở Việt Nam, hiện có khoảng 25 loài mực ống thuộc bộ Teuthida, tập trung
nhiều nhất ở vùng nƣớc sâu khoảng 30-50 m. Mùa vụ khai thác từ tháng 6 đến tháng 9
(vụ Nam) và tháng 12 đến tháng 4 năm sau (vụ Bắc), trong đó chủ yếu có 4 loài đƣợc
đánh bắt với số lƣợng chiếm trên 96% tổng sản lƣợng, bao gồm: Loligo japonica,
Loligo chinensis, Loligo beka và Todarodes pacificus.
Mực ống Loligo sp. (Hình 1.1a) đƣợc phân loại [58]:
Ngành động vật thân mềm

Mullusca

Lớp chân đầu

Cephalopoda

Bộ mực ống

Teuthida

Họ

Loliginidae

Chi

Loligo

Hình 1.1. Thống

gi trị xuất hẩu mực, ạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp. (b)
Mai mực.
5


Mực ống Loligo sp. có giá trị xuất khẩu cao với sản lƣợng khai thác trên toàn
vùng biển Việt Nam vào khoảng 24.000 tấn/năm. Theo số liệu thống kê của Hiệp hội
chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), hiện nay các mặt hàng từ mực,
bạch tuộc của Việt Nam đang đƣợc xuất khẩu sang 25 thị trƣờng trong đó có các thị
trƣờng khó tính nhƣ Nhật Bản, Hoa Kỳ, Châu Âu với tổng kim ngạch đạt 390-460
triệu USD/năm, trong đó giá trị xuất khẩu từ mực chiếm 55-65%, ƣớc đạt 165 triệu
USD [1, 8]. Kết quả khảo sát cho thấy cứ sản xuất đƣợc 1 tấn mực thành phẩm sẽ thải
ra 0,45 tấn phế liệu, tỷ lệ này phụ thuộc vào loài, kích thƣớc mực nguyên liệu. Hiện
nay, hầu hết các phế liệu này đƣợc thu gom và tận dụng để sản xuất các sản phẩm phụ
dùng trong thức ăn chăn nuôi.
Mai mực chiếm tỷ lệ khoảng 0,4-0,5% trọng lƣợng của toàn thân mực ống nguyên
liệu tƣơi hoặc 10-15% phế liệu nội tạng mực thải ra sau quá trình chế biến (Hình 1.1b).
Theo số liệu thống kê của Công ty Việt Nam Food thuộc tỉnh Cà Mau (VNF), lƣợng phế
liệu từ chế biến mực ống đƣợc công ty thu mua mỗi tháng khoảng 130 tấn. Do đó,
lƣợng mai mực thu đƣợc ƣớc đạt trung bình khoảng 10-15 tấn/tháng. Hiện nay nguồn
nguyên liệu này chủ yếu đƣợc phơi khô và bán thô cho các nhà máy chế biến làm thức ăn
chăn nuôi hoặc bán trực tiếp cho các thƣơng lái Trung Quốc với giá trị thấp.
1.1.2. Cấu trúc và thành phần hóa học của mai mực ống Loligo sp.
Nguồn nguyên liệu khác nhau dẫn đến qui trình chiết chitin khác nhau, tùy thuộc
vào hàm lƣợng khoáng và protein có trong phế liệu. Do đó thành phần hóa học của
nguồn nguyên liệu đƣợc xem là yếu tố quyết định đến việc chọn qui trình tách chiết và
chất lƣợng của sản phẩm chitin thu đƣợc. Kết quả tổng hợp về thành phần hóa học một
số nguồn phế liệu thủy sản thông dụng để sản xuất chitin hiện nay đƣợc trình bày trong

Bảng 1.1. So sánh các thành phần cho thấy, vỏ cua có hàm lƣợng khoáng cao nhất
(56%), trong khi hàm lƣợng chitin lại thấp nhất (chỉ có 12,9%). Do đó, việc thu nhận
chitin từ vỏ cua gặp nhiều khó khăn trong quá trình loại khoáng và hiệu quả thu nhận
chitin thấp.

6


Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong ngu n liệu của một số loại phế liệu thủ
sản thông dụng để sản xuất chitin
Thành phần hóa học (%)

Nguồn phế liệu

TLTK
Độ ẩm

Protein Khoáng Lipid α-Chitin

Tôm sú (Penaeus monodon)
Phế liệu vỏ đầu tôm

9,1

26,8

29,3

0,5

34,9

Phế liệu vỏ tôm

9,7

42,8

20,8

1,2

36,5

Vỏ tôm thẻ (Penaeus vannamei)

-

26,1

26,6

-

27,3

Vỏ tôm (Crangon crangon)

-

40,6

27,1

9,9

17,8

Vỏ tôm (Pandalus borealis)

-

41,9

29,2

10,2

17,0

Cua xanh (Callinectes sapidus)

4,5

24,0

56,0

2,0

12,9

Ghẹ chấm (Portunus trituberculatus)

12,9

10,3

57,9

0,3

17,1

[2]

[158]

[3]

Vỏ tôm có hàm lƣợng lipid tƣơng đối cao, nhƣ vỏ tôm Pandalus borealis
(10,2%) do đó cần phải lƣu ý công đoạn xử lý lipid. Tuy nhiên, thông thƣờng lƣợng
lipid này có thể đƣợc loại bỏ trong công đoạn khử protein trong môi trƣờng kiềm. Nhƣ
vậy, để thu nhận chitin từ vỏ tôm, vỏ cua và vỏ ghẹ thì bắt buộc phải tiến hành quá
trình khử khoáng và khử protein.
Thành phần hóa học có trong mai của một loài mực đã đƣợc công bố trong các
nghiên cứu trƣớc đây đƣợc tổng hợp ở Bảng 1.2. So với các nguồn phế liệu vỏ tôm,
cua và ghẹ, phế liệu mai mực có hàm lƣợng chitin cao hơn nhiều (khoảng 31-42%)
trong khi đó hàm lƣợng khoáng lại rất thấp (dƣới 2%). Hàm lƣợng lipid cũng rất thấp
hoặc không phát hiện. Do đó, khi tách chiết thu nhận chitin có thể bỏ qua quá trình

khử khoáng và khử lipid mà chỉ tập trung vào quá trình khử protein.

7


Bảng 1.2. Thành phần hóa học trong một số mai mực
β-chitin

Protein

Lipid

CaCO3

Khoáng

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

31,0

64,0

2,3

35-40

58,0

-

-

-

Loligo lessoniana

36,1

Loligo formosana

Nguyên liệu

Illex argentinus
Ommastrephes bartrami

TLTK

0,1

[47]

-

-

[93]

-

-

< 1%

[81]

-

-

-

0,025

[36]

36,5

-

-

-

0,042

40-42

-

-

-

1,9

[95]

40,0

-

-

-

1,7

[154]

Dosidicus gigas

Loligo sanpaulensis

Loligo plei
Loligo vulgaris

Thành phần khoáng trong mai mực và trong vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei (Bảng
1.3) cho thấy hàm lƣợng các nguyên tố Ca, Fe, K, Mg, Na và Zn trong mai mực thấp
hơn rất nhiều so với trong vỏ tôm. Ví dụ, hàm lƣợng Ca trong mai mực Loligo
lessoniana là 17,74 ppm trong khi trong vỏ tôm là 4856 pmm, cao gấp 250 lần. Hơn
nữa, đáng chú ý là các kết quả công bố đều cho thấy mai mực không chứa các kim loại
nặng nhƣ Hg, Pb và As. Như vậy, phế liệu mai mực ống là nguồn nguyên liệu tiềm
năng để thu nhận -chitin có độ tinh khiết cao.
Bảng 1.3. Thành phần ho ng của ngu n liệu mai mực

Nguyên liệu

Khoáng

Ca

Fe

K

Mg

Na

Zn
TLTK

(%)

(ppm)

Illex argentinus

1,00

170

-

210

100

450

-

[47]

Loligo lessoniana; Loligo
formosana

0,04

17,74

7,73

-

3,30

-

-

[36]

Loligo sp.

2,4

1025

30

255

200

[38]

Loligo plei; Loligo
sanpaulensis

1,9

94,5

3,5

-

Vỏ tôm thẻ (Penaeus vanamei)

26,6

4856

8

15,67 2437

1220 8540
11,7

-

-

[95]

-

1594

11,8

[2]


Trong nguyên liệu, chitin tồn tại dƣới dạng liên kết với các thành phần nhƣ
protein, chất khoáng, chất màu, lipid và các hợp chất khác với hàm lƣợng biến đổi tùy
theo loại nguyên liệu. Vì vậy, nên trong quá trình tách chiết, thu nhận chitin cần phải
khử các hợp chất phi chitin này. Có nhiều nghiên cứu công bố về sự tồn tại các liên kết
này, trong đó các nghiên cứu của Rinaudo (2006) và Lavall (2007) cho thấy chitin tồn
tại dƣới dạng liên kết với các thành phần khác nhƣ protein, cacbonat canxi và nhiều
hợp chất hữu cơ khác dƣới dạng phức hợp gây khó khăn cho việc tách chiết và thu
nhận chitin [95, 134].

Hình 1.2. Mô hình cấu tr c chitin trong mai mực ngu n liệu [112, 170].
Tƣơng tự, Armenta (2009) và Nikolov (2010) đã đƣa ra mô hình mô tả chitin
trong nguyên liệu đƣợc bao bọc bởi các sợi xoắn protein tạo nên cấu trúc vững chắc bảo
vệ cơ thể sinh vật (Hình 1.2 và Hình 1.3) [16, 112], nghiên cứu cho thấy cấu trúc chitin
trong lớp biểu bì có các thuộc tính bất đẳng hƣớng, các mô khoáng liên kết chặt chẽ với
các sợi chitin-protein tạo nên cấu trúc dạng tấm và đƣợc vôi hóa bằng các muối cacbonat
canxi làm cho lớp vỏ có độ cứng chắc bảo vệ cơ thể sinh vật mềm yếu bên trong.
9


H

HH
O

R

CH3

O

Chitin

O

H

Imine bond
H3C

H

O

H
n HOH2C
O C R

NH

O
H3C

CH3

NHH

H

HO

C

OH

HO

H

CH3

CH3

O

H
HOH2C

CH3

O
C

H

C

CH3

CH3

O

H
H

O
NH

O

HOH2C
H

H
NH

H

HO

HO

H3C

C

H

HO

HO

Ester bond

CH3

O

HOH2C

H3C

CH3

H

O

Fatty acid

Ester bond

Astaxanthin

N
Imine bond

R CH

C O
NH

Protein

R CH
C O
n

NH
R CH2

Hình 1.3. Một iểu mô phỏng những li n ết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với
astaxanthin và c c ph n tử h c trong ngu n liệu [16].
Các kết quả nghiên cứu Kristbergsson, Einrsson và Peter năm 2003 cũng cho
thấy chitin trong cấu trúc nguyên liệu có các liên kết rất chặt chẽ với các thành phần
khác nhƣ protein, cacbonat canxi, lipid, chất màu, khoáng chất và các hợp chất hữu cơ
khác gây khó khăn cho việc nghiên cứu tách chiết và thu nhận chitin (Hình 1.4).

Hình 1.4. Mô hình cấu tr c lớp vỏ tôm [88].
10