Khóa luận tốt nghiệp phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của pepper yellow leaf curl việt nam virus

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
“Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam
virus ”

Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường
Họ và tên

: Hà Văn Dũng

Lớp

: BVTVB-K55

Chuyên ngành

: Bảo vệ thực vật

Hà Nội-2014

1


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành báo cáo này ngoài những nỗ lực của bản
thân, tôi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và quý báu từ nhiều tập thể
và cá nhân.
Trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy

TS. Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới –
Trường Học viện nông nghiệp Việt Nam, Phó khoa Nông học và Ths. Trần Thị
Như Hoa - Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếp
hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành báo cáo.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc
Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nông nghiệp Việt
Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo trong bộ
môn bệnh cây cũng như các Thầy cô trong khoa Nông học, Trường Học viện
nông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian
tôi học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè
đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành báo
cáo này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014
Sinh viên
Hà Văn Dũng

2


MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
A. tumefaciens
AS
ATP
Bb

CP
CTAB
ddNTP
DNA
Dntp
dsDNA
E.coli
EDTA
ICTV
IR
Kb
LB
ORF
PCR
RCA
RE
Rep
RNA
Rnase
SDS
SsDNA
TAE
Taq
Vir
β- ME

Từ viết tắt
Agrobacterium tumefaciens
Acetosyringone
Adenosine triphosphate

Base pair
Capsid protein
Cetryl Ammonium Bromide
Dideoxynucleoside triphosphate
Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleoside triphosphate
Double strand DNA
Escherichia coli
Ethylene diamine tetra acetic acid
International Committee on Taxonomy of Viruses
Itergenic region
Kilo base
Luria and Bertani
Open reading frame
Polymerase Chain Reaction
Rolling circle amplification
Restriction enzyme
Replication protein
Ribonucleic acid
Ribonuclease
Sodium Dodecyl Sulphate
Singe strand DNA
Tris – acetate – EDTA
Thermus aquatic
Virulence region
Beta- Mercaptoethanol

3

DANH MỤC BẢNG

4


DANH MỤC HÌNH

TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về
begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây
bệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua.
Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thông qua
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đồng thời chúng tôi tiến hành lây
nhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn..
Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiện
trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam nhằm phát
hiện PepYLCV và begomovirrus khác. Lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của
begomovirrus trên ớt tại miền Bắc.
Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV.

5


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu
Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ

Geminiviridae cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng.
Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ các
virus thuộc chi Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình
chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trên
đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.
Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ
gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử
DNA-A đã gây triệu chứng điển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả
phân tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệu chứng bệnh.
Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng,
điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá
nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có
thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử
Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của
begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt
Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có
nhiều cây dại. (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007).
Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá
cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có mặt
của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng
bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà Nội)
thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên
từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus
mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus
(PepYLCVNV).
6


Các nghiên cứu sơ bộ tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũng
nhiễm tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát

hiện được một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt ở Việt Nam có ý nghĩa quan
trọng cả về mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các
cây trồng quan trọng của Việt Nam.
Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh
học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu.
Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt
Nam virus”
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục tiêu
Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập tại
miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus.
1.2.2 Yêu cầu
- Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội,
Hưng Yên.
- Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình
- Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và
cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước.
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
vector bọ phấn.

7


2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua
Cây ớt là một loại quả của cây cây thuộc chi Capsicum của họ Cà
(Solanaceae). Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên
thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Độ là nước sản
xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng
Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt. Ở Việt Nam, ớt là một gia vị
thường xuyên có mặt trong các bữa ăn, ngoài ra ớt còn có rất nhiều công dụng
như: cải thiện hệ tiêu hóa, giảm cân, chữa bệnh ung thư, ngừa tai biến mạch, tăng
sức đề kháng.
Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây
Ban Nha lan truyền tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là
Châu Âu. Cà chua là loài trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150
triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc là
nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu,
tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ. Các khu vực chế biến tại California chiếm 90%
lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz, Miyao et al., 1997).
Cũng như ớt, ở nước ta cà chua là một gia vị hay có trong mỗi bữa ăn, bởi cà chua
là một thực rất giàu : Nước (chiếm 93 đến 95 % ), giàu nguyên tố khoáng,và
vitamine A, C, và E. Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhóm của caroténoïdes,
như β-carotène cho một hoạt chất tiền vitamine A rất có lợi cho sức khỏe.
2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus
Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ
Bean golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng loài (198 loài
vào năm 2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng.
Tất cả các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều không
truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia
tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Fauquet and Stanley, 2005).

8

2.2.1 Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử
(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1
tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo
ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này
không hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein
vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein
(pentameric capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị
hình thái (Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001).

Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh:
www.ncbi.nlm.nih.gov)
2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus
Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước
khoảng 2,6- 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi
là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A
(Ha, 2007)

9


Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus (Nguồn
ảnh: www.expasy.ch)
2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A
Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame)
được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có
hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo
vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus
vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen AV2

mã hóa Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy
DNA của virus. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm
có 4 ORF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1 mã hóa protein tái sinh
(Rep protein) có chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh
và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC2 (TrAPTranscriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức
năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gen AC3 mã hóa protein tăng cường tái
sinh (REn- Replication Enhancer) có chức năng tương tác với prote ký chủ điều
khiển chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới phổ ký
chủ, phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ (Ha,
2007).

Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus
()

10


2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B.
DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp
theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều
ngược kim đồng hồ chứa gen BC1.
BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) có chức năng
chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liên
quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được
kiểm soát bởi CP.
BC1 là một protein vận chuyển : (MP- Movement protein) có chức năng
vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ.

CR=Common Region

CR
DNA-B
~2.7kb

BV1 (NSP)

BC1 (MPB)

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus (Ha, Coombs et al.,
2008).

2.2.5 Đặc điểm của vùng IR
Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, nằm giữa 2
vùng gen mã hóa ngược chiều nhau, có cả trên DNA-A và DNA-B. Vùng này có
chứa nguồn gốc tái sinh (ori- origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron)
cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân- thòng lọng
(stem-loop) có chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các begomovirus. Vị
trí T7 – C8 của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus trong
quá trình tái sinh.

11


Đối với begomovirus có bộ gen kép có chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng
150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region). Vùng
CR có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh của DNA-B bởi chuỗi ori- nguồn
gốc tái sinh nằm trên vùng này. Tuy nhiên, với số gen ít ỏi của mình, DNA-B
không thể tự tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần có sự nhận biết và cắt- nối của
protein Rep được mã hóa trên DNA-A (Ha, 2008)
2.2.6 Phân loại các Begomovirus

Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New
world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đông
bán cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam, Stanley et al., 1999),
(Rybicki, 1994)
Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt
nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ
gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và
kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen
AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới
(Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005). Begomovirus ở cụm Tân thế giới có
chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này
không có mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới (Harrison and Robinson,
2005)
Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ
có thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày
nay. Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu
thế giới.
2.2.7 Tái sinh của Begomovirus
Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism).
Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào
ký chủ (Gutierrez, Ramirez-Parra et al., 2004), (Picó, Díez et al., 1996). Pha tổng
hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng
kép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một
12


sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ. (2) Pha tái
sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại
chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase
của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep

lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới
được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng.
Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn
mạch vòng hoàn chỉnh.
2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus
Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên
ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào
già cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngừng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại
cảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ
dinh dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của
bệnh do các begomovirus. Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 2-4
tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996). Một
chất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon có
thể đã được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp
khoảng một phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì
những lý do trên bệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây
thoái hoá. Sự huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi trường và cây bệnh thuận lợi
cho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở
nước ta những năm 1960. (Nguyễn Thị Hà Uyên, 2012)
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá
không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá
cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và
nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ,
đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng (Picó, Díez et
al., 1996). Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiết nóng như hè thu và xuân
hè.
13


Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua

(httpwww.avrdc.org)
2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền
Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci)
theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circulant). Bọ phấn Bemisa tabaci
Gennadius (1989) thuộc họ rầy phấn (Aleyrodidae), bộ cánh đều (Homotera).
Cho đến nay trên thế giới có hai loài bọ phấn được công nhận đó là:
Bemisia tabaci và Bemisia argentifolii, loài Bemisia argentifolii được tìm thấy
nhiều ở Hoa kỳ, Nhật, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập, Trung Quốc, … Sự khác
nhau giữa hai loài bọ phấn này là B. argentifolii ăn tạp, mắn đẻ hơn, gây rối loạn
độc tố cho cây trồng.
Theo Navot và cộng sự (1991), bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành một
vòng đời khoảng 20 – 30 ngày ở điều kiện thích hợp. Trung bình có khoảng 11 –
15 lứa/năm. Bọ phấn phát triển mạnh trong điều kiện khô và nóng, mưa nhiều làm
giảm mật độ bọ phấn, chúng thường chích hút và bay vào buổi sáng, buổi chiều
mát. Để tránh ánh sáng mặt trời bọ phấn núp vào mặt dưới của lá, điều này phù
hợp với phân bố chủ yếu ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ
phấn. Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem.
Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới
tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt. Chúng hút dịch cây trong khoảng
15 – 30 phút và tiềm ẩn trong cơ thể chúng là 8-24 giờ (thời gian để virus nâng
cao nồng độ trong bọ phấn) là chúng có khả năng truyền bệnh, khoảng thời gian
14


để chúng truyền ngắn nhất là 15 phút (EPPO/CABI, 1996). Thời gian chích hút
của bọ phấn dài hơn thời gian truyền dịch virus sang cây khỏe và thời gian tiềm
ẩn là 21 giờ. Bọ phấn hút dịch cây ở giai đoạn sâu non và ngay sau khi hóa trưởng
thành chúng có thể truyền nhiễm bệnh virus theo hệ thống và không truyền lại
cho đời sau. Có thể phát hiện thấy virus ở bất kì giai đoạn phát triển nàocủa bọ

phấn từ giai đoạn trứng (Ghanim and Czosnek, 2000). Triệu chứng xuất hiện trên
cây con khi bị xâm nhiễm từ 2 – 5 tuần. Virus không truyền qua chứng bọ phấn.

Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci
2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do
begomovirus gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được
xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones and
Navas-Castillo, 2000).Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn, bệnh
cuốn lá bông (Briddon, 2003). Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng
lá ngọn cà chua.
Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng.
Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc
biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Picó, Díez et al., 1996).

15


2.2.11 Phòng chống
Cho đến nay vẫn chưa có loài thuốc hóa học nào phòng trừ được trực tiếp
bệnh do virus gây ra. Phòng trừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến lược chính
là phòng chống vector và tạo cây kháng bệnh.
- Phòng chống vector: (Kheyr-Pour, Bendahmane et al., 1991) cho biết, trên thế
giới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mặt quanh năm
trên đồng ruộng. Đây là nguyên nhân khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặp
nhiều khó khăn. (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên cứu đặt bẫy dính
bọ phấn theo dõi mặt độ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Coimbatace (Ấn Độ)
cho thấy: từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt độ cao, cường
độ ánh sáng lớn với ẩm độ trung bình tạo điều kiện cho bọ phấn sinh sôi nảy
nở nhanh chóng nên mật độ bọ phấn cao, từ tháng 5 đến tháng 8 mưa nhiều

nên mật độ bọ phấn thấp, đỉnh cao của mật độ bọ phấn khoảng tháng 11 đến
tháng 1 năm sau. Từ đặc điểm đó, nhiều kỹ thuật phòng trừ bọ phấn được áp
dụng tùy điều kiện:
+ Dùng giống kháng bọ phấn.
+ Dùng thuốc hóa học.
+ Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính.
+ Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng có
hiệu quả trong điều kiện nhà lưới) .
- Tạo giống kháng virus: Tính kháng begomovirus có thể được tạo ra nhờ 2
cơ chế: Tính kháng từ cây và tính kháng từ tác nhân gây bệnh (PRD).
Những năm gần đây, cùng với tiến bộ khoa học kĩ thuật các nhà khoa học
đã tạo ra các giống ớt có khả năng chống lại sự xâm nhiễm, tái tổ hợp của
virus trong tế bào cây. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á
(AVRDC) đã lai tạo ra những dòng ớt có tính kháng rất cao với bọ phấn
Bemisia tabaci cũng như kháng bệnh do begomovirus gây ra. Ở nước ta
đang có dự án thí nghiệm nghiên cứu tính kháng bệnh virus (begomovirus)
củ 34 giống ớt có nguồn gốc từ AVRDC (trung tâm rau màu thế giới) tại
16


Đồng Tháp bước đầu đã cho những kết quả rất khả quan, đây đều là các
giống kháng chuyển gen dùng gen kháng từ cây.
2.3 Một số begomovirus hại cà chua
Hiện nay có tới hơn 50 begomovirus phân lập từ cà chua (có từ tomato ở
đầu tên virus) đã được công bố trên thế giới (Fauquet, Briddon et al., 2008). Trên
cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điểm hình là cuốn lá
(cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiểm
sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể biết
được dựa vào các phân tích phân tử (Moriones & Navas-Castillo, 2000).
Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất

trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có
khi tới 100%. Bệnh đã được phát hiện thấy trên cà chua từ những năm 80. Một số
nghiên cứu về tạo huyết thanh chuẩn đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thực hiện
trong thời gian này nhưng bản chất thực sự của virus vẫn chưa rõ. Gần đây dựa
vào các phân tích phân tử, có ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra
bệnh xoăn vàng lá cà chua ở Việt Nam. Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Việt
Nam virus (ToLCVNV) được phân phập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng ngọn ở
miền Bắc vào năm 2001 (Green et al., 2001), Loài thứ hai là Tomato yellow leaf
curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh
Kanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiện
trên cây cà chua ở Việt Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mẫu Việt Nam là
DQ169054, -55). Năm 2007, từ một mẫu cà chua bị bênh xoăn vàng ngọn thu
thập tại Hà Nội, cùng với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng đã được
phân lập. Loài này được đặt tên là Tomato yellow leaf curl Việt Nam virus
(ToYLCKaV) (Hà et al., 2008). Trong số 3 virus trên có 2 virus được phân lập
trên mẫu cà chua gây bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc là ToLCVNV và TYLCVNV.
2.4 Một số begomovirus hại ớt
Theo (Green and Kim, 1991) có khoảng 35 loài virus khác nhau gây hại
trên ớt ở các vùng trồng trên thế giới đã được phát hiện thì có 12 loài gây hại trên
ớt ở Châu Á Thái Bình Dương. Cho đến năm 2001 thì có đến 65 loài virus khác
17


nhau đã được phát hiện trong đó có những loài thuộc chi Begomovirus (AVRDC,
2001).
Theo kết quả nghiên cứu của (Green and Kim, 1991), triệu chứng cuốn lá
ớt trồng ở Banthra lan truyền qua bọ phấn Bemissia tabaci là do Chilli Leaf Curl
Virus (ChiLCV) gây ra.
Số lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được
phát hiện. Đã có hơn 9 loài virus thuộc chi begomovirus gây hại trên các cây

trồng khác ở Trung Quốc và Đài Loan
Ở nước ta, tại miền Bắc, Nguyễn Thị Thu Ngọc (2009) đã phát hiện được
sự có mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCVNV) và Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên ớt. Tuy nhiên
hiện tại ở Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về xác định thành phần bệnh
virus hại ớt nói chung và Begomovirus hại ớt nói riêng.
Trên ớt triệu chứng do begomovirus gây ra gồm có: biến vàng, cuốn lá,
khảm lá,...Triệu chứng của Pepper leaf curl virus gây ra: gây hại là non, lá biến
dạng, bị cuốn mép.
2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR
Giới thiệu: PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20
trong sinh học phân tử. PCR là kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu
hết các nghiên cứu CNSH (Hà Viết Cường, 2010), đặc biệt là trong lĩnh vực chẩn
đoán bệnh virus. Ngoài các kỹ thuật chẩn đoán thông thường bằng mắt, chỉ thị,
kháng nguyên- kháng thể thì PCR là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả chính xác và
hiệu quả nhất. Trên thực tế những loài tác nhân gây bệnh trong cùng 1 chi hay 1
họ sẽ gây ra những triệu chứng tương tự nhau, khó phân biệt. PCR giúp phân biệt
chính xác đến loài nhờ vào mồi đặc hiệu, được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen.
Nguyên lý: PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA, gồm nhiều chu kỳ nối
tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

18


- Biến tính: Hỗn hợp phản ứng được dặt ở nhiệt độ cao (92-94 0C) trong khoảng
thời gian ngắn (20-60 giây). Ở nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép tách
thành sợi đơn.
- Gắn mồi: Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiệt độ gắn mồi trong thời gian ngắn
(35 giây). Nhiệt độ gắn mồi được tính toán tùy thuộc đặc điểm mồi, thường
trong khoảng 40-600C, ở nhiệt độ này mồi được gắn vào sợi khuôn ở vị trí đặc

hiệu.
- Tổng hợp sản phẩm PCR: hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu cho
phản ứng tổng hợp chuỗi, tùy thuộc DNA polymerase chịu nhiệt.
2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication)
Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA
(Rolling Circle Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng
mạch vòng. Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể
Φ29, một enzyme có hoạt tính chuyển mạch (strand-displacement) rất cao, và mồi
hexamer để nhân các phân tử DNA mạch vòng thành các multimer mạch thẳng
(gồm nhiều bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ được cắt bằng
enzyme cắt giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thông
thường. Đây là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có
bộ gen DNA mạch vòng kể cả các begomovirus và vệ tinh ((Inoue-Nagata,
Albuquerque et al., 2004), (Haible, Kober et al., 2006), (Knierim and Maiss,
2007)).

19


Hình 2.7. Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật RCA (Rolling Circle
Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA

(Fujii, Kitaoka et al., 2006)
Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của
begomovirus.Sản phẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới
hạn thích hợp trong điều kiện không triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer
(1 bộ gen), dimer (2 bộ gen) và multimer (nhiều bộ gen). Chỉ các sản phẩm dimer
được tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị nguyễn.Bằng cách đơn giản
này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus có thể được tạo ra khá nhanh
chóng. (Inoue-Nagata, Albuquerque et al., 2004), (Knierim and Maiss, 2007),

(Ferreira, Lemos et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008),
(Wyant, Gotthardt et al., 2011).
2.7 Kĩ thuật Agroinoculation
Kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn
A.tumerfaciens được gọi là agroinoculation.Agroinoculation là kỹ thuật chuyển
cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A. tumerfaciens.
Agrobacterium tumerfaciens là vi khuẩn đất, gram (-), được sử dụng như
các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A.
20


tumerfaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Tiplasmid (Tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây
bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u
được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp
tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được
do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập
vào hệ gen của cây bị bệnh, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo
ra khối u.
Kỹ thuật agroinoculation đòi hỏi 1 cấu trúc xâm nhiễm bao gồm bộ gen
virus (hoặc vệ tinh) được thiết kế chứa 2 nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu và được
gắn vào vị trí giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên. Cấu trúc xâm
nhiễm sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumerfaciens. Khi lây nhiễm, tế
bào vi khuẩn sẽ tiếp xúc với tế bào cây ký chủ và các protein chức năng (nằm trên
Ti-plasmid) sẽ chuyển toàn bộ phần DNA nằm giữa bờ trái và bờ phải của cấu
trúc xâm nhiễm vào nhân tế bào cây ký chủ và tổng hợp phần DNA này vào bộ
gen tế bào cây ký chủ. Trong tế bào chứa gen chuyển, gen Rep của virus sẽ được
biểu hiện thành protein Rep. Protein Rep sẽ cắt bộ gen virus khỏi bộ gen tế bào
cây tại vị trí đặc hiệu trên chuỗi ori và nối lại thành bộ gen virus nguyên vẹn. Bộ
gen virus nguyên vẹn này sẽ thực hiện chức năng sinh học và gây bệnh.

21


Hình 2.8. Khối u do A.tumerfaciens gây ra

Hình 2.9. Quá trình lây nhiễm của Ti
Plasmid trong A.tumerfaciens vào cây

A: Agrobacterium tumefaciens. B: Agrobacterium genome. C: Ti
Plasmid : a: T-DNA , b: Vir genes , c: Replication origin , d: Opines
catabolism genes. D: Plant cell. E: Mitochondria. F: Chloroplast. G: Nucleus
Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây được
nhúng trong dung dịch vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gian
bào; vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lại
bình thường); (ii) tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô; và (iii) tưới trực tiếp dịch vi
khuẩn vào đất

22


3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu
Virus: Pepper yellow leaf curl virus (PepYLCV)
Cây: ớt, cà chua
3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện
3.2.1 Địa điểm nghiên cứu
- Điều tra, thu mẫu đồng ruộng đồng ruộng được thực hiện tại Khu trồng rau

Lĩnh Nam (Thanh Trì – Hà Nội), Văn Đức (Văn Giang – Hưng Yên),
Quỳnh Phụ (Thái Bình)
- Thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu bệnh cây
nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
3.3 Thời gian thực hiện
Từ tháng 1/2014 đến tháng 7/2014
3.4 Vật liệu nghiên cứu
3.4.1 Cây thí nghiệm:
Bảng 3.1. Cây thí nghiệm
STT
1

Cây
Cà chua

Giống
AVTO1080

Nguồn gốc

Đặc điểm

AVRDC

Chuẩn nhiễm
(không chứa
gen kháng)
23

BM DTGiống

2

Cà chua

HT7

3

Ớt

Hiểm Lai
F1

Thuốc lá cảnh
(Nicotiana
benthamiana)

4

Chuẩn nhiễm

Địa phương Chuẩn nhiễm

AVRDC

Cây mô hình
cho virus thực
vật

5

Thuốc lá (N. tabacum)

cv.
Samsum

AVRDC

Cây chỉ thị

6

Thuốc lá (N. tabacum)

cv. Xanthi

AVRDC

Cây chỉ thị

7

Thuốc lá (N. tabacum)

cv. K326

8

Thuốc lào (N.
glutinosa)

AVRDC

Cây chỉ thị

9

Hoa ngũ sắc
(Ageratum
conyzoides)

Cây dại

Cây chỉ thị

10

Cà bát

Địa phương Chuẩn nhiễm

11

Cà pháo

Địa phương Chuẩn nhiễm

Viện NCTL Cây chỉ thị

3.4.2 Thu thập mẫu
Mẫu bênh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra
(bảng 3.3), sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silicagel để kiểm tra virus.
Bảng 3.2. Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013)
Ký hiệu

Địa điểm, khu vực thu mẫu

Đối tượng

Triệu chứng

VNP 4

FAVRI

Ớt

Khảm vàng, cuốn lá

VNP 93

Đà Nẵng

Ớt

Xoăn vàng lá

VNP 96

Túy Loan- Đà Nẵng

Ớt

Cuốn lá, khảm

VNP 120

Thái Bình

Ớt

Khảm

VNP 179

Cam lộ- Quảng Trị

Ớt

Cuốn lá, khảm

VNP 192

Cam Đường- Lào Cai

Ớt

Khảm

VNP 217

Cò Nòi- Sơn La

Ớt

Khảm
24


VNP 234

Cổ Phúc- Yên Bái

Ớt

Khảm

VNP 246

Chiềng Sinh- Sơn La

Ớt

Xoăn lá

VNP 251

Chiềng Sinh- Sơn La

Ớt

Cuốn lá, khảm

VNP 291

Vĩnh Tường- Vĩnh Phúc

Ớt

Khảm vàng, lá nhỏ

VNP 300

Sóc Sơn- Hà Nội

Ớt

Xoăn vàng lá

VNP 306

Yên Thế- Bắc Giang

Ớt

Khảm vàng

VNP 313

Châu Thành- An Giang

Ớt

Khảm vàng

VNP 453

Vĩnh Bảo- Hải Phòng

Ớt

Khảm vàng

VNP 456

Quỳnh Phụ- Thái Bình

Ớt

Sáng gân

VNP 459

Quỳnh phụ- Thái Bình

Ớt

Sáng gân từ cuống

VNP 535

Hòa An- Cao Bằng

Ớt

Khảm

VNP 558

Chợ Mới- Bắc Kạn

Ớt

Khảm nhăn

VNP 626

Túy Loan- Đà Nẵng

Ớt

Khảm

VNP 632

Túy Loan- Đà Nẵng

Ớt

Khảm vàng

VNP 634

Điện Bàn- Quảng Nam

Ớt

Khảm vàng

VNP 649

Phù Cát- Bình Định

Ớt

Khảm vàng

VNP 683

Thái Bình- Đồng Tháp

Ớt

Khảm

VNP 706

Châu Thành- An Giang

Ớt

Khảm vàng

VNP 716

Yên Thế- Bắc Giang

Ớt

Khảm

VNP 785

Bình Thủy- Cần Thơ

Ớt

Khảm

VNP 961

An Dương- Hải Phòng

Ớt

Khảm, biến vàng

VNP

1500

Cao Lãnh- Đồng Tháp

Ớt

Lá vàng, gân sáng

VNP
1501

Thái Bình- Đồng Tháp

Cà tím

Vàng lá

Các mẫu gây bệnh virus trên cà tím, ớt và một số cây trồng khác được chúng tôi
thu thập sử dụng cho nghiên cứu này,chủ yếu tập trung nghiên cứu một số mẫu
begomovirus quan trọng trên ớt,cà tím thu được tại miền Trung Việt Nam với
những triệu chứng đặc trưng của begomovirus..
25