BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ LÊN MEN

Báo cáo thực tập công nghệ lên men

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG
Page 1


Báo cáo thực tập công nghệ lên men

DANH MỤC HÌNH

Page 2


Báo cáo thực tập công nghệ lên men

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH MÔI TRƯỜNG LÊN ĐỘNG
HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN TRONG QUÁ TRÌNH
NUÔI CẤY MẺ
1. TỔNG QUAN
1.1. Mục tiêu bài thí nghiệm

Nắm vững kiến thức về động học sinh trưởng.
Nhận xét được ảnh hưởng của pH lên động học sinh trưởng của nấm men.
Hoàn thiện các thao tác và các kĩ năng quan sát dưới kính hiển vi.
1.2. Tổng quan về nấm men

Từ xa xưa, mặc dù chưa ý thức được sự tồn tại của vi sinh vật nhưng con người đã
biết đến rất nhiều ứng dụng của chúng trong sản xuất và đời sống.
Những tài liệu khảo cổ cho biết cách đây trên 6000 năm, người dân Ai Cập ở dọc

sông Nile đã có tập quán nấu rượu, các hình vẽ trên kim tự tháp cũng cho thấy nghề này
rất phổ biến ở nơi đây. Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích như là các loại nấm men dùng
để sản xuất rượu trắng, rượu vang, bia, làm bột nở bánh mì, tạo sinh khối giàu protein và
vitamin, sản xuất enzyme, sản xuất acid acitric từ tự nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin
B2)… thì cũng còn rất nhiều các loại nấm men có thể gây bệnh cho con người. [4]
Page 3


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Trong đó, loài Saccharomyces Cerevisiae hiện được sử dụng như một công cụ đắc
lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vục cho sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của kỹ
thuật di truyền. Để nấm men Saccharomyces Cerevisiae có thể phát triển tốt, cho năng
suất cao, người ta phải kiểm soát và điều chỉnh các yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đến
sự sinh trưởng của nấm men như: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, tỷ lệ giống…Để có thể
hiểu rõ hơn tầm quan trọng của một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
của nấm men là pH nên trong bài thực hành này nhóm chúng em được tìm hiểu về đề tài :
“Ảnh hưởng của pH môi trường lên động học sinh trưởng của nấm men trong quá trình
nuôi cấy mẻ”.

Hình 1. Một số loài nấm men: A – Lactobacillus-johnsonii; B – Candida; C –
Lactobacillus Acidophilus; D – Sacccharomyces cerevisiea
1.3. Tổng quan về giống Saccharomyces Cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong
bánh mì nên thường được gọi là men bánh mì, là một loại vi sinh vật thuộc chi
Page 4


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Saccharomyces lớp Ascomycetes ngành nấm. Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng

nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi
trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu, bia.[3]
S.cerevisiae có hình dáng tế bào là hình cầu, hình ovan hay elip. Thường có 1 – 4
bào tử trong nang, ít khi có 8 bào tử.[3]
Saccharomyces cerevisiae là một trong những loài sinh vật nhân chuẩn được khoa
học dùng nhiều nhất, cùng với E.coli là hai loài sinh vật mô hình phổ biến nhất.

Hình 2. Nấm men Saccharomyces Cerevisae
1.3.1. Đặc tính sinh học

Các nghiên cứu di truyền học được tiến hành ở Saccharomyces cerevisiae đã từ
hơn 70 năm nay. Đối tượng này kết hợp trong nó hai tính chất tuyệt vời:
Page 5


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
− Là đơn bào nên có thể tiến hành thí nghiệm như vi khuẩn, đồng thời có những đặc

tính chủ yếu điển hình của Eukaryote và có ty thể với bộ gen DNA nhỏ, giống với
vi khuẩn nên nó có thể nuôi trong môi trường dịch thể hay đặc và tạo khuẩn lạc
trên môi trường thạch.
− Thích nghi trong môi trường chứa đường cao, có tính acid cao. Có thề nuôi tế bào

nấm men quy mô lớn trong các nồi lên men và dễ dàng thu nhận sinh khối tế bào.
1.3.2. Hình thức sinh sản

Sinh sản vô tính theo kiểu nảy chồi: ở điều kiện thuận lợi nấm men
Saccharomyces cerevisiae sinh sôi nảy nở nhanh. Khi một chồi xuất hiện, các enzyme
thủy phân xuất hiện làm phân giải phần polysaccharide của thành tế bào làm cho chồi
chui ra khỏi tế bào mẹ. Vật chất mới được tổng hợp sẽ huy động đến chồi làm chồi phình

to lên, xuất hiện vách ngăn giữa chồi và tế bào mẹ. Chồi tách ra khỏi tế bào mẹ và hình
thành tế bào mới.[4]

Hình 3. Tế bào nấm men S. cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp
tạo chồi
1.4.

Sinh trưởng và phát triển của nấm men

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men diễn biến qua 4 giai đoạn.

Page 6


Báo cáo thực tập công nghệ lên men

Hình 4. Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng và phát triển của nấm men qua các giai đoạn

1.4.1. Giai đoạn tiềm phát (lag phase)
Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trường đến lúc chúng bắt đầu sinh sản.
Ở giai đoạn này, chúng còn phải thích nghi với điều kiện môi trường mới.
Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua những biến đổi lớn về hình thái và
sinh lý, kích thước tăng lên đáng kể và chúng trở nên nhạy cảm với những tác động bên
ngoài. Số lượng tế bào nấm men ở giai đoạn này là không tăng hoặc tăng không đáng kể.

1.4.2. Giai đoạn tăng trưởng cấp luỹ thừa (log phase)
Số lượng và sinh khối tế bào trong giai đoạn tăng theo cấp số nhân. Khả năng
thích ứng với những điều kiện không thuận lợi của môi trường ngoài tăng lên rõ rệt, đồng
thời xuất hiện chức năng lên men rượu.
Giai đoạn này thuận tiện để xác định năng lượng sinh sản, thời gian nảy chồi,

nhưng không nên đánh giá kích thước của tế bào cũng như những dấu hiệu khác của
khuẩn lạc. Do trong thời kỳ đầu của giai đoạn này, tốc độ sinh sản của tế bào thường
nhanh hơn tốc độ tạo thành tế bào chất nên kích thước của tế bào có phần nhỏ đi.

1.4.3. Giai đoạn ổn định
Page 7


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Số lượng tế bào trong giai đoạn này không tăng nữa, có thể là do sự cân bằng giữa
số sinh ra và chết đi. Song kích thước tế bào tăng lên rõ rệt. Quá trình lên men rượu cũng
bắt đầu.

1.4.4. Giai đoạn suy vong
Số lượng tế bào giảm xuống do có hiện tượng tiêu hủy. Lượng protein và acid
nucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn tiêu biến.
Như vậy có thể thấy số lượng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit,
song sinh khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lượng tế bào ở giai đoạn
này lớn.
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện

nuôi cấy thu sinh khối tế bào

1.5.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon,
nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca và vitamin.
Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà nguồn
carbon duy nhất là tinh bột, phát triển tốt hơn trên môi trường đường với nguồn nguyên
liệu được nấu chín.
Môi trường nước chiết giá đậu cũng được sử dụng để nuối cấy nấm men do trong

đậu chứa hàm lượng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm men. Ngoài ra, còn có các
vitamin A1, B1, B2, C, E, K và các chất kích thích tố tăng trưởng khác. Tuy nhiên, vitamin
C trong nước chiết giá đậu có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men.
Ngoài ra, nấm men có thể được nuôi cấy trong một số môi trường như: môi trường
cám, môi trường rỉ đường hay dung dịch đường được acid hóa với pH=4, nước bã rượu,
môi trường thủy phân từ cellulose thực vật, môi trường dịch kiềm sulfit (thành phần chủ
yếu là đường pentose).
1.5.2. Nhiệt độ
Page 8


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Saccharomyces cerevisiae có nhiệt độ tối ưu là 28-30 0C, trên 430 C và dưới 280 C
thì sự sinh trưởng của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn.
Ở 300 C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S.cerevisiae 2-3 lần, ở 35-380 C
chúng phát triển nhanh hơn 6-8 lần.
Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh: còn nhiệt độ thấp khoảng 20230 C, hạn chế được mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn.

1.5.3. pH của môi trường
pH tối ưu cho nấm men khoảng 4.5 – 5.6. Ở pH=4, tốc độ tích lũy sinh khối giảm,
pH=3 – 3.5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào
tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hưởng bởi
pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trường nằm ngoài khoảng 4.5 –
5.6.

1.5.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn
Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hòa oxy hòa tan.
Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây tác động âm trên hoạt động sống của tế bào
nấm men. Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxy
được hòa tan vào môi trường nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào.

Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để oxy hóa 1 kg đường, nhưng thực tế
chỉ cần 1 phần nhỏ oxy bơm vào là được nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do các
quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trường.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu

Chủng vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae
Hóa chất sử dụng trong môi trường nuôi cấy:
Đường
Page 9


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
K2HPO4
MgSO4.7H2O
Peptone
Nước cất
2.2. Phương pháp
2.2.1. Chuẩn bị môi trường
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy như sau:
Môi trường
M2e
M2d
M2f
M2g

Saccharose
(g/l)
50

50
50
50

Peptone
(g/l)
1
1
1
1

K2HPO4
(g/l)
3
3
3
3

MgSO4.7H2O
(g/l)
2
2
2
2

pH
4.0
5.0
6.0
7.0

Môi trường M2 được điều chỉnh pH bằng dung dịch H 2SO4 0.1N. Được phân phối
vào bình nuôi cấy và được tiệt trùng ở 121 0C trong 30 phút. Các môi trường được kiểm
tra nồng độ đường tổng trước khi sử dụng.
2.2.2. Chuẩn bị giống vi sinh vật

Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) dạng đông khô được sử dụng làm chủng
giống vi sinh vật. Nấm men được hoạt hóa và nhân giống trog môi trường M1b ở 30 0C
trong 24 giờ trên máy lắc xoay vòng với tốc độ 120rpm. Nấm men được kiểm tra các chỉ
tiêu (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống, (c) tỉ lệ tế bào nảy chồi và (d) đường tổng.
Môi trường chuẩn bị giống:
Môi
trường

Saccharose
(g/l)

Peptone
(g/l)

M1b

50

1

Dịch chiết
giá*
(ml)
Đủ 1000

pH
7.0

*Dịch chiết giá: 100g giá đậu xanh (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước cất. Đun sôi
30 phút. Thu phần dịch trong. Bổ sung nước cho đủ 1000ml.
2.2.3. Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men trong nuôi cấy mẻ

Sau quá trình nhân giống, nấm men (10ml) được bổ sung vào 190 ml môi trường
M2b đã được tiệt trùng bình nuôi cấy. Quá trình nuôi cấy mẻ được tiến hành ở nhiệt độ
Page 10


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
phòng (30oC), lắc 120rpm (hoặc nuôi cấy tĩnh). Trong suốt quá trình nuôi cấy, bắt đầu từ
giờ thứ 0, mỗi 1 giờ các chỉ tiêu (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống và (c) tỉ lệ tế
bào nảy chồi và (d) nồng độ đường khử và đường tổng số sẽ được kiểm tra.
Các thông số động học sinh trưởng của nấm men sẽ được tính toán để rút ra kết
luận.
2.2.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm men, tỉ lệ tế bào nấm men

sống, tỉ lệ tế bào nảy chồi
Có thể sử dụng buồng đếm để định lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn như
nấm men, bào tử nấm mốc...với độ phóng đại x100 đến x400. Với tế bào vi khuẩn, do
kích thước nhỏ, nên phải sử dụng buồng đếm Petroff-Hasser. Phương pháp đếm trực tiếp
còn giúp quan sát được hình thái tế bào...Kết quả đếm được là tổng số tế bào có trong
mẫu, không phân biệt được tế bào còn sống hay đã chết (chỉ phân biệt được tế bào nấm
men sống/chết khi tiến hành nhuộm với dung dịch methylen blue).
2.2.4.1.

Cấu tạo buồng đếm hồng cầu

Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phẩn lõm
phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 400 ô vuông nhỏ có diện tích tổng cộng là 1mm 2, bao
gồm 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông gồm có 16 ô vuông nhỏ. Vì thế, diện tích của một hình
vuông nhỏ là 1/400mm2 và diện tích của một hình vuông lớn là 1/25mm2.

Page 11


Báo cáo thực tập công nghệ lên men

Hình 5. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu
2.2.4.2.
−
−

Cách tiến hành
Pha loãng huyền phù nấm men (sao cho mỗi ô vương lớn có từ 10-50 tế bào).
Trộn đều 1ml huyền phù (đã pha loãng) với 1 giọt (~50µl) dung dịch 0.2%

methylen blue (pha trong D.W) trong 30 giây.
− Đậy buồng đếm bằng 1 tấm lamelle.
− Nhẹ nhàng dùng đầu pipette đặt 1 giọt huyền phù nấm men và cạnh buồng
đếm (nơi tiếp giáp với lamelle). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ
chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian
nằm giữa buồng đếm và lamelle được trám đầy bởi huyền phù nấm men, còn
các rãnh xung quanh thì không bị dính ướt.
− Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x4 để tìm buồng đếm và
vật kính x10 và x40 để quan sát. Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa trập

để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ. Thông thường ta chọn
một ô trung tâm và bốn ô nằm ở bốn góc hoặc năm ô theo đường chéo (các ô
đánh dấu x). Có thể sử dụng máy ảnh kỹ thuật số để chụp hình buồng đếm ở
vật kình x10 để sau này sử dụng đếm số lượng tế bào nấm men.

Page 12


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
−

Kết quả đếm mật độ tế bào chỉ có giá trị trong vòng 3-5 phút sau khi cho mẫu
vào buồng đếm, phải đếm các tế bào nằm trên hai đường kẻ kể nhau được

chọn của từng ô.
− Ở mỗi độ pha loãng, sau khi đếm ta được số tế bào trên năm ô lớn là a.
 Số tế bào nấm men (N) trên 1.0 ml mẫu:

Trong đó:
N: số tế bào trên 1.0 ml mẫu cho vào buồng đếm
a: số tế bào trên 5 ô vuông lớn
b: số ô vuông nhỏ trên 5 ô vuông lớn (16x5=80)
400: tổng số ô vuông nhỏ trong 25 ô vuông lớn
0.1: thể tích (mm2) mẫu chứa trên ô trung tâm
103: số chuyển mm2 thành ml (103 mm2 = 1ml)
10n: độ pha loãng mẫu

2.2.5. Tính toán các thông số động học sinh trưởng của nấm men

n = t/td

Nt = No/2n = No.2t/td
(lnNt – lnNo)/t = 0.693/td
µ = 0.693/td (tính dựa vào số lượng tế bào)
YN/S = (Nt – No)/(St – So)
Với:
n: số thế hệ
td: thời gian số tế bào nhân đôi (thời gian thế hệ)
Nt: số tế bào ở thời điểm t
No: số tế bào ở thời điểm ban đầu Nt: số tế bào ở thời điểm t
µ: hẳng số tốc độ sinh trưởng (ở đây được xem là tốc độ gia tăng số
lượng tế bào trên một đơn vị số lượng tế bào)
Page 13


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
St: nồng độ cơ chất (carbohydrate) ở thời điểm t
So: nồng độ cơ chất (carbohydrate) ở thời điểm 0 giờ
Các số liệu đo đạc và các thông số động học sinh trưởng sẽ được biểu diễn bằng
các bảng và đồ thị bao gồm: (1) bảng số liệu của quá trình lên men, (2) đồ thị diễn tả
đườn cong sinh trưởng của nấm men, (3) xác định thời gian thế hệ ở log phase, (4) hằng
số tốc độ sinh trưởng ở log phase và (5) YN/S tại cuối log phase.
Các kết quả sẽ được mô tả, so sánh, giải thích và biện luận để làm sáng tỏ ảnh
hưởng của điều kiện thí nghiệm đến kết quả đo đạc và tính toán thu nhận được.

3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Tổng số tế bào nấm men

Hình 6: Đồ thị thể hiện tổng số tế bào nấm men theo thời gian
Từ biểu đồ trên cho thấy tổng số tế bào lớn nhất khi pH = 5 và thấp nhất khi pH=7.
Khi bắt đầu nuôi cấy nấm men trong môi trường mới (tại t = 0 (h)), tổng số tế bào trong

khoảng xấp xỉ 1500 – 1700 tế bào. Mức này được ổn định trong khoảng 1h sau đó tế bào
bắt đầu sinh trưởng mạnh nhất tại pH= 5, tại pH= 4 và 6 tổng số tế bào tương đương với
nhau và kém nhất là pH= 7.
-

pH = 5, tổng số tế bào cực đại khoảng 5610 tế bào tại giờ thứ 4,6,7.
pH = 6, tổng số tế bào cực đại khoảng 3800 tế bào tại giờ thứ 3,6.
pH = 4, tổng số tế bào cực đại khoảng 3700 tế bào tại giờ thứ 4.
pH = 7, tổng số tế bào cực đại khoảng 3000 tế bào tại giờ thứ 3,7.

Theo nghiên cứu của Audrey Serra và công sự đã kết luận rằng pH không có ảnh
hưởng đáng kể đến tăng trưởng S.cerevisiae và trong tất cả các thí nghiệm của ông pH
được giữ ở 5.[1]
Page 14


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
3.2. Tỷ lệ tế bào nảy chồi và chết
 Môi trường pH=4

Hình 7. Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=4
Trong 1 giờ đầu tiên, % tế bào nảy chồi có tăng nhưng không nhiều (từ 1.3% tăng
lên 2.4%) trong khi % tế bào chết trong giai đoạn này tăng cao (từ 12.5% tăng lên
30.7%). Giai đoạn này đang ở pha lag, do nấm men mới được chuyển vào môi trường
mới, chưa thích nghi kịp nên nhiều tế bào nấm men bị chết, một số ít tế bào bắt đầu thích
nghi và nảy chồi.
Trong 2 giờ tiếp theo, giai đoạn này đang ở pha log. Tế bào đã dần thích nghi với
môi trường mới do đó tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng lên, tỷ lệ tế bào chết giảm xuống, trong
giờ thứ 2, tỷ lệ tế bào chết có tăng nhưng không nhiều (tăng 6.3%) nguyên nhân có thể do
một số tế bào không thích nghi hoặc sai số trong quá trình lấy mẫu và quá trình đếm.

Trong 2 giờ kế tiếp, tế bào vẫn đang ở pha log, tỷ lệ tế bào chết giảm mạnh (giảm
14.5%) do tế bào nấm men đang sinh trưởng, tốc độ tăng trưởng cao nên tế bào chết giảm
mạnh, tỷ lệ tế bào nảy chồi trong 2 giờ này hầu như không có sự thay đổi lớn có thể do tế
bào nảy chồi tăng trưởng nhanh đã tách thành 2 tế bào độc lập.
Trong 1 giờ kế tiếp, tỷ lệ tế bào nảy chồi và tế bào chết có giảm nhưng ít, đang ở
giai đoạn ổn định.
 Môi trường pH=5

Hình 8. Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=5
Trong 2 giờ đầu tiên, tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng (từ 2.97% tăng lên 21.43%) trong
khi đó tỷ lệ tế bào chết giảm mạnh (từ 40.26% giảm còn 9.14%), nguyên nhân có thể do
đây là môi trường tối thích cho nấm men phát triển, giống nấm men có khả năng sinh
trưởng tốt, môi trường nuôi cấy có cơ chất phù hợp và dễ hấp thu đối với tế bào nấm
men.

Page 15


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Trong 1 giờ tiếp theo, tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng nhanh (từ 21.43% tăng lên 52.7%),
tỷ lệ tế bào chết dường như không có sự thay đổi nhiều, tế bào đang trong giai đoạn tăng
trưởng. %). Do nấm men sử dụng cơ chất có hiệu quả, thích nghi tốt với điều kiện môi
trường nên phát triển mạnh mẽ.
Trong 1 giờ tiếp theo, tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm mạnh (từ 52.7% giảm còn
15.26%), tỷ lệ tế bào chết không thay đổi đáng kể, tế bào vẫn đang trong giai đoạn tăng
trưởng, tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm có thể do tế bào tăng trưởng nhanh, sau khi phát triển
đã tách ra thành 2 tế bào độc lập.
Trong 2 giờ kế tiếp, tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm nhẹ, tỷ lệ tế bào chết không thay đổi
nhiều, tỷ lệ giữa nảy chồi và chết gần như giống nhau do tế bào đang trong pha ổn định.
Trong 1 giờ cuối cùng, tỷ lệ tế bào nảy chồi không đổi, tỷ lệ tế bào chết tăng (tăng

21.95%), đã bước vào giai đoạn suy vong, cơ chất cạn kiệt và tích lũy các sản phẩm trao
đổi chất ức chế sinh trưởng nấm men.
 Môi trường pH=6

Hình 9. Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=6
Trong 1 giờ đầu tiên là giai đoạn pha lag, tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm nhẹ (từ
12.97% tăng lên 11.25%) trong khi đó tỷ lệ tế bào chết giảm mạnh (từ 43.53% giảm còn
30.00%).Nguyên nhân có thể do nấm men vừa được cấy vào môi trường mới với pH=6,
tế bào nấm men cần thời gian để thích nghi nên số tế bào nảy chồi giảm. Tuy nhiên đây là
môi trường mới có nồng độ cơ chất nhiều hơn nên tế bào sẽ sử dụng nguồn cơ chất mới
để phát triển nên số tế bào chết giảm.
Ở 4 giờ tiếp theo, sau khi nấm men đã thích nghi được với môi trường nuôi cây
mới thì tế bào nấm men sẽ sử dụng nguồn cơ chất để sinh trưởng và phát triển. Dẫn đến
tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng mạnh (từ 11.25% lên 24.47%). Ở giờ thứ 5, song song tỷ lệ tế
bào nảy chồi cực đại thì tỷ lệ tế bào chết là nhỏ nhất (2.66%). Tỷ lệ tế bào chết đã giảm
mạnh từ 30% xuống 2.66%).

Page 16


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Ở 2 giờ cuối cùng, sự sinh trưởng và phát triển của tế bào giảm rõ rệt thể hiện qua
tỷ lệ tế bào chết tăng mạnh (từ 2.66% lên 21.48%) và tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm (từ
24.47% xuống 14.77%).
 Môi trường pH=7

Hình 10. Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=7
Trong 1 giờ đầu tiên, % tế bào nảy chồi có tăng nhưng không nhiều (từ 3.47% tăng
lên 5.48%) trong khi % tế bào chết trong giai đoạn này tăng cao (từ 15.03% tăng lên
18.63%). Giai đoạn này đang ở pha lag, do nấm men mới được chuyển vào môi trường

mới, chưa thích nghi kịp nên nhiều tế bào nấm men bị chết, một số ít tế bào bắt đầu thích
nghi và nảy chồi.
Trong 3 giờ tiếp theo, tế bào nấm men đã thích nghi được với môi trường nên tỷ lệ
tế bào tăng mạnh ( từ 5.48% lên 16.14%), cùng với đó tỷ lệ chết giảm (từ 18.63% xuống
9.12%)
Ở 2 giờ tiếp theo, sự sinh trưởng của tế bào chậm lại thể hiện qua tỷ lệ tế bào nảy
chồi giảm (từ 16.14% xuống 11.51%) và tỷ lệ tế bào chết tăng nhẹ (từ 9.12% lên
10.83%).
Trong 1 giờ cuối cùng thì tỷ lệ tế bào chết tăng lên đáng kể (từ 10.83% đến
20.36%), cùng với đó thì tỷ lệ tế bào nảy chồi giảm mạnh (từ 11.51% xuống 7.6%). Điều
này chứng tỏ, giai đoạn sinh trưởng và phát triển của tế bào đã dừng lại và bắt đầu vào
giai đoạn suy vong.
 So sánh tỷ lệ tế bào chết và nảy chồi theo thời gian ở 4 khoảng pH (4,5,6,7)

Bảng 1. So sánh tỷ lệ tế bào nảy chồi ở 4 khoảng pH (4,5,6,7)
pH
4
5
6
7

Tỷ lệ tế bào nảy chồi
cao nhất
20.00%
52.70%
24.47%
16.14%
Page 17

Thời điểm tỷ lệ tế bào nảy

chồi cao nhất
Giờ thứ 3
Giờ thứ 3
Giờ thứ 5
Giờ thứ 4


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Qua bảng này, ta có thể thấy rằng ở khoảng pH=5 thì nấm men có thể sử dụng
nguổn cơ chất hiệu quả để làm tăng tỷ lệ tế bào nảy chồi (cao nhất với 52.70%) ở giờ thứ
3 của thời gian nuôi cấy. Còn ở khoảng pH=7 thì tỷ lệ tế bào nảy chồi là thấp nhất với
16.14% ở giờ thứ 4.

3.3. Quá trình sinh trưởng của tế bào và nồng độ đường theo thời gian
 Môi trường pH=4

Hình 11. Đồ thị tốc độ sinh trưởng của tb và nồng độ đường theo thời gian ở pH=4

Hình 12. Đồ thị sự sinh trưởng của tb tại pha log ở pH=4
Pha lag 0-1 (h): pha lag rất ngắn, dấu hiệu là số tế bào chết tăng đáng kể trong khi
số tể bào nảy chồi giảm nhẹ.
Pha log 1-4 (h): nấm men đã thích nghi tốt với môi trường tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng
vượt trội và tỷ lệ tế bào chết giảm dần. Log N tăng từ 8.44716 đến 8.87157. Số lượng tế
bào tăng và nồng độ cơ chất giảm mạnh. Tại thời điểm 4h số lượng tế bào bắt đầu tăng từ
từ, chuẩn bị bước sang giai đoạn ổn định.
Pha ổn định 4-6 (h): Số lượng tế bào đạt giá trị cực đại thời điểm 4h (10 8.87157) và có
xu hướng không đổi qua các giờ tiếp theo, hàm lượng đường bị tiêu thụ giảm đều đặn và
liên tục (độ Brix tương ứng ở 4.5 và 6 h là 4.1, 4 và 3.9).
Hằng số tốc độ sinh trưởng µ max = 0.262 (mai tính)
 Môi trường pH=5

Hình 13. Đồ thị tốc độ sinh trưởng của tb và nồng độ đường theo thời gian ở pH=5

Page 18


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Hình 14. Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng của tb biểu diễn tại pha log ở pH=5
Pha lag: 0-1(h), số tế bào nảy chồi tăng nhẹ đồng thời số tế bào chết tăng mạnh.
Chứng tỏ nấm men cần thời gian thích ứng với môi trường mới.
Pha log 1-4 (h): Nấm men tăng trưởng nhanh từ 0 đến 4 giờ (log N tăng từ
8.57518 đến 9.20952). Số lượng tế bào đạt cực đại bằng 109.20952 tại giờ thứ 4.
Pha ổn định 5-9 (h): Số lượng tế bào qua các giờ chênh lệch không đáng kể (Log
N tại 5h là 9.0086, tại 6h là 9.04297, tại 7h là 9.04999)
Hằng số tốc độ sinh trưởng µ max =0.323
 Môi trường pH=6

Hình 15. Đồ thị tốc độ sinh trưởng của tb và nồng độ đường theo thời gian ở pH=6

Hình 16. Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng của tb tại pha log ở pH=6
Pha lag 0-1 (h): pha lag rất ngắn, số tế bào chết tăng vượt trội trong khi số tế bào
nảy chồi tăng nhẹ
Pha log 1-3 (h): nấm men đã thích nghi tốt với môi trường tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng
mạnh và tỷ lệ tế bào chết giảm dần. Số lượng tế bào tăng (log N tăng từ 8.54654 đến
8.88081) và nồng độ cơ chất giảm. Số lượng tế bào đạt cực đại bằng 10 8.88081 tại giờ thứ 3.
Số lượng tế bào giảm nhẹ từ thời điểm 3h trở đi chuẩn bị bước sang giai đoạn ổn định.
Pha ổn định 3-6(h): tổng số tế bào qua các giờ chênh lệch không đáng kể. Tại thời
điểm 6h tổng số tế bào đạt cực đại bằng 108.88309
Pha suy vong 6-7 (h) số lượng tế bào giảm một cách rõ rệt, logN giảm từ 8.88309
xuống 8.77525 là do cạn kiệt cơ chất, một số chất dinh dưỡng cần thiết hay sự tích lũy

của sản phẩm trao đổi chất bậc 2 không có ích cho sinh trưởng và phát triển.
Hằng số tốc độ sinh trưởng µ max = 0.412
 Môi trường pH=7

Page 19


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Hình 17. Đồ thị tốc độ sinh trưởng của tb và nồng độ đường theo thời gian ở pH=7

Hình 18. Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng của tb tại pha log ở pH=7
Phase lag: không có. Do môi trường mới gần giống với môi trường ban đầu (pH=7)
nên nấm men không cần khoảng thời gian dài để thích nghi mà bắt đầu sinh trưởng và
phát triển.
Pha log 0-3 (h): ở pha này nấm men phát triển với tốc độ sinh trưởng đặc trưng tối
đa của chúng, số lượng tế bào nảy chồi tăng mạnh và tỷ lệ tế bào chết giảm. Tổng số tế
bào tăng tuy nhiên nồng độ cơ chất lại giảm dần. Tại thời điểm 3 (h) lượng tế bào đạt cực
đại bằng 108.77525, tại đó tổng số tế bào cũng bắt đầu giảm nhẹ và chuẩn bị bước sang pha
ổn định.
Pha ổn định 3-7(h): Số lượng tế bào qua các giờ chênh lệch không đáng kể (Log N
tại 4h là 8.75739, tại 5h là 8.76042, tại 7h là 8.77232 )
Pha suy vong 7-8 (h) số lượng tế bào giảm một cách rõ rệt (logN giảm từ 8.77232
xuống 8.74194) do vi sinh vật không có cơ chất để sinh trưởng và phát triển.
Hằng số tốc độ sinh trưởng µ max = 0.244
 So sánh

Bảng 2. Các thông số so sánh
Các thông số
so sánh
Pha lag

pH=4

pH=5

pH=6

pH=7

0-1 (h)

0-1 (h)

0-1 (h)

Không có

Pha log

1-4 (h)

1-4 (h)

1-3 (h)

0-3(h)

Pha ổn định

4-6 (h)

5-9 (h)

3-6 (h)

3-7 (h)

µ max

0.262

0.323

0.412

0.244

2.645 (h)

2.146 (h)

1.682 (h)

2.840 (h)

Tại 4h:109.20952

Tại 6h: 108.88309

Tại 3h : 108.77525

Td
Nồng độ sinh
khối lớn nhất

Tại 4h: 108.87157

Page 20


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
Qua bảng so sánh các thông số ta nhận thấy rằng tại pH=5 không xuất hiện pha
lag, pha log dài hơn các pH khác kéo dài 4h trong khi tại các môi trường khác chỉ kéo dài
trong 3h. Pha ổn định tại pH=5 kéo dài trong 2h (từ 4 đến 6 h) tương tự tại pH=4 và kém
hơn môi trường pH=6 và pH=7 nhưng nồng độ sinh khối lớn nhất thu được lại là cao nhất
so với các môi trường còn lại. Điều này cho thấy nấm men có hiệu suất chuyển đổi cơ
chất cao trong khoảng thời gian ngắn, môi trường pH=7 có khả năng ứng dụng cao vào
thực tiễn sản xuất công nghiệp.
Ở môi trường pH=4, µ

max

tương đối thấp, cho thấy sự phát triển và sinh sôi còn

max

cao hơn tại pH=4, nấm men sinh trưởng và phát triển

kém do ảnh hưởng của pH
Ở môi trường pH=5, µ

với tốc độ cao vì môi trường phù hợp và có pH tối ưu.
Ở môi trường pH=6, µ max cao hơn cả các môi trường còn lại. Nhưng nồng độ sinh
khối lớn nhất thu được là 108.8943 < 109.043 (pH=5) cho thấy nấm men phát triển nhanh
nhưng hiệu suất chuyển đổi cơ chất thấp hơn tại pH=5 nguyên nhân pH=5 tạo ra môi
trường tốt hơn cho nấm men.
Ở môi trường pH=7, µ

max

nhỏ hơn các môi trường còn lại nhưng nồng độ sinh

khối lớn nhất thu được tại pha ổn định chỉ nhỏ hơn môi trường pH=5. Nấm men sinh
trưởng và phát triển kém tại pha lag nhưng hiệu suất chuyển đổi sinh khối thu được tương
đối cao điều này có thể do sinh ra sản phẩm trao đổi chất kết hợp với pH trong môi
trường phù hợp cho nấm men.
Theo Nguyễn Lân Dũng, thời gian thế hệ của nấm men rượu (Saccharomyces
cerevisiae) là 120 phút so với những kết quả Td thu được 2.645h (pH=4), 2.146h (pH=5),
1.682 (pH=6), 2.840 (pH=7) thì có chênh lệch khá đáng kể do thao tác thực hiện thí
nghiệm, ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, điều kiện thí nghiệm,...
4. KẾT LUẬN
 Kết luận

pH là một trong các yếu tố quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và
phát triển của nấm men.

Page 21


Báo cáo thực tập công nghệ lên men

Trong môi trường pH = 6 và 7, nấm men nhanh đạt trạng thái ổn định (chỉ sau 3h)
và duy trì phase ổn định ở một khoảng thời gian dài, thích hợp cho việc sản xuất các sản
phẩm trao đổi chất bậc 2.
Trong môi trường pH=5 (pH nằm trong khoảng tối thích của nấm men) nấm men
phát triển nhanh và ổn định, hiệu suất chuyển đổi sinh khối lớn nhất so với nghiên cứu
của Seda Karasu Yalcin, 2006 kết luận rằng tại pH = 4 cho nồng độ chất khô và tốc độ
sinh trưởng là tối ưu nhất

[5]

. Môi trường pH=5 thích hợp cho quá trình lên men thực tế,

yêu cầu thu nhận được nhiều sản phẩm trao đổi chất bậc 2 (sản phẩm hình thành trong
pha ổn định). Ở môi trường pH thấp, có thể hạn chế được một số vi sinh vật tránh nhiễm
vào bình giống và cạnh tranh cơ chất với nấm men.
Trong môi trường pH=4, nấm men phát triển chậm và nồng độ sinh khối thu được
cũng nhỏ nhất so với tại các môi trường pH khác. Điều này cho thấy tính ứng dụng kém
tại nồng độ pH này.
 Mở rộng

Mức độ hấp thu chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme tham
gia vào sự tổng hợp protein, tạo vitamin đều tùy thuộc vào độ pH, pH tốt nhất cho sự sinh
trưởng của men bánh mì là 4.5 – 5.5, ngoài khoảng pH này sẽ làm chất lượng giảm đi,
pH=4: tốc độ tích lũy sinh khối giảm, pH = 3 hay pH = 3.5: sẽ làm cho sự sinh trưởng của
nấm men bị dừng lại. [8]
Kết quả chúng ta có thể thấy rằng sự phát triển của nấm men bị ảnh hưởng tại các
giá trị Ph thấp và cao. Tại giá trị pH cao có thể làm giảm hàm lượng sinh khối khô. Nó
báo cáo rằng, phần lớn nấm men phát triển giữa pH 4.5-6.5, nhưng gần như tất cả các loài
đều có thể phát triển trong môi trường acid và kiềm. pH thấp và cao được biết gây ra áp
lực hóa học lên tế bào nấm men.[7]

Kowda M. Wasungu, Ronald E. Simard đã nghiên cứu về “ đặc tính phát triển của
nấm men bánh mì trong ethanol”, sự ảnh hưởng của nhiệt độ (15° - 40°C) và độ pH (2,56,0) trên sự tăng trưởng liên tục của nấm men bánh '(Saccharomyces cerevisiae) ở trạng

Page 22


Báo cáo thực tập công nghệ lên men
thái ổn định trong 1% ethanol đã được điều tra nhiệt độ và pH tối ưu là 30°C và 4,5 tương
ứng.[2]
pH nằm trong khoảng 4 đến 5 là tối thích cho quá trình sản xuất ethanol, pH có ảnh
hưởng đến con đường tạo ra sản phẩm trao đổi chất như ở pH nằm trong khoảng 5,5 đến
6 ở 300C với hàm lượng glucose 40kgm-3 : sản phẩm chính là ethanol và butyrate, pH <5 :
thì sản phẩm chính là acid acetic.[5]

5. TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Audrey Serra, Pierre Strehaiano, Patricia Taillandier. Influence of temperature and pH
on Saccharomyces bayanus var. uvarum growth; impact of a wine yeast interspecific
hybridization on these parameters.
[2]. Kowda M. Wasungu, Ronald E. Simard. Growth characteristics of bakers' yeast in
ethanol. 1982
[3]. Lương Đức Thẩm. Nấm men công nghiệ. NXB khoa học và kỹ thuật, 2009
[4]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. Vi sinh vật học. NXB giáo
dục, 2009.
[5]. Yan Lin, Wei Zhang , Chunjie Li , Kei Sakakibara , Shuzo Tanaka , Hainan Kong,
2012. Factors affecting ethanol fermentation using Saccharomyces cerevisiae BY4742.
Page 23


Báo cáo thực tập công nghệ lên men

[6]. Seda Karasu Yalcin, 2006. Proizvodnja glicerola s pomoću dva endogena soja
vinskog kvasca pri različitim udjelima inokuluma (Sản xuất Glycerol bằng phương tiện
của hai chủng nội sinh của nấm men rượu theo tỷ lệ khác nhau cấy).
[7]. Seda Karasu Yalcin, Z. Yesim Ozbas. EFFECTS OF PH AND TEMPERATURE ON
GROWTH AND GLYCEROL PRODUCTION KINETICS OF TWO INDIGENOUS
WINE STRAINS OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE FROM TURKEY. Brazilian
Journal of Microbiology (2008) 39:325-332
[8]. Đề tài quy trình sản xuất sinh khối nấm men, 2014, < />
Page 24