Enzyme thủy phân thực phẩm

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP. HCM
MÔN HÓA HỌC THỰC PHẨM



MỤC LỤC



HÌNH

Lời mở đầu


Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết
các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế. Hàng năm
lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên
500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Bản chất của enzyme là protein nên enzyme cũng có các tính chất tương tự
như một protein. Các tác nhân gây biến tính protein như nhiệt độ, acid, kiềm,
tác động cơ học…đều có thể làm enzyme biến tính thuận nghịch hoặc không
thuận nghịch. Enzyme khác các protein ở chỗ: trong cấu tạo của enzyme một
cấu trúc rất đặc biệt gọi là trung tâm hoạt động. Không phải tất cả các phần của
enzyme đều tham gia vào hoạt động xúc tác mà chỉ có trung tâm hoạt động
mang tính đặc hiệu trong phân tử enzyme mới tham gia xúc tác phản ứng.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên enzyme
thủy phân có đầy đủ các đặc điểm của một chất xúc tác. Điểm khác nhau của
enzyme này so với các xúc tác khác là khả năng xúc tác đặc hiệu và cường lực

xúc tác mạnh hơn nhiều so với các xúc tác thông thường. Trong 2 giờ, 1g
pepxin thủy phân đến 5kg protein trứng luộc ở nhiệt độ bình thường. Sỡ dĩ phản
ứng enzyme diễn ra nhanh như vậy là do năng lượng hoạt hoá trong phản ứng
enzyme được hạ xuống rất thấp so với trường hợp không có xúc tác và cũng
nhỏ hơn rất nhiều so với các xúc tác khác. Vì có tính đặc hiệu cao nên phản ứng
thủy phân của enzyme ít tạo thành sản phẩm phụ có thể gây độc cho người sử
dụng.


1.

Enzyme thủy phân
1.1

•

Thế nào là enzyme thủy phân?

Là nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân các hợp chất hữu cơ với
sự

tham gia của nước
• Phản ứng tổng quát: XY + H2O
XOH + YH
• Cách gọi tên: Tên của cơ chất được tách ra hydrolase
• Các enzyme thường gặp là amylase, protease, lipase.

Tính chất chung của nhóm enzym này là xúc tác các phản ứng thủy
phân, nghĩa là phân giải các hợp chất phức tạp với sự tham gia của
nước, thành những hợp chất đơn giản hơn. Các hyddrolase phần lớn

là các enzyme một thành phần nên chúng không cần coenzyme cho
hoạt động xúc tác. Trung tâm hoạt động của chúng bao gồm tổ hợp
các nhóm định chức của axitamin không tham gia tạo thành trục
chính của sợi polypeptide. Các nhóm định chức có thể ở xa nhau
trong mạch polypeptide nhưng lại gần nhau trong không gian, được
định hướng xác định trong không gian cách nhau những khoảng cách
nhất định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình
xúc tác.
 Nhóm hyddrolase ( EC3) được chia thành 11 phân nhóm sau:

3.1 : enzym thủy phân các liên kết ester
3.2 : enzym thủy phân các liên kết glycoside
3.3 : enzym thủy phân các liên kết eter
3.4 : enzym thủy phân các liên kết peptide
3.5 : enzym thủy phân các liên kết C—N không phải peptide (các
amide)
3.6 : enzym thủy phân các liên kết anhydride acid
3.7 : enzym thủy phân các liên kết C—C
3.8 : enzym thủy phân các liên kết haloid – rượu
3.9 : enzym thủy phân các liên kết P—N
3.10 : enzym thủy phân các liên kết S—N
3.11 : enzym thủy phân các liên kết C—P
4


1.2. Cơ chế tác dụng của enzym thủy phân


Sự khuyết electron trong liên kết bị thủy phân là yếu tố quan trọng
quyết định khả năng và sự dễ dàng của phản ứng thủy phân.Tác dụng

xúc tác của enzyme phụ thuộc vào từng trường hợp và do sự phân
bố electron đã tồn tại trước đó quyết định. Enzyme có thể tác dụng
bằng các cách khác nhau. Cơ chế đơn giản nhất cho phép liên hệ
"phần dương" của liên kết bị thủy phân với tác dụng của enzyme là:
tâm ái nhân của enzyme sẽ tương tác trực tiếp với một trong hai
nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thủy phân. Sự tạo thành
phức hợp trực tiếp như thế với trung tâm phản ứng sẽ làm cho sự đứt
các liên kết và sự thủy phân được dễ dàng, thuận lợi. Enzym
colinesterase và nhiều esterase khác đều tác dụng thủy phân cơ chất
theo cơ chế này.

Một cơ chế khác liên hệ tính tác dụng của enzyme với sự khuyết electron của
liên kết bị thủy phân là: enzyme làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại
trước đó bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít
nhiều gần gũi với liên kết bị thủy phân. Nhờ vậy, làm cho sự phân bố electron
trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo một chiều hướng cần thiết, khiến cho việc
đứt liên kết được dễ dàng hoặc khiến cho một trong hai nguyên tử của liên kết
tương tác được với các tác nhân ái nhân.

1.3. Đặc điểm của trung tâm hoạt động enzyme thủy phân
Trung tâm hoạt động của các enzyme thủy phân thường không chứa nhóm
ngoại mà chứa các acid amine đặc hiệu. Thường là vòng amidazol của histidine
và nhóm hydroxyl của một trong số các gốc serine. Các thành phần trong trung
tâm hoạt động sẽ hình thành liên kết yếu để cơ chất có thể gắn vào. Cụ thể là
nhóm hydroxyl của serine sẽ hình thành liên kết hydro với nguyên tử nitrogen
của vòng amidazol. Chính nhờ liên kết yếu cho nên các nhóm chức trong trung
tâm hoạt động rất linh động. Khi có sự cảm ứng của cơ chất, theo thuyết
enzyme của Koshland, các nhóm chức này sẽ di chuyển, định hướng chính xác
để gắn vào.

5


 Thứ tự sắp xếp của các acid amine quanh trung tâm hoạt động:

Kimotripxin A — Gly — Asp — Ser — Gly —
Tripxin — Gly — Asp — Ser — Gly —
Trombin — Asp — Ser — Gly —
Kimotripxin — Asp — Ser — Gly —
Colinesteraza — Gly — Glu — Ser — Ala —
Carboxylesteraza — Gly — Glu — Ser — Ala —

1.4. Đặc điểm của các cơ chất bị enzyme thủy phân
Các cơ chất của enzyme thủy phân thường là các polyme như protein,
glucid, lipid, cellulose…các cơ chất này chứa liên kết bị thủy phân do các phân
tử tích điện dương tạo nên mà Bernard Pullman và Albert Pullman gọi đó là
“liên kết nhị dương”. Ví dụ: liên kết peptide, liên kết glycoside.

Hình 1. Liên kết glycoside
Chính vì vậy, một enzyme muốn thủy phân một cơ chất nào đó, cơ chất đó
phải phù hợp về không gian và phù hợp về sự tĩnh điện trong trung tâm hoạt
động.

1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme thủy phân
 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các enzyme đều theo một quy
luật như nhau. Vận tốc xúc tác của enzyme chỉ tăng theo nhiệt độ trong một
giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme chưa bị biến tính. Trong phạm vi
nhiệt độ thích hợp, khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzyme cũng tăng theo.

Khi tăng đến nhiệt độ tới hạn thì hoạt tính xúc tác sẽ giảm và nếu nhiệt độ tiếp
6


tục tăng thì enzyme bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác. Thông thường đối với
đa số enzyme bị biến tính hoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng 70 oC. Khi
nhiệt độ thấp hơn 0oC thì enzyme bị biến tính thuận nghịch và giảm hoạt tính
xúc tác hoặc không thể hiện hoạt tính xúc tác.
Mỗi loại enzyme có nhiệt độ tối thích mà tại đó nó thể hiện hoạt tính xúc tác
cao nhất. Nhiệt độ thích hợp này phụ thuộc vào loại enzyme, nguồn thu
enzyme, pH, kim loại, chất bảo vệ. Thông thường vào khoảng 40 – 50oC.
 Ảnh hưởng của pH

pH ảnh hưởng tương tự như nhiệt độ. pH làm thay đổi trạng thái ion hóa
của enzyme và cả cơ chất. pH thích hợp cho enzyme hoạt động là giá trị pH mà
tại đó enzyme và cơ chất tích điện trái dấu do đó mà kết hợp với nhau dễ dàng.
Đại đa số enzyme thích hợp với pH từ 5 đến 9, nhưng cũng có loại hoạt
động ở pH rất thấp (3,5) hoặc rất cao (11). pH thích hợp của mỗi loại enzyme
còn phụ thuộc vào nguồn thu enzyme, bản chất enzyme và có thể thay đổi tùy
thuộc vào nhiệt độ, cơ chất.
 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất và enzyme

Nồng độ cơ chất, enzyme ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme. Khi cơ
chất còn thừa, nếu nồng độ enzyme tăng thì vận tốc phản ứng tăng. Khi hết cơ
chất, nếu tăng nồng độ enzyme vận tốc phản ứng vẫn không tăng. Khi nồng độ
cơ chất giảm thì mức độ tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất giảm nên phản ứng
enzyme cũng giảm. Khi tăng lượng chế phẩm enzyme sử dụng thì phản ứng
thủy phân xảy ra nhanh hơn, đồng thời, lượng sản phẩm tạo thành cũng nhiều
hơn.
 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và ức chế

Chất hoạt hóa là chất khi thêm vào phản ứng enzyme sẽ làm tăng hoạt tính
xúc tác của enzyme hoặc chuyển enzyme từ dạng không hoạt động sang dạng
hoạt động. Do vậy khi có mặt chất hoạt hóa vận tốc phản ứng enzyme tăng.
Chất ức chế khi có mặt trong các phản ứng enzyme sẽ làm giảm hoạt tính
hoặc mất hoạt tính xúc tác của enzyme. Các chất kìm hãm hoạt động của
enzyme thường là các ion kim loại nặng, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ,
cũng có thể là các protein và cả cơ chất hay chính sản phẩm của phản ứng.
7


2. Amylase
2.1. Giới thiệu chung về Enzyme Amylase
Năm 1831,Erhard Friedrich Leuchs (1800-1837) mô tả các quá trình thủy
phân tinh bột bằng nước bọt, do sự hiện diện của một loại enzyme trong
nước bọt “ptyalin”, một amylase. Lịch sử hiện đại của các enzyme bắt đầu vào
năm 1833 , khi các nhà hóa học Pháp Anselme Payen và Jean-François Persoz
cô lập một phức tạp amylase từ nảy mầm lúa mạch và đặt tên nó là “diastase”.
Năm 1862, Alexander Jakulowitsch Danilewsky (1838-1923) tách amylase tụy
từ trypsin.
Enzyme amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong giới sinh vật. Các
enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho quá trình thủy phân
tinh bột, glicogen và xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm
polysaccharide với sự tham gia của nước .
RR’ +H-OH → RH + R’OH.
Enzyme amylase có trong nước bọt, trong dich tiêu hóa của người và động
vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn.
Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong
công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công
nghệ thực phẩm.

2.2. Phân loại

Amylase

Endoamylase

Exoamylase

β-amylase

Enzyme khử nhánh

γ-amylase

α- amylase

Khử trực tiếp

Khử gián tiếp

α- dextrin 6-Glucanohydrolase

Oligo-1,6-glucosidase

Hiện nay người ta có 6(Pullulanase)
loại enzyme amylase được xếp vào (2Transglucosylase)
nhóm :
8

Và Amylo-1,6-glucosidase


•

Endoamylase (enzyme nội bào): gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử
nhánh .Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp
là pullulanase (hay α-dextrin-6-glucanohydrolase) ;

khử gián tiếp là

transglucosylase ( hay oligo-1,6-glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase.
• Exoamylase ( enzyme ngoại bào): gồm có β-amylase và glucoamylase.
 Sự khác biệt giữa các loại enzyme amylase:
- Các loại enzyme amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở
pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt.
- Tốc độ phẩn ứng của amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa
của cơ chất. Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ
chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của các quá trình thủy phân khác nhau.
- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt
động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau.
• Có 3 loại enzyme amylase chính thường gặp là α-amylase, β-amylase
và γ-amylase.
2.2.1. α-amylase:
α-amylase là một enzyme loại protein thủy phân liên kết α của các
polysaccharide chứa liên kết α như tinh bột và gycogen, tạo ra glucose và
maltose. Đây là dạng chủ yếu của amylase được tìm thấy ở người và động vật
có vú khác. Nó cũng có mặt trong các loại hạt giống sử dụng tinh bột như một
loại năng lượng dự trữ, và trong chất tiết của nhiều loại nấm. Như có trong
nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm,tụy tạng, trong nấm mốc, vi khuẩn.

 Tính chất:
 α-amylase tương đối bền với nhiệt hơn các amylase khác nhưng lại kém

bền với acid.
 Ion canxi có tác dụng làm bền cấu trúc không gian của phân tử enzyme.
Mặc dù tìm thấy nhiều trong các mô, amylase chủ yếu có trong dịch tụy và
nước bọt, trong đó có dạng riêng của α-amylase người. Chúng có sự khác nhau
về sự tập trung đẳng điện, và cũng có thể được tách ra trong thử nghiệm bằng
cách sử dụng các kháng thể đơn dòng đặc biệt.
•

Amylase nước bọt (Ptyalin)

Amylase được tìm thấy trong nước bọt và phân giải tinh bột thành maltose
và dextrin. Nó phân giải các phân tử tinh bột lớn không hòa tan thành tinh bột
hòa tan (amylodextrin, erythrodextrin, achrodextrin), tạo ra các đoạn tinh bột
9


nhỏ hơn và cuối cùng là maltose. Ptyalin hoạt động trên các mối liên kết α (1,4)
glycosidic thẳng, nhưng hợp chất thủy phân đòi hỏi một loại enzym hoạt động
trên các sản phẩm phân nhánh. Amylase nước bọt bị bất hoạt trong dạ dày bởi
acid dạ dày.

Hình 2. Enzyme Amilaza ở nước bọt người
Điều kiện tối ưu cho ptyalin :
 Tối ưu pH - 5,6-6,9
 Nhiệt độ cơ thể người: 37 °C
 Sự hiện diện của một số anion và hoạt hóa ( Chloride và bromide o

hiệu quả nhất. Iodide - ít hiệu quả hơn. Sulfate và phosphate kém hiệu
quả nhất )
•

Amylase tuyến tụy

α-amylase tụy phân cắt ngẫu nhiên các liên kết α (1-4) glycosidic của
amylose tạo ra dextrin, maltose, hoặc maltotriose. Nó thông qua một cơ chế
chuyển đôi với giữ cấu hình anomeric.
Các thử nghiệm đối với amylase được thực hiện dễ dàng hơn đối với lipase,
làm cho các kiểm tra chủ yếu được sử dụng để phát hiện và theo dõi viêm tụy.
Các phòng thí nghiệm thường sẽ đo amylase tụy hoặc amylase tổng số. Nếu chỉ
đo amylase tụy có tăng sẽ không thể phân biệt với quai bị hoặc chấn thương
10


tuyến nước bọt khác. Tuy nhiên, bởi vì nó có số lượng nhỏ, nên thời gian là rất
quan trọng khi lấy mẫu máu để đo chất này. Lấy máu nên được thực hiện ngay
sau một cơn đau viêm tụy, nếu không nó sẽ được đào thải nhanh chóng qua
thận.
o

Cơ chế tác dụng của α-amylase:

α-amylase từ khác nguồn khác nhau có nhiều điểm rất giống nhau. α-amylase
có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử
cơ chất một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả.
Ứng dụng cuả α-amylase: α-amylase được sử dụng trong sản xuất



ethanol để phá vỡ tinh bột trong hạt thành đường lên men. (Ví dụ: Bước đầu
tiên trong việc sản xuất xi-rô ngô giàu fructose là trộn lẫn bột ngô với αamylase, tạo ra chuỗi đường ngắn hơn được gọi là oligosaccharides.) Một αamylase được gọi là "Termamyl", có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis, cũng được sử dụng trong một số chất tẩy rửa, đặc biệt là nước
rửa chén và de-starching chất tẩy rửa.
 Cách xác định α-amylase:

Một số phương pháp có thể xác định đối với hoạt động của α-amylase, và
các ngành công nghiệp khác nhau có xu hướng dựa vào các phương pháp khác
nhau. kiểm tra bằng I-ốt tinh bột là một sự phát triển của các phương pháp kiểm
tra bằng Iốt, được dựa trên thay đổi màu sắc, như α-amylase làm thoái hóa tinh
bột và thường được sử dụng trong nhiều ứng dụng. Một kiểm tra tương tự như
thử nghiệm trong công nghiệp sản xuất Amylase Phadebas, được sử dụng như
là một bài kiểm tra về chất lượng và số lượng trong nhiều ngành công nghiệp
khác như chất tẩy rửa, thực phẩm khác nhau, ngũ cốc, mạch nha, và sinh học
pháp y

2.2.2. β-amylase

11


β-amylase có phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Trong các hạt
ngũ cốc nảy mầm β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết 1,4 α-glucan
trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu
không khử của mạch. Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-amilaza có
cấu hình β.
Ở ngũ cốc, β-amylase tham gia vào sự phân giải tinh bột trong quá trình nảy
mầm của hạt. Ở lúa β-amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và
hầu như không được tổng hợp ở hạt khô. Ở lúa mạch, enzyme có mặt ở trong

hạt khô, nó được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên
kết.

Hình 3. Enzyme β-amylase
 Tính chất của β-amylase:
 β-amylase không bền khi có Ca2+ , β-amylase bị kìm hãm bởi Cu2+,

Hg2+, urea, idomeoacetamide, idone, ozon,...
 β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền hơn với acid.
 β-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C, nhiệt độ tối thích là 550C ; pH

từ 5,1-5,5.
 Cơ chế hoạt động của β-amylase
12


Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ
chất.

β-Amylaese phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nhưng khi gặp

liên kết α-1,4-glucoside đứng kề cận liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng
hoạt tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất
nhiều α-1,6-glucoside và được gọi là β-dextrin.
Tinh bột

Β-amylase

Maltose(54-58%) + β-dextrin(42-

26%)

2.2.3. γ-amylase
γ-amylase có nhiều ở sinh vật, gan động vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc
aspergillus, penicillium và Rhizopus. Glucoamylase xúc tác cho phản ứng thủy
phân các liên kết 1,4-1,6-glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi
polixacarit. Glucoamylase là những enzyme có thể thủy phân được cả hai kiểu
liên kết của các mạch α-glucan đẻ giải phóng ra ở dạng β.

Hình 4. Enzyme γ-amylase
Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng dao động rất
lớn từ 27000 đến 112000 Dag tùy thuộc vào nguồn gốc của enzyme.
Nói chung thì các amiloglucosidase đều chứa các gốc meethioni, tritophan
và một nữa gốc cystein. Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc
bậc 3 và hoạt động của enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các
13


amyloglucosidase từ nấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5 đến 20% gluxit
trong đó chủ yếu là các mono saccharid glucose mannose, galactose và
glucosamin.
Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác
nhau ở khả năng thủy phân tinh bột ở trạng thái rắn và bỏi độ bền của chúng.
Amyloglucosidase I tự hấp thụ và thủy phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại
amyloglucosidase II không có cả hai tính chất này.
 Tính chất:
 Đa số glucoamilaza có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH từ 3,5-

5,5 ; nhiệt độ là 500C.
 Nó bền với acid hơn α-amilazaa nhưng kém bền hơn trong

rượu, acetone,…và không được bảo vệ bởi Ca2+.
 Cơ chế hoạt động của γ-amylase

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thủy phân
lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng
cũng thủy phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm. Tốc độ thủy
phân cũng tùy thuộc bản chất của các liên kết kề cận với liên kết glucozit được
thủy phân, cũng như kích thước và cấu trúc của cơ chất bị thủy phân. Nhất là
với các α-glucan mạch dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thủy phân nhanh
hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit.

2.3. Một số ứng dụng của enzyme amylase trong thực phẩm
Có thể kế đến rất nhiều ứng dụng của amylase trong nhiều lãnh vực khác
nhau :


Trong y học và dược phẩm: thuốc , hóa chất chứa hoạt tính enzyme
amylase và amylase được sử dụng đễ chuẩn đoán viêm tụy cấp.
14


 Trong công nghiệp: amylase được ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa

và còn được ứng dụng trong công nghiệp dệt.
 Trong công nghiệp thực phẩm: amylase được ứng dụng trong sản xuất

nhiều sản phẩm khá quen thuộc như bột ngọt , bia , cồn , siro , bánh mì ,
bánh kẹo , ...
2.3.1.

Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất bột ngọt

Amylase được sử dụng trong giai đoạn thủy phân tinh bột.


Mục đích: tạo điều kiện để thực hiện các phản ứng thủy phân tinh bột
thành đường lên men được chủ yếu là đường glucose.



Enzyme thường dùng: enzyme α– amylase, γ-amylase ( vừa thủy phân
-1,4- glucoside vừa thủy phân -1,6- glucoside)

2.3.2. Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất bia

Enzyme amylase tác động vào giai đoạn đường hóa: biến đổi tinh bột thành
các dextrin và maltose .Quá trình nảy mầm xảy ra trong giai đoạn nấu bia.
Trong quá trình này , malt sau khi được nghiền sẽ hòa tan chung với nước theo
một tỷ lệ thích hợp dưới tác dụng của các enzyme ở nhiệt độ nhất định sẽ được
đường hóa trong nồi nấu malt.
2.3.3. Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất cồn

Enzyme sử dụng: α – amylase và β– amylase.
 Trước đây người ta dùng Enzym amylase của malt, nhưng ngày nay đã

thay thế bằng Enzym amylase của nấm sợi.
 Trong sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột, enzyme amylase được

sử dụng ở các giai đoạn đường hóa:

• Chuyển hóa tinh bột bằng α - amylase để tạo thành dextrin.
15


• Chuyển hóa dextrin bằng β - amylase hay amyloglucosidase để tạo ra
đường có khả năng lên men .
2.3.4. Ứng dụng trong sản xuất siro
 Enzym amylase chỉ được sử dụng sau khi tinh bột hoà vào nước.
 Enzym được sử dụng trong công nghệ sản xuất siro fructose phải là những

Enzym chịu nhiệt. Những enzym này thường được thu nhận từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis , Bacillus stearothermophilus. Ngoài ra, người ta còn
sử dụng α-amylase từ nhiều vi sinh vật khác nhau .
2.3.5. Ứng dụng trong sản xuất bánh mì
 Trong sản xuất bánh mì , người ta sử dụng enzyme nhằm giải quyết một số

vấn đề sau:
+ Làm tăng nhanh thể tích bánh.
+ Làm màu sắc của bánh đẹp hơn.
+ Làm tăng mùi thơm cho bánh.
 Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng cả hai loại Enzyme α-amylase và

β- amylase, các loại enzyme này tham gia thủy phân tinh bột để tạo thành
đường. Nhờ đó nấm men Saccharomyces cerevisiae sẽ dể dàng chuyển hóa
chúng thành cồn, CO2., làm tăng thể tích của bánh và tạo ra màu sắc, hương vị
tốt cho bánh .
2.3.6. Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo

Tuy nhiên, nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong tinh bột thì phản
ứng trên xảy ra không mạnh, nhất là khi sử dụng lọai bột xấu để sản xuất bánh.

Do đó người ta thường bổ sung thêm enzyme protease và amylase vào chế biến
bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Khi đó lượng đường khử và lượng amino
acid tự do sẽ tăng lên, phản ứng oxi-hóa khử cũng được tăng cường.

2.3.7. Ứng dụng trong sản xuất glucoza và mật

16


Chúng ta đã biết từ tinh bột có thể thu được các phẩm vật đường khác nhau
khi thủy phân tinh bột bằng acid cũng như bằng enzym amylase sẽ thu được
mật. Mật glucoza hay mật maltoza thường được dùng trong sản xuất bánh kẹo
và trong sản xuất các sản phẩm ăn kiên cho trẻ em và người bệnh.

3. Protease
3.1. Giới thiệu chung
Protease hay peptidase (EC.3.4) là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt
mối liên kết peptide (-CO~NH-)n trong các phân tử polypeptide, protein và một
số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử
thấp.
Protease phân bố ở động vật, thực vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme
phong phú nhất là nguồn từ vi sinh vật, có hầu hết ở các vi sinh vật như nấm
mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn thích hợp nhất để
sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus), đến thực vật ( đu đủ, dứa) và động vật ( gan, dạ
dày bê…). So với protease động vật và thực vật, protease của vi sinh vật có
những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất
phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình

dạng phân tử nên khó tách ra dưới tác dụng tinh thể đồng nhất. Do nó là phức
hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc
hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.

17


Hình 5. Cấu trúc không gian enzyme protease

3.2. Phân loại enzyme protease
Protease thuộc phân lớp thứ tư của lớp thứ ba (E.C.3.4)
Protease (peptidase)
(E.C.3.4)

Exopeptidase

Endopeptidase

(E.C.3.4.11-17)

(E.C.3.4.21-99)

Serine proteinase
Aminopeptidase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Carboxypeptidase
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
•

Dựa vào vị trí tác động lên mạch polypeptide, exopeptidase
được
phân thành
Metallo
proteinase

2 loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra 1 acid amine, 1 dipeptide hoặc tripeptide.

18


+ Carboxypetidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra 1 acid amine hoặc 1 dipeptide.
• Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4
nhóm:
+ Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác
của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: chymotripsyn và subtilisyn.
Nhóm chymotripsyn gồm các enzyme động vật như: chymotripsyn, trypsyn,
elastase. Nhóm subtilisyn gồm 2 loại enzyme vi khuẩn: subtilisyn Carsberg và
subtilisyn BPN. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính
và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cysteine proteinase gồm các proteinase thực vật như papain, bromelain,
một vài proteinase động vật và proteinase kí sinh trùng. Các Cysteine
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
+ Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm móc
cũng như các vi sinh bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở
vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn gồm 3 nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11

3.3. Nguồn thu nhận
Enzyme protease là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất
tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế mọi vi sinh vật đều
được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là 3
nguồn chính: động vật, thực vật, vi sinh vật.
3.3.1.

Nguồn động vật

- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và chứa nhiều enzyme
nhất.
19


- Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
protease tên là renin. Enzyme này từ lâu đã được sử dụng phổ biến trong công
nghệ phomai. Renin làm biến đổi casein thành parasein có khả năng kết tủa
trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca 2+ . Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển
hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm

renin bị nhiễm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá nhiều, khi
đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông
tụ sữa kém đi.
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như
ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.

3.3.2. Nguồn thực vật
Có 3 loại protease từ động vật: Bromelain, Papain, Ficin. Bromelain thu được
từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Papain thu được từ nhựa của lá,
thân, quả đu đủ (Carica papaya). Các enzyme này được sử dụng để chống lại
hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh ( chilling proofing) do kết tủa protein.
Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong làm mềm thịt và trong
mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( ficus carica) được sử dụng để
thủy phân protein tự nhiên.
3.3.2.

Nguồn vi sinh vật
Enzyme protease được phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn...

gồm nhiều loại thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillum, Clotridium,
Streptomyces và một số loại nấm men.
 Vi khuẩn

Lượng protease được sản xuất từ vi khuẩn ước tính khoảng 500 tấn, chiếm
59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hoặc thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopetidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó
protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân
hủy tới 80% liên kết peptide trong phân tử protein.
Trong các chuẩn vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillussubtilis, B.mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc
chi Clostridium. Trong đó, B. Sutilus có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất.
20


Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH
trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp ( pH từ 58) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh
dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid
ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. Subtilis, B. Mensentericus,
B.thermorpoteolitius và một số giống thuộc chi Clostridium.
 Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghệ thực phẩm là các chủng: Aspergillus, A.terricola,
A.saitoi,… các nấm mốc này có khả năng có khả năng của ba loại protease:
acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid có
khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3.
Một số nấm mốc như: A.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti… cũng có
khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa trong sản xuất phomai.
 Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn
và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm ra được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như Streptomyces grieus, S.fradiae, S.terimosus,….
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được
chiết tách từ S.grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân
tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ)
người ta cũng tách chiết được sản phẩm tương tự từ S.grieus có tên là protelin.
Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân keratin. Ở Mỹ
chế phẩm được sản xuất có tên là M-zim dùng trong sản xuất da. Protease từ

S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công
nghệ chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptide định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp gồm: pH, các nhóm
carboxyl hoặc amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, sản
phẩm trong hệ hai pha lỏng.

21


Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh
vật có những lợi ích chính như sau:
+ Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy và giống vi sinh vật.
+ Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16-100 giờ nên có thể thu hoạch
nhiều lần quanh năm.
+ Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi.
+ Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản
xuất.
Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc,
gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập giống vi sinh vật có
trong tự nhiên hoặc giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi, chỉ tổng hợp
ưu thế một số loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.
3.4.

Ứng dụng
Proetase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: công
nghiệp thực phẩm, công nghệ nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp.

3.4.1 Trong công nghiệp chế biến thịt
Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong
thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và tăng hương vị thịt. Sử
dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế
phẩm keratineza thủy phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ
da, long vũ. Để thủy phân sâu sắc và triệt để protein cần dùng các protease có
tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường phối cả 3 loại
protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỉ lệ tổng cộng 1-2% khối
lượng protein cần thủy phân.
Ưu điểm của việc thủy phân protease bằng enzyme là bảo toàn được vitamin
của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thủy
phân.
Để làm mềm thịt người ta hay sử dụng papain, bromelain, ficin… các
enzyme này chỉ phân giải được các peptide ở vùng không xoắn của collagen do
đó có thể ít hiệu quả đối với thịt chứa nhiều collagen hoặc thủy phân thịt quá
mức làm cho chất lượng cảm quan xấu.
22


Các yêu cầu của chế phẩm enzyme sử dụng làm mềm thịt:
•
•
•

Có khả năng chịu nhiệt
Không độc đối với con người
Có khả năng làm giảm độ bền vững của mô liên kết khi gia nhiệt

3.4.2 Trong công nghiệp sữa

Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của
chúng. Người ta chỉ sử dụng các protease của vi sinh vật có tính chất tương tự
rennin hoặc chỉ thay thế 25-50% rennin. Protease từ một số vi sinh vật như:
A.candidus, P.roquerti, B.mesentericus… được dùng trong sản xuất phomat.
Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy… protease làm giảm thời
gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.

3.4.3 Trong chế biến thủy sản
Khi sản xuất nước mắm thời gian chế biến thường dài nhất, hiệu quả thủy
phân (độ đạm) phụ thuộc rất nhiều nguyên liệu cá, phương pháp gài nén. Nên
hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó
sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút
ngắn thời gian và cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số
tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ.

3.4.4. Trong công nghiệp da
Các loại enzyme được dùng trong chế biến da động vật như: protease acid,
protease trung tính, protease kiềm của vi khuẩn, protease nấm sợi, papain từ đu
đủ, bromelain từ trái thơm.
Enzyme protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần
protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết
quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định,
tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây để làm mềm da
người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện
nay, việc đưa các protease được tách từ vi khuẩn (B.mesentericus, B.subtilis),
nấm mốc (A.oryzae, A.flavus) và xạ khuẩn (S.fradiae, S.griseus, S.rimosus...)
vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí
quan trọng.
23

3.4.5 Trong công nghiệp dệt
Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi
được bóng dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm
dính các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các sợi tơ tằm, do đó làm giảm
lượng hóa chất để tẩy trắng.

3.4.6 Trong sản xuất bia
Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia
và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A.oryzae được dùng để thủy phân protein
trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Vai trò của protease:
•

Giai đoạn đàm hóa: hệ enzyme protease được cho vào sau khi cho malt vào
thùng đạm hóa nhiệt độ nâng từ 30oC lên khoảng 52oC, lúc này hệ enzyme
protease bắt đầu hoạt động, giữ nhiệt độ trong khoảng 1 giờ. Đây là nhiệt độ
tối ưu cho hoạt động của protease để tạo ra sản phẩm polypeptide và acid

•

amin.
Làm trong bia và ổn định chất lượng sản phẩm: nhiều nghiên cứu cho thấy
pepsin, ficin, chế phẩm protease nấm sợi và papain đều có tác dụng rất tốt
trong quá trình ổn định chất lượng bia. Trong đó papain được ứng dụng
nhiều nhất.

3.4.7 Trong y học
Sử dụng nhiều enzyme protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, chữa
bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương.

Enzyme cũng như một số chất được dùng trong chữa bệnh cho người và gia
súc có những đặc tính chung không phù hợp như:
•
•
•
•

Khối lượng phân tử lớn khó qua màng tế bào
Dễ dàng bị thủy phân trong màng tiêu hóa
Có biểu hiện như kháng nguyên
Dễ bị mất hoạt tính sinh học do hoạt động ức chế của các chất hiện diện
trong hệ miễn dịch và trong mô

24


3.4.8 Trong công nghiệp xà phòng, các chất tẩy rửa, mỹ phẩm, sản xuất bánh
kẹo và một số ngành khác
Người ta bổ sung thêm enzyme protease trong các loại xà phòng diệt khuẩn,
kem dưỡng da, xà phòng có tính tẩy rửa cao.
Ứng dụng enzyme trong sản xuất bánh kẹo làm tăng mùi và vị của bánh.
Ngoài ra protease được ứng dụng trong nhiều ngành khác như:
•

Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị

•

trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn

hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn

•

trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.
Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,

kháng sinh ...
• Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein,
sản xuất mỹ phẩm.

4. Enzyme Lipase ( triacylglyxerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3 )
4.1. Giới thiệu về enzyme lipase


Lipase là enzyme tham gia quá trình xúc tác cho phản ứng thủy phân
thuận nghịch triaxiglixerol ( dầu thực vật, mỡ động vật ) ở điều kiện bình
thường tạo thành glixerin và axit béo tương ứng. Lipase xúc tác phản ứng
thủy phân lần lượt từng liên kết α – ester trong phân tử chứ không phải cắt
đứt cả ba liên kết ester cùng một lúc. Lipase có hoạt tính mạnh đối với cơ

chất không tan trong nước, thể hiện hoạt tính bề mặt.

Lipase khác với enzyme esterase ở điểm chỉ thủy phân cơ chất không tan
trong nước và hoạt tính được tăng cường khi ở bề mặt phân chia pha cơ chất
– nước (interfacial activation). Vì vậy hoạt tính tối ưu của lipase thể hiện
trong hệ nhũ tương (dầu trong nước) ngoài ra còn hoạt động mạnh ở hệ nhũ
đảo (nước trong dầu) và dầu hòa tan trong dung môi hữu cơ. Hơn thế nữa
lipase rất linh hoạt vì có thể xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ester và tổng
hợp ester đặc hiệu về cấu hình không gian với sự đa dạng về cơ chất phản

ứng.
25