Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanoltừ cây elephantopus sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO
CHIẾT METHANOL TỪ CÂY ELEPHANTOPUS SP.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn:

Th S. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện:

Phạm Hữu Tuấn

MSSV: 1151110538

Lớp: 11DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên
cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm
Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời
cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm……

Sinh viên

Phạm Hữu Tuấn


LỜI CÁM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại
học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh
học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức
quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.
Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt,
người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở
Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh
chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt
đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên
con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như
trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày……tháng……2015

Sinh viên

Phạm Hữu Tuấn


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
TRANG
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục ......................................................................................................................... i
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... iv
Danh sách các hình...................................................................................................... v
Danh sách các bảng ...................................................................................................vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 1
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2
4. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................ 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3
1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp....................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc ........................................................................................................ 3
1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc Elephantopus sp. ........................................... 3
1.1.4. Phân bố .............................................................................................................. 5
1.1.5. Công dụng ......................................................................................................... 5
1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật .............................................. 6
1.2.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật ....................... 6
1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật ........................................... 6

i


Đồ án tốt nghiệp

1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ......................................................... 8
1.2.4. Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn ở thực vật trên thế giới và tại
Việt Nam .................................................................................................................. 12
1.3. Ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của thực vật . 14
1.4. Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh ................................................... 15
1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy .............................................................. 15
1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da ...................................................... 21
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 27
2.1. Thời gian và địa điểm......................................................................................... 27
2.1.1. Thời gian ......................................................................................................... 27
2.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 27
2.2. Vật liệu ............................................................................................................... 27
2.2.1. Nguồn mẫu ..................................................................................................... 27
2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ............................................................................................ 27
2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị........................................................................... 28
2.4. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 29
2.4.1. Phương pháp xử lý và tách chiết hợp chất kháng khuẩn ................................ 29
2.4.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị ...................................................... 29
2.4.3. Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................................... 30
2.4.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật chỉ thị .................................. 30
2.4.5. Phương pháp tách các phân đoạn từ cao tổng methanol ................................. 30
2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết .......................... 31
2.4.7. Phương pháp xác định chỉ số MIC .................................................................. 32

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.4.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học .................................................... 33
2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 34
2.5. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 34
2.5.1. Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp ............ 34
2.5.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol từ cây
Elephantopus sp. ....................................................................................................... 36
2.5.3. Thí nghiệm 3: Tách chiết các phân đoạn từ cao tổng methanol 75% từ cây
Elephantopus sp. ....................................................................................................... 37
2.5.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn của cao
tổng methanol ............................................................................................................ 38
2.5.5. Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao tổng
methanol Elephantopus sp ........................................................................................ 39
2.5.6. Thí nghiệm 6: Định tính một số thành phần có trong cây Elephantopus sp ... 41
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 45
3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp............................ 45
3.2. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp. . 45
3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao tổng Elephantopus sp ................................... 49
3.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cây Elephantopus sp ................................ 50
3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng Elephantopus sp. qua từng phân đoạn..... 53
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 58
4.1. Kết luận .............................................................................................................. 58
4.2. Đề nghị ............................................................................................................... 58
Tài liệu tham khảo .................................................................................................... 59

iii

Đồ án tốt nghiệp

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BF: Butanol fraction
EF: Ethyl acetate fraction
EMB: Eosin Methylene Blue
HF: Hexan fraction
ME: dịch chiết methanol 75%
MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu
PSMs: Plant Secondary Metabolites
TSA: Trypticase Soya Agar
TSB: Trypton Soya Broth
XLD: Xylose Lysine Deoxycholate
WF: Water fraction

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái cây Elephantopus scaber ..................................................... 4

Hình 1.2. Hình thái cây Elephantopus mollis ...................................................... 4
Hình 1.3. Hình thái cây Elephantopus tomentosus .............................................. 5
Hình 1.4. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm
.............................................................................................................................. 7
Hình 1.5. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử ........................................... 15
Hình 1.6. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB ............................................. 16
Hình 1.7. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử .......................................... 17
Hình 1.8. Khuẩn lạc Vibrio trên môi trường Chrom agar .................................. 17
Hình 1.9. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử .................................. 18
Hình 1.10. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD ................................... 19
Hình 1.11. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử ..................................... 20
Hình 1.12. Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey ............................. 20
Hình 1.13. Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử ............................ 22
Hình 1.14. Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa trên môi trường thạch thường22
Hính 1.15. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử ............... 23
Hình 1.16. Khuẩn lạc Enterococcus faecalis trên môi trường thạch máu BA ... 24
Hình 1.17. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử ......................... 25
Hình 1.18. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung
egg yolk .............................................................................................................. 25
Hình 2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% (100 mg/ml) đối với
chủng Escheriachia coli (trái) và Shigella flexneri ............................................ 37
vi


Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.2. Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn hexan (20 mg/ml) và butanol (50
mg/ml) đối với chủng Escheriachia coli và Shigella flexneri ........................... 39
Hình 2.3. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% (25 mg/ml) đối với
chủng Listeria monocytogenes và Vibrio alginolyticus (phải). ......................... 40

Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với
nhóm Escherichia spp. ...................................................................................... 45
Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với
chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus
............................................................................................................................ 46
Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với
chủng Listeria monocytogen Pseudomonas aeruginosa .................................... 47
Hình 3.4. Thử nghiệm định tính tannin .............................................................. 52
Hình 3.5. Thử nghiệm định tính alkaloid ........................................................... 53
Hình 3.6. Thử nghiệm định tính flavonoid ........................................................ 53
Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn đối với nhóm Escherichia54
Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của của các phân đoạn đối với chủng Shigella
flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus ................ 54
Hình 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn lên chủng Listeria
monocytogenes và chủng Pseudomonas aeruginosa ......................................... 55

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của dịch chiết methanol 75% từ cây
Elephantopus sp . ............................................................................................... 48
Bảng 3.2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết methanol 75% từ
cây Elephantopus sp ........................................................................................... 49
Bảng 3.3. Định tính một số thành phần hóa học có trong cao chiết methanol cây
Elephantopus sp. ................................................................................................ 50
Bảng 3.4. Kết quả tổng hợp của hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol 75% và 4

phân đoạn hexan, ethyl acetate, butanol và nước từ cây Elephantopus sp. ....... 56

viii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm đầu thế kỉ XIX khi người ta tìm cách chữa trị các vết
thương, nhiễm trùng do các tác sinh học cụ thể là vi khuẩn thì kháng sinh là sự lựa
chọn được ưu tiên hàng đầu. Các loại kháng sinh thời điểm đó chủ yếu được phân lập
từ nấm ví dụ như penicillin được phân lập từ nấm Penicillium nhưng cho tới nay do
sự hiện tượng kháng thuốc đã xuất hiện và trở nên mạnh mẽ và lan rộng hơn thì việc
sử dụng các hợp chất có nguồn gốc thực vật nên được quan tâm và nghiên cứu nhiều
hơn. Thật vậy khi dân số ngày càng tăng nhanh ở các nước đang phát triển, tỷ lệ dịch
bệnh ngày càng tăng và đa dạng cùng với đó sự gia tăng của các loại thuốc hóa học
cũng mang tới những hệ quả không mong muốn thì việc tạo ra loại thuốc có nguồn
gốc tự nhiên vừa rẻ tiền vừa gần gũi với cuộc sống luôn được mọi người đón nhận.
Đã từ rất lâu, khi cuộc sống con người vẫn chưa có nhiều tiện nghi, các phương tiện
cũng như các loại thuốc tân thời, việc con người sử dung các loại thuốc có nguồn gốc
tự nhiên rất được con người ưa chuộng. các thầy thuốc giỏi chữa được nhiều căn bệnh
hiểm nghèo thường có một kiến thức rất uyên thâm về cây thuốc và các công dụng
của chúng họ quan niệm rằng các cây thuốc và các vị thuốc luôn ở quanh ta, cây thuốc
sau khi được đem về sẽ được phơi khô và chủ yếu ngâm với nước sắc làm thuốc uống,
thuốc này trị được nhiều bệnh và như một bài thuốc dân gian nó vẫn tồn tại cho tới
ngày nay
Để tìm hiểu một cách cặn kẽ và chi tiết hơn về tác dụng trị các bệnh có nguồn
gốc sinh học cũng như kiểm chứng khả năng thay thế những loại thuốc tân thời chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol

từ cây elephantopus sp.”. Đề tài nghiên cứu này dựa tên một loài cây được dân gian
dùng như một vị thuốc, hy vọng sẽ làm sáng tỏ một số công dụng được dân gian
truyền tụng dưới ánh nhìn khoa học và thuyết phục hơn.
2. Mục đích
Xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Elephantopus sp.
1


Đồ án tốt nghiệp

Bước đầu xác định thành phần hóa học có trong cây Elephantopus sp.
3. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol và các phân đoạn từ
cây Elephantopus sp.
Xác định chỉ số MIC và MBC của cao chiết methanol và các phân đoạn từ
cây Elephantopus sp.
Định tính một số thành phần hóa học có trong cây Elephantopus sp.
4. Phạm vi nghiên cứu
Các khảo sát thực hiện chỉ trên hệ dung môi methanol 75% và 4 phân đoạn
của methanol 75% bao gồm Hexan, Butanol, Ethyl acetate và nước.
Trong phản ứng xác định thành phần hóa học chỉ giới hạn ở mức độ định
tính các nhóm chất chung.
Giới hạn khảo sát chỉ trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.
Chỉ khảo sát cây thuốc ở mức độ chi

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp.
1.1.1. Nguồn gốc
Elephantopus sp. là loại cây sống lâu năm thuộc họ Cúc, có khoảng 26 loài,
chúng đã được mô tả từ lâu đời điển hình như Elephantopus tomentosus được mô tả
lần đầu vào năm 1753, Elephantopus mollis được Kunth mô tả vào năm 1820, còn
Elephantopus scaber thì được mô tả lần đầu vào năm 1753 bởi Lour.
1.1.2. Phân loại
Giới

Plantae

Ngành

Magnoliophyta

Lớp

Angiospermae

Loại

Campanulids

Bộ

Asterales

Họ

Asteraceae

Giống

Elephantopus

Loại

Elephantopus sp.

1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc Elephantopus sp.
1.1.3.1. Elephantopus scaber
Elephantopus scaber cao 30-60 cm. Lá mọc thành hoa thị ở gốc, thuôn thon
hay thành cuống ôm thân, tù ở đầu, dài 6 -12cm, rộng 3-5 cm, có răng, có lông ráp ở
cả hai mặt, với lông trắng, cứng, áp sát. Hoa tím hay hồng, xếp 4 cái thành đầu; các
đầu này lại tập hợp thành ngù bao bởi hai lá bắc hình tam giác, dài 10-15mm, rộng ở
gốc. Quả bế có 10 cạnh, hình thoi, có lông, cụt ở đỉnh; mào lông cứng xếp một dãy,
thường ra hoa vào mùa thu giữa tháng 6 tới tháng 12, (Wang và ctv 2004).

3


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1. Hình thái cây Elephantopus scaber
1.1.3.2. Elephantopus mollis
Elephantopus mollis cao 0,5-1m, phủ đầy lông. Lá mọc dài theo thân, không
cuống; phiến thon dạng bay, dài 10-15cm, gốc ôm thân, mép khía lượn, có lông mềm
ngắn ở mặt dưới; các lá trên rất tiêu giảm. Cụm hoa dài theo thân, nhánh mang nhiều
hoa đầu kép trong một bao chung; các hoa đầu phụ cao 8 mm, mang 4 tới 5 hoa trắng,

quả bế cao 3mm, có rãnh; mào lông có 5 tơ và thường ra hoa vào tháng 6 và 7
(Alyokhin và ctv 2002).

Hình 1.2. Hình thái cây Elephantopus mollis
1.1.3.3. Elephantopus tomentosus

4


Đồ án tốt nghiệp

Elephantopus tomentosus cao từ 60 tới 120 cm, thân cây thẳng đứng nhiều
nhánh, góc cạnh có lông tơ trắng, phần thân rễ khỏe mạnh hình sợi hướng thẳng lên,
lá thường bị úa khi cây bắt đầu nở hoa, hầu như không có cuốn lá hoặc cuốn lá rất
nhỏ, lá nằm bên dưới có hình chữ nhật hay oval diện tích khoảng 8-22 × 3-7 cm, một
gân chính, lá nằm trên có hình elip hay hình chữ nhật có diện tích vào khoảng 7-8 ×
1,5-2 cm, hướng trục có lằn xếp và nổi cộm lên lông tơ thưa thớt hoặc dày đặc, cụm
hoa vào khoảng 12 tới 20 cụm, cuốn thon dài (Wang và ctv, 2012).

Hình 1.3. Hình thái cây Elephantopus tomentosus
1.1.4. Phân bố
Elephantopus sp. thường mọc nhiều ở châu Phi, Nam Á, Úc và Châu Mỹ,
một vài loài thuộc Đông Nam Mỹ và số ít ở Ấn Độ và Himalaya. Loài Elephantopus
mollis được tìm thấy ở dọc các bờ biển Philippines, ngoài ra còn có thể tìm thấy ở
Mexico, Đài Loan và Borneo. Tại Việt Nam có thể gặp một trong hai loài là
Elephantopus scaber hay Elephantopus tomentosus.
1.1.5. Công dụng
Elephantopus sp. được dân gian sử dụng như một loại thuốc cổ truyền để
điều trị các bệnh như viêm thận, phù nề, sốt tức ngực, lở loét, đau khớp do thương
5

Đồ án tốt nghiệp

tích, ho do viêm phổi. chúng cũng còn được dùng như một loại thuốc bổ tăng cường
sức khỏe, làm thuốc hạ sốt, viêm cuống phổi và hen suyễn. Người Thái Lan đã dùng
Elephantopus scaber để chữa chứng ho, làm thuốc bổ (Inta và ctv, 2008). Ở Malaysia
nước sắc rễ cây Elephantopus scaber giúp ngăn chặn viêm nhiễm sau khi sinh con,
ngoài ra toàn bộ cây Elephantopus scaber được nấu cùng với đậu đỏ có thể trị chứng
đầy hơi (Hammer và Johns, 1993), Elephantopus scaber ở Brazil được sử dụng như
một phương thuốc truyền thống giúp hạ sốt, lợi tiểu, loại sỏi thận (Poli và ctv, 1992).
Trong nghiên cứu hiện tại chúng cũng được kiểm tra khá kỹ lưỡng về tính độc, khả
năng hạ sốt, khả năng giảm đau, kháng viêm, lợi tiểu và gây táo bón. Elephantopus
mollis có công dụng lợi tiểu, hạ sốt, trị thương, kháng khuẩn và virus, rễ cây
Elephantopus mollis có công dụng chống nôn mửa còn lá cây có công dụng trong
việc chữa các vết loét và bệnh chàm, cả rễ và lá có công dụng làm mềm vết thương,
trị tiêu chảy và các chứng đau lỗ tiểu và đau dạ dày (Muthiumani và ctv, 2010). Ở
Malaysia người ta sử dụng Elephantopus tomentosus như một vị thuốc lợi tiểu, hạ
sốt, giảm đau và trị giun, ngoài ra chúng còn được dùng làm thuốc bôi ngoài da
(Jaganath, 2000). Trong báo cáo của Yam và ctv (2009) thì Elephantopus tomentosus
được sử dụng để điều trị kháng viêm.
1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật
1.2.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật
Chất kháng khuẩn thực vật là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác
dụng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn
thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ thường rất
nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010).
1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật
Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm
việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng

hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào,
gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin
6


Đồ án tốt nghiệp

của tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant
secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác
động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế
bào (Radulovíc và ctv 2013).

Hình 1.4. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm
Các hợp chất từ thực vật có tác động kháng khuẩn không chỉ là đối với vi
khuẩn Gram dương và Gram âm mà còn với cả nấm, trong đó các chủng Gram âm là
nhạy cảm dễ bị các hợp chất thực vật tác động lên nhất, có tới 5 hướng mà các hợp
chất thực vật có thể tác động tới các chủng Gram âm. Trường hợp điển hình là của
thymol, hợp chất này có tác động tới cả màng tế bào của tế bào chất bên ngoài và bên
trong bằng cách tích hợp vào nhóm đầu cực của lớp đôi lipid dẫn tới sự chênh lệch,
làm tăng tính bán thấm của màng tế bào và gây chết, tuy nhiên thymol cũng có thể
tham gia vào việc quy định các gen tham gia vào tổng hợp protein màng ngoài, ức
chế enzym liên quan đến bảo vệ chống lại stress nhiệt, tổng hợp ATP, các con đường
trao đổi chất citric. Tiềm năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của PSMs có thể
bị ảnh hưởng và phụ thuộc bởi rất nhiều yếu tố như tính năng của tế bào đích (vi
khuẩn, nấm, Gram dương, Gram âm), điều kiện môi trường, khả năng hòa tan, nồng
7


Đồ án tốt nghiệp

độ, nhiệt độ, độ pH ảnh hưởng quan trọng tới tác động kháng khuẩn của PSMs cũng
như các hỗn hợp của chúng (Radulovíc và ctv, 2013). (Hình 1.4).
1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật
1.2.3.1. Alkaloid
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino
acid, đa số có nhân dị vòng. Đa số các alkaloid đều có tính base yếu. Chủ yếu trong
thực vật, tập trung ở một số họ: Apocynaceae (họ Trúc đào) gần 800 alkaloid,
Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần 400 alkaloid, Fabaceae (họ Đậu) 350 alkaloid,
Solanaceae (họ Cà) gần 200 alkaloid. Phương pháp định tính alkaloid: Thử nghiệm
Wagner, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Mayer, thử nghiệm Dragendroff.
Vai trò của alkaloid chủ yếu là tác động diệt khuẩn, ảnh hưởng lên hệ thần
kinh, hạ huyết áp, chống ung thư.
Một số alkaloid có tính kháng khuẩn: Solamargine là một glycoalkaloid có
trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasinum), và các loại alkaloid khác trong
loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Kháng khuẩn
tốt nhất dối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp tới việc
kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. Ngoài solamargine thì berbein
cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với shigella, Staphylococcus. Những năm gần đây
một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tinh kháng khuẩn với nhiều vi
khuẩn Gram dương, Gram âm ngoài ra berberine còn chống lại nấm men gây bệnh
và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với khuẩn gây
sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn berberine là khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn
gây bệnh số rét, chính vì thế mà tác dụng kháng khuẩn của berberine đối với loài này
khá mạnh. Đặc biệt khi dùng berberine điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột sẽ
không ảnh hưởng tới sự phất triển bình thường của hệ vi sinh vật có lợi ở ruột. Vì vậy
berberine đang được chú ý phát triển ơ nhiều nước (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010).
1.2.3.2. Saponin

8

Đồ án tốt nghiệp

Saponin thuộc nhóm glycosides, dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi
khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần
glucid thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong
aceton, ether, hexan, hòa tan vào nước từ đó làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch
và tạo bọt. phát hiện trong mẫu có Saponin bằng thử nghiệm lắc tạo bọt
Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi
lỏng), một số saponin có tác dụng chống viêm, một số có tác dụng kháng khuẩn,
kháng nấm, ức chế virus, kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, theo Hoàng Sầm
và Hứa Văn Thao (2012).
1.2.3.3. Anthraquinone glycoside
Anthraquinone glycosides là hợp chất thường có màu từ vàng, cam tới đỏ,
gắn vào nhân thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH..., tuỳ theo vị
trí các nhóm chức gắn vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau. Anthraquinone
glycosides được định tính bằng thử nghiệm Borntrager.
Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất anthraquinon có tác dụng kích thích
miễn dịch chống ung thư. Thành phần ức chế vi khuẩn trong cây Đại Hoàng chủ yếu
là dẫn chất của anthraquinone, có tác dụng kháng khuẩn rộng chủ yếu đối với tụ cầu,
liên cầu, song cầu khuẩn lậu, trực khuẩn bạch hầu, thương hàn, phó thương hàn, kiết
lị, theo Mạnh Hùng (2015).
1.2.3.4. Flavonoids
Flavonoids là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc
của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa. Bộ khung cơ bản gồm 2
vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, có độ tan không giống
nhau. Flavonoid glycosides, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi
hữu cơ, tan được trong nước, cồn, aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ,
không tan trong nước. flavonoids được phân loại dựa trên vị trí của gốc aryl đính vào.
flavonoids được xác định bằng các thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm acid clohidric

và thử nghiệm Benidict.
9


Đồ án tốt nghiệp

Flavonoids có vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic
trong tế bào, ngăn cản 1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng…),
tham gia quá trình lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa.
Một số hợp chất Flavonoids có hoạt tính kháng khuẩn có thể kể đến như
catechin. Chúng là một trong những hợp chất flavonoid có khả năng ức chế Vibrio
cholera, Streptococcus mutans, Shigella và một số vi sinh vật khác. Catechin hoạt
động bằng cách vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme
glucosyltransferase của Streptococcus mutans, cơ chế hoạt động là do khả năng tạo
phức không thuận nghịch với các amino acid ái nhân trong protein từ đó làm bất hoạt
chức năng gây bệnh của protein trong vi sinh vật. Galangin có hoạt tính chống lại vi
khuẩn Gram dương cũng như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV-1 và Coxsackie B
type I (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010).
1.2.3.5. Phenolic
Phenolic là những hợp chất hóa học được tìm thấy ở khắp các chất màu của
hoa quả được cấu tạo từ các tiểu đơn phân phenol, đa số được tổng hợp từ
phenylalanine, ở thực vật nhóm phenolic chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid (Một
trong những hợp chất đơn giản có độc tinh sinh học được cấu tạo từ dẫn xuất thế vòng
phenolic). Phenolic chủ yếu được phân thành 2 loại chính là phenolic acid và
flavonoid polyphenol. Chủ yếu người ta dùng các loại thuốc thử Folin để xác định sự
có mặt của phenolic.
Phenolic có vai trò bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh và các động vật ăn
cỏ, chất chống oxi hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh, chống ung thư, ngăn
ngừa bệnh tim và kháng viêm, một hợp chất phenolic khác là chlorogenic acid được
biết như là chất gây ra viêm da dị ứng ở người.

Một số hợp chất phenolic có hoạt tinh kháng khuẩn như eugenol là hợp chất
phenolic có chứa 1 nhánh thế mà có carbon ở trạng thái oxy hóa thấp không chứa oxy
được xem là chất kìm hãm đồng thời chống lại cả nấm sợi và vi khuẩn. Catechol và
pyrogallol là hai hợp chất hydroxyl hóa của phenol cho thấy là có độc tính đối với vi
10


Đồ án tốt nghiệp

sinh vật. Catechol có 2 nhóm OH và pyrogallol có 3 nhóm OH. Vị trí và số lượng các
nhóm hydroxyl trên vòng phenol được xem như là có liên quan tới độc tính của chúng
lên vi sinh vật, cụ thể là tăng sự hydroxyl hóa thì độc tính của chúng sẽ tăng lên.
Ngoài ra, người ta còn nhận thấy rằng phenol ở trạng thái oxy hóa càng cao thì khả
năng ức chế vi sinh vật càng tăng. Cơ chấ này được cho là nguyên nhân dẫn tới độc
tính của các hợp chất phenolic này đối với vi sinh vật bao gồm sự ức chế enzyme bởi
các hợp chất oxi hóa, có thể thông qua các phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông
qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này đối với protein (Nguyễn Thị Hiền
và ctv 2010).
1.2.3.6. Tannin
Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết
bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và
alkaloid), có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không
tan trong các dung môi hữu cơ, tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân,
kẽm, sắt). Có thể chia tannin làm hai loại tannin thủy phân được (Tannin pyrogalic)
và tannin không thủy phân được (Tannin pyrocatechic). Tannin thủy phân được thì
được thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo thành phần đường (glucose) và
phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este, tủa xanh đen với muối
sắt III, dễ tan trong nước, ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn. Tannin
không thủy phân được thì dễ tạo thành chất phlobaphen không tan, thường là chất
trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là những chất đồng trùng

hợp của hai loại), tủa xanh với muối sắt III, ví dụ: Vỏ Quế, Canhkina, Ðại hoàng.
Tannin thường được định tính bằng thử nghiệm Gelatin mặn, thử nghiệm chì acetate,
thử nghiệm FeCl3, thử nghiệm KMnO4.
Tannin có vai trò bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc
trừ sâu, tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng, công dụng chữa
viêm ruột, tiêu chảy.

11


Đồ án tốt nghiệp

Cơ chế kháng khuẩn của tannin chủ yếu là là tạo phức với các protein gây bất
hoạt chúng giống như ở flavonoid. Condensed tannin đã được xác định có thể liên kết
với thành tế bào vi khuẩn có trong hệt tiêu hóa của động vật nhai lại, ngăn chặn sự
sinh trưởng và ức chế hoạt tính của protease. Tính kháng khuẩn của tannin được tăng
cường bởi tia UV ở bước sóng 320 tới 400 nm (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010).
1.2.3.7. Terpene
Terpene là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon của terpene được
tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8, terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài
họ thông, theo Nguyễn Tiến Thắng (2011).
Terpenenes có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và các động vật
nguyên sinh.
Cơ chế kháng khuẩn của terpenenes được cho là liên quan tới sự phá vỡ màng
tế bào bởi các hợp chất lipophilic. Các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu
thực vật có khả năng kiểm soát được Listeria monocytogenes.
1.2.4. Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn ở thực vật trên thế giới và
tại Việt Nam:
Trong nghiên cứu của Anees và ctv (2009) thì 6 hợp chất có được từ cây
Elephantopus.scaber trong quá trình cô đặc từ 2 loại dung môi n-hexane và methanol

từ 3 phần khác nhau của cây gồm rễ, thân và lá thu được hợp chất stigmasterol, lupeol,
stearic acid, đồng phân deoxyelephantopin, đồng đẳng 1 và 2 của deoxyelephantopin.
Thành phần hóa học chính của cây Elephantopus mollis là elephantopin,
triterpenes, stigmasterol epifriedelinol và lupeol (Consolacion, 2009). Cũng trong
nghiên cứu này thì phần tan dichloromethane của lá E.mollis đã đưa ra phương pháp
NMR quang phổ và theo đó đã tìm ra được các hợp chất sau: 2-deethoxy-2hydroxyphantomolin, ester của acid béo và α amyrin, ester của acid béo và lupeol,
stigmasterol.

12


Đồ án tốt nghiệp

Kết quả của Chaghaby (2011) ghi nhận các dịch chiết khác nhau từ lá cây
Annona Squamosa đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương
mạnh hơn Gram âm. Kết quả của của Chaghaby dựa trên nghiên cứu của Chopra và
Greenwood cho rằng vi khuẩn Gram âm ít bị ảnh hưởng nhiều bởi những chất có
chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn Gram dương là do chúng có một lớp màng
ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide cho phép chúng có khả năng
điều hòa, vận chuyển các chất ra vào bên trong cơ cấu nội bào. Mỗi một dịch chiết
đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên những bất
đồng được quan sát thấy ở những dịch chiết lên các chủng vi sinh vật là khác nhau.
Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp chất hóa học có trong mỗi loại dịch
chiết, theo nghiên cứu của Doriane (2013).
Trong nghiên cứu của Ibtisam (2011) đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
của dịch chiết ethanol trên 6 loại cây gồm có Ginger (Zingiber officinale), Cinnamon
(Cinnamomum verum), black cumin (Nigella sativa), Clove (Syzygium aromaticum)
black pepper (Piper nigrum) và chamomile (Anthemis nobilis) để chống lại các chủng
vi khuẩn Gram dương thông thường bao gồm Staphylococus aureus và Bacillus
subtilis, các chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và

nấm men Candida albicans, kết quả ghi nhận dịch chiết của cây Syzygium
aromaticum có khả năng ức chế mạnh đến sự phát triển của Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans, dịch chiết cây Cinnamomum verum
có khả năng ức chế mạnh đến sự phát triển của Bacillus subtilis và Candida albicans,
còn dịch chiết của những cây còn lại ở mức trung bình.
Nghiên cứu của Lê Thị Bích Uyên (2007) trên cây Aloe vera và Mirabilis
jalapa L cho thấy dịch chiết ethanol của cây lô hội Aloe vera ngoài tự nhiên có khả
năng kháng được các chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và không có
hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus và nấm Candida albicans,
tuy nhiên dịch chiết của Aloe vera ngoài tự nhiên cho khả năng kháng rất yếu chủ yếu
là ức chế cho vòng kháng mờ và nhỏ, dịch chiết trong ethanol của cây lô hội invitro
có khả năng kháng được chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và
13


Đồ án tốt nghiệp

Staphylococcus, với khả năng kháng cao hơn. Cũng trong nghiên cứu trên thì dịch
chiết ethanol của mô sẹo cây hoa phấn tự nhiên Mirabilis jalapa L. và cây hoa phấn
invitro có khả năng kháng chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và
Staphylococcus.
1.3. Ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của thực
vật:
Theo kết quả nghiên cứu của Antara Sen (2012) thì dịch chiết của cây Melia
azedarach L trên tất cả các hệ dung môi ethanol, methanol, petroleum ether và nước
đều có khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn gây bệnh cho người đã được phân lập
trước đó bao gồm Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, và
Pseudomonas aeruginosa.
Nghiên cứu trên chỉ ra rằng dịch chiết của cây thu được nhờ hệ dung môi
Petroleum ether cho kết quả dối kháng tốt với tất cả các chủng. Cùng với đó trong

một nghiên cứu khác của Murugesan (2011) trên cây Memecylon umbellatum thì dịch
chiết của cây này trong dung môi Petroleum ether có hoạt tính tốt lên các chủng vi
sinh vật chỉ thị. Từ dịch chiết trên ông thu nhận sự có mặt của amino acid,
carbonhydrate, flavonoid, protein, nhóm hợp chất phenolic, saponin và steroid. Ngoài
ra, dịch chiết nước từ lá của cây Pterospermum acerifolium trong nghiên cứu của
Thatoi (2008) còn có hoạt tính kháng khuẩn nổi bật chống lại một số chủng vi khuẩn
gây bệnh Gram dương và Gram âm.
Dịch chiết của lá cây Bryophyllum pinnatum và Kalanchoe crenata trong
nghiên cứu của Aibinu (2007) sử dụng bào gồm 5 loại dịch chiết: nước, methanol và
các loại dịch chiết địa phương bao gồm rượu dừa, gin và “omi ekan-ogi”, các loại
dịch chiết của 2 loại cây trên được thử hoạt tính chống lại một số chủng vi sinh vật
Gram âm Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Salmonella paratyphii, Citrobacter spp,
các chủng Gram dương Staphylococcus aureus ATCC 25213, Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis và nấm Candida albicans, trong nghiên cứu
14