Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo hạt, bảo quản và nảy mầm của hạt nhân tạo đối với cây lan thạch hộc tía (dendrobium officinale kimura et migo)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
TẠO HẠT, BẢO QUẢN VÀ NẢY MẦM CỦA HẠT NHÂN TẠO
ĐỐI VỚI CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA (DENDROBIUM
OFFICINALE KIMURA ET MIGO)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : NGUYỄN CỬU THÀNH NHÂN
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110528

:

HUỲNH THỊ NGỌC TRÂM
Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn
của Th.s Nguyễn Cửu Thành Nhân. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung
thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu
trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Chân thành cảm ơn:
 Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công Nghệ Tphcm
 Quý thầy cô trường Đại Học Công Nghệ Tphcm
 Quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Cửu Thành Nhân đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ em suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tâp cũng như thực
hiện luận văn này.
Cảm ơn công lao cha mẹ đã tận tụy suốt đời vì con để con có được như ngày hôm
nay.
Xin gửi lời cảm ơn đến:
Tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Ươm Tạo Doanh Nghiệp Nông Nghiệp
Công Nghệ Cao và phòng Nuôi Cấy Tế Bào Thực Vật, cùng tất cả bạn bè trong và
ngoài lớp 11DSH04 đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và
thực hiện đề tài.
Tp. Hồ Chí Minh, Ngày..... tháng ..... năm 2015
Sinh viên

Huỳnh Thị Ngọc Trâm

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................................... vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................................vii
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4
1.1

Khái quát về cây lan .....................................................................................4

1.1.1 Phân loại thực vật học .................................................................................4
1.1.2 Lịch sử cây lan ............................................................................................4
1.1.3 Tình hình sản xuất lan .................................................................................5
1.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan .............................................................6
1.1.4.1 Cơ quan dinh dưỡng .............................................................................6
1.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa ................................................8
1.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan ................................................................9
1.2

Giới thiệu về lan Thạch Hộc Tía: ..............................................................10

1.2.1 Đặc trưng hình thái và sự phân bố: ...........................................................10
1.2.2 Công dụng: ................................................................................................10

1.2.3 Giá trị kinh tế:............................................................................................12
1.3

Nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................................................13

1.3.1 Khái niệm ..................................................................................................13
1.3.2 Lịch sử phát triển.......................................................................................14
1.3.3 Ứng dụng: ..................................................................................................15
1.3.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro ...........................................................15
1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng nhân giống in vitro................................................17
1.3.6 Các bước nhân giống in vitro: ...................................................................18
1.4

Công nghệ tạo hạt nhân tạo: .....................................................................19

1.4.1 Khái niệm hạt nhân tạo: ............................................................................19
iii


Đồ án tốt nghiệp

1.4.2 Ưu điểm của hạt nhân tạo: ........................................................................20
1.4.3 Quá trình tạo hạt nhân tạo: ........................................................................20
1.4.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo:........................................................................22
1.4.5 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo: ..........................23
1.4.6 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium: 23
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................25
2.1

Đối tƣợng nghiên cứu: ................................................................................25

2.2

Thời gian thực hiện: ...................................................................................25

2.3

Nội dung nghiên cứu : ................................................................................25

2.4

Vật liệu nghiên cứu .....................................................................................26

2.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .......................................................26
2.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy ..........................................................26
2.4.3 Môi trường sử dụng ...................................................................................26
2.5

Phƣơng pháp nghiên cứu ...........................................................................27

2.5.1 Chuẩn bị môi trường .................................................................................27
2.5.2 Bố trí thí nghiệm .......................................................................................28
2.6

Xử lý số liệu: ................................................................................................31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................32
3.1

Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Thạch Hộc Tía:

32

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................52
4.1

Kết luận ........................................................................................................52

4.2

Đề nghị .........................................................................................................52

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt
nhân tạo.......................................................................................................................28
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O.
.....................................................................................................................................28
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân ....................................29
Bảng 2.4. Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo..............................................30
Bảng 2.5. Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau ..........31
Bảng 3.1. Nồng độ alginate ảnh hưởng đến hình thái vỏ hạt nhân tạo .....................35
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate .................................36
Bảng 3.3 Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau..........37
Bảng 3.4: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các thời gian ngâm hạt khác nhau: ...........41
Bảng 3.5 Khảo sát khả năng bảo quản hạt trên môi trường MS: ..............................43
Bảng 3.6 Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau.

.....................................................................................................................................44
Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bảo quản hạt nhân tạo......................46
Bảng3.8 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bảo quản hạt nhân tạo.......................48
Bảng 3.9: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể.............................................50

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2. Cấu tạo hoa lan .............................................................................................9
Hình 1.3. Hình ảnh một số loài lan Thạch Hộc. ........................................................13
Hình 2.1. Cấu tạo hạt nhân tạo ...................................................................................20
Hình 2.2. Các giai đoạn phát sinh phôi soma ............................................................21
Hình 2.3. Hình dạng phôi soma .................................................................................21
Hình 2.4. Quy trình tạo hạt nhân tạo ..........................................................................22
Hình 3.1. Vật liệu hạt nhân tạo .................................................................................33
Hình 3.2. Môi trường tạo hạt nhân tạo .......................................................................34
Hình 3.3. Các bước tạo hạt nhân tạo ..........................................................................34
Hình 3.4. Hạt nhân tạo................................................................................................34
Hình 3.5. Quá trình nảy mầm của hạt nhân tạo lan Thạch Hộc Tía. .........................35
Hình 3.7. Biểu đồ tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau ....36
Hình 3.8. Biểu đồ tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau ....37
Hình 3.9. Hạt nhân tạo nảy mầm ở các nồng độ alginate khác nhau ........................39
Hình 3.10. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt ở các thời gian ngâm CaCl2.2H2O khác
nhau.............................................................................................................................41
Hình 3.11. Hạt nhân tạo nảy mầm ở các nồng độ alginate khác nhau ......................42
Hình 3.13 Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường vỏ hạt khác nhau

Hình 3.14 Hạt nhân tạo nảy mầm ở các môi trường vỏ hạt khác nhau .....................45
Hình 3.15. Hình thái vỏ hạt nhân tạo sau 4 tuần bảo quản .......................................47
Hình 3.16. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường bảo quản khác
nhau.............................................................................................................................48
Hình 3.17. Hạt nảy mầm trên các giá thể khác nhau ................................................50
Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường bảo quản khác
nhau.............................................................................................................................51

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BAP

Benzyl amino purine

GA3

Giberrenlin

2 IP

Cytokinin

CV

Hệ số biến thiên

MS

Murashige và Skoog

PVP

Polyvinyl pyrrolidone

NSC

Ngày sau cấy

vii


Đồ án tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài:
Cuộc sống ngày càng hiện đại và phát triển. Con người buộc phải đối mặt với
nhiều vấn đề và áp lực từ cuộc sống. Chính vì vậy mà vui chơi, giải trí là một
nhu cầu không thể thiếu. Ngoài các hoạt động vui chơi giải trí khác thì thú chơi
hoa, cây cảnh cũng có một chỗ đứng nhất định của nó. Không những tạo ra
mảng xanh, không gian tươi mát thì cây xanh còn giúp nâng cao hơn chất lượng
cuộc sống, giúp con người ta gần gũi hơn với thiên nhiên, sống lâu và sống
khỏe.
Hoa có mặt trong đời sống con người hết sức phổ biến. Từ làm vật liệu trang
trí làm đẹp cho không gian sống, quà tặng đến các công dụng làm thức ăn hay
dược liệu. Hoa là biểu tượng cho cái đẹp. Mỗi loài hoa có những màu sắc mùi
hương đặc biệt cho từng vùng miền, thời tiết hay khí hậu. Nhiều lễ hội hoa cũng

được tổ chức tại các quốc gia hàng năm.
Trong số đó, hoa lan được biết đến và yêu mến vì vẻ đẹp, sự sang trọng cũng
như lợi ích kinh tế mà hoa lan mang lại. Lan rất đa dạng về chủng loại, màu sắc,
mùi hương và phân bố rộng khắp trên toàn thế giới. Trồng và kinh doanh lan
cũng từ đó mà phát triển rộng rãi. Sản lượng hoa lan mỗi năm trên thế giới ước
tính hàng tỷ đô la. Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển rất mạnh,
Thái Lan là nước xuất khẩu lan nhiều nhất thế giới (có đến 1.000 giống hoa lan),
tại Malaysia thì chính phủ đã qui hoạch hẳn 300 ha đất ở Johor và giao cho Hiệp
hội hoa lan tổ chức thành khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”,
ngành trồng hoa lan ở Đài Loan cũng đang tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt
doanh thu hằng năm hơn 9,3 tỷ đài tệ. gắng hơn nữa trong việc tìm tòi ra cách để
sản xuất ra lan nhanh và hiệu quả hơn. Dồng thời đẩy mạnh việc lai và chọn tạo
giống để cho ra những giống lan mới, sức chống chịu cao với bệnh hại cũng như
thời tiết đang ngày càng trởi nên khắc nghiệt hơn. Trong những năm trở lại đây,
Việt Nam chúng ta cũng nghiên cứu rất nhiều về lan đặc biệt là nhân nhanh lan
bằng phương pháp nuôi cấy mô.

1


Đồ án tốt nghiệp

Cây lan được biết là loài thực vật rất khó gieo hạt trong tự nhiên. Muốn nhân
giống lan người ta thường dùng phương pháp tách chiết hoặc nuôi cấy in vitro.
Với sự phát triển của kỹ thuật tại hạt nhân tạo, chúng ta có thể ứng dụng lấy phôi
soma cho bọc vỏ nhân tạo có chứa môi trường dinh dưỡng, nhằm bảo quản phôi
và tại điều kiện cho hạt nhân tạo nảy mầm. Với kỹ thuật này khắc phục hạn chế
khó nảy mầm của hạt lan trong tự nhiên và giúp nhân nhanh các giống lan trồng,
cũng như các loại thực vật khó nảy mầm. Đồng thời mở ra một hướng mới cho
việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các hạt hữu tính có khả năng nẩy mầm

thấp và không đồng loạt.
Xuất phát từ những lý do trên mà tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu các yếu tố
ảnh hƣởng đến quá trình tạo hạt, bảo quản và nảy mầm của hạt nhân tạo
đối với cây lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” để
thực hiện luận văn tốt nghiệp của mình. Khi thực hiện đề tài này, tôi hy vọng sẽ
mang đến những hiểu biết mới về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan
Thạch Hộc nói riêng và hoa lan nói chung, đồng thời đem lại những ứng dụng
thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật tại Việt Nam.
2. Tình hình nghiên cứu:
Khái niệm về phôi sinh dưỡng được biết tới đầu tiên là vào năm 1958 nhưng
cho đến cuối năm 1970 Murashige mới đua ra khái niệm hạt nhân tạo – phôi
sinh dưỡng có vỏ bọc nhân tạo. Trong các năm tiếp theo đã không có những kết
quả đáng kể nào ngoài việc xem xét khả năng sống sót của phôi được thực hiện
trên cây carrot do Kitto và Janick (1982-1985). Năm 1975, Bingham và cộng sự
đã tiến hành thí nghiệm trên cây cỏ đinh lăng và đã chứng minh được sự phát
triển phôi sinh dưỡng thành cây. Năm 1981 Robert Laurence, năm 1991,
K.Redenbaugh và cộng sự đã tiến hành tạo phôi vô tính thành công trên cây cần
tây và rau diếp.
Nghiên cứu về hạt nhân tạo trong nước cũng còn là việc khá mới mẻ. Trong
đó có thể thấy vài nghiên cứu về hạt nhân tạo trên cây lan Vanda, lan Hồ Điệp
hoặc trên cây hoa Ly, cũng như những cây có giá trị kinh tế cao. Mục đích nhằm

2


Đồ án tốt nghiệp

tìm ra phương pháp tối ưu để lưu trữ và góp phần nghiên cứu giải quyết nhu cầu
giống phục vụ cho việc tiêu thụ hoa, cây cho giá trị kinh tế cao trong nước và
xuất khẩu.

3. Mục đích nghiên cứu:
-

Tạo hạt nhân tạo có ý nghĩa trong công tác duy trì nguồn mẫu, nguồn gen
thực vật quí hiếm trong một thời gian dài phục vụ cho những mục đích sử
dụng khác trong tương lai.

-

Làm cơ sở cho việc kiểm chứng sự khác nhau giữa cây hoa lan Thạch Hộc
Tía in vitro có nguồn gốc từ phôi soma với cây hoa lan Thạch Hộc Tía từ các
nguồn mô khác.

-

Làm cơ sở để nghiên cứu tiếp khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma
của các loại cây thân thảo một lá mầm khác.

-

Bảo quản phôi soma hiệu quả và lưu trữ giống dễ dàng hơn

4. Nội dung nghiên cứu:
-

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân
tạo.

-

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O

-

Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân tạo.

-

Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo.

-

Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái quát về cây lan
1.1.1 Phân loại thực vật học
Ngành: Angiospermae (hạt kín)
Lớp:Monocotyledonae
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Họ phụ: Orchidoideae
1.1.2 Lịch sử cây lan
Họ phong lan phân bố từ 680 vĩ Bắc đến 560 vĩ Nam, nghĩa là từ gần cực
Bắc như Thuỵ Điển , Aleska, xuống tận cuối cùng ở cực nam của Ostralia.

Tuy nhiên tập trung phân bố của họ này là ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt
châu Mỹ và Đông nam á. Ngay ở các vùng nhiệt đới họ phong lan cũng phân
bố rộng khắp từ vùng đầm lầy sát Biển Hồ qua các đồi núi thấp lên các vùng
núi cao. Mặc dù đa số các loài lan chỉ mọc ở độ cao dưới 2000 m so với mặt
nước biển, song có một số ít loài sống cả ở độ cao 5000m so với mặt nước
biển (ở Colômbia óc một số loài phong lan sống ở núi quanh năm tuyết phủ).
Ban đầu người ta nghĩ cây Lan được biết đến lần đầu tiên là ở Châu Âu
qua bản viết tay bằng tiếng Hy Lạp” Xem Xét Cây Cỏ” (Enquiry intoPlants)
của Theophrastus (khoảng năm 370-285 TCN). nhưng thực ra thì cây lan đã
được biết đến đầu tiên ở phương Đông từ rất lâu: Khổng Tử (551-479 TCN)
sau khi đi chu du thiên hạ về lại nước Lỗ. Trên đường về, ông thấy hoa lan
mọc chen với cây cỏ ở rừng sâu bèn than rằng: “Ôi, hoa lan có mùi thơm
vương giả, nay tươi tốt một mình ở chốn sơn lâm, mọc xen lẫn với loài cỏ
hoang dại, chẳng khác nào bậc hiền giả không gặp thời, đứng chung với bọn
bỉ phu”, mà từ đó các bài thơ, phú, vịnh về hoa lan sau này của các thi nhân
Trung Hoa đều bị ít nhiều ảnh hưởng.
Ở phương Đông, lan đựơc chú ý đến vẻ đẹp duyên dáng của lá và hương
thơm tuyệt diệu của hoa. Vì vậy trên thực tế lan chủ yếu chiêm ngưỡng trước

4


Đồ án tốt nghiệp

tiên là lá chứ không phải màu sắc của hoa. Ở phương Tây, lan được biết đến
trước hết là công dụng về dược liệu và sau đó là sức hấp dẫn của hoa cùng
các đặc tính về thực vật của nó. Theophrastus được xem là ông tổ của thực
vật học và là cha đẻ của ngành học về lan và đến năm 1836 John Lindley đặt
tên cho họ lan là Orchidaceae.
Ở Việt Nam dấu vết nghiên cứu về lan buổi đầu không rõ ràng lắm, có lẽ

người đầu tiên khảo sát về lan là Gioalas Noureiro- nhà truyền giáo người Bồ
Đào Nha đã mô tả cây lan lần đầu tiên ở Việt Nam trong cuốn “flora
cochinchinensis” gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình đến nam phần
Việt Nam là Aerides, Phaijus… mà đã được Ben Tham và Hooker ghi lại
trong cuốn “ Genera plante rum” (1862 –1883). Chỉ sau khi người Pháp đến
Việt Nam mới có những công trình được công bố là F. gagnepain và
A.gnillaumin mô tả 101 chi gần 70 loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong
bộ “Thực vật Đông Dương chí” do H. lecomte chủ biên, xuất bản từ 1932 –
1934. bên cạnh đó cũng có một số tác giả khác cung đề cấp đén lan Việt
Nam. Một số người Việt Nam cũng bắt đầu nghiên cứu về lan như “Cây cỏ
Việt Nam” của GS. Phạm Hoàng Hộ với 289 loài được mô tả và có hình vẽ
minh hoạ.
1.1.3 Tình hình sản xuất lan
 Trên thế giới:
Châu Âu, Hà Lan là quốc gia duy nhất có công nghệ trồng lan xuất
khẩu sớm, ứng dụng trồng trong nhà kính nên xuất khẩu được quanh
năm, đặc biệt là lan Cymbidium. Còn Italia là quốc gia nhập khẩu lan
nhiều nhất Châu Âu, chủ yếu từ các nước: Thái Lan 64 triệu cành, Hà
Lan 10 triệu cành vào năm 1993. Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu
cành, Singapore 289 ngàn cành Dendrobium vào năm 1994.
Châu Á, đứng đầu thế giới về nhập khẩu lan vẫn là Nhật, chủ yếu là
Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis từ Malaysia,
Singapore và Thái Lan là nhiều nhất

5


Đồ án tốt nghiệp

 Ở Việt Nam

Do chúng ta ở vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa, vì vậy phong lan
rất đa dạng. Bên cạnh các loại lan rừng nổi tiếng về màu sắc và hương
thơm còn có các giống lan nhập ngoại như Dendrobium, Vanda,
Mokara, Phalaenopsis, Cattleya… còn phân bổ lan rừng thì khắp cả
nước:
Vùng khí hậu lạnh: Cao Nguyên và các tỉnh phía Bắc có thể trồng
được các loài lan như Dendrobium, Cymbidium, Phalaenopsis,
Cattleya, Paphiopedilum…
Vùng khí hậu nóng ẩm như ở Nam và Trung Trung Bộ, nhất là
miền Đông Nam Bộ có các loại lan như: Cattleya, Vanda, Mokara,
Cymbidium, Ngọc Điểm…
Tuy nhiên có những khó khăn của người trồng lan ở nước ta:
-

Nông dân trồng lan còn nhỏ lẻ, thiếu quy hoạch chiến lược,
kỹ thuật so với nước ngoài.

-

Chưa tạo được giống lan riêng biệt cho Việt Nam có thể
cạnh tranh với các giống lan nhập ngoại, nhất là Thái Lan.

-

Thị trường tiêu thụ còn nhiều khó khăn, chưa ổn định kinh tế
lâu dài cho người trồng lan.

Tuy nhiên, thành phố Hồ Chí Minh đã có nhiều chính sách, nguồn
vốn đầu tư để xây dựng và mở rộng khu nông nghiệp cao, chuyển đổi
đổi cơ cấu nông nghiệp cho phù hợp với tình hình và xu hướng phát

triển của thành phố, trong đó cây lan cũng là cây chủ lực.
1.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan
1.1.4.1 Cơ quan dinh dưỡng
a) Sự phát triển ở cây đa thân
 Trường hợp lan Cau diệp (Spathoglottis plicata Bl.)
Đây là loài địa lan, giả hành là một thân ngắn phù mập. Mỗi giả hành có
một số lá bao che và mang rễ ở đáy. Đáy lá to ra tạo thành bẹ bao

6


Đồ án tốt nghiệp

quanh giả hành. Ở nách của mỗi bẹ lá có thể có các chồi mà mỗi chồi
có thể phát triển thành cành mang hoa (phát hoa) hay tạo ra cơ quan
dinh dưỡng mới (giả hành mới).
Các chồi ở nách lá ấy được che chở bởi những lá ngắn không có phiến
lá bên trên. Khi chồi bắt đầu phù to có dạng một giả hành sơ khởi thì
các lá ló ra về phía đỉnh, sau đó các rễ mới xuất hiện ở về phía đáy.
Cuối cùng các lá phát triển lớn lên, tích trữ dưỡng chất về phía đáy
làm cho giả hành lớn dần ra.
 Trường hợp lan Bạch câu (Dendrobium crumenatum Sw.)
Xuất hiện từ đồng bằng đến núi cao, phụ sinh sống bám trên cây hay
trên hốc đá, rễ chúng không luôn bị ẩm ướt như ở trong đất như lan
Cau diệp. Cành lan mới sinh ra từ gốc của cành cũ: Gồm gốc nhỏ
mang rễ, tiếp là đoạn phù mập không rễ, không lá, kế trên là đoạn dài
mang lá mọc xen hai hàng, trên cùng là đoạn dài nhỏ lỏng y như vậy
nhưng không có lá, tất cả gọi là giả hành. Như vậy Bạch câu sống
nhiều năm (cây đa niên) nhờ các đơn vị nối tiếp nhau, chồi mới sinh
ra từ chồi bên ở gốc của đơn vị trước đó và cứ thế tiếp tục phát triển

theo chiều ngang.

Hình 1.1. Lan Bạch Câu

7


Đồ án tốt nghiệp

b) Sự phát triển ở cây đơn thân
Ở kiểu phát triển độc trụ, nếu ta cắt một đoạn ở phía ngọn
của thân thì đoạn bị cắt rời này vẫn phát triển về phía đỉnh.
Còn nếu cắt đoạn thân của cây (đỉnh giả hành) thì đoạn cắt rời
ấy không thể phát triển về phía đỉnh.Ví dụ như cây Vanda,
Ngọc Điểm (Rhynchostys gigantea), Hồ Điệp (Phalaenopsis)…
Lá có phiến hình trụ dài và có bẹ bọc kín thân. Thân luôn luôn
mọc cao lên về phía đỉnh. Sự mọc dài của đỉnh không có giới
hạn nên cây chỉ có một thân phát triển vô hạn. Sự phát triển
ngừng lại khi đỉnh bị tổn thương, lúc đó chồi bên sẽ xẻ rách bẹ
lá để mọc dài ra thành nhánh, nhánh này cũng sinh trưởng
không giới hạn như đỉnh ban đầu.
1.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa
 Hoa lan kiểu tam phân (chia 3): 3 lá đài, 3 cánh hoa, 3 tâm bì
 Phấn hoa dính lại thành phấn khối, ít khi rời từng hạt như ở
các loài hoa khác
 Sự hiện diện của trụ là phần hợp nhất của bộ phận sinh dục
đực và bộ phận sinh dục cái. Đó là đặc điểm quan trọng chỉ có
ở hoa lan.
 Hình dạng, kích thước của môi, cộng thêm vị trí của nhuỵ đực
đã làm cho hoa lan không đều, có sự đối xứng hai bên rõ rệt.

Tuy cấu trúc chung như vậy nhưng trong chi tiết từng bông hoa lan
cũng có những khác biệt mà từ đó ta chia chúng ra những giống loài
khác nhau, chỉ cần đề cập đến cánh môi thôi cũng đã rất phong phú.
Nhưng 99% các cây lan có 1 nhuỵ đực thụ mà thôi số còn lại có 2-3
nhuỵ đực thụ (Nguyễn Thiện Tịch,1996). Về phái tính thì đại đa số
cây lan là hoa lưỡng tính, nhưng ở giống Catasetum và Cycnoches
hoa lại là đơn tính.

8


Đồ án tốt nghiệp

Cánh môi: Ở một số loài thì rất lớn so với hai bên cánh, một số loài
có cánh môi rất nhỏ.

Hình 1.2. Cấu tạo hoa lan
Hình dạng: Môi có thể nguyên hay có thuỳ, có rìa, có tua, cuộn hay
nhăn…có cấu trúc rất kỳ lạ như có sọc, có sóng, có gai, có lông, trơn
láng hay nhăn..có cựa, móc, túi ở đằng sau..
Màu sắc: Thường khác hai bên, hoặc có sọc, điểm, những màu
khác biệt.
1.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan
 Ẩm độ: Thông thường tối thiểu là 70% thích hợp cho sự tăng trưởng
của nhiều loài. Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng vẫn là ẩm độ của vùng bản
xứ
 pH của nước: pH của nước phù hợp cho lan tăng trưởng là 5-6, nếu lên
7 hoặc trên 7 thì không nên tưới nước cho cây.
 Nhiệt độ: Tuỳ thuộc vào nhiệt độ của điều kiện địa lý, vùng cao độ thì
sẽ có sự phân bổ giống lan phù hợp.

 Ánh sáng: Yếu tố quyết định cho sự quang hợp, hô hấp và nhất là cho
sự trổ hoa.
 Vanda lá tròn cần 100% ánh sáng
9


Đồ án tốt nghiệp

 Vanda lá sắp thành hàng cần 70% ánh sáng
 Dendrobium cần 70% ánh sáng
 Cattleya cần 50% ánh sáng
 Phalaenopsis cần khoảng 30% ánh sáng
 Độ thông gió: Lan có 2 nhóm chính là phong lan và địa lan, tốc độ gió
khoảng 10-15 km/giờ, nghĩa là gió làm lá và các cành nhỏ hơi rung
động, nếu trồng ở nơi thông gió và mát mẻ, cây lan sẽ tăng trưởng
nhanh và ít bị bệnh hơn.
1.2 Giới thiệu về lan Thạch Hộc Tía:
Thạch hộc tía có tên khoa học Dendrobium officinale Kimura et Migo
Chi: Thạch hộc
Họ: Lan (Orchidaceae)
Phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400 m so với mặt
biển, thường phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng.
1.2.1 Đặc trƣng hình thái và sự phân bố:
Thạch hộc được phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanma và nhiều
nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong điều kiện môi trường tự nhiên
độ ẩm 70%, nhiệt độ không khí bình quân năm 12 - 18 độ C, lượng mưa 900
- 1.500 mm, thường tập trung sống ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và
vách đá...
Thạch hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã
đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có

nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên
đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán.
1.2.2 Công dụng:
Trong cổ thư đông y Trung Quốc cách đây hơn 1.000 năm đã xác định ở
Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch hộc,
Tuyết liên, Nhân sâm, Thủ ô, Phục linh, Tùng dung, Linh chi, Ngọc trai,
Đông trùng hạ thảo, trong đó Thạch hộc xếp đầu bảng.

10


Đồ án tốt nghiệp

Giá trị của thạch hộc có 2 loại công năng chủ yếu:
-

Làm thuốc:
Thạch hộc tía có giá trị độc đáo và công năng bảo vệ sức khỏe, đã
trở thành sản phẩm bổ dưỡng từ lâu đời, được sử dụng trong các mục
đích y tế (Li et al, 2008.).
Thạch hộc làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý.
Thạch hộc tía giàu polysacarit thạch hộc, alkaloit thạch hộc, các acid
amine và nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và
nhiều nguyên tố vi lượng, trong đó polysacarit thạch hộc tới 22%,
hàm lượng các acid amine như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới
35% tổng lượng acid amine (Xiang et el, 2013). Ngoài ra Thạch Hộc
Tía còn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl , keton,
ester và các chất nhầy, hợp chất amidon. Trong thân Thạch hộc tía có
hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất
amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine,

nobilonine, dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và
muối amoniac N-methyl-dendrobium, 8-epidendrobine, các chất này
có vị hơi đắng...
Nghiên cứu về dược lý hiện đại, Thạch Hộc Tía có tác dụng chống
ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch
máu và kháng đông máu (Liu et al, 2011; Hou et al, 2012; Xia et al,
2012; Xiang et al, 2013). Thạch hộc tía có thể dùng đơn độc hoặc
phối trộn với các dược liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ Thạch
hộc được thị trường đón nhận. Trong dược điển có đề cập đến nhiều
loài Thạch hộc nhưng tốt nhất vẫn là Thạch hộc tía.

-

Làm thực phẩm:
Cách sử dụng làm thực phẩm có nhiều cách như nấu súp với hồng
sâm, với bách sa sâm lợi phổi sinh tân. Ngoài ra có thể nấu cháo
Thạch hộc, trà Thạch hộc và nhiều món ăn khác. Những năm gần đây

11


Đồ án tốt nghiệp

công năng làm thực phẩm chức năng đã được khám phá thêm, là sản
phẩm thiên nhiên an toàn và bổ dưỡng. Thạch hộc tía có vị hơi ngọt
hơi đắng vào 3 kinh phế, vị, thận, công năng tư âm, thanh nhiệt, chỉ
khát, hư hao, gầy yếu, miệng khô.
1.2.3 Giá trị kinh tế:
Thạch hộc trồng một lần có thể thu hoạch 6 năm, đầu tư ban đầu có thể tốn
kém, nhưng năm thứ 2 có thể thu hồi vốn, từ năm thứ 3 có lãi. Trong điều

kiện thâm canh, năng suất tươi khoảng 5 tấn/ha/năm với giá bán khoảng 3
triệu đồng/kg, doanh thu đạt 15 tỷ đồng/ha/năm. Thị trường tiêu thụ là khả
quan, nếu chế biến sâu, thị trường càng lớn và hiệu qủa càng cao, bao gồm
thị trường nội địa, thị trường Đông Nam Á, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật
Bản và châu Âu, châu Mỹ.
Ở Trung Quốc đã có nhiều sản phẩm thuốc từ Thạch hộc bán ra thị trường
trong và ngoài nước, đặc biệt là xưởng thuốc Kim Năng ở Nam Kinh tỉnh
Giang Tô, trải qua 15 năm nghiên cứu bào chế, được thuốc tiêm: “Mạch lộ
ninh”, từ năm 1982 đến nay được đánh giá là thuốc điều trị có hiệu quả đối
với bệnh cứng hóa động mạch, viêm màng não. Xưởng thuốc này cũng đã
cho ra đời các loại thuốc tiêm, thuốc uống, viên nang đều mang tên “Mạch lộ
ninh”. Cùng với sản phẩm thảo dược truyền thống làm từ Thạch hộc là
“Phong đấu Thạch hộc” được coi là tuyệt phẩm của thảo dược có hàng ngàn
năm lịch sử.
Thạch hộc chế biến thành phong đấu, giá xuất khẩu vào những năm 80 thế
kỷ trước đạt mức 3.000 USD/kg. Ở Đài Loan giá phong đấu từ 1.0003.000USD/kg. Giá phong đấu hảo hạng cực kỳ đắt, ở thị trường Trung Quốc
khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg. Giá 1 cây Thạch hộc tươi 3 tuổi có giá
25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây thạch hộc, có thể thu
được 25-30 tỷ trong 3 năm. Ở thị trường Trung Quốc giá phong đấu Thạch
hộc cao cấp là 60 triệu đồng/kg. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên
thế giới về Thạch hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại siêu lợi nhuân cho

12


Đồ án tốt nghiệp

những người trồng và chế biến thạch hộc. Nhu cầu thị trường Trung Quốc
hiện nay cần khoảng 2000 tấn/năm, nhưng mới sản xuất được 200 tấn/năm.
Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15000 tấn/năm tương

đương hàng chục tỉ USD.

A: Thạch Hộc Tía B: Tiểu Hoàng Thảo
C: Tụ Thạch Hộc D: Thạch Hộc
Hình 1.3. Hình ảnh một số loài lan Thạch Hộc.
1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.3.1 Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào
thực vật hay còn gọi nuôi cấy thực vật in vitro để phân biệt với các quá trình
13


Đồ án tốt nghiệp

nuôi cấy trong điều kiện tuej nhiên ngoài ống nghiệm. Nhờ áp dụng kĩ thuật
nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều
lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng
di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất.
Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống
cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng.
1.3.2 Lịch sử phát triển
Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng
học thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật
nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền
chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị
độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể”. Năm 1902, Haberlandt đề
xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn
năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của

cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai cây
khó thực hiện và ông bị thất bại. Năm 1922, Kote và Robbins đã lặp lại thí
nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ
của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy
nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại
và ngừng hẳn mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934,
White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua.
Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh
trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch
cứng.
Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh
trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh
trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học
thành công.

14


Đồ án tốt nghiệp

Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi
cấy mô sẹo cây cà rốt
Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau
đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện.
Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa
kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá.
Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơnđã được
phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn
chỉnh.
Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ

nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành
công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá.
1.3.3 Ứng dụng:
Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi
cấy mô đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar.
Kỹ thuật này thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng:
-

Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh.

-

Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.

-

Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến.

-

Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn.

-

Lai xa.

-

Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast.

-

Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai.

-

Cố định nitrogen.

-

Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp.

-

Bảo quản nguồn gen quý.

1.3.4 Các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

15


Đồ án tốt nghiệp

Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích
thước khoảng 0.58 - 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau
khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây
đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi. Sau
đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng
thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh.

 Nuôi cấy mô sẹo
Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra
trong môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là
những tế bào vô tổ chức có màu trắng. Khối mô sẹo này có khả năng
tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích
thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với
những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. cây tái
sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh
trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma của phương pháp này
rất cao.
 Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn
Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong
máy lắc thì khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều
tế bào đơn lẻ gọi là tế bào đơn. Những tế bào đơn này nuôi cấy trong
môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy
trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong môi trường
thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo. Những tế bào mô
sẹo này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì
sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta
dựa vào phương pháp này để tạo ra giống mới bằng cách đột biến tế
bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ.
 Nuôi cấy protoplast- chuyển gen

16


Đồ án tốt nghiệp

Protoplast thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức
sống và duy trì chức năng sẵn có. Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ

thân, lá, rễ bằng cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có. Trong môi
trường thích hợp các protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp
tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây
trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây trồng
bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác
loài (Nguyễn Hoàng Lộc, 2009)
Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính
của một số loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp
chuyển gen khác.
 Nuôi cấy tế bào đơn bội
Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp
tạo thành mô sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây
hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể n gọi là cây đơn bội. Trong nuôi cấy
mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này xử lý colchicin để
tạo thành cây đa bội.
1.3.5 Các yếu tố ảnh hƣởng nhân giống in vitro
 Lựa chọn mẫu cấy
Mô non (chồi đỉnh), chồi nách hay chồi bất định tái sinh tốt hơn so
với mô già của cùng một cây.
 Môi trường nuôi cấy
Môi trường MS (Murashige và Skoog) cho kết quả tốt trong nhân
giống cây ban đầu và nhân chồi tiếp theo. Để tạo chồi nách nồng độ
auxin và cytokinin tương đối thấp, còn tạo chồi bất định cần nồng độ
cytokinin cao và auxin thấp; Còn tạo mô sẹo thì ngược lại.
Môi trường rắn hay lỏng cũng ảnh hưởng đến khả năng phát triển
rễ. Agar giúp cây đứng vững và tăng khả năng thoáng khí tạo điều
kiện hấp thu dưỡng chất.

17