Tổng quan quy trình phá vỡ bào tử nấm linh chi và bước đầu nghiên cứu điều kiện nẩy mầm của bào tử này

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC .......................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................... vi
LỜI MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu......................................................................................1
3. Mục đích đề tài ...............................................................................................2
4.Nhiêm vụ nghiên cứu ......................................................................................3
5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................3
6. Kết quả đạt được của đề tài ...........................................................................3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN...............................................................................4
1.1

Nấm Linh chi ........................................................................................4

1.2

Phân loại................................................................................................4

1.2.1 Phân loại theo khoa học ..................................................................4
1.2.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc ..............................................5
1.3

Đặc tính sinh học của nấm Linh chi .....................................................8

1.3.1 Mũ nấm ...........................................................................................9
1.3.2 Thụ tầng ........................................................................................10
1.3.3 Cuống nấm ....................................................................................10

1.3.4 Bào tử nấm Linh chi......................................................................10
1.4

Chu kỳ sống của nấm Linh chi ...........................................................14

1.5

Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi .......................15

1.5.1 Dinh dưỡng ...................................................................................15
1.5.2 Nhiệt độ .........................................................................................16
1.5.3 Độ ẩm ............................................................................................16
1.5.4 Không khí......................................................................................16
1.5.5 Ánh sáng .......................................................................................16

i


Đồ án tốt nghiệp
1.5.6 Trị số pH .......................................................................................16
1.6

Tác dụng trị liệu cơ bản của các nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 16

1.7

Thành phần hóa dược cơ bản, thành phần khoáng và đặc tính dược lý
của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ..........................................21

1.7.1 Thành phần hóa dược cơ bản và đặc tính dược lý ........................25

1.7.2 Thành phần khoáng nấm Linh Chi................................................36
1.7.3 Thành phần khoáng đa lượng cơ bản của nấm Linh chi (chủng
Linh chi Đà Lạt) ................................................................................................37
1.8

Phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp nảy mầm kết hợp
phương pháp hóa học và cơ học .........................................................38

1.8.1 Sơ đồ các bước trong phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương
pháp nảy mầm (theo patent EP 1 092 765 A2) .................................................41
1.8.2 Sơ đồ các bước thúc đẩy nảy mầm bào tử nấm Linh chi (CN
1807575 A) 50
1.9

Định lượng và định tính một số hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi
(Đàm Nhận, 1996) ..............................................................................53

1.9.1 Định tính Triterpenoid (kết quả xem phụ lục A) ..........................53
1.9.2 Định tính thành phần chất khử (kết quả xem phụ lục A) ..............53
1.9.3 Định tính aminoacid (kết quả xem phụ lục A)..............................53
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................54
2.1

Vật liệu – thiết bị - hóa chất ................................................................54

2.1.1 Vật liệu ..........................................................................................54
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ .......................................................................54
2.1.3 Môi trường ....................................................................................55
2.2

Phương pháp .......................................................................................57

2.2.1 Phương pháp luận .........................................................................57
2.2.2 Xác định tác nhân khử trùng .........................................................58
2.2.3 Khảo sát khả năng khử trùng của tác nhân khử trùng thích hợp
theo nồng độ ......................................................................................................58

ii


Đồ án tốt nghiệp
2.2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm bào tử nảy mầm.......................................60
2.2.5 Nảy mầm bào tử nấm Linh chi trên môi trường thóc ...................61
2.2.6 Nảy mầm bào tử nấm Linh chi trong môi trường dịch chiết khoai
tây

61
2.2.7 Kích hoạt nảy mầm bào tử nấm Linh chi ......................................62
2.2.8 Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase

bằng cách đo đường kính vòng phân giải .........................................................63
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................64
3.1

Xác định tác nhân khử trùng ...............................................................64

3.2

Khảo sát khả năng khử trùng của tác nhân khử trùng thích hợp theo
nồng độ................................................................................................66

3.3

Nảy mầm bào tử trên môi trường thóc ...............................................66

3.4

Nảy mầm bào tử nấm Linh chi trên môi trường dịch chiết khoai tây .68

3.5

Kích hoạt nảy mầm bào tử nấm Linh chi bằng các dung dịch dinh
dưỡng ..................................................................................................69

3.6

Xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo
đường kính vòng phân giải .................................................................70

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................79
PHỤ LỤC ...........................................................................................................1

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1: Hoàng chi (Laetiporus sulphureus) ......................................................... 5
Hình 1.2: Thanh chi (Ganoderma genus) ................................................................ 5
Hình 1.3: Bạch chi (Fomitopsis officinalis) ............................................................ 6
Hình 1.4: Hồng chi (Ganoderma tsugae) ................................................................ 6
Hình 1.5: Hắc chi (Polyporus melanopus) .............................................................. 7
Hình 1.6: Tử chi (Ganoderma sinense) ................................................................... 7
Hình 1.7: Cấu tạo cơ bản nấm Linh chi................................................................... 9
Hình 1.8: Hình thái giải phẫu thể quả và bào tử đảm .............................................. 12
Hình 1.9: Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi Ganodermataceae .......... 14
Hình 1.10: Chu kì sống của nấm Linh chi ............................................................... 15
Hình 1.11: 29 triterpenoids chiết xuất từ bào tử nấm Linh chi từ năm 1988
(Bingji Ma et al., Nov 2011) .................................................................................... 30
Hình 1.12: Sơ đồ tổng quát các bước phá vỡ theo EP 1 092 765 A2 ...................... 43
Hình 1.13: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm bằng dịch chiết malt .................................... 45
Hình 1.14: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm bằng nước dừa ............................................. 46
Hình 1.15: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm bằng dịch chiết nấm Linh chi ...................... 47
Hình 1.16: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm bằng môi trường dinh dưỡng chứa biotin .... 48
Hình 1.17: Sơ đồ kích hoạt nảy mầmbằng dung dịch dinh dưỡng chứa
kali photphat và magnesium sulfate ......................................................................... 49
Hình 1.18: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm bằng dung dịch dinh dưỡng chứa 5% capillitia
và dịch chiết malt 1% ............................................................................................... 50
Hình 1.19. Sơ đồ kích hoạt nảy mầm bằng nước cất............................................... 51
Hình 1.20. Sơ đồ kích hoạt nảy mầm theo patent CN 1807575 A .......................... 52
Hình 2.1. Sơ đồ khái quát quy trình thí nghiệm ...................................................... 61
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ............................................................................ 64
Hình 2.3. Quy trình kích hoạt nảy mầm bào tử nấm Linh chi................................. 66
Hình 3.1:Tác nhân khử trùng là H2O2 và nước cất vô trùng ................................... 68

iv

Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.2. Tác nhân khử trùng là javel 2% ............................................................... 69
Hình 3.3.Ảnh hưởng của H2O2 lên khả năng nảy mầm của bào tử nấm Linh chi... 70
Hình 3.4: Tơ nấm Linh chi phát triển mạnh trên môi trường thóc ......................... 71
Hình 3.5: Tơ nấm Linh chi quan sát dưới kính hiển vi (100X)............................... 71
Hình 3.6. Sợi nấm Linh chi trong môi trường dịch chiết khoai tây ........................ 72
Hình 3.7: Bào tử được kích hoạt bằng nước dừa..................................................... 73
Hình 3.8: Bào tử được kích hoạt bằng PD lỏng có bổ sung 0,1% KH3PO4 và 0,1%
MgSO4.7H2O ............................................................................................................ 73
Hình 3.9: Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase .............................................. 75

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật
khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996)............................................................................. 11
Bảng 1.2: Lục bảo linh chi và tác dụng trị liệu......................................................... 18
Bảng 1.3: Thử nghiệm chiết bằng cồn – nước rửa của các loài Ganoderma .......... 19
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của Ganoderma lucidum (Trung Quốc và Việt Nam)
cơ bản được xác định gồm các chất .......................................................................... 24
Bảng 1.5: Một số loài Linh Chi đã được phân chất .................................................. 24
Bảng 1.6: Thành phần hoạt chất cơ bản của nấm Linh chi (Lê Xuân Thám, 1996). 25
Bảng 1.7: Danh sách các triterpenoids từ bào tử nấm Linh chi................................ 31
Bảng 1.8: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong quả thể nấm Linh chi ........... 38
Bảng 1.9: Hàm lượng khoáng đa lượng trong bào tử đảm ....................................... 39

Bảng 1.10: Thành phần hoạt chất của nấm Linh chi với trạng thái sinh lý khác nhau .....39
Bảng 1.11: So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái
khác nhau của nấm Linh chi (2.5mg/mL) ................................................................. 42
Bảng 1.12: Một số Patent về nảy mầm và phá vách bào tử ...................................... 43
Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của thóc (lúa) .................................................... 55
Bảng 2.2: Thành phần khoáng của thóc (lúa) ........................................................... 56
Bảng 3.1: Thành phần khoáng của thóc và nấm Linh chi ........................................ 63
Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme sinh ra trong giai đoạn nuôi tơ nấm Linh chi
trong 24 giờ ................................................................... .......................................... 68

vi


Đồ án tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Hơn 4.000 năm trước đây (từ thời Hoàng đế 2550 – 2140 TCN), giá trị dược
liệu của nấm Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ (Zhao, J.D…1994). Từ
đó tới nay trải qua bao nhiêu thăng trầm của lịch sử, bao biến động của thời tiết, khí
hậu, môi trường, Linh chi vẫn trường tồn và thể hiện giá trị siêu dược liệu trên cả
nhân sâm (Đỗ Tất Lợi et al., 1994).
Việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa
với quy mô rộng lớn, cả về phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, chế
biến và bào chế dược phẩm đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng
dược lý và phương cách điều trị lâm sàng. Tuy nhiên, theo như chúng ta đã nhìn
thấy, Linh chi ở nước ta từ bao đời nay vẫn còn là hoang dại và đang có nguy cơ xói
mòn nguồn gen quý này do hiện tượng suy thoái môi trường. Vì vậy cho nên, vấn
đề đặt ra là làm sao có thể khai thác, nghiên cứu, tận dụng chúng một cách có hiệu
quả để không lãng phí sự ưu đãi của thiên nhiên.

Mặc dù người ta tin rằng các bào tử của Linh đại diện cho bản chất của Linh vì
nó chứa tất cả các chất hoạt tính sinh học của Linh chi, hầu hết các nghiên cứu về
nấm Linh chi được tiến hành bằng cách sử dụng thể quả hoặc sợi nấm của Linh chi
làm vật liệu thử nghiệm, bào tử nấm Linh chi rất ít khi nghiên cứu do tỷ lệ nảy mầm
của chúng rất thấp chỉ 3 – 15%. Vì vậy cho nên việc nghiên cứu nảy mầm bào tử
nấm Linh chi là rất quan trọng quyết định sự thành công của các giai đoạn nghiên
cứu sau nảy mầm.

2. Tình hình nghiên cứu
Các nước Châu á dẫn đầu về nghiên cứu hóa dược, nuôi trồng và bào chế các
loại Linh chi. Thực tế một số tác giả đã quan tâm phân tích lớp vỏ láng ở các loài
Ganoderma và Amauroderma vào thập niên 20, phát hiện ergosterol và các enzyme
phennoloxydase, peroxydase,…ở nấm Linh chi Ganoderma lucidum. Gần đây mới
có lẻ tẻ các khảo cứu về tác dụng gây dị ứng và bệnh đường hô hấp bởi bào tử một
số loài Linh chi Ganoderma ở Aukland (New Zealand)(Hasnain, SM., et al 1985),

1


Đồ án tốt nghiệp
đặc biệt bởi các thành tố chiết từ G. applanatum, G. lucidum và G. meredithiae ở
New Orleans (Hoa Kỳ).
Hội nghị nấm học thế giới 7/1994 tại Vancouver (Canada) đã dành riêng một
hội thảo về Linh chi, kết quả đã đi đến quyết định thành lập Viện nghiên cứu Linh
chi Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi, đặt trụ sở tại New York (Hoa Kỳ). Do vậy,
vào tháng 10/1994 Hội nghị Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi đã được tổ chức tại
Bắc Kinh, Trung Quốc. Tại đây quan điểm về sự tồn tại độc lập của họ Linh chi
Ganodermataceae Donk với tầm quan trọng là các nấm làm thuốc quý. Vào tháng
7/1996, Hội nghị Quốc tế về nấm học Châu á, lại dành một trong năm Hội thảo cho
các báo cáo về Linh chi tại đại học Chiba, Nhật Bản. Tại mỗi Hội nghị số báo cáo

rất lớn, thể hiện tầm quan trọng kinh tế và sự phong phú của nấm Linh chi.
Vào thập niên 70 – 80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm
Linh chi. Chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam. Gần
đây một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam á cũng bắt đầu tham gia
vào tiến trình này.
Ở Việt Nam, với vi trí địa lý tự nhiên nằm trong vùng trung tâm phân bố của
họ Ganodermataceae Donk. Tuy nhiên kể từ nghiên cứu của Patouillard, N 100
năm về trước, việc nghiên cứu của hệ nấm Việt Nam nói chung và Linh chi nói
riêng mới chỉ được tiến hành sơ bộ về hệ thống học, kỹ thuật nuôi trồng. So với quy
mô và nhịp độ chung của thế giới cũng như trong khu vực thì chúng ta cũng còn
phải cố gắng rất nhiều.
Chính vì lẽ đó, nên tôi muốn đóng góp một phần nhỏ của mình trong sự cố
gắng chung đó bằng những nghiên cứu sơ bộ của mình về “TỔNG QUAN VỀ QUY
TRÌNH PHÁ VỠ BÀO TỬ NẤM LINH CHI VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
ĐIỀU KIỆN NẢY MẦM CỦA BÀO TỬ NÀY” trong khóa luận tốt nghiệp này.

3. Mục đích đề tài
-Tìm hiểu các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua khảo sát các sáng
chế liên quan.
- Áp dụng các phương pháp đã biết gây nảy mầm bào tử nấm Linh chi bằng
nhiều phương pháp khác nhau.

2


Đồ án tốt nghiệp

4.Nhiêm vụ nghiên cứu
- Tổng quan về nấm Linh chi và tác dụng dược lý của nấm Linh chi.
- Tổng quan về các quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi trên thế giới.

- Thí nghiệm bước đầu về :
o Khảo sát phương pháp khử trùng bào tử.
o Nảy mầm bào tử nấm Linh chi trên môi trường thóc.
o Nảy mầm bào tử nấm Linh chi trong môi trường lỏng lắc
o Khảo sát sơ bộ hoạt tính enzyme chitinase trong quá trình hình
thành sợi nấm.

5. Phương pháp nghiên cứu
Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm.

6. Kết quả đạt được của đề tài
- Tổng quan về các quy trình phá vỡ và các thông số kỹ thuật quy trình.
- Nảy mầm thành công bào tử nấm Linh chi trân cả môi trường rắn và môi
trường lỏng.
- Xác định được hoạt tính enzyme chitinase ngoại bào của bào tử nảy mầm.
- Tương đối khắc phục được sự nhiễm trong quá trình nuôi cấy.
7. Hạn chế của đề tài
Quá trình khắc phục các tác nhân gây nhiễm mất quá nhiều thời gian, phải tiến
hành thí nghiệm lặp lại nhiều lần, ảnh hưởng đến kết quả cần đạt.
Các nghiên cứu chỉ được tiến hành sơ bộ.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Nấm Linh chi
Từ đầu thế kỷ 17, các nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung Quốc, chính
bởi chính giá trị dược liệu cao của chúng. Ngay từ thời Hoàng đế, trong các thư tịch

cổ đã ghi chép về giá trị của Linh Chi (Zhao Ji-ding, và Zhang Xiao-quing, 1994)
cách nay đã trên dưới 4000 năm. Trong bản thảo cương mục các ghi chép đã chuẩn
mực hơn, và nấm Linh Chi ngày càng được coi trọng. Cho nên, dễ hiểu là các nhà y
dược Việt Nam, kế tục Lý Thời Trân, đã phát hiện Linh Chi ở nước ta và như Lê
Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “nguồn sản vật quý của đất rừng Đại Nam”.
1.2 Phân loại
1.2.1 Phân loại theo khoa học
Linh chi có nhiều tên gọi khác nhau như Bất Lão Thảo, Vạn Niên Thảo, Nấm
lim…Mỗi tên gọi của Linh chi gắn liền với giá trị dược liệu của nó. Tên gọi Linh
chi bắt nguồn từ Trung Quốc, hay theo tiếng nhật là Reishi hoặc Mannentake, tên
gọi Latinh: Ganoderma lucidum.
Nấm Linh chi có vị trí phân loại rộng rãi hiện nay
Giới : Mycetalia
Ngành nấm đảm: Basidiomycota
Lớp nấm đảm: Basidiomycetes
Bộ nấm lỗ: Ganodermatales
Họ : Ganogermataceae
Chi : Ganoderma
Loài : Ganoderma lucidum
Theo trình định danh, có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này. Kể từ lần
đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác
định tên chính thức: Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr. ) Karst đã mất đến 100
năm (1881).

4


Đồ án tốt nghiệp
1.2.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc
Sách Bản thảo cương mục (in năm 1995) củ Lý Thời Trân, đại danh y Trung

Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), và khái
quát tác dụng trị liệu của Linh chi. Linh chi đều có tính bình, không độc và tác động
tốt đến sức khỏe.
Loại có màu vàng gọi là Hoàng chi hoặc Kim chi.

Hình 1.1. Hoàng chi (Laetiporus sulphureus )
Loại có màu xanh gọi là Thanh chi

Hình 1.2. Thanh chi (Ganoderma genus)

5


Đồ án tốt nghiệp
Loại có màu trắng gọi là Bạch chi hay Ngọc chi.

Hình 1.3. Bạch chi (Fomitopsis officinalis)
Loại có màu hồng, màu đỏ gọi là Hồng chi hay Đơn chi hoặc Xích chi

Hình 1.4. Hồng chi (Ganoderma lucidum)

6


Đồ án tốt nghiệp
Loại có màu đen gọi là Huyền chi hay Hắc chi

Hình 1.5. Hắc chi (Polyporus melanopus)
Loại có màu tím gọi là Tử chi

Hình 1.6. Tử chi (Ganoderma sinense)
Gần đây khi tìm được cách gây giống, những khoa học gia Nhật Bản chứng
minh được rằng những cây nấm màu sắc khác nhau không phải vì khác loại mà chỉ
vì môi trường và điều kiện sinh hoạt khác nhau. Thay đổi điều kiện người ta có thể
có được đủ sáu loại từ cùng một giống.

7


Đồ án tốt nghiệp
Ngoài việc phân loại Linh chi theo màu sắc, còn có thể phân loại nấm Linh chi
dực theo các đặc điểm sau:
o Vị trí nấm mọc trên cơ chất chủ
- Nhóm mọc cao: tai nấm mọc từ gốc lên đến ngọn cây.
- Nhóm mọc gần đất : nấm mọc từ gốc cây chủ
- Nhóm mọc từ đất : tai nấm mọc từ rể cây hoặc xác mùn
o Nhiệt độ ra nấm
- Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 200C – 230C
- Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 240C – 260C
- Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 270C – 300C
Vì vậy cho thấy, Linh chi không những đa dạng về chủng loại, mà còn đa dạng
về cả sinh thái, đây là loài nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N. 1889).
Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác nhập
một chi riêng, là Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ
biến nhất là Ganoderma lucidum có tới 45 thứ.
Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành
công trong phòng thí nghiệm (1978). Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi
đỏ đặc sắc của các rừng lim Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào nuôi
trồng chủ động.
1.3

Đặc tính sinh học của nấm Linh chi
Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ. Nấm xuất hiện nhiều vào

mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây. Ở Việt Nam nấm Linh chi được gọi là nấm
Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard N.T (1890 – 1928)
Đã có nhiều mô tả, khảo cứu về nấm Linh Chi chuẩn Ganoderma lucidum
(Leys. Ex Fr.) Kast., có lẽ đây là một trong những loài phổ biến nhất trên thế giới,
do đó, có những sai biệt hình thái ngoài và sự phân ly thành nhiều chủng. Vì vậy
trước đây đã có khái niệm “nhóm G. lucidum” và bao hàm tới 220 loài. Ngày nay
người ta thực sự thừa nhận giới hạn loài chuẩn này theo nghĩa chặt chẽ hơn với 45

8


Đồ án tốt nghiệp
thứ (varietas), chủ yếu là các chủng địa lý và khó hòa bện sợi song hạch với nhau
(khi kiểm tra bằng phép nuôi cấy thuần khiết).

Hình 1.7. Cấu tạo cơ bản nấm Linh chi
1.3.1 Mũ nấm
Quả thể có cuốn dài hoặc ngắn, thường đính bên, đôi khi trở thành đính gần
tâm do quá trình liên tán mà thành. Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi xòe hình
quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng
xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, được
bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang sếp sít nhau kiểu hàng rào và có đầu sợi
dầy thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 - 10μm. Chính những tế bào vỏ này
tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm. Lớp vỏ láng phủ suốt theo
cuống. Kích thước tán biến động từ 2 – 30cm, dày 0,8 – 2,5cm, cuống dài từ 2,5 –
3,5cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2cm). phần đính cuống hoặc gồ

lên hoặc lõm như lõm rốn. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt –
trắng. Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ. Hệ sợi kiểu trimitic, đầu
tận cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ
láng phủ trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan
mạnh trong cồn. Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu
được mưa, nắng. Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào
tử.

9


Đồ án tốt nghiệp
1.3.2 Thụ tầng
Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 –
1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5
ống/mm. Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy,
không màu, dài 16 - 22μm. Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpose)
phồng căng hay lõm thụt vào mà thành.
1.3.3 Cuống nấm
Cuống nấm có thể dài hoặc ngắn, thường dính ở bên phần lõm vào của mũ
nấm. Cuống mới hình thành có màu trắng sau chuyển sang màu vàng đến nâu…và
phủ vỏ bóng, có màu sắc và cấu trúc tương tự mũ nấm. Cuống hình trụ, gần như
tròn hoặc hơi dẹp, chiều dài có kích thước 3 – 20 x 0,5 – 2 cm. Mô của cuống đồng
nhất với mô của mũ.
1.3.4 Bào tử nấm Linh chi
Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào
tử, tức là hạt giống hữu ích cho đời sau.
Bào tử đảm thường được mô tả có dạng trứng cụt. Đôi khi có tác giả mô tả là
dạng hình trứng có đầu chóp tròn – nhọn. Thực ra đó là do chụp phủ lớp nảy mầm
hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành. Mỗi bào tử được bao phủ với hai

lớp tường rất khó khăn gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng mật ong sáng,
chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích thước bào tử
rất nhỏ dao động ít nhiều khoảng từ 5-6 x 8,5 – 12 μm. Vỏ bào tử khá dày, cỡ 0,7 –
1,2 μm, có cấu trúc phức tạp.

10


Đồ án tốt nghiệp
Bảng 1.1: Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật
khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996)
Kích thước bào tử (μm)

Nguồn

Vùng thu mẫu

1889 Patouuillard

10 – 12 x 6 – 8

Đông Dương

1939 Imazeki

9,5 – 11 x 5,5 – 7

Nhật Bản

1964 teng

8,5 – 11,5 x 5 – 6,5

Trung Quốc

1972 Steyaert

8,5 – 10,8 - 13 x 5,5 – 8,5

Indonesia . Úc Châu

1973 Pegler et al

9 – 13 x 6 – 8

Anh Quốc

1976 Ryvarden

7 – 12 x 6 – 8

Bắc Âu. Phi Châu

1980 Ryvarden et al

7 – 12 x 6 – 8

Đông Phi Châu

1981 Kiet

7,5 – 10 x 5 – 6,5

Bắc Việt Nam

1982 Bazzalo et at

9 – 13 x 5 – 7

Argentine

1986 Melo

8,2 – 11,5 – 13,5x 6,3 – 7,5 – 8,1 Bồ Đào Nha

1986 Gilbertson et al

9 – 12 x 5,5 – 8

Bắc Mỹ

1986 Adaskaveg et al

10 – 11,8 x 6,8 – 7,8

Bắc Mỹ

1987 Petersen

7–8x6-8

Bắc Âu

Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt
bào tử bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu
đỏ rất mịn, như đất đỏ bazan.
Tuy vậy số lượng bào tử linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ
chỉ thu được 1 kg bào tử.
Bào tử nấm Linh chi tức là cơ quan sinh sản của Linh chi, giống như hoa ở
thực vật, bào tử linh chi chứa các thành phần giống như linh chi: polysaccharide,
triterpen, acid béo, acid amin, vitamin và các nguyên tố vi lượng với hàm lượng
đậm đặc hơn linh chi gấp nhiều lần từ 7 – 10 lần. Cho đến nay, hơn 150
triterpenoids đã được phát hiện. Do những tiến bộ gần đây trong quang phổ hiện đại
và kỹ thuật quang phổ, một loạt các triterpenoids được phân lập từ bào tử của nấm
Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ. Từ năm 1988
các nhà khoa học đã phân lập được 29 triterpenoids bao gồm cả cấu trúc và hoạt
tính sinh học của chúng.
11


Đồ án tốt nghiệp
Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về
cấu tạo tinh vi của bào tử đảm thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở
Nhật, Trung Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt.

Hình 1.8. Hình thái giải phẫu thể quả và bào tử đảm
nấm hồng chi chuẩn Ganoderma lucidum
a – đính cuốn bên kiểu lồi
b – đính cuốn bên kiểu lõm
c- đính cuống gần tâm kiểu lõm rốn do liền tán (hiếm)

d – cấu trúc đỉnh (apex) bào tử đảm và kiểu phân lớp vỏ
e, f, g – các vị trí bào tử: miệng lồi (e), miệng lõm (f)
Rõ ràng kiến tạo lỗ thủng trên bề mặt lớp vỏ ngoài là phổ biến. Lỗ nảy mầm
hình tròn, khá lớn, là đặc điểm quan trọng phổ biến ở các loài Ganoderma (đướng
kính 3,2 – 4,2μm). Thuật ngữ “germpore” là tương đương định nghĩa “aperture” do
Erdtman đưa ra (1952) – là chỉ vùng mà tại đó vỏ bào tử mỏng đi rất nhiều, nơi
mầm sợi nấm nguyên thủy (hay mầm ống phấn trong trường hợp của tiểu bào tử ở

12


Đồ án tốt nghiệp
thực vật) nhú ra khi nảy mầm (germination). Trên lớp vỏ ngoài thấy rõ các trụ
chống – chính là khái niệm “gai chống” theo nhiều tác giả khác. Đỉnh các trụ nổi gồ
thành các mụn cóc – gò hạt. Các trụ chống chính là tầng cột theo phân loại của
G.Erdtman (1952) (columellae), các trụ được nối với nhau bởi các vách mỏng
chống từ tầng nền tới tầng phủ, chúng tạo thành các xoang rỗng của lớp ngoài, nhờ
đó tạo khả năng bảo vệ cao cho vỏ bào tử.

Hình 1.9. Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi Ganodermataceae
1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử)
2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử
xẻ múi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma)

13


Đồ án tốt nghiệp
Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường
cản quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của

lớp vỏ trong cho đến nay còn chưa được biết rõ.
Cần lưu ý rằng: khái niệm “gai chống nhọn” từ màng trong đâm sát màng
ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác. Thực chất các gai hay chính
các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành các u lồi – và chính các u
lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium, exosporium hay chính
là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt – mụn cóc – u nhú trên bề mặt vỏ
bào tử. Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973), Mims et al (1989)
đã từng phân tích và thảo luận nhiều.
1.4 Chu kỳ sống của nấm Linh chi

Hình 1.10. Chu kì sống của nấm Linh chi
Bào tử đảm đơn bội, trong điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo nên hệ sợi sơ cấp
(primary hyphae) - trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm khá thấp ở nhiệt độ 28 – 300C
chỉ đạt 3 – 15%. Hệ sợi sơ cấp đơn nhân, đơn bội mau chóng phát triển phối hợp
với nhau tạo thành hệ sợi thứ cấp (tức hệ sợi song hạch), phát triển và phân nhánh
rất mạnh tràn ngập khắp giá thể.
Lúc này thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày- rất dày
(gasterospores – Chlamydospores), chúng dễ dàng rụng ra và khi gặp điều kiện phù
hợp sẽ nảy mầm cho ra hệ sợi song hạch tái sinh. Hệ sợi thứ cấp sẽ phát triển mạnh
đạt đến giai đoạn cộng bào tức là các vách ngăn được hòa tan.

14


Đồ án tốt nghiệp
Tiếp đó là giai đoạn sợi bện kết để chuẩn bị cho sự hình thành mầm móng thể
quả (primordial). Đây chính là giai đoạn phân hóa hệ sợi. Từ hệ sợi nguyên thủy
hình thành các sợi cứng màng dày, ít phân nhánh, bện kết lại thành các cấu trúc bó
được cố kết bởi các sợi bện phân nhánh rất mạnh. Từ đó hình thành các mầm nấm
màu trắng mịn vươn dài thành các trụ tròn mập. Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe thành

tán, trong lúc lớp vỏ láng đỏ cam xuất hiện. Tán lớn dần hình thành bào tầng và bắt
đầu phát tán bào tử đảm liên tục cho đến khi nấm già sẫm màu, khô tóp và lụi dần
trong 3 – 4 tháng.
Nấm Linh Chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ đậu Fabales) sống
hay đã chết. Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 – tháng 11), có thể trên thân
cây (cuống thường ngắn), quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây (khi ấy cuống thường
dài và có thể phân nhánh). Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, ánh sáng khuếch tán
nhẹ. Do có lớp vỏ láng đỏ. Linh Chi có thể chịu nắng rọi – khi đó thường xuất hiện
lớp phấn ánh xanh tím, có thể chịu mưa liên tục. Ở những vùng thấp rõ ràng là ưu
thế của các chủng chịu nhiệt độ cao (280 – 350C) như ở vùng châu thổ sông Hồng và
đồng bằng sông Cửu Long (quanh TP.Hồ Chí Minh). Ở vùng núi đồi vĩ độ cao
(>1000m) thường có các chủng ôn hòa, thích hợp nhiệt độ thấp hơn (21 – 260C) –
như vùng Đà lạt, Sapa, Tam Đảo, Tây Nguyên,…ở nước ta. Nếu theo các tư liệu cổ
thì Linh Chi của vùng rừng sâu, núi cao được coi là linh thiêng quí giá.
1.5 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi
1.5.1 Dinh dưỡng
Nguồn cacbon: nguồn cacbon chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose,
tinh bột, pectin, lignin, cellulose, hemicelluloses, từ đó chúng tổng hợp năng lượng
và tạo thành các chất cần thiết.
Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu urê,
muối amon, sulphate amon. Nitơ không được quá nhiều làm cho sợi nấm mọc nhiều
khó hình thành quả thể.
Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1. Giai đoạn hình thành
thể quả, tỉ lệ là 30/1 hoặc 40/1.
Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K. nguồn vi lượng đó chỉ thêm trong quá trình
nuôi cấy giống mẹ, còn khi trồng thì chúng có trong các nước và nông sản phẩm.

15

Đồ án tốt nghiệp
1.5.2 Nhiệt độ
Thích hợp nhất là 22 – 280C. Khi nuôi cấy tầng sâu nhiệt độ thích hợp là 280C
không thấp hơn 270C. Thông thường nhiệt độ thích hợp cho Linh chi phát triển là
24 – 280C. Nhiệt độ không nên thay đổi lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát
triển thành tán mà ở dạng sừng hưu, dạng đuôi gà.
1.5.3 Độ ẩm
Hàm lượng nước môi trường thường là 65% là vừa, quá nhiều hoặc quá ít sẽ
ảnh hưởng đến sự phát triển sợi nấm. Đô ẩm không khí nên giữ ở 85 – 95%, nuôi
cấy trong phòng cần giải quyết vấn đề về độ ẩm và thông thoáng gió.
1.5.4 Không khí
Nấm Linh chi là loài háo khí vì vậy cần thông gió, giữ độ ẩm và nhiệt độ thích
hợp. Khi nuôi cấy nấm trong tầng lỏng cần lắc 100 – 150 vòng/phút. Lắc mạnh dễ
làm sợi nấm đứt đoạn.
1.5.5 Ánh sáng
Nấm Linh chi cần ánh sang tán xạ. Sợi nấm nuôi trong điều kiện tối là tốt nhất.
1.5.6 Trị số pH
pH của môi trường nuôi nấm Linh chi là 3 – 7,5, thích hợp nhất là 5 -6. Trong
môi trường lỏng là 4,5 – 5. Trong vật liệu trồng nấm điều chỉnh pH từ 5,8 – 6 là
vừa.
1.6 Tác dụng trị liệu cơ bản của các nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi
Linh chi được dùng như một thượng dược từ khoảng 4000 năm nay ở Trung
Quốc. Chưa thấy có tư liệu về tác dụng xấu, độc tính của Linh chi (ngoại trừ các
khảo cứu về khả năng tồn tại các dị ứng nguyên trên bề mặt bào tử một số loài
Ganoderma – điều rất phổ biến trong nấm). Cách đây 400 năm, nhà y – dược nổi
tiếng của Trung Quốc Lý Thời Trân đã phân ra các nhóm Linh chi chính và khái
quát tác dụng trị liệu của chúng.

16

Đồ án tốt nghiệp
Bảng 1.2. Lục bảo linh chi và tác dụng trị liệu
Tên

Màu

Thanh chi:

Xanh

Tác dụng dược lí
Vị chua, tính bình, không độc. Chủ trị sáng
mắt, bổ can khí, an thần, tăng trí nhớ

còn có tên là
Long chi
Hồng chi còn có

Đỏ

Vị đắng, tính bình, không độc. Chủ trị xung

tên là Xích chi

trung kết (tức ngực) ích tâm khí, bổ trung,

hay Đơn chi

tăng trí nhớ, tăng trí tuệ.

Hoàng chi còn

Vàng

có tên là Kim

Cam (ngọt) bình, không độc. Chủ trị ích
trùng khí, an thần.

chi
Bạch chi còn có

Trắng

làm thong miệng, mũi, an thần.

tên là Ngọc chi
Hắc chi còn có

Cay, bình, không độc. Chủ trị ích phế khí,

Đen

Mặn, bình, không độc. Chủ trị ù tai, lợi khớp,

tên gọi là Huyền

bảo thần (bảo vệ công năng của hệ thần kinh)

chi

ích tinh khí, làm dai gân cốt.

Tử chi còn có
tên gọi là Mộc

Tím

Ngọt, ôn, không độc. Chủ trị lợi thủy đạo (lợi
tiểu), ích thận khí.

chi
Trên thực tế có thể coi Linh chi không có độc tính. Quá trình kiểm tra đã được
thực hiện ở Việt Nam, tại một số cơ sở sau (theo GS. Bùi Chí Hiếu et al, 1993).
Phân viện kiểm nghiệm Dược phẩm – Bộ y tế - Sài Gòn.
Trung tâm Đào tạo và nghiên cứu Y dược học Dân tộc.
Viện Dược liệu, Hà Nội (Đàm Nhận, 1994 – 1995)
Kết quả cho thấy dùng liều cao (gấp 50 – 100 lần liều dùng thông thường cho
người) cũng không gây ra nhiễm độc cấp tính, hay trường diễn. Do vậy chưa xác
định được chỉ số LD 50 trên chuột nhắt trắng.

17


Đồ án tốt nghiệp
Quan sát dài ngày, không thấy biểu hiện bất thường trên chuột thí nghiệm, các
thông số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu,… vẫn trong giới hạn bình thường. kết quả
tổng hợp đáng lưu ý, với hiệu quả trị liệu cao.
Bảng 1.3. Thử nghiệm chiết bằng cồn – nước rửa của các loài Ganoderma

Bệnh

Chế phẩm

Số ca

Mức
hiệu quả %

Tháng điều
trị

Xơ cứng bì

MAW

173 79,1%

3–6

Viêm da cơ

MAW

55

96,4 %

3–6

Hồng ban Lupus

MAW

84

82,1%

3

Ruing tóc từng phần

MAW

232 78,9%

1–3

35

74,3%

3–6

121 56,2%

3-6

Giảm trương lực teo cơ

MAW. SAW

Loạn dưỡng cơ tiến triển MAW. SAW

Trong hơn một thập niên Liu, G.T et al đã chứng minh tác dụng trị liệu tương
tự của Ganoderma lucidum và Ganoderma capense, đặc biệt chất chiết xuất từ bào
tử và hệ sợi nuôi cấy chìm đều có tác dụng.
Đến 1988, tại Nhật Bản đã có tới 300 bệnh nhân bị nhược cơ được điều trị
thành công bằng Linh chi, theo biện pháp điều trị bệnh sinh trên nguyên tắc điều
hòa miễn dịch. Đáng chú ý là không nảy sinh tác dụng phụ nào.
Bệnh gan và tiết niệu cũng được điều trị khả quan bằng chế phẩm Linh chi.
Bệnh viện ở Sơn Đông Trung Quốc dung một loại “xúp” Linh chi để giải độc và bổ
gan có kết quả tốt (>90%) cho 70.000 ca, trong đó có 879 ca đang được trị liệu
chuyên biệt (Lui Xing ja, 1994). Tác giả còn cho rằng các nấm Linh chi bóng (Glossy
Ganoderma) đều tác dụng tốt trên tiết niệu, điều hòa rối loạn tuần hoàn não, tránh các
cơn kịch phát nghẽn mạch và làm dịu thần kinh. Với thành công trên 319 bệnh nhân
và các kế quả nghiên cứu tác giả đã được tặng thưởng huân chương hạng hai.
Hiệu quả kiềm hãm quá trình kết tụ tiểu cầu bởi chất chiết của Ganoderma
lucidum được chứng minh rõ ràng invitro bởi nhiều công trình công phu, đến năm
1990 lại được Tao, J. và Feng Ky khẳng định. Họ cũng chứng minh invitro với 15

18


Đồ án tốt nghiệp
người tình nguyện khỏe mạnh và với 33 bệnh nhân bị xơ cứng động mạch, trong đó
hiệu quả chống nghẽn mạch cũng tỏ ra khả quan.
Vấn đề bệnh tim mạch ngày càng trầm trọng trong thế giới hiện nay, tràn ngập
các loại stress và tình trạng ô nhiễm môi sinh. Do vậy người ta lại tìm đến với Linh
chi mặc dù không nên coi Linh chi là thuốc vạn năng – trị bách bệnh và cũng không

nên để bệnh quá nặng mới tìm đến thuốc. Kết quả thông báo mới đây của nhóm
Wang chi et al (1994) trên 35 bệnh nhân bị bệnh mạch vành tim, tỏ ra triển vọng với
tỷ lệ tiến triển tốt tới trên 85,7 %.
Hàng loạt các hoạt chất của Linh chi được chứng tỏ có tác dụng kìm hãm sinh
tổng hợp cholesterol cũng củng cố cho kết quả trị liệu các bệnh nhân cao huyết áp
và nhiễm mỡ xơ mạch. Thực nghiệm ở Việt Nam trên chuột cho thấy hiệu quả giảm
tới 50% lượng cholesterol khi áp dụng liều lượng 0,4g/kg thể trọng trong 30 ngày
(Bùi Chí Hiếu et al, 1993). Từ đó xác định kết quả trị liệu trên bệnh nhân. Sau một
vài tuần bệnh nhân có chuyển biến tốt, huyết áp ổn định dần, các cơn cao huyết áp
nếu có tái phát cũng nhẹ hơn, ngắn hơn, thưa hơn. Dùng thuốc hạ huyết áp kinh
điển kết hợp với Linh chi, tác dụng điều chỉnh huyết áp tăng rõ rệt, hạn chế các tác
dụng phụ của tây dược (Kanmatsuse, K., et al, 1985,…)
Ở đây thật thú vị, nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố
khoáng vết hiếm. Vanadium (V) được chứng tỏ mới đây có tác dụng chống tích
đọng Cholesterol trên thành mạch. Tương tự như vậy, từ năm 1992 các nhà khoa
học Trung Quốc đã phát hiện ra vai trò của Germanium (Ge) ( Theo Lý Kiện,
1992). Xuất phát từ thực tế hàm lượng Ge trên Sâm Triều Tiên lên tới hàng trăm
ppm liên quan chặt chẽ với hiệu quả lưu thông khí huyết, tăng cường chuyển vận
oxy vào mô, kỹ thuật làm giàu Ge vào sinh khối Linh chi đã được xúc tiến. Tại hội
nghị quốc tế về Linh chi tại Bắc Kinh, 24 – 26.10.1994, kỹ thuật này đã được loan
báo, nhờ đó hàm lượng Ge trong hệ sợi nuôi cấy chìm lên tới gần 3000ppm, trên thể
quả nuôi trồng trên gỗ khúc cũng đạt tơi trên 100ppm. Hiện nay, chỉ số Ge trong các
dược phẩm từ Linh chi được coi như một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều
trị bệnh tim mạch và giảm đau trong điều trị ung thư (Chen Ti Qian, 1994,…)

19