Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus SP l5 vào bảo quản và xử lý hạt bắp

Đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ
MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG DỊCH NUÔI CẤY
VI KHUẨN LACTOBACILLUS sp. L5 VÀO BẢO QUẢN
VÀ XỬ LÍ HẠT BẮP

Ngành:

Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI
TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100880

: NGUYỄN XUÂN VIỆT
Lớp: 13DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2017.


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Sinh viên thực hiện luận văn

Nguyễn Xuân Việt

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ,
giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian
từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghê
Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh
đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu, tạo
điều kiện thuận lợi nhất cho chúng em trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận
văn tốt nghiệp tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương và cô Nguyễn Thị Hai đã tận
tâm hướng dẫn, giúp đỡ em có cơ hội được thực hành, vận dụng những kiến thức đã
học vào công việc thực tế và hoàn thành luận văn với kết quả tốt nhất. Cuối cùng xin
cảm ơn các bạn làm luận văn ở phòng thí nghiệm đã chia sẻ những kinh nghiệm, giúp
đỡ em trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian hơn 3 tháng. Bước đầu đi vào
thực tế, tìm hiểu về lĩnh vực bảo quản hạt nông sản bằng chất bảo quản có nguồn gốc
sinh học, tuy nhiên kiến thức của em còn hạn chế. Do vậy, không tránh khỏi những
thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu
của quý Thầy Cô để em có kiến thức và kỹ năng tốt hơn cho công việc trong tương lai.
Tp Hồ Chí Minh, 6/2017

Nguyễn Xuân Việt

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT......................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. ix
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài: .......................................................................................... 1

2.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................................. 2
2.1.

Ngoài nước ...................................................................................................... 2

2.2.

Trong nước ...................................................................................................... 3

3.

Mục đích nghiên cứu ................................................................................................ 3

4.

Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................. 3

5.

Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 3

6.

Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 4
6.1.

Phương pháp luận ............................................................................................ 4

6.2.

Phương pháp xử lí số liệu................................................................................ 4

Kết quả đạt được ...................................................................................................... 4

7.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................................ 6
1.1

Tổng quan về nấm .................................................................................................. 6

1.1.1. Giới thiệu chung .............................................................................................. 6
1.1.2. Phân loại nấm .................................................................................................. 6
1.1.3. Một số độc tố và tác hại của độc tố nấm mốc. ................................................ 7
1.2.

Tổng quan về vi khuẩn lactic ............................................................................... 20

1.2.1. Đặc điểm chung ............................................................................................. 20
1.2.1.1. Hình thái và dinh dưỡng của vi khuẩn lactic .......................................... 20
1.2.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ................................................ 20
1.2.1.3. Phân loại vi khuẩn lactic ........................................................................ 22

iii


Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Khả sinh sinh các hợp chất kháng khuẩn của các chủng LAB ..................... 24
1.2.2.1. Bacteriocin .............................................................................................. 24
1.2.1.2. Phân loại bacteriocin .............................................................................. 25
1.2.3. Khả năng kháng nấm của LAB và ứng dụng ................................................ 27
1.2.3.1. Khả năng kháng nấm của LAB .............................................................. 27
1.2.3.2. Ứng dụng của vi khuẩn LAB ................................................................. 29

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 30
2.1. Địa điểm nghiên cứu: .............................................................................................. 30
2.2. Thời gian thực hiện: ................................................................................................ 30
2.3. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 30
2.3.1. Vật liệu: ............................................................................................................ 30
2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng: ..................................................................... 30
2.3.2.1. Hoá chất: ................................................................................................... 30
2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy:................................................................................. 31
2.4. Thiết bị và dụng cụ:................................................................................................. 31
2.4.1. Thiết bị: ............................................................................................................ 31
2.4.2. Dụng cụ: ........................................................................................................... 31
2.5. Phương pháp luận: .................................................................................................. 32
2.5.1 Mục tiêu đồ án:.................................................................................................. 32
2.5.2 Nội dung: ........................................................................................................... 32
2.6.

Phương pháp nghiên cứu: .................................................................................... 33

2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu:.......................................................................................... 33
2.6.2. Khảo sát hình thái vi khuẩn .............................................................................. 34
2.6.2.1. Nhuộm Gram .......................................................................................... 35
2.6.2.2. Nhuộm bào tử ......................................................................................... 36
2.6.2.3. Thử nghiệm di động ............................................................................... 37
2.6.2.4. Thử nghiệm Catalase .............................................................................. 38

iv


Đồ án tốt nghiệp

2.6.2.5. Hàm lượng acid tổng .............................................................................. 38
2.6.2.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường .................................................... 39
2.6.2.7. Thử nghiệm Protease .............................................................................. 39
2.6.2.8. Thử nghiệm Chitinase: ........................................................................... 40
2.6.3. Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5. ............ 40
2.6.3.1. Định tính khả năng sinh IAA ................................................................. 40
2.6.3.2. Định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy................................................. 40
2.6.4. Khả sát khả năng phát triển của chủng nấm Fusarium sp.: .......................... 41
2.6.5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với
chủng nấm Fusarium sp.: ........................................................................................... 43
2.6.6. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 đến độ khoẻ mầm ở cây bắp45
2.6.7. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau gia nhiệt của chủng
Lactobacillus sp. L5 với Fusarium sp.: ..................................................................... 46
2.6.8. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch buôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5
đối với sự nảy mầm của hạt. ...................................................................................... 49
2.6.9. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus spp. L5
có cảm nhiễm nấm mốc đối với sự nảy mầm của hạt. ............................................... 52
2.3.9. Ứng dụng sử dụng dịch nuôi cấy bảo quản hạt bắp ...................................... 55
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN................................................................. 57
3.1.

Khảo sát sinh lý, sinh hóa và tính thuần của chủng Lactobacillus sp. L5 ........... 57

3.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa MRS Agar ........................................................ 57
3.1.2. Hình thái tế bào ............................................................................................. 58
3.1.3. Thử nghiệm Catalase ..................................................................................... 59
3.1.4. Khả năng di động .......................................................................................... 59
3.1.5. Hàm lượng acid tổng ..................................................................................... 61
3.1.6. Khả năng lên men đường .............................................................................. 61
3.1.7. Thử nghiệm Chitinase ................................................................................... 62

3.1.8. Thử nghiệm Protease ..................................................................................... 63

v


Đồ án tốt nghiệp

3.2.

Định tính và định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5.. ...... 64

3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng
nấm mốc Fusarium sp.: .................................................................................................. 67
3.4. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5
sau gia nhiệt.................................................................................................................... 69
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 đối với sự phát triển
của hạt bắp. ..................................................................................................................... 72
3.5.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới thời gian nảy mầm . 72
3.5.2. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. ........ 74
3.5.3. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều cao. ............... 76
3.5.4. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều dài rễ............. 80
3.5.5. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới sinh khối tươi. ........ 84
3.6.

Ứng dụng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt. ..................... 89

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 95
4.1.

Kết luận ................................................................................................................ 95

4.2.

Kiến nghị .............................................................................................................. 95

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 96

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BVTV:

Bảo vệ thực vật

KĐKTH:

Không đun, không trung hoà

KĐTH:

Không đun, trung hoà

KTHCN:

Không trung hoà, cảm nhiễm

KTHKCN:

Không trung hoà, không cảm nhiễm

LAB:

Lactic acid bacteria

MRS:

Man De Rogosa and Sharpe

NT:

Nghiệm thức

PDA:

Potato Dextrose Agar

PDB:

Potato Dextrose Broth

THCN:

Trung hoà, cảm nhiễm

THKCN:

Trung hoà, không cảm nhiễm

VSV:

Vi sinh vật

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số loại nấm và độc tố của chúng ............................................................ 17
Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động. ............. 23
Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men. 28
Bảng 3.1: Hàm lượng % acid lactic của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ............. 61
Bảng 3.2: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 ......................... 62
Bảng 3.3: Kết quả biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ IAA. ......... 64
Bảng 3.4: Đường kính phát triển của chủng nấm mốc Fusarium sp. ............................ 66
Bảng 3.5: Tỉ lệ ức chế (%) chủng nấm mốc Fusarium sp. của Lactobacillus sp. L5. ... 68
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các mức xử lí nhiệt sau 15 phút đến tỉ lệ ức chế Fusarium sp.
........................................................................................................................................ 69
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới thời gian nảy mầm. .................................. 72
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới tỉ lệ nảy mầm............................................ 74
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều cao của cây bắp ngày 7. .......... 76
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới rễ sau 7 ngày .......................................... 80
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới sinh khối tươi sau 7 ngày. ..................... 84
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến độ khoẻ mầm sau 7 ngày ...................... 86
Bảng 3. 13: Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ở các nghiệm
thức ứng dụng bảo quản hạt bắp. ................................................................................... 89

viii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Trichothecennes và Detoxified ................................... 13
Hình 3.1: Khuẩn lạc Lactobacillus sp. L5 trên đĩa MRS Agar (Trái) và khuẩn lạc quan
sát dưới kín hiển vi (phải). ............................................................................................. 57
Hình 3.2: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm Gram. ......................................... 58
Hình 3.3: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm bào tử. ........................................ 58
Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (Từ trái qua phải):
Thử nghiệm âm tính của L5, Đối chứng âm vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong nước
cất, Thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp. ......................................................... 59
Hình 3.5: Khả năng di động của chủng Lactobacillus sp. L5 ........................................ 60
Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 ......................... 62
Hình 3.7: Thử nghiệm chitinase của chủng Lactobacillus sp. L5.................................. 62
Hình 3.8: Thử nghiệm protease của chủng Lactobacillus sp. L5 .................................. 63
Hình 3.9: Dịch nuôi cấy sau ly tâm đổi màu khi cho thuốc thử so với ĐC. .................. 64
Hình 3.10: Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA
(μg/ml) ............................................................................................................................ 65
Hình 3.11: Khả năng phát triển của các chủng nấm mốc Fusarium sp. trên môi trường
MRS Agar cải tiến và PDA sau 3 ngày. ......................................................................... 66
Hình 3.12: Hình thái sợi nấm và bảo tử nấm mốc Fusarium sp. dưới kính hiển vi....... 67
Hình 3.13: Khả năng ức chế nấm của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 đối với
nấm mốc Fusarium sp. ................................................................................................... 68
Hình 3.14: Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt dịch nuôi cấy
Lactobacillus sp. L5 lên khả năng kháng Fusarium sp.................................................. 70
Hình 3.15: Khả năng ức chế nấm của chủng Lacotbacillus sp. L5 sau khi gia nhiệt. ... 71
Hình 3.16: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy trước và sau gia nhiệt đối với

thời gian nảy mầm của hạt bắp....................................................................................... 73

ix


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.17: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ
nảy mầm. ........................................................................................................................ 75
Hình 3.18: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới chiều cao cây bắp ............ 77
Hình 3.19: Chiều cao cây NT THKCN sau 7 ngày. ....................................................... 78
Hình 3.20: Chiều cao cây NT THCN sau 7 ngày........................................................... 78
Hình 3.21: Chiều cao cây ở NT KTHKCN sau 7 ngày.................................................. 79
Hình 3.22: Chiều cao cây ở NT THKCN sau 7 ngày..................................................... 79
Hình 3.23: Đồ thị thể hiện chiều dài rễ ở các nghiệm thức sau 7 ngày. ........................ 81
Hình 3.24: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THKCN sau 7 ngày. ......................................... 82
Hình 3.25: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THCN sau 7 ngày. ............................................ 82
Hình 3.26: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTH KCN sau 7 ngày. ..................................... 83
Hình 3.27: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTHCN sau 7 ngày. ......................................... 83
Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện sinh khối tươi của cây ở các NT sau 7 ngày. .................... 85
Hình 3.29: Đồ thị biểu thị độ khoẻ của mầm cây bắp sau 7 ngày ................................. 87
Hình 3.30: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của các nghiệm thức dịch nuôi cấy
Lactobacillus sp. L5 ....................................................................................................... 90

x


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài:
Các loại hạt nói chung và hạt nông sản nói riêng là một phần quan trọng trong
quá trình tồn tại và phát triển của loài ngoài người. Cho nên con người ngày nay luôn
tìm các tăng sản lượng hạt nông sản lên tối đa trên cùng một đơn vị diện tích. Tuy
nhiên chỉ tăng sản lượng hạt nông sản phục vụ cho mục đích cuối cùng vẫn chưa đủ.
Sau khi thu hoạch hạt vẫn rất dễ bị tổn thương trong quá trình bảo quản và chế biến, nó
ảnh hưởng nhiều đến giữ giống cho mùa vụ sau hay ảnh hưởng tới chất lượng và giá trị
của nông sản. Vì vậy ngoài nghiên cứu để nâng cao sản lượng thu hoạch chúng ta cần
tiến hành song song quá trình nghiên cứu bảo quản và khả năng nảy mầm của nông sản
sau thu hoạch. Để làm được điều đó là một công việc không dễ dàng.
Công nghệ bảo quản hạt nông sản có nhiều phương pháp khác nhau nhưng cơ
bản có 3 phương pháp đó là vật lý, hoá học và sinh học. Nhưng ngày nay người ta càng
ngày càng chú trọng đến phương pháp bảo quản bằng sinh học do có nhưng ưu điểm
vượt trội của nó như an toàn với người sử dụng, không ảnh hưởng đến cảm quan màu
sắc, mùi vị của nông sản sau thu hoạch. Các hợp chất sinh ra từ vi khuẩn lactic ngày
càng được chú trọng trong bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sinh hợp chất kháng các
vi sinh vật có hại. Việc chú trọng bảo quản thực phẩm tươi sống như thịt cá trứng sữa,
rau của quả là tối cần thiết nhưng việc bảo quản các loại hạt nông sản cũng rất quan
trọng trong cuộc sống con người.
Hạt bắp là một trong 5 loại hạt ngũ cốc quan trọng của nước ta. Do chúng ta chỉ
tập trung vào số lượng nên chất lượng chưa thực sự tốt dẫn đến khả năng xuất khẩu của
hạt bắp không cao. Hạt bắp rất dễ bị nhiễm các loại nấm như Aspergillus spp. làm mốc
hạt, hay nấm Fusarium spp. làm thối thân thối bắp hay nấm Helminthosporium spp.
gây bệnh đốm lá trên cây bắp. Trong đó loài Fusarium spp. không chỉ gây hại cho hạt

1


Đồ án tốt nghiệp

bắp ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm do chúng sinh độc tố như Zearelenone,
Vomitoxin mà còn ảnh hưởng tới khả năng hô hấp của con người và động vật khi sử
dụng bắp nhiễm Fusarium spp. Cùng với khả năng kháng các loài nấm bệnh của các
chủng lactic trên hạt đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trong và ngoài nước. Nước ta
có các sản phẩm lên men truyền thống và công nghiệp khi sử dụng các chủng vi khuẩn
lactic được chứng minh thực tế là an toàn với người sử dụng nên người thực hiện thấy
đây là vấn đề cấp thiết nên đã thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ứng dụng dịch
nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp”.
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.1.

Ngoài nước

Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm khác nhau như:
 “Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium
in vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A. Laitila (2002).
 Năm 2004, Cassandra De Muynck nghiên cứu “Khả năng kháng nấm của vi
khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm”.
 Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic
phân lập từ kim chi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005.


R Munoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của
Aspergillus nomius

của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces

cerevisae” năm 2010.
 Ghisian và cs (2005) đã nghiên cứu sự sản xuất Fumonissin từ các loài
Fusarium phân lập từ ngũ cốc tươi ở Iran. Kết quả phân lập được 3619 chủng

Fusarium verticilloides và Fusarium proliferatum từ 92 mẫu ngũ cốc mới thu
hoạch tại 4 vùng địa lí khác nhau của Iran, đồng thời cũng xác định được hàm
lượng Fumonissin mà chúng tạo ra trên môi trường ngũ cốc.

2


Đồ án tốt nghiệp

2.2.

Trong nước

Hiện tại nước ta cũng có khá nhiều công trình nghiên cứu vi khuẩn kháng nấm
bệnh trên các loại cây và hạt khác nhau tiêu biểu như:
 Chế phẩm Bimix của trung tâm công nghệ sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh
xử lí mùi hôi trong chăn nuôi khi kết hợp xử dụng sản phẩm sau lên men của
3 chủng Bacillus subtillis, Streptomycess sp, Saccharomycess cerevisiae. Sản
sinh enzyme ngoại bào để ức chế nấm mốc gây bệnh.
3. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm có nguồn gốc sinh học để bảo quản và khả
năng nảy mầm của hạt bắp khỏi nấm bệnh gây hại từ vi khuẩn lactic.
4. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát khả năng bảo quản hạt của dịch nuôi cấy của chủng Lactobacillus sp. L5
trong bảo quản và sự phát triển của hạt bắp.
5. Nội dung nghiên cứu
Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 và các chủng nấm Fusarium sp.
Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5.
Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5.
Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng

nấm Fusarium sp.
Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy ở sau khi đun ở các nhiệt độ, pH
khác nhau của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 với các chủng nấm Fusarium sp..

3


Đồ án tốt nghiệp

Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 kích thích sinh trưởng
của hạt bắp.
Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt
bắp.
6. Phương pháp nghiên cứu
6.1.

Phương pháp luận

Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic đối với các nấm gây
hư hỏng hạt ngũ cốc và sinh độc tố, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu và tìm
hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm hạt. Sau khi xác định tác nhân gây ức chế là
dịch nuôi cấy, sẽ sử dụng trức tiếp để ứng dụng trong bảo quản hạt bắp đã cảm nhiễm
nấm mốc. Sau đó thử nghiệm khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với khả năng
nảy mầm của hạt bắp.
6.2.

Phương pháp xử lí số liệu

Phần mềm Excel 2016.
Phần mềm thống kê SAS 9.4.

7. Kết quả đạt được
Xác định khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 đối với
chủng Fusarium sp.
Xác định được khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy được đun ở các nhiệt độ
65oC, 80oC, 100oC trong 15 phút, trung hoà pH = 6 và không trung hoà.
Xác định được ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn Lactobacillus
sp. L5 ở các mức nhiệt độ và các độ pH đối với khả năng nảy mầm của hạt bắp.

4


Đồ án tốt nghiệp

Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 kích thích sinh trưởng
của hạt bắp.
Ứng dụng trong bảo quản hạt bắp, thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạt bắp.

5


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về nấm
1.1.1. Giới thiệu chung
Nấm (Fungi, Mycota) là một giới trong số năm giới theo hệ thống phân loại của
R. H. Whittaker (1996). Nấm thuộc ngành nấm (Euphycophyta), là bộ môn nghiên cứu
của nấm học (Mycology), là một ngành khoa học độc lập với vi sinh vật. Tuy nhiên có
một số nhóm nấm (nấm men, nấm mốc) do kích thước nhỏ bé và muốn nghiên cứu
phải sử dụng các phương pháp vi sinh vật học nên được coi là đối tượng nghiên cứu

của vi sinh vật học. Nấm có nhiều đặc điểm giống với thực vật nhưng khác với thực vật
ở chổ không có sắc tố quang hợp và cơ thể ít phân hóa về mặt hình thái.
Nấm tồn tại và phân bố khắp trng tự nhiên như đất, nước, rễ thân lá quả hạt
cây. Chúng có khả năng sinh độc tố có hại cho con người, động vật và thực vật. Tuy
nhiên chúng lại có vai trò rất quan trọng trong việc phân giải các hợp chất trong tự
nhiên có chứa cellulose, protein, lipid, kitin, pectin,… đảm bảo chu trình khép kín
trong tự nhiên.
1.1.2. Phân loại nấm
Dựa theo tổ chức hình thái, nấm được chia thành 4 lớp chính:
Lớp Phycomycetes (lớp nấm tảo): Sợi không có vách ngăn ngăn, bào tử gồm 2
lớp phụ: Oomycetes (nấm noãn) và Zygomycetes (nấm tiếp hợp).
Lớp Ascomycetes (lớp nấm túi): Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng túi
bào tử, sinh sản hữu tính theo kiểu tạo túi (namg) và túi bào tử (ascospore).
Lớp Basidiomycetes (lớp nấm đảm): Sinh sản hữu tính theo kiểu tạo đảm bào tử
(basidiospore). Gập ở các nấm có tai nấm: Nấm rơm, nấm hương.

6


Đồ án tốt nghiệp

Lớp Deuteromycetes (lớp nấm bất toàn): Không có khả năng sinh sản hữu tính và
có 3 bộ.
1.1.3. Một số độc tố và tác hại của độc tố nấm mốc.
Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) cho biết:
Trong 300 loại độc tố vi nấm đã biết, chỉ có 20 loài ảnh hưởng đến sức khỏe con
người, khoảng 15 loài gây ung thư. Trong một thời gian dài, người ta ít chú ý đến khả
năng gây bệnh trong thực phẩm bị mốc. Nhưng vào năm 1960, hơn 100000 con gà tây
ở Anh đã bị chết một cách rất khó hiểu. Sau đó, người ta đã phát hiện ra nguyên nhân
là những con gà này đã ăn bột lạc nhiễm Aspergillus flavus, chính nấm mốc này đã tạo

ra những độc tố nguy hiểm. Nhờ phát hiện này người ta đã khẳng định rằng con người
cũng có thể bị bệnh nếu ăn phải những hạt mốc, kể cả với lương rất nhỏ.
Một số độc tố thường gặp như sau:
 Aflatoxin, Ochratoxins do Aspercillus spp.
Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị
phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 1200oC, phải đun 30 phút mới mất
tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm
mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên nó lại không bền
dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện
pháp hơn. Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp và độc nhất là aflatoxin
B1.
Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu
sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn.

7


Đồ án tốt nghiệp

Theo Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm (2011), cho biết:
Aflatoxine liên quan tới các bệnh khác nhau ở gia súc, vật nuôi trong nhà cũng
như con người; là loại độc tố nấm mốc được nghiên cứu rộng và sâu nhất trên toàn thế
giới.
Cần lưu ý rằng aflatoxin có thể sinh ra trong ngũ cốc ngay cả trước khi thu hoạch,
trong thu hoạch và sau thu hoạch nếu ngũ cốc không được bảo quản đúng cách hay
được sinh ra trong thức ăn chăn nuôi trước khi được sử dụng. Nói chung, khi aflatoxin
sinh ra, khó có thể làm gì để loại bỏ chúng khỏi ngũ cốc hay thức ăn chăn nuôi. Các
loại độc tố này có cấu tạo hoá học rất ổn định và không bị phá huỷ bởi nhiệt, ánh sáng,
axit, xử lý kiềm, hay kéo dài thời gian lưu trữ.
Khi người và động vật ăn phải thực phẩm chứa độc tố nấm mốc Aflatoxin có thể

gây đến ngộ độc cấp tính hoặc mãn tính.
Ngộ độc cấp tính:
Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính đã được thông báo ở các nước, với các biểu
hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan.
Theo Phạm Duy Tường (2009) cho biết: Khi ăn phải lượng Aflatoxin lớn sẽ gây
ngộ độc cấp tính và gây tử vong. Thông thường mổ ra thấy gan to, màu sắc nhợt nhạt,
có hoại tử nhu mô gan và chảy máu...
Theo Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm (2011), cho biết:
Biểu hiện ngộ độc aflatoxine lâm sàng ở người đã được thống kê khắp nơi trên
thế giới. Triệu chứng đặc trưng là nôn ọe, đau bụng, phù phổi, hôn mê và chết do phù
não và chất béo cuộn vào gan, thận và tim.

8


Đồ án tốt nghiệp

Ngộ độc mãn tính:
Hiện nay, một loạt các nghiên cứu trên người cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan
nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin, nhưng cơ chế tác
động của aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy
nhiên đã tìm thấy sự gắn kết của aflatoxin B1 với AND của tế bào gan ở những bệnh
nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máu ngoại vi,
trong máu rau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với aflatoxin B1.
Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm aflatoxin B1 với sự đột biến gen ở
các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 – một gen kiểm soát sự chết
tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo
nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính.
 Ochratoxins
Ochratoxins là chất dẫn xuất isocoumarin. Nó chủ yếu được sinh ra từ nấm mốc

Aspergillus ochraceus và Penicillium viridicatum, nhưng cũng có khi từ loại nấm mốc
khác. Độc tố này xuất hiện trong quá trình lưu kho khi nấm mốc nhiễm vào ngũ cốc và
đỗ, đặc biệt ở thời tiết lạnh và ôn đới. Độc tố được sản sinh mạnh nhất và nhiều nhất ở
20 - 25oC. Trong số các ochratoxin, ochratoxin A(OTA) có độc tính mạnh nhất.
Cơ quan nghiên cứu ung thư đã phân chia OTA thành nhóm 2B carinogen. Trong
chăn nuôi, thương tổn do nhiễm độc ochratoxin A xuất hiện chủ yếu ở gia cầm và heo.
Tuy nhiên tất cả các gia súc phòng thí nghiệm đã qua thử nghiệm đều rất dễ bị thương
tổn khi ăn thức ăn có độc tố ochratoxins. Khi tiêu thụ thức ăn chứa khoảng vài trăm
ppb độc tố ochratoxins A dẫn tới chuyển hóa thức ăn kém, tỷ lệ tăng trưởng giảm và
phát triển kém, kèm theo là giảm sức đề kháng chống lại các vi khuẩn và virus.

9


Đồ án tốt nghiệp

Độc tính:
Độc tố này chủ yếu gây bệnh cho đông vật nhất là lợn và các loài dạ dày đơn.
Đặc điểm nổi bật khi nhiễm độc tố này là tiêu thụ nước tăng và đi tiểu nhiều do sự tổn
thương thận. Khi mổ thấy thận thường to và màu xám với bề mặt vỏ thận không nhẵn
nhụi và xơ vỏ thận.
Không ảnh hưởng tới loài nhai lại.
 Phương pháp hạn chế Aflatoxin
 Theo Phạm Duy Tường (2009) cho biết biện pháp phòng chống ngộ độc do
độc tố của Aflatoxine và Ochratoxins như sau:
Trong bảo quản thực phẩm: phải đảm bảo yêu cầu vệ sinh trong bảo quản, bảo
quản nơi khô, thoáng mát, trước khi bảo quản phải phơi khô, giữ nguyên vỏ, để nấm
mốc không thể phát triển và sinh ra độc tố.
Quá trình chế biến: Khi làm tương, xì dầu phải phải chọn thực phẩm tốt và phải
chọn mốc đúng chủng loại.

Kiểm tra và giám sát chặt chẽ thức ăn cho người và vật nuôi.
Xử lý nghiêm túc theo các quy định và luật vệ sinh an toàn thực phẩm.
Nghiên cứu, áp dụng các biện pháp xử lý, chế biến thực phẩm để giảm thiểu hàm
lượng Aflatoxine và Ochratoxins trong thực phẩm.
Độc tố do Fusarium spp. gây ra:
 Fumonisins
Fumonisins nhóm bao gồm 6 loại độc tố khác nhau, (FB1, FB2, FB3, FB4, FA1,
FA2). Chúng được sản sinh từ Fusarium moniliforme, Fusarium proliferratum và

10


Đồ án tốt nghiệp

Fusarium sp, đặc biệt khi khí hậu ẩm và ôn hòa. Fumonisins được thấy chủ yếu trong
ngô và các sản phẩm từ ngô, do vậy đây là vấn đề khó khăn trên toàn thế giới. Fumosin
B1 là độc tố nhiều nhất và phổ biến nhất trong nhóm.
 Độc tính
Fumonisins B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất, gây nên một số triệu chứng như:
Gây não bạch cầu hoặc tổn hại gan.
Ung thư gan.
Ung thư thực quản ở người và tổn thương gan, thận, tim, phổi, thậm chí ức chế
sinh trưởng và gây chết.
Ngoài ra, người còn bị bệnh bạch hầu do nhiễm độc thực phẩm:
Bệnh bạch hầu do nhiễm độc thực phẩm phát hiện ở những người đã ăn phải hạt
ngũ cốc nhiễm mốc hoặc các chế phẩm từ hạt ngũ cốc tích trữ qua mùa đông ở ngoài
đồng. Độc tố này thường gây tử vong và được gọi bằng nhiều tên khác nhau: Bệnh
thiếu máu không tái tạo, bệnh bạch cầu chảy máu, bệnh mất bạch cầu hạt, viêm họng
nhiễm trùng, bệnh độc tố thực phẩm, bệnh độc tố gây suy tủy.
 Zeatalenone

Zeatalenone( ZON) là sản phẩm duy nhất của loài nấm mốc Fusarium phát triển
trong điều kiện độ ẩm cao( ví dụ Fusarium roseum, Fusarium graminearum, Fusarium
culmorum). Nó có tác dụng tương tự hoocmone động dục giống cái và gây ra động dục
giả (hiện tượng tương tự động dục). Lợn được coi là loài gia súc nhạy cảm nhất.

11


Đồ án tốt nghiệp

 Phương pháp loại trừ:
Do Fumonisin và Zeatalenone bền nhiệt chỉ bị phá hủy khi tác động nhiệt độ
>2000oC. Các biện pháp thủy phân không làm giảm mà ngược lại làm tăng cường độc
tính.
Biện pháp hiệu quả nhất là phân loại và lựa chọn nguyên liệu.
 Trichothecenes
Trichothecenes thuộc nhóm 150 hợp chất có cấu trúc tương tự được sản sinh chủ
yếu từ Fusarium spp, một loại nấm mốc phân bố rộng rãi trong các loại ngũ cốc trên
thế giới.
Do đặc tính hóa học và sự hình thành nấm mốc, chúng có thể được phân chia
làm 4 nhóm căn bản với các loại A và B ảnh hưởng tiêu cực đối với chăn nuôi gia súc.
Trichothecenes loại A (sản sinh chủ yếu từ Fusanum sporotrichioides) bao gồm các
loại độc tố khác nhau T-2 toxin, HT-2 toxin, neosolaniol (NEO) và diacetoxyscirpenol
(DAS). Trichothecenes loại B( sản sinh chủ yếu từ Fusariltm culmorum và F
.graminearum) gồm các loại deoxymvalenol và 3-acetyl cùng với 15 chất dẫn xuất của
nó.
Độc tính:
- T- 2 toxin ức chế sự tổng hợp protein và làm suy yếu sự hoàn thiện của tế bào
máu trong tủy xương và ngăn chặn hệ miễn dịch.
Rối loạn chức năng ribosom, ức chế sự tổng hợp protein ở ty thể.

Gây nên thương tổn cho tuyến nhày của dạ dày và ruột dẫn tới hậu quả là xuất
huyết diện rộng và viêm toàn bộ niêm mạc dạ dày.

12


Đồ án tốt nghiệp

Nếu ăn phải lượng lớn độc tố trong thực phẩm sẽ gây nôn ọe, bỏ ăn.

Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Trichothecennes và Detoxified
 Phương pháp hạn chế ngộ độc do Trichothecenes:
Trichothecenes rất với các tác động môi trường và bền với nhiệt, không bị phân
giải ở nhiệt độ dưới 2300oC, độc tố này bền vững trong không khí và ánh sáng hàng
tuần lễ.
Có thể xử lý hoàn toàn Trichothecenes ở 6000oC trong 10 phút trong dung dịch
NaOH.
Trichothecenes có thể dễ dàng loại bỏ phần lớn bằng nước.
Trichothecenes mất hoạt tính khi kết hợp với một số tác nhân như bentonit và
đất sét trắng.
Trichothecenes bị vô hoạt trong dung dịch NaHSO3 3- 5%.

13


Đồ án tốt nghiệp

Do trong đề tài sử dụng nấm chủng nấm Fusarium spp. nên sẽ mô tả khá đầy đủ
về chủng nấm này:
Đặc điểm của nấm Fusarium spp.

Fusarium spp. là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc kí
sinh trên nhiều loại hạt rễ thân cây trồng khác nhau, Chúng cạnh tranh dinh dưỡng,
phát triển tơ nấm phủ kín mô mạch trong thân cây hay tiết độc tố vào mạch dẫn khiến
ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt hay làm héo rũ cây.
Phân loại :
Nấm Fusarium spp. thuộc:
Nghành:

Ascomycota

Lớp:

Deuteromycetes

Họ:

Tuberaulariaceae

Bộ:

Moniliales

Chi:

Fusarium

Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây như héo do tắc mạch, thối
rễ, thân và bắp, thối cổ rễ cây con. Một số loài gây bệnh cũng sản sinh độc tố nấm lẫn
tạp trong hạt ngũ cốc.
Fusarium spp. là một loại nấm gặp phố biến trong đất đôi khi là ở hạt và thân

cây trồng và cũng gặp trên các vật liệu cellulose.
Nhiệt độ phát triển thích hợp của Fusarium spp. là 25 – 30oC.

14