Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của photorhabdus SPP và xenorhabdus SPP từ heterorhabditis indica và steinernema guangdongense

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA PHOTORHABDUS SPP. VÀ XENORHABDUS
SPP. TỪ HETERORHABDITIS INDICA VÀ
STEINERNEMA GUANGDONGENSE

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện:
MSSV: 0851110063

PHẠM THỊ HƯƠNG
Lớp: 08DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2012


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU………………………………………………………………....1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................. 8
1.2. Mục đích của nghiên cứu ............................................................................................ 9
1.3. Nhiệm vụ của nghiên cứu ........................................................................................... 9
1.4. Các kết quả đạt được của đề tài ................................................................................... 9
CHƯƠNG II : TỔNG QUAN.............................................................................................. 11

2.1. Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) .................................................. 11
2.1.1. Khái niệm EPN ................................................................................................... 11
2.1.2. Vai trò và ưu thế của EPN .................................................................................. 11
2.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng .............................................................. 12
2.2.1. Phân loại ............................................................................................................ 12
2.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus ............................ 14
2.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae: .................................................... 14
2.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus.......................................................... 15
2.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản...................................................................... 16
2.3.4. Một số yếu tố độc lực.......................................................................................... 25
2.4. Mối quan hệ cộng sinh .............................................................................................. 34
2.4.1. Vai trò của tuyến trùng ....................................................................................... 34
2.4.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh ........................................................................... 35
2.4.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn ............................. 35
2.5. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt .................................. 38
2.5.1. Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt ................................................................ 39
2.5.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt ................................................................... 39
2.5.3. Các loài côn trùng bị vi khuẩn Xenorhabdus tiêu diệt ...................................... 40
2.6. Tình hình nghiên cứu Photorhabdus và Xenorhabdus trên thế giới và Việt Nam .... 41
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 42
2.6.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam....................................................................... 45
CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... Error! Bookmark not
defined.
3.1. Thời gian và địa điểm................................................ Error! Bookmark not defined.
1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3.1.1. Thời gian ............................................................ Error! Bookmark not defined.

3.1.2. Địa điểm ............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.2. Vật liệu .................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Nguồn tuyến trùng EPN ..................................... Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Nguồn vi sinh vật ................................................ Error! Bookmark not defined.
3.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng.......... Error! Bookmark not defined.
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.1. Phương pháp phân lập ....................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.2. Hình thái ............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Sinh lý ................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập . Error! Bookmark not defined.
3.3.5. Thử nghiệm sinh hóa .......................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.6. Hoạt tính sinh học .............................................. Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................... Error! Bookmark not defined.
4.1. Kết quả phân lập hai chủng vi khuẩn khảo sát .......... Error! Bookmark not defined.
4.2. Hình thái khuẩn lạc ................................................... Error! Bookmark not defined.
4.2.1. Quan sát khuẩn lạc ............................................. Error! Bookmark not defined.
4.2.1. Nhuộm Gram (quan sát vi thể) ........................... Error! Bookmark not defined.
4.2.3. Nhuộm tiên mao.................................................. Error! Bookmark not defined.
4.3. Thử nghiệm sinh lý................................................ Error! Bookmark not defined.
4.3.1. Di động ............................................................... Error! Bookmark not defined.
4.4. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập .... Error! Bookmark not defined.
4.5. Thử nghiệm sinh hóa ................................................. Error! Bookmark not defined.
4.5.1. Kết quả thử nghiệm catalase .............................. Error! Bookmark not defined.
4.5.2. Lên men lactose .................................................. Error! Bookmark not defined.
4.5.3. Indole .................................................................. Error! Bookmark not defined.
4.5.4. Khử nitrate.......................................................... Error! Bookmark not defined.
4.5.5. Phân giải tinh bột ............................................... Error! Bookmark not defined.
4.5.6. Sinh hơi H2S ....................................................... Error! Bookmark not defined.
4.5.7. Thử nghiệm phân giải lipase .............................. Error! Bookmark not defined.
4.5.8. Thử nghiệm phân giải protease .......................... Error! Bookmark not defined.

4.6. Khả năng đối kháng với vi sinh vật gây hại của hai chủng vi khuẩn khảo sát...Error!
Bookmark not defined.
2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

4.6.1. Kết quả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh .......... Error! Bookmark not defined.
4.6.2. Kết quả đối kháng với nấm gây bệnh ................. Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 47
5.1. Kết luận ..................................................................................................................... 47
5.2. Kiến nghị…. .......................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................90

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
 BSL: Bướm sáp lớn
 LB:

Luria-Bertani

 LPS:

Lipopolysaccharide

 EPN:

Entomopathogenic Nematodes

 HBHL: Hydroxybutanoyl homoserine lactone
 IJs:

Infective Juveniles

 NBTA: Nutrient bromothymol blue agar

 PDA:

Potato glucose agar

 QS:

Quorum Sensing

 TSA:

Tryptone Soya Agar

 VKCS: Vi khuẩn cộng sinh

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng .............................................................. 13
Bảng 2.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus ..................................................... 15
Bảng 2.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus ....................... 16
Bảng 2.4. Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của Xenorhabdus /
Photorhabdus ....................................................................................................................... 18
Bảng 2.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus ....... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.7. Đặc điểm của một số loài Photorhabdus............................................................. 23
Bảng 2.8. Đặc điểm của một số loài Xenorhabdus .............................................................. 24
Bảng 2.9. Các chất kháng sinh trong Photorhabdus............................................................ 30
Bảng 2.10. Các chất kháng sinh trong Xenorhabdus ........................................................... 32
Bảng 2.11. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh ................................................ 38
Bảng 2.12. Các chế phẩm EPN tại Việt Nam ...................................................................... 45
Bảng 3.1. Thành phần thuốc nhuộm tiên mao ..................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.2. Thành phần thuốc thử trong thí nghiệm khả năng phân giải nitrate .............Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.3. Thành phần thuốc thử protease ........................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.4. Quy ước đường kính vòng phân giải ................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 4.2. Khả năng phân giải protein của P1 và X1trên môi trường agar gelatin và chicken
offal ...................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 4.3. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn khảo sát với Salmonella,E .Coli, B.
subtilis. ................................................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 4.4. Khả năng đối kháng của chủng P1 và X1 với Salmonella, E .Coli, B. subtilis,
sau lần cấy chuyền thứ 7. ..................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 4.5. Kết quả đối kháng nấm Phytophthora spp sau lần cấy chuyền thứ nhất ......Error!
Bookmark not defined.
Bảng 4.6. Kết quả đối kháng Phytophthora spp sau lần cấy chuyền thứ bảy...............Error!
Bookmark not defined.

5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng ...................................................... 14
Hình 2.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus .......................................... 16
Hình 2.3. Vai trò của pha I .................................................................................................. 19
Hình 2.4. Vai trò của pha II ................................................................................................. 19
Hình 2.5. Giả định về khả năng gây độc của X.nematophila .............................................. 25
Hình 2.6. Cấu trúc nội độc tố vi khuẩn Gram âm (lypopolysaccharide) ............................. 28
Hình 2.7. Các hướng ứng dụng của vi khuẩn cộng sinh ...................................................... 42
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.2. Phân lậpPhotorhabditis từ Heterorhabditis indica............. Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.3. Phân lập Xenorhabdus từ Steinernema guangdongense ..... Error! Bookmark not
defined.
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện ................ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc quan sát qua kính hiển vi ..... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.3. Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined.
Hình 4.4. Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện ................ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.5. Hình thái khuẩn lạc quan sát dưới kính hiển vi ... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.6. Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined.
Hình 4.7. Hình thái tiên mao ............................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.8. Hình thái vi khuẩn khi nhuộm gram .................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.9. Hiện tượng thử nghiệm catalase .......................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.10. Hiện tượng thử nghiệm di động trên đĩa thạch .. Error! Bookmark not defined.
Hình 4.11. Hiện tượng thử nghiệm di động trong ống nghiệm .......... Error! Bookmark not
defined.
Hình 4.12. Hiện tượng thử nghiệm lên men lactose ............ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.13. Hiện tượng thử nghiệm indole ........................... Error! Bookmark not defined.

Hình 4.14. Hiện tượng thử nghiệm khử nitrate.................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.15. Hiện tượng thử nghiệm phân giải tinh bột ......... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.16. Hiện tượng thử nghiệm sinh hơi H2S................. Error! Bookmark not defined.
Hình 4.17. Hiện tượng phân giải lipase trên tween 20 ........ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.18. Hiện tượng phân giải lipase trên chicken offal .. Error! Bookmark not defined.
Hình 4.19. Hiện tượng phân giải gelatin của P1 .................. Error! Bookmark not defined.
6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 4.20. Hiện tượng phân giải gelatin của X1 ................. Error! Bookmark not defined.
Hình 4.21. Hiện tượng phân giải gelatin của P1 .................. Error! Bookmark not defined.
Hình 4.22. Hiện tượng phân giải gelatin của X1 ................. Error! Bookmark not defined.
Hình 4.23. Thử nghiệm hoạt tính kháng B. subtilis với P1 . Error! Bookmark not defined.
Hình 4.24.Thử nghiệm hoạt tính kháng B. subtilis với X1 .. Error! Bookmark not defined.
Hình 4.25.Thử nghiệm hoạt tính kháng E. coli với P1 ........ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.26. Thử nghiệm hoạt tính kháng Salmonella với P1 Error! Bookmark not defined.
Hình 4.27. Thử nghiệm hoạt tính kháng B. subtilis với P1 . Error! Bookmark not defined.
Hình 4.29.Thử nghiệm hoạt tính kháng E. coli với P1 ........ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.30. Thử nghiệm hoạt tính kháng Salmonella với P1 Error! Bookmark not defined.
Hình 4.31. Mẫu đối chứng Phytophthora spp. .................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.32. Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp. ............... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.33. Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp. ............... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.34. Mẫu đối chứng Phytophthora spp. .................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.35. Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp. ............... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.36. Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp. ............... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.37. Mẫu đối chứng Phytophthora spp. .................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.38. Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp. ............... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.39. Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp. ............... Error! Bookmark not defined.

7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU
----oOo---1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay ngành nông nghiệp Việt Nam đang trên đà phát triển hết sức mạnh
mẽ cả về số lượng và chất lượng, trong đó một số mặt hàng nông sản như cà phê,
lúa gạo có kim nghạch xuất khẩu cao và có vị thế trên thị trường quốc tế. Nhu cầu
tăng sản lượng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đang được đặt ra,
đi đôi với nó luôn đòi hỏi những kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn.
Tuy nhiên không phải chỉ riêng Việt Nam mà hầu như tất cả các nước nông
nghiệp người nông dân ít được trang bị đầy đủ kiến thức về sản xuất để đảm bảo
tính bền vững. Vì vậy ở không ít nơi người nông dân sử dụng ồ ạt các loại thuốc trừ
sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học vì không hiểu biết hay đã biết được tác hại
nhưng vẫn cố ý sử dụng để tăng sản lượng, thu lợi nhuận. Chính việc sử dụng mà
không tuân thủ các quy định về liều lượng và cách thức đã làm dịch bệnh trở nên
nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Không những vậy, thế giới
đang phải đối mặt với vấn đề nhức nhối là tồn dư quá mức của các chất hóa học có
thể gây hại cho sức khỏe con người trong các sản phẩm nông nghiệp. Vì vậy xu
hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đang trở nên rất hữu ích vì tiết
kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức khỏe cho con người, đồng
thời tính an toàn môi trường cao.
Trong các biện pháp sinh học được sử dụng hiện nay thì dùng tuyến trùng ký
sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema và Heterorhabditis đang
được các nước trên thế giới và Việt Nam đặc biệt chú ý. Tuy nhiên, các loài tuyến
trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt vi khuẩn cộng
sinh trong ruột chúng, nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng, gồm

Photorhabdus trong Heterorhabditis và Xenorhabdus trong Steinernema. Với vai
trò đặc biệt, hai loài vi khuẩn trở thành mấu chốt trong mối quan hệ giữa sâu hại –
tuyến trùng – vi khuẩn. Đây được coi là những loài vi khuẩn có đời sống rất đặc biệt
khi cộng sinh trong một vật chủ và gây hại cho một vật chủ khác thông qua vật chủ
mà nó cộng sinh. Mặt khác có thể thấy được khả năng kháng mạnh với các loài vi
8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc và các loài nấm gây hại cho nông nghiệp, điều
này mở ra những ứng dụng rất lớn. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện chỉ có một số
nghiên cứu tại Hà Nội có liên quan đến hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus, ở
các tỉnh thành miền Nam chưa có nghiên cứu về vấn đề phân lập và ứng dụng vi
khuẩn cộng sinh này. Trong nghiên cứu này sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm
Heterorhabditis indica và Steinernem guangdongense, trên thế giới Heterorhabditis
indica được ứng dụng rộng rãi vì những tác dụng mang lại trong lĩnh vực bảo vệ
thực vật và Steinernema guangdongense là một loài tuyến trùng mới chưa có bất kỳ
nghiên cứu về loài vi khuẩn cộng sinh với nó. Vì những lợi ích rất quan trọng của
loài vi khuẩn này và yêu cầu mở rộng kiến thức khoa học mà người tiến hành đề tài
đã chọn hướng cho đồ án tốt nghiệp là : “Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học
của Photorhabdus spp. và Xenorhabdus spp. từ Heterorhabditis indica và
Steinernema guangdongense ”
1.2. Mục đích của nghiên cứu
Phân lập các chủng vi khuẩn thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có
khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây hại cho gia súc và nông nghiệp.
Khi thành công đề tài sẽ đánh dấu cho triển vọng về việc sử dụng vi khuẩn
Xenorhabdus và Photohabdus trong hoạt động sản xuất nông nghiệp đáp ứng được
yêu cầu có thể sản xuất quy mô lớn, nhanh chóng, hiệu quả cao.
1.3. Nhiệm vụ của nghiên cứu

- Phân lập các chủng thuộc hai chi vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus.
- Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng phân lập được với ba loài vi
khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella và loài nấm Phytophthora tại
hai thời điểm cấy chuyền là sau lần đầu tiên và lần thứ 7 cấy chuyền.
1.4. Các kết quả đạt được của đề tài
- Phân lập được hai chủng vi khuẩn P1 và X1 thuộc hai chi Photorhabdus và
Xenorhabdus.

9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Kết quả khả năng đối kháng cho thấy sự thể hiện khả năng đối kháng của
P1 và X1 với các vi khuẩn, nấm gây hại. Mức đối kháng của mỗi chủng với mỗi
loài thử nghiệm là khác nhau và sau hai thời điểm cấy chuyền là khác nhau.

10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN
----oOo---2.1. Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN)
2.1.1. Khái niệm EPN
EPN viết tắt của từ Entomopathogenic Nematodes, đây là thuật ngữ dùng để
chỉ các loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis,
chúng vừa có khả năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh giết chết côn trùng.
Thực chất các loài tuyến trùng kí sinh này là tổ hợp được hình thành trong tự
nhiên và có sự chuyên hóa cao, trong đó các loài tuyến trùng thuộc giống

Steinernema cộng sinh với vi khuẩn Xenorhabdus, còn Heterorhabditis thì cộng
sinh với vi khuẩn Photorhabdus. Sở dĩ được gọi là cộng sinh vì cả vi khuẩn và
tuyến trùng đều dựa vào nhau để tồn tại, phát triển, sinh sản. Đây là một hiện tượng
cộng sinh bắt buộc, cả tuyến trùng và vi khuẩn không thể tồn tại độc lập trong tự
nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
2.1.2. Vai trò và ưu thế của EPN
Vai trò của EPN được thấy trước tiên như là các thiên địch tự nhiên có tác
dụng điều chỉnh mật độ quần thể côn trùng, trong đó có nhiều loài sâu hại. Thực tế
cho thấy, trong tự nhiên nơi đâu có sự tồn tại của EPN thì nơi đó hầu như không
bùng phát dịch hại do côn trùng gây ra (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
EPN đang nhận được sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
có những ưu thế sau :
a. Phương pháp sử dụng EPN trong phòng trừ sinh học đã được xác nhận là
an toàn với người, động vật và thực vật.
b. EPN có khả năng ký sinh và gây hại trên một diện rộng đối với các loài
sâu hại và côn trùng.
c. Các loài sâu hại và côn trùng không có khả năng kháng lại tổ hợp này.
d. Có khả năng sản xuất sinh khối lớn trong điều kiện in vitro và in vivo.
e. Áp dụng thực tiễn dễ dàng bởi biện pháp và thiết bị phun thuốc chuẩn
đang được sử dụng.

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

f.

Có khả năng kết hợp với nhiều loại thuốc hóa học để tăng hiệu quả sử

dụng.
g. Có khả năng chủ động đi tìm vật chủ và giết chết chúng sau 48h.
h. Tồn tại bền bỉ trong đất và nhân nhanh khi gặp sâu hại nên chỉ cần phun
chế phẩm EPN cho cả một quá trình lâu dài.
i.

Dễ dàng tuyển chọn các chủng đạt yêu cầu theo nhu cầu sử dụng.

2.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng
2.2.1. Phân loại
Tuyến trùng ký sinh côn trùng đã được tìm thấy trong sáu bộ tuyến trùng:
- Aphelenchida
- Diplogasterida
- Mermithida
- Oxyurid
- Rhabditida
- Tylenchida
Trong các bộ trên thì bộ Rhabditida, Mermithida và Tylenchida là quan trọng
nhất.
Trong bộ Rhabditida, tuyến trùng trong hai họ sau đây đã được đề cập:
- Họ Steinernematidae với hai giống Steinernema và Neosteinernema
- Họ Heterorhabditidae với chỉ một giống Heterorhabditis.
Steinernema đã được Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, vì tên
này đã được sử dụng trước đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema,
trước năm 1982 rất nhiều loài của tuyến trùng này có tên khác là Neoaplectana.
Hiện nay có khoảng 56 loài đã được mô tả. Neosteinernema được Nguyễn và Smart
mô tả năm 1994, tuyến trùng này chỉ có một loài và ký sinh trên mối.
Heterorhabditis được Poinar mô tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 loài. Đây được
đánh giá là nhóm tuyến trùng quan trọng nhất trong bảo vệ mùa màng, vì vậy có
nhiều nghiên cứu tập trung về các giống này (Nguyễn Bá Khương).

Vòng đời của EPN khoảng 10 - 12 ngày và trung bình từ một vật chủ cho
khoảng 5×104 ấu trùng tùy thuộc vào loài và trọng lượng vật chủ.
12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 2.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng
Tên

Phân loại

Ngành

Nematoda

Lớp

Chromadorea

Phân lớp

Chromadoria

Bộ

Rhabditida

Phân bộ

Panagrolaimomorpha

Họ
Giống

Steinernematidae
Steinernema

Neosteinernema

Heterorhabditiae
Heterorhabditis

2.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis
Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJs) mang vi khuẩn cộng sinh trong
ruột. Khi vào đến bên trong vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng
sẽ phóng thích các vi khuẩn cộng sinh từ ruột của chúng vào trong máu của côn
trùng. Vi khuẩn sẽ phát triển nhanh nhờ huyết tương của côn trùng tạo ra hiện tượng
ngộ độc máu làm côn trùng chết trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đồng hồ. Vi khuẩn
sẽ phân hủy mô trong cơ thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh
dưỡng để phát triển sang tuổi 4 và thành thành trùng thế hệ 1. Phụ thuộc vào nguồn
dinh dưỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác nhau trong cơ thể côn trùng như
hình 2.1.

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng

a. Chu trình sống khi đầy đủ dinh dưỡng
Khi nguồn thức ăn phong phú thì tuyến trùng sẽ sống theo vòng tròn như
hình 2.1. Trứng của tuyến trùng thế hệ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuyến trùng thế hệ 1 và
chúng lại tiếp tục ăn vi khuẩn để phát triển sang ấu trùng tuổi 2, 3, 4 và thành trùng
thế hệ thứ 2. Thành trùng thế hệ mới sẽ tiếp tục chu trình sống và sinh sản như ở thế
hệ 1.
b. Chu trình sống khi không đủ dinh dưỡng
Khi không có đủ nguồn dinh dưỡng thì tuyến trùng sẽ sống theo chu kỳ ngắn
như vòng nửa vòng cung phía dưới của hình 2.1. Trứng của thành trùng thế hệ thứ 1
sẽ nở ra ấu trùng tuổi 1, từ đây phát triển sang dạng ấu trùng tuổi 2, kế đó sẽ chuyển
sang dạng trung gian giữa ký sinh và tiềm sinh, cuối cùng thành ấu trùng gây
nhiễm, chờ thời cơ để xâm nhập vào vật chủ.
2.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus
Photorhabdus và Xenorhabdus đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây
bệnh với côn trùng cũng như cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng. Đây được đánh
giá là hai chi vi khuẩn đặc biệt nhất trong giới vi sinh vật khi cộng sinh với một vật
chủ là tuyến trùng và ký sinh gây hại với một vật chủ khác là côn trùng (Steven
Forst và David Clarke, 2011).
Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng thuộc hai chi Photorhabdus và
Xenorhabdus thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột).
2.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae là một họ vi khuẩn lớn, gồm trên 100 loài mang những
đặc điểm cơ bản sau:
a. Nơi cư trú
Họ vi khuẩn đường ruột gồm những vi khuẩn thường trú trên cơ thể, ở ống
tiêu hóa của người và động vật, có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh.
b. Hình thái

14

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn, không sinh
nha bào. Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số
vi khuẩn khác di động (E. coli, Salmonella) nhờ có tiên mao ở xung quanh thân tế
bào. Một số giống có vỏ nhìn thấy được nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella.
c. Sinh lý
Các vi khuẩn đường ruột là gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, phát triển
được trên các môi trường nuôi cấy thông thường.
d. Tính chất sinh hóa
Lên men glucose, có sinh hơi hoặc không sinh hơi, oxidase âm tính, hầu hết
catalase dương tính, khử nitrate thành nitrite.
Lên men một số đường như glucose, galactose hoặc không lên men một số
đường như lactose, manose, saccharose.
Có thể có một số enzyme như urease, tryptophanase.
Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có lưu
huỳnh.
2.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus
Bảng 2.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus
Phân loại

STT
1

Giới

Bacteria

2

Ngành

Proteobacteria

3

Lớp

Gramma proteobacteria

4

Bộ

Enterobacteriales

5

Họ

Enterobacteriaceae

6

Chi

Photorhabdus

Xenorhabdus

Hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có mối quan hệ với nhau, có thể thấy
mối quan hệ giữa hai chi qua hình 2.1.

15


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus

2.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản
Đây là hai chi có sự tương tự cả về hình thái, sinh lý và sinh hóa, tuy nhiên
có thể phân biệt chúng theo một số đặc điểm cơ bản được nhắc đến trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus
STT
1

Đặc điểm
Trình tự 16S rRNA

Photorhabdus

Xenorhabdus

Tại vị trí 208 – 213

Tại vị trí 208 – 211

TGAAAG

TTCG

Tế bào có hình que, kích Tế bào có hình que và
2

Đặc điểm hình thái

thước vào khoảng (0,5 - 2 × kích thước là (0,3 - 2 × 2 –
1 – 10 µm)
16

10 µm)


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phát triển tối ưu ở 280C,
3

Điều kiện nuôi cấy

một vài chủng phát triển ở
37 - 380C.

Loài vật chủ cộng

5

sinh

Điều kiện phát triển tốt
nhất là 280C hoặc nhỏ
hơn, một vài chủng phát
triển ở 40C.

Heterorhabditis

Steinernema

Ngoài ra còn có một số đặc điểm cơ bản khác về mặt sinh hóa thì tùy thuộc
từng loài và chủng cụ thể.
a. Đặc điểm sinh lý nổi bật
Photorhabdus và Xenorhabdus là Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có cả hai quá
trình lên men và hô hấp trong tế bào.
Đặc điểm nổi bật nhất phải nhắc đến là hiện tượng biến đổi pha, đây được coi
là một hiện tượng rất độc đáo trong hai chi vi khuẩn này.
 Hiện tượng biến đổi pha:
Đây là thuật ngữ để chỉ giai đoạn biến đổi tự nhiên xảy ra ở một số vi khuẩn
về một số điểm như hình thái, màu sắc, tính chất hóa lý trong tế bào vi khuẩn.
Nguyên nhân do biến đổi trong cấu trúc DNA đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của
các protein mà chúng tổng hợp ra điều này làm thay đổi các kiểu hình và kháng
nguyên ở pha thứ cấp. Đối với vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus, pha I (sơ
cấp) là dạng tế bào tự nhiên có quan hệ với tuyến trùng, còn pha II (thứ cấp) có thể
xuất hiện một cách tự phát khi vi khuẩn đi vào pha cân bằng không tăng trưởng.
 Đặc điểm của hai pha:
Đặc điểm trước tiên để dễ dàng phân biệt hai pha là khả năng hấp thu màu
môi trường để tạo màu khuẩn lạc ở pha sơ cấp nhưng ngược lại pha thứ cấp lại
không thể hấp thu màu nên không tạo màu đặc trưng như pha I. Một đặc điểm rất

quan trọng khác là khả năng sinh enzyme và chất kháng sinh mạnh ở pha I nhưng
hầu như không có ở pha II. Có thể thấy được một số các đặc điểm khác nhau cơ bản
ở bảng 2.4.

17


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 2.4. Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của Xenorhabdus /
Photorhabdus
Đặc điểm

Dạng sơ cấp

Dạng thứ cấp

Hình thái khuẩn lạc trên Tròng, lồi, dạng hạt, màu Phẳng, trong mờ, cạnh đều.
đục, cạnh không đều.

nutrient agar

Hình thái khuẩn lạc trên Các khuẩn lạc hút nước, có Không xốp, màu đỏ, trung
màu đỏ trung tính, đỏ, đỏ tính, trắng, vàng.

MacConkey

hồng.
Hình thái khuẩn lạc trên Dạng xốp, xanh dương, Không có dạng xốp, màu
oliu hoặc xanh lá.

NBTA

đỏ hoặc nâu sẫm.

Xung quanh khuẩn lạc có Không tạo thành vùng
vùng trong, một phần agar trong suốt bao quanh.
bị biến màu.
Sắc tố tạo thành trong môi Phụ thuộc chủng và môi Phụ thuộc chủng và môi
trường lỏng

trường. Ở P. luminesens có trường. Thường có màu
màu thay đổi từ tím đến vàng thẫm, da cam. Màu
màu tía khi tăng nồng độ thay đổi không mạnh khi
thêm NaOH do nồng độ sắc

NaOH.

tố thấp.
Hình dạng và hình thái tế Tế bào dạng que, kích Tế bào tương đối dài, kích
bào

thước nỏ đến trung bình thước nhỏ đến trung bình
(dài 3 - 5
2

, rộng 1,5 – (6-7

, rộng 1 - 1,5

).

). Cơ thể có thể vùi Cơ thể ít có thể vùi

hình oval hoặc hình vuông.
Phát

huỳnh

quang

ở Dương tính

Âm tính

Hoạt tính kháng khuẩn

Dương tính

Âm tính

Photorhabdus
Sinh trưởng của tuyến Tuyến trùng sinh trưởng Nhân giống tuyến trùng
trùng trong nhân nuôi vi tốt, tăng nhanh kích thước, khó khăn, sinh trưởng đình
khuẩn

số lượng thế hệ sau và khả trệ, chết nhiều.
năng sống sót.
18

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Vai trò của hai pha:
Pha I (pha sơ cấp):
Tế bào vi khuẩn
cộng sinh

Tạo các enzyme
ngoại bào

Tạo các chất kháng
sinh

Cung cấp dinh
dưỡng

Bảo vệ xác côn
trùng

Hình 2.3. Vai trò của pha I

Đây là pha được coi là đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh
đối với côn trùng gây hại và cung cấp dinh dưỡng để tuyến trùng phát triển, sinh
sản. Pha I có rất nhiều enzyme như protease, lipase, lecithinase, các enzyme này
đóng vai trò trong việc phá vỡ các đại phân tử trong cơ thể côn trùng để cung cấp
dinh dưỡng cho sự phát triển của chính nó và tuyến trùng. Mặt khác, có rất nhiều
các hợp chất kháng sinh đã được tìm thấy ở pha này, chúng có nhiệm vụ tấn công
côn trùng và bảo vệ xác côn trùng khỏi sự xâm nhập của các loài vi sinh vật cạnh
tranh chất dinh dưỡng ở xác côn trùng.

Tế bào vi khuẩn
cộng sinh

Biến đổi kháng
nguyên

Tránh hàng rào
miễn dịch vật chủ
Hình 2.4. Vai trò của pha II

19


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Pha II (thứ cấp):
Ở pha thứ cấp có sự giảm mạnh của việc sản xuất phospholipase, lipase,
siderophores, khó di động hơn (N. Boemare và R.J. Akhurst, 1988; A. Givaudan
và cộng sự, 1995). Như vậy, pha II không đóng vai trò trong việc gây độc cho
côn trùng hay cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng, điều này có thể giải thích
một phần lý do tại sao tuyến trùng không sinh sản và phát triển hiệu quả khi tế
bào pha II chiếm đa số trong xác côn trùng (R.J. Akhurst và N. E. Boemare.
1990). Tuy nhiên việc biến đổi sang pha II giúp vi khuẩn tránh được hàng rào
miễn dịch của vật chủ nhờ việc đột biến ở trên DNA mã hóa cho protein kháng
nguyên, kết quả là sự biến đổi kháng nguyên của chúng (A. Barbour 2002).
b. Đặc điểm hình thái nổi bật
* Khuẩn mao:
Khuẩn mao là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn, cứng, mọc quanh bề mặt tế
bào nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có đường kính khoảng 7 - 9 nm, rỗng ruột
(đường kính trong là 2 - 2,5 nm), số lượng khoảng 250 - 300 sợi/vi khuẩn, có một

tiểu đơn vị lớn hơn 17 kDa, vai trò chính là giúp vi khuẩn bám dính. Khuẩn mao
của vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus được đánh giá có vai trò trong gây độc
vì bám vào tế bào, mô côn trùng tạo điều kiện cho các yếu tố gây độc khác hoạt
động.
* Tiên mao:
Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy
rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng, vai trò chính là giúp cho vi khuẩn vận động.
Mặt khác, chúng đóng một vai trò quan trọng trong gây độc vì nó sẽ đưa vi khuẩn
đến những vị trí thích hợp để gây bệnh, né tránh những vị trí bất lợi và tìm đến các
nguồn dinh dưỡng.
Trong hầu hết chủng X. nematophila đã được kiểm tra, tế bào sơ cấp đều thể
hiện hai đặc tính là di động và quần tụ bầy đàn trong khi tế bào thứ cấp không có
tiên mao và không thể di động. Trong một nghiên cứu để tìm ra nguyên nhân thiếu
tiên mao trong tế bào thứ cấp, Givaudan và cộng sự (1996) tách dòng gen mã hóa
20


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

tiên mao fliC và filD của X. nematophila cho thấy fliCD operon không bị thay đổi
trong tế bào thứ cấp nhưng không được sao chép. Sự sao chép của fliCD operon bị
điều khiển bởi flhDC (đây là operon ở Enterobacteriaceae kiểm soát sự biểu hiện
của hơn 50 gen mã hóa chức năng tiên mao). Việc không có tiên mao ở tế bào thứ
cấp là do thiếu yếu tố sigma fliA đây là yếu tố cần cho việc sao chép của fliCD.
c. Đặc điểm sinh hóa
* Photorhabdus
Các đặc tính sinh hóa có sự khác nhau giữa các chủng của chi Photorhabdus,
hầu hết âm tính trong các mô tả của Enterobacteriaceae
Bảng 2.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus
Kết quả

Tên thử nghiệm



Pha I

 Catalase




Pha II
+

Khử nitrate

-

Thủy phân gelatine

+

Tan huyết cừu

Hầu hết +

Tan máu ngựa

Hầu hết +

 Phân giải tween 20
 Tween - 40, 60, 80 và 85

+
Hầu hết +

 Acid hóa fructose, D - mannose, maltose,

Hầu hết +

ribose, N – acetylglucosamine
Lên men từ glycerol

+ yếu

Nguồn cacbon và năng lượng từ fumarate,

+

glucosamine, L - glutamate, L - malate, L proline, Succinate, L – tyrosine
Phát quang

+

+ yếu

Hấp thu màu môi trường

+

-

* Xenorhabdus
Xenorhabdus âm tính với hầu hết thử nghiệm của Enterobacteriaceae.

21


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 2.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus
Kết quả

Tên thử nghiệm

Pha I

Pha II

Catalase

+

Khử nitrate

-

Thủy phân gelatine

+

Tan huyết cừu

Hầu hết +

Tan máu ngựa

Hầu hết +

Phân giải tween 20

+

Tween - 40, 60, 80 và 85

Hầu hết +

Acid hóa glucose

+

Di động

+

+ yếu

Hấp thu màu môi trường

+

-

Kháng sinh

+

-

d. Đặc điểm một số loài đã được nghiên cứu
* Photorhabdus
Photorhabdus được nghiên cứu khá nhiều nhưng tập trung chủ yếu vào P.
luminescens và P. temperata. Bảng 2.7 nêu một số đặc điểm cơ bản của các loài
này.

22


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 2.7. Đặc điểm của một số loài Photorhabdus
Thử nghiệm

P.
luminescens

P.
luminescens

P. luminescens
laumondii

luminescens

H.
Phân lập

Heterorha

bacteriopho

bditis spp.

ra nhóm
Brecon

P.
luminescens
akhustii

H.
bacteriophor

P. temperata

H. indica

a nhóm HP88

Heterorhabdi
tis spp.

Nhiệt độ (0C)

35 - 39

38 - 39

35 - 36

38 - 39

33 - 35

Hấp thụ màu

+

+

+

+

+

Kháng sinh

+

+

+

+

+

Indole

+

+

+

d

[-]

Simon’s citrate

d

+

D

d

d

+

+

+

+

[+]

d

-

[+]

d

d

[-]

-

D

-

[+]

[-]

-

D

-

[-]w

Myo- inositol

d

+

[+]

[+]

dw

d- mannitol

d

dw

-

+

[-]

L-fucose

d

d

-

[+]

d

lecithinase

+

+

+

+

+

d

+

[-]

+

+

d

+

-

d

+

Phân hủy
aesculin
Urease
Phenylalanine
deaminase
Tryptophan
deaminase

Phân hủy máu

cừu
Phân hủy máu
ngựa

Nguồn: Entomopathogenic Nematology (2011)

23


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

* Xenorhabdus
Xenorhabdus có vai trò rất quan trọng trong các ứng dụng bảo vệ thực vật vì
vậy có rất nhiều nghiên cứu về các loài của chi này. Các đặc điểm cơ bản được thấy
trong bảng 2.8.
Bảng 2.8. Đặc điểm của một số loài Xenorhabdus
Thử
nghiệm

Nguồn
phân lập

Sản xuất
acid từ

Sử dụng

Nội dung

X.

nematophila

X. bovienii

X.
poinarii

X.
beddingii

X.
japonica

S. carpocapsae

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

35

32

40

39

35

+

+

-

+

-

d

D

D

+

d

ow

Y

Br

lb

yb

+

+

+

+

-

-

-

D

+

-

d

[-]

[-]

-

dw

-

+

-

+w

-

+w
+
+w
-

dw
+
[+]
+
+
dw
[+]
[+]

[-]
[+]
-

+
+
+
+
+
+

-

S. feltiae, S.
intermedium,
S. affine, S.
kraussei
S. glaseri, S.
cubanum
Steinernema
spp. chưa được

mô tả
S. kushidai
Nhiệt độ tối ưu
để phát triển
Gây độc cho
lepidopteran
Di động
Hấp thụ màu
sắc
Simmon’s
citrate
Phân giải
aesculin
Phenylalanine
deaminase
Tryptophan
deaminase
Myo-inositol
Ribose
Salicin
Diaminobutane
D,L-Glycerate
L(-)Histidine
Myo-inositol
Ribose
L-Tyrosine

24