Nghiên cứu sản xuất natade coco

tên đề tài.txt
Nghiên cứu sản xuất Natade Coco
(Giảng viên hướng dẫn:TS. Phan Ngọc Hòa)
SV: Nguyễn Thị Như Yến
MSSV: 0851110308
Lớp: 08DSH4

Page 1


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
- Sản phẩm Nata de coco là một món ăn quen thuộc của người Việt Nam.
Không chỉ ở Việt Nam mà ở các nước khác như Phillipin, Nhật Bản, Mỹ, Hàn Quốc
cũng xem Nata de coco là một món ăn tráng miệng ưa thích vừa thơm ngon, bổ
dưỡng lại còn có tác dụng tốt đối với sức khỏe. Giá thành sản phẩm cũng khá rẻ, dễ
dàng tiếp cận với người tiêu dùng. Do đó, thị trường Nata de coco là một thị trường
vô cùng tiềm năng.
- Dựa trên những lý do trên, nhóm thực hiện đề tài đã tiến hành nghiên cứu để
tìm ra những điều kiện tối ưu cho sản xuất Nata de coco thích hợp với điều kiện tại
Việt Nam.
- Ngoài ra, nhóm thực hiện đề tài nhận thấy sản phẩm Nata de coco trên thị
trường thường chỉ có màu trắng đục không được thu hút về giá trị cảm quan, do đó
nhóm thực hiện đề tài muốn cải tiến sản phẩm bằng cách tạo màu sắc hấp dẫn cho
sản phẩm Nata de coco từ các chất màu tự nhiên. Nhóm thực hiện đề tài đã tiến
hành các khảo sát để chọn ra nguyên liệu chất màu tự nhiên phù hợp với Nata de
coco về giá trị cảm quan.
1.2. Tình hình nghiên cứu
- Năm 1886, lần đầu tiên nhà bác học Brown đã báo cáo về sự tổng hợp lớp

màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum. Mặc dù vậy, đến nửa sau thế kỷ
XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi BC. Đầu tiên Hestrin và
cộng sự (1943, 1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A.
xylinum. Ông chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng glucose và O2 để tổng
hợp cellulose. Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được
Acertobacter tổng hợp trong môi trường có glucose và ATP. Cùng với sự tiến bộ
của khoa học kỹ thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu rõ.

-1-


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

- A.xylinum sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường nước dừa, tạo thành một
lớp cellulose màng mỏng, nhầy và trong suốt trên bề mặt môi trường. Miếng
cellulose được rửa sạch và nấu trong nước trước khi nấu trong syrup. Nata de coco
thu được có độ ẩm hơn 90 % và được dùng làm món tráng miệng, cocktail trái cây
và rau câu trái cây.
- A.xylinum phân bố rộng khắp trong thiên nhiên và là một chất gây ô nhiễm
phổ biến trong công nghiệp sản xuất giấm từ A.aceti. A.xylinum được phân lập từ
trái cây mục nát (Lapuz và cộng sự, 1967), rau quả và nước dừa lên men (de
Gallardo và cộng sự, 1971). Nhiều chủng A.xylinum có khả năng sản xuất cellulose
với lượng không ổn định và phát triển trên bề mặt cơ chất khác nhau như
glucose,sucrose, fructose, đường chuyển hóa, ethanol và glycerol (White và Brown,
1989). [6]
- Cellulose sản xuất bởi A.xylinum phát triển tốt cả trong môi trường tĩnh và
động (Chao và cộng sự, 2000; Toyosaki và cộng sự, 1995; de Gallardo và cộng sự,
1971) và chịu ảnh hưởng của loại và nồng độ đường, nguồn nitơ và pH (Embuscado
và cộng sự, 1994). [6]
- A.xylinum có khả năng phát triển tốt ở pH thấp khỏang 3.5 (Lapuz và cộng

sự, 1967) và Verschuren và cộng sự (2000) đã báo cáo là pH 4.0 và 5.0 là điều
kiện lý tưởng cho sự phát triển cellulose. [6]
- Là cellulose vi khuẩn, Nata de coco có tính háo nước cao, có khả năng giữ
nước gấp 100 lần trọng lượng của nó. Khả năng giữ nước là một đặc tính vật lý –
một khả năng của cấu trúc thực phẩm ngăn không cho nước thoát ra ngoài do cấu
trúc không gian 3 chiều (Hermansson 1986). Đây là một đặc tính quan trọng của
cellulose. [6]
- Độ dày của nata ảnh hưởng đến khả năng giữ nước sẽ làm biến đổi cấu trúc
vật lý và đặc tính cảm quan. Ảnh hưởng của những điều kiện chế biến đến thuộc
tính vật lý của Nata de coco được nghiên cứu bởi Chung và Shyu (1999). [6]
- Theo nghiên cứu của A.Jagannath và cộng sự (2008), khối lượng và độ dày
thạch là tối ưu nhất ở pH 4,0, nồng độ sucrose 10%, (NH4)2SO4 0,5%.

-2-


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

1.3. Mục đích nghiên cứu
- Hoàn thiện quy trình sản xuất Nata de coco.
- Tối ưu hóa điều kiện lên men Nata de coco.
- Chọn lựa nguyên liệu tạo màu tự nhiên phù hợp về giá trị cảm quan cho sản
phẩm Nata de coco.
1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Khảo sát tỷ lệ giống và hàm lượng đường saccharose bổ sung ảnh hưởng đến
khối lượng khô Nata de coco thu được.
- Tối ưu hóa thực nghiệm tỷ lệ giống và hàm lượng saccharose bổ sung đến
khối lượng khô của cellulose thu được.
- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý, cảm quan và vi sinh cho sản phẩm Nata de
coco.

- Khảo sát giá trị cảm quan của 3 loại nguyên liệu tạo chất màu tự nhiên: lá
dứa, lá cẩm và đài hoa bụp giấm để tạo màu cho sản phẩm Nata de coco.
1.5. Phương pháp nghiên cứu
- Tiến hành khảo sát tỷ lệ giống và hàm lượng đường saccharose bổ sung ảnh
hưởng đến khối lượng cellulose khô thu được bằng phương pháp đo mật độ tế bào
(đo OD) sau mỗi 24h trong vòng 7 ngày và khối lượng khô cellulose thu được sau 7
ngày lên men.
- Tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm tỷ lệ giống và hàm lượng saccharose bổ
sung đến khối lượng khô của cellulose thu được bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm với sự hỗ trợ của phần mềm Statgraphic Plus.
- Tiến hành khảo sát giá trị cảm quan của 3 loại nguyên liệu tạo chất màu tự
nhiên: lá dứa, lá cẩm và đài hoa bụp giấm để tạo màu cho sản phẩm Nata de coco
bằng cách thành lập hội đồng cảm quan 20 người cho điểm mức độ ưa thích theo
thang điểm từ 1 - 7 giành cho các chỉ tiêu: cấu trúc, màu sắc, mùi, vị.

-3-


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

1.6. Các kết quả đạt được của đề tài

- Nhóm thực hiện đề tài đã thu được kết quả là với tỷ lệ giống 7,4 % và nồng
độ đường saccharose bổ sung 4,95 % cho khối lượng cellulose cao nhất.
- Sau khi tiến hành nhuộm màu và thực hiện cảm quan trên 20 người, nhóm
thực hiện đề tài đã thu được kết quả là sản phẩm Nata de coco bắt màu đều và tốt
với màu của lá cẩm cho ra sản phẩm có màu tím rất đẹp, và có mùi hương khá tốt
nên sản phẩm Nata de coco nhuộm màu bằng lá cẩm khá phù hợp với thị hiếu của
người tiêu dùng, có thể phát triển sản phẩm và tung ra ngoài thị trường.

1.7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
- Đồ án bao gồm 5 chương:
 Chương 1: Mở đầu
- Nhóm thực hiện đề tài đã nêu ra tính cấp thiết của đề tài, nhu cầu thị trường
đầy tiềm năng của sản phẩm Nata de coco từ đó có thể thấy việc đi sâu nghiên cứu
điều kiện tối ưu cho quá trình lên men Nata de coco và cải tiến sản phẩm là hết sức
cần thiết cho ngành thực phẩm nước ta.
 Chương 2: Tổng quan tài liệu
- Nhóm thực hiện đề tài đã giới thiệu sơ lược về sản phẩm Nata de coco và quy
trình sản xuất Nata de coco. Đồng thời giới thiệu về 3 nguyên liệu tạo chất màu tự
nhiên: lá dứa, lá cẩm và đài hoa bụp giấm.
 Chương 3: Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Nhóm thực hiện đề tài nêu ra các phương pháp và cách thức các tiến hành
khảo sát, tối ưu hóa thực nghiệm điều kiện lên men: tỷ lệ giống, nồng độ đường
saccharose đến khối lượng cellulose thu được.
- Nhóm thực hiện đề tài nêu ra phương pháp tiến hành các xác định lý hóa và
đưa ra phương pháp cảm quan sản phẩm.
 Chương 4: Kết quả và thảo luận
- Nhóm thực hiện đề tài trình bày kết quả thu được từ đó đưa ra những nhận xét
và thảo luận về kết quả đề tài từ đó đưa ra những phương pháp giải quyết phù hợp.

-4-


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

 Chương 5: Kết luận và kiến nghị
- Kết luận lại kết quả cuối cùng của đề tài nghiên cứu và đưa ra những kiến
nghị để đưa ra những giải pháp thích hợp để cải tiến sản phẩm Nata de coco tốt hơn.

-5-


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Nata de coco
2.1.1. Khái niệm Nata de coco

- Thạch dừa (Nata de coco) là một loại thức ăn phổ biến, có nguồn gốc từ
Philippin, được tạo ra từ sự lên men nước dừa bởi vi khuẩn Acetobacter xylinum.
- Đây là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ
cellulose vi khuẩn. Sản phẩm thạch dừa là một món ăn tráng miệng dai, trong suốt
và rất ngon.
- Hiện nay, không chỉ người dân ở Philippine mà người dân ở các nước khác
trên thế giới cũng rất thích món ăn này đặc biệt là người Nhật Bản. Năm 1992,
thạch dừa bắt đầu được giới thiệu ở Nhật bản như một sản phẩm thực phẩm ăn
kiêng cho các cô gái trẻ. Năm 1993, thạch dừa từ Philippine được xuất khẩu sang
Nhật Bản.
- Người Nhật cho rằng thạch dừa có thể giúp cơ thể con người chống lại bệnh
ung thư ruột kết. Trong thạch dừa có hàm lượng chất xơ cao rất tốt cho hệ thống
tiêu hoá. Thạch dừa cung cấp ít năng lượng và không chứa cholesterol.
- Thạch dừa là thức uống giải khát có tác dụng nhuận tràng, kéo dài sự trẻ

trung. Ngoài ra, thạch dừa còn làm màng trị vết bỏng, làm giá thể nuôi cấy vi sinh
vật thay cho môi trường agar. Trong một đề tài nghiên cứu gần đây, từ vi khuẩn
Acetobacter xylinum của thạch dừa, có thể tạo ra màng cellulose vi khuẩn (Bacterial

-6-

Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

cellulose-BC), có độ chịu lực cao và không bị biến tính khi xử lý nhiệt. Sử dụng
màng BC làm màng bao xúc xích, làm màng bảo quản dừa tươi thay cho hóa chất.
Trong tương lai, thạch dừa cũng vẫn sẽ là đề tài để các nhà khoa học tiếp tục nghiên
cứu.
2.1.2. Cấu trúc của Nata de coco
- Bản chất của thạch dừa (Nata de coco) là một màng nhày Bacterial Cellulose
(BC) có cấu trúc là hemicellulose. Do thạch dừa có bản chất là polysaccharide ngoại
bào nên có khả năng ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau. Cho đến nay, việc
ứng dụng thạch dừa trong thực phẩm mới chỉ dừng lại ở những sản phẩm kẹo, jelly,
các sản phẩm giải khát.
- Cellulose (C6H10O5)n là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc
glucopyranose nối với nhau bởi nối -1,4.

Hình 2.1. Cấu trúc cellulose
- Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy, BC có cấu trúc hóa học giống y hệt
PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính
của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành nên
các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khỏang 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có
nguồn gốc tự nhiên (Kudlicka, 1989). Các sợi sơ cấp kết lại thành các vi sợi
(microfibril) (Jonas và Farah, 1998). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối
cùng hình thành các dải (ribbon) (Yamanaka và cộng sự, 2000). Các dải có chiều
dày 3 – 4 nm  chiều rộng 70 – 80 nm (Zarr, 1977); 3,2  133 nm (Brown và cộng
sự, 1976); 4,1  117 nm (Yumanaka và cộng sự, 2000). Trong khi chiều rộng của
các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30,000 – 75,000 nm hay gỗ bulô

-7-

Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

(Betula) là 14,000 – 40,000 nm. Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay
đổi từ 1 – 9 m làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối
hydrogen. BC khác với PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa; thường BC
có mức polymer hóa từ 2,000 – 6,000 (Jonas và Farah, 1998); một vài trường hợp
đạt tới 16,000 – 20,000 (Watanabe và cộng sự 1998b), trong mức polymer hóa của
thực vật là 13,000 – 14,000 (Teeri, 1997).
- Cấu trúc mạng polysaccharide của thạch dừa: Thạch dừa có cấu trúc mạng là
các polysaccharide, chúng sắp xếp không theo trật tự, không theo quy luật, chúng
đan xenvào nhau rất chằng chịt theo mọi phía. Do trong quá trình lên men, các vi
khuẩn Acetobacter xylinum đã chuyển động hỗn loạn không theo quy luật. Đó là
nguyên nhân tạo nên tính dai và chắc về mọi phía của miếng thạch. Bên cạnh đó,
mạng luôn luôn ngậm một lượng nước đáng kể (99 %).
- Cấu trúc BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy (Watanabe và cộng
sự, 1998a; Yamanaka và cộng sự, 2000). Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tổng
hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt
dịch lỏng và không khí giàu oxy. Các miếng BC này được gọi là BC trên môi
trường tĩnh (S-BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ
những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi,
và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi
trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống
đỡ cho quần thể tế bào A.xylinum (Jonas và Farah, 1998). Các sợi BC kế nhau được
tạo ra từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ
môi trường lắc (A-BC: Agitated – BC). A-BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ,
các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường (Vadamme
và cộng sự 1998). Các sợi đan lưới với nhau trong môi trường lắc giống như mô
hình kẻ ô, có cả 2 hướng song song và vuông góc (Watanabe và cộng sự, 1998).
- Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân

biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ, và tia hồng ngoại (Jonhson và

-8-


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

Neogi, 1989). Cellulose I có thể được chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II
thì không thể chuyển thành cellulose I.

Hình 2.2. Cấu trúc cellulose (a) của vi khuẩn (BC) (20000 lần) và (b) của
thực vật (PC) (200 lần)

Hình 2.3. Vi khuẩn Acetobacter xylinum đang sản xuất cellulose

-9-


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

Hình 2.4. Màng cellulose do vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo ra
2.1.3. Nguyên liệu trong sản xuất Nata de coco
- Dừa (Cocos nucifera), là một loài cây trong họ Cau (Arecaceae). Nó cũng là
thành viên duy nhất trong chi Cocos và là một loại cây lớn, thân đơn trục (nhiều khi
gọi là nhóm thân cau dừa) có thể cao tới 30 m, với các lá đơn xẻ thùy lông chim 1
lần, cuống và gân chính dài 4 – 6 m các thùy với gân cấp 2 có thể dài 60 – 90 cm; lá
kèm thường biến thành bẹ dạng lưới ôm lấy thân; các lá già khi rụng để lại vết sẹo
trên thân. [11]
 Phân loại khoa học [11]

 Giới (regnum):

Plantae

 Bộ (ordo):

Arecales

 Họ (familia):

Arecaceae

 Phân họ (subfamilia): Arecoideae
 Chi (genus):

Cocos

 Loài (species):

C. nucifera

- 10 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

Bảng 2.1. Thành phần và khối lượng các bộ phận trên trái dừa nặng 1.2 kg
Bộ phận

Trọng lượng ( kg ) % Khối lượng

Vỏ

0,4

33

Gáo

0,18

12

Nước dừa

0,26

25

Cơm dừa

0,36

30

Dầu dừa

0,12

Bã dừa

0,06

Ẩm

0,18

- Nước dừa là chất lỏng, trong, chứa trong quả dừa. Khi quả dừa già đi, nước
dừa được thay thế bởi cùi dừa và không khí. Quả dừa non chứa rất ít cùi dừa, và lớp
cùi này mỏng, rất mềm và khá trong. Nước dừa được dùng làm đồ uống phổ biến ở
các nước nhiệt đới, đặc biệt là vùng Đông Nam Á, các đảo Thái Bình Dương và
Caribe.
- Nước dừa là thức uống tự nhiên không chứa chất béo, ít năng lượng (16,7
kcal/100 g hay 70 kJ/100 g). Trung bình một trái dừa có chứa 300 ml nước, chiếm
25% trọng lượng trái dừa. Nước dừa là loại nước giải khát phổ biến vì chứa nhiều
chất dinh dưỡng như: đường, protein, lipid, vitamin, và khoáng nhưng với nồng độ
rất loãng. Nước dừa cũng được sử dụng làm dịch truyền tại một số nước khi không
có sẵn nước muối y khoa.
Bảng 2.2. Thành phần hoá học của nước dừa
STT

Thành phần

Khối lượng

1

Chất khô

4,71

2

Đường tổng số

2,08

3

Tro

0,02

4

K

3,12

- 11 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

5

Na

1,5

6

Ca

2,9

7

Mg

3,0

8

Fe

0,01

9

Cu

0,04

10

P

3,7

11

S

3,4

12

Protein

0,55

13

Dầu béo

0,74

14

Tỷ trọng

1,02

Bảng 2.3. Bảng so sánh thành phần hóa học của nước dừa già và nước dừa non
(Nguồn: Satyavati Krishnankutty - 1987)
Nước dừa già

Nước dừa

Nước dừa

Nước dừa

non

già

non

Chất khô (%)

5,4

6,5

K(mg%)

247,0

290,0

Đường khử (%)

0,2

4,4

Na (mg%)

48,0

42,0

Khoáng (%)

0,5

0,6

Mg (mg%)

15,0

10,0

Protein (%)

0,1

0,01

P (mg%)

6,3

9,2

Chất béo (%)

0,1

0,01

Fe (mg%)

79,0

106,0

Acid (mg%)

60,0

120,0

Cu (mg%)

26,0

26,0

pH

5,2

4,5

- 12 -

Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

Bảng 2.4. Hàm lượng vitamin có trong nước dừa (mg/l)
(Nguồn: The Wealth of India – 1950)
STT

Vitamin

Hàm lượng (mg/l)

1

Acid ascorbic

0,0022 – 0,0037

2

Panthothenic

0,52

3

Acid nicotinic

0,64

4

Thiamin

Vết

5

Acid folic

0,003

6

Riboflavin

<0,001

7

Biotin

0,02

8

Pyridoxine

Vết

Bảng 2.5. Hàm lượng acid amin có trong nước dừa

(Nguồn: Pradera et at -1942)
STT

Acid amin

Hàm lượng (% khối
lượng/amin tổng số)

1

Acid glutamic

9,76 – 14,5

2

Arginine

10,75

3

Leucine

1,95 – 4,18

4

Lysine

1,95 – 4,57

5

Proline

1,21 – 4,12

6

Aspartic

3,6

7

Tyrosine

2,83 – 3

8

Alamine

2,41

9

Histidine

1,95 – 2,05

10

Phenyl alanin

1,23

11

Serine

0,59 – 0,91

12

Cystein

0,97 – 1,17

- 13 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

- Trong sản xuất thạch dừa, chúng ta sử dụng nước dừa già. Vì nước dừa già
tuy không còn độ đường nhiều như dừa non nhưng vẫn còn giữ được hàm lượng các
chất khoáng. Nước dừa già được xem là một phế phẩm của các nhà máy cơm dừa
nạo sấy, cơ sở sản xuất kẹo dừa, kẹo chuối, mứt, bánh phồng…có giá thành rẻ thích
hợp sử dụng để sản xuất thạch dừa.

 Tiêu chuẩn chọn lựa nguyên liệu:
- Vì nước dừa già là phế phẩm của các nhà máy nạo sấy cơm dừa, do đó trong
quá trình vận chuyển nước dừa già từ xưởng sản xuất đến xưởng chế biến thạch dừa
ngoài việc phải đảm bảo vấn đề vi sinh, ta cần chú ý đến các tiêu chuẩn sau:
+ Nước dừa sử dụng trong công nghệ sản xuất thạch dừa phải là nước dừa
già (khỏang 11 tháng tuổi).
+ Nước dừa trong, không có mùi hay màu lạ.
2.2. Vi sinh vật trong sản xuất Nata de coco
- Giống vi sinh vật dùng trong sản xuất thạch dừa là Acetobacter xylinum.
2.2.1. Đặc điểm
- Acetobacter xylinum là một vi khuẩn ưa nhiệt độ trung bình không gây bệnh
được xác định bởi AJ Brown vào năm 1886 do nó có khả năng sản xuất cellulose .
Trong tự nhiên A. xylinum được tìm thấy trong đất và thường thấy trên trái cây rụng
mục nát.
- A.xylinum là loại vi khuẩn hình que dài khoảng 2μm, đứng riêng lẽ hoặc xếp
thành chuỗi, có khả năng di động nhờ tiên mao, không sinh bào tử. Chúng là vi
khuẩn gram âm nhưng gram của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do
điều kiện môi trường. Chúng là loài vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng
trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và khí.
- Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ,
nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 – 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành
từng cụm, và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy.

- 14 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

- Có khả năng tạo váng hemicellulose khá dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod
và H2SO4.

- Do có khả năng đặc biệt sản xuất cellulose nên chúng là một sự lựa chọn phổ
biến cho các nhà khoa học nghiên cứu để sinh tổng hợp cellulose. Là một sinh vật
kiểu mẫu, chúng được sử dụng để nghiên cứu chế độ cellulose được tổng hợp từ
glucose bởi vi khuẩn như A. xylinum và tiềm năng ứng dụng chúng trong công
nghiệp và dệt may.
- A.xylinum sinh trưởng ở điều kiện pH < 5, nhiệt độ khoảng 28 - 32 0C và có
thể tích luỹ 4,5 % acid acetic.
- Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn,
nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép, chúng sẽ quay ngược trở lại làm ức chế
hoạt động của vi khuẩn.
2.2.2. Phân loại
 Chủng Acetobacter xylinum này có nguồn từ Philippin. Acetobacter xylinum
thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì
Acetobacter xylinum thuộc:
 Giới:

Bacteria

 Ngành: Proteobacteria
 Lớp:

Alpha proteobacteria

 Bộ:

Rhodospirllales

 Họ:

Acetobacteraceae

 Giống: Gluconacetobacter
 Loài :

Acetobacter xylinum

2.2.3. Sinh lý, sinh hoá
- Trong tự nhiên A. xylinum được tìm thấy trong đất, đôi khi cộng sinh với
những cây trồng như cây mía hoặc cà phê. Điều kiện sinh trưởng lý tưởng của A.
xylinum: độ pH < 5 ở 30 ˚C trong một môi trường phức tạp bao gồm chủ yếu là

- 15 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

glucose, nhưng các nguồn carbon khác có thể được sử dụng ngay cả trong việc sản
xuất của cellulose.
- A. xylium cho phản ứng catalase dương tính, có khả năng oxy hóa tiếp tục
ethanol thành acid acetic, CO2 và H2O.
- A.xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào
chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển hóa
glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 - 2 đơn vị.
- A.xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy. Trong tế bào vi
khuẩn, glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng
tế bào. Tiền chất này tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với
một enzyme có thể polyme hóa glucose thành cellulose.
- Trong môi trường nuôi cấy A. xylinum thì các sợi nhỏ phát triển dài ra.
- A.xylinum tạo nên lớp cellulose dày là do môi trường nuôi cấy nước dừa có
bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết. Cellulose là những polisaccharide không tan

trong nước mà tan trong môi trường kiềm. Đó cũng là thành phần chính của màng tế
bào thực vật.
-

A. xylinum sống thích hợp ở nhiệt độ 28 - 32 0C. Ở nhiệt độ này quá trình

hình thành các sản phẩm trong đó có thạch dừa là tốt nhất.
Bảng 2.6. Đặc điểm sinh hóa của A. xylinum
STT

Đặc điểm sinh hóa của A. xylinum

Hiện tượng

Kết quả

1

Oxy hóa ethanol thành acid acetic

Acid acetic tạo ra sẽ kết

+

hợp với CaCO2 làm vòng
sáng rộng hơn và tạo lớp
cặn đục rõ
2

Catalase

Sủi bọt khí

+

3

Sinh trưởng trên môi trường Hoyer

Sinh khối không phát

-

triển
4

Chuyển hóa glucose thành acid

Vòng sáng xung quanh
khuẩn lạc

- 16 -

+


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

Chuyển hóa glycerol thành

Vòng CuO xuất hiện

dihydroxyaceton

xung quanh khuẩn lạc

6

Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu

Không thấy sắc tố nâu

7

Kiểm tra tổng hợp cellulose

Váng vi khuẩn xuất hiện

5

+

-

màu lam
2.2.4. Chức năng sinh lý của cellulose đối với A.xylinum
- Trong môi trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharid ngoại
bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào (Costeron, 1999), màng BC là một
ví dụ. Những tế bào vi khuẩn sản xuất cellulose được bẫy bên trong mạng lưới
polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp

giáp giữa môi trường lỏng và không khí (William và Cannon, 1989) (Hình 2.3). Vì
vậy, các chủng vi khuẩn sản xuất BC có thể sống ở những nơi cống rãnh (Jonas và
Farah, 1998). Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt
môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với
khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose (Jonas và Farah,
1998; Costeron, 1999). Một vài tác giả cho rằng, cellulose được tổng hợp bởi
A.xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị
thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo- hay
endo-glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi
cấy một vài chủng A.xylinum sản xuất cellulose (Okamoto và cộng sự, 1994).
- Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi
khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như
giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật gây bệnh.
Các vi khuẩn A.xylinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Có
những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực
tím. Khỏang 23 % số tế bào A.xylinum được bao bọc bởi BC sống sót sau 1h xử lý
tia cực tím. Tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn
3 %. (Ross và cộng sự, 1993).

- 17 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

2.2.5. Sinh tổng hợp BC [10]
- Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa 1 cách
chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, các phức hợp xúc tác
và các protein điều hòa. Tiến trình này bao gồm sự tổng hợp uridine
diphosphoglucose (UDPGlc), tiền chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa
glucose vào chuỗi -1,4-glucan, và sự kết hợp các sợi mới vào dải (ribbon), được

hình thành từ hàng trăm, thậm chí hàng ngàn sợi cellulose riêng lẽ. Con đường và
cơ chế của sự tổng hợp UDPGlc tương đối được biết nhiều, trong khi đó cơ chế
phân tử của sự polymer hóa glucose vào mạch dài và các mạch nhánh, sự đẩy ra bên
ngoài tế bào của chúng, và sự kết hợp thành sợi cần được làm sáng tỏ hơn.
- Cellulose được tổng hợp từ A.xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến
dưỡng carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý tế bào liên quan đến hoặc là chu
trình pentose phosphate hoặc là chu trình Krebs, đi kèm với quá trình sinh tạo
glucose (Ross và cộng sự, 1991; Tonouchi và cộng sự, 1996) (Hình 2.5). Quá trình
glycose giải không hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì nó không tổng hợp được
enzyme quan trọng của con đường này đó là phosphofructose kinase (Ross và cộng
sự, 1991). Ở A.xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với tiến trình dị hóa
oxid hóa và tiêu thụ khỏang 10 % năng lượng có nguồn gốc từ những phản ứng dị
dưỡng (Weinhouse, 1977). Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các quá trình
đồng hóa khác, bao gồm sự tổng hợp protein (Ross và cộng sự, 1991).
- A.xylinum chuyển nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol,
dihydroxyacetone, pyruvate, và các dicarboxylic acid thành cellulose, thường có
hiệu suất 50 %. Dicarboxylic acid đi vào chu trình Krebs nhờ vào quá trình
decarboxyl hóa để thành pyruvate, chuyển thành hexose thông qua con đường sinh
tạo glucose, tương tự đối với glycerol, dihydroxyacetone, và các hợp chất trung gian
của chu trình pentose phosphate.
- Tiền chất trực tiếp của cellulose là UDPGlc (uridine diphosphoglucose), là
sản phẩm của con đường phổ biến ở các vi sinh vật, bao gồm cả thực vật, liên quan
đến sự phosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate, được xúc tác bởi

- 18 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

glucokinase, tiếp đến là quá trình đồng phân hóa hợp chất này thành Glucose--1phosphate, được xúc tác bởi phosphoglucomutase, và cuối cùng chuyển thành

UDPGlc bởi enzyme UDPGlc pyrophosphorylase. Enzyme cuối cùng này dường
như quan trọng liên quan đến quá trình tổng hợp BC, bởi vì một vài đột biến không
tổng hợp cellulose (Cel-) thiếu enzyme này (Valla và cộng sự, 1989). Hơn nữa, hoạt
động của pyrophosphorylase thay đổi ở những chủng A.xylinum khác nhau và hoạt
động cao nhất được phát hiện ở các sinh vật tổng hợp cellulose hữu hiệu nhất, như
A.xylinum spp. Sucrofermentans BPR2001. Chủng này thích sử dụng fructose hơn,
biểu lộ sự hoạt động cao của phosphoglucoisomerase, và có một hệ thống
phosphotransferase. Hệ thống này chuyển fructose thành fructose-1-phosphate và
tiếp đến là fructose-1,6-biphosphate. (Hình 2.5).
Cellulose

Glucose

CS

ATP

UDP-Glc

GK

UGP

ADP
PGM

Glc-1-P

G6PDH
Glc-6-P

PGI

PGA
(NAD, NADP)
Chu trình
Pentose
phosphate

FK
Fructose

PTS

Fru-6-P

ATP

ADP

FBP

1PFK
Fru-1-P

Fru-bi-P

Con đường
sinh glucose

Chu trình

Kerbs

CS: cellulose synthase

PTS: hệ thống của phosphotransferase

GK: glucosekinase

Fru-bi-P: fructose-1,6-biphosphate

- 19 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

FK: fructosekinase

UGP:UDP-glucose

pyrophosphorylase
FBP:fructose-1,6-biphosphate phosphotase

Fru-6-P: fructose-6-phosphate

G6PDH:glucose-6-phosphate dehydrogenase Glc-6-P: glucose-6-phosphate
1PFK: fructose-1-phosphate kinase

Glu-1-P: glucose-1-phosphate

PGI: phosphoglucoisomerase

PGA: phosphogluconic acid

PGM: phosphoglucomutase

UDPGlc: uridine diphosphoglucose

Hình 2.5. Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của A. xylinum
2.2.6. Tiêu chí chọn giống
a. Khả năng tạo sản phẩm
- Tạo màng cellulose dai và chắc về mọi phía trên bề mặt môi trường.
- Tạo sản phẩm có hàm ẩm cao (có thể lên đến 99 %)
- Có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau để tạo sản phẩm: glucose,
saccharose, lactose, maltose, dextrin và galactose…
b. Khả năng sinh trưởng
- Khả năng cạnh tranh và ức chế vi sinh vật tạp nhiễm cao.
c. Các tính chất khác
- Tính ổn định của hoạt tính trao đổi chất: ít bị thái hóa.
- Khả năng sinh tổng hợp độc tố: không có khả năng sinh độc tố.
- Khả năng thích nghi: tốt, chịu được môi trường có nồng độ chất khô cao
(nồng độ chất khô thích hợp cho quá trình hình thành thạch dừa là 11.5-12 0Bal),
khỏang nhiệt độ và pH để lên men tạo sản phẩm rộng (t = 20 – 32 0C, pH = 3,5 –
6,5)
- Tỷ lệ hàm lượng của các sản phẩm trao đổi chất: chỉ quan tâm tới hàm lượng
cellulose, không quan tâm đến các sản phẩm khác. Do đó mà ta cần chọn giống có
khả năng tạo cellulose với hàm lựơng lớn.
2.3. Quy trình sản xuất Nata de coco
2.3.1. Quy trình chung

- 20 -

Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

Hình 2.6. Sơ đồ quy trình sản xuất Nata de coco

- 21 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

2.3.2. Thuyết minh quy trình
2.3.2.1. Chuẩn bị giống để sản xuất
- Giống Acetobacter xylinum được nuôi trong môi trường thạch nghiêng,
thành phần gồm:
SA

8g

DAP

2g

Saccharose

20 g

Agar

20 g

Nước dừa

1000 ml

- Các ống nghiệm chứa môi trường thanh trùng ở 121 °C trong 20 phút.
- Cấy giống , để trong tủ ấm 3 - 4 ngày.
- Tiến hành nhân giống, có thể qua 1 cấp hoăc hai cấp hoặc nhiều hơn tuỳ theo
qui mô sản xuất. Thành phần môi trường nhân giống như trên nhưng không có Agar
gọi là môi trường dịch thể. Môi trường được khử trùng ở 121 °C trong 30 phút. Để
nguội đến 30 °C, cấy giống theo tỉ lệ 10 %. Lắc hay sục khí trong thời gian 18 - 20
giờ. Sau đó giống được đưa vào sản xuất.
2.3.2.2. Chuẩn bị môi trường
- Nước dừa già được thu nhận ở các nhà máy sản xuất cơm dừa nạo sấy.
- Thành phần gồm: đường, protein, dầu béo, khoáng ,vitamin…hoà tan và một
số tạp chất khác. Có thể sử dụng các nguyên liệu thay thế đã trình bày ở phần trên.
- Dùng vải lọc để loại bỏ tạp chất.Vải lọc được cố định trên rổ lọc. Dịch nước
dừa sau khi lọc được thu vào thùng chứa. Cặn trên vải lọc được tách ra ngoài.
- Bổ sung dinh dưỡng: SA, DAP, đường glucose là nguồn cung cấp Nitơ,
khoáng… tạo môi trường tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp sản phẩm.
- Môi trường sau khi bổ sung dinh dưỡng được thanh trùng bằng cách đun sôi
khoảng 10-45’ để tiêu diệt các vi sinh vật có trong môi trường. Sau đó làm nguội.
- Dùng acid acetic chỉnh về pH = 4,5 - 5, chỉnh nhiệt độ đến 28 – 32 °C (pH,
nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men).
2.3.2.3. Lên men

- 22 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

- Đổ môi trường vào các dụng cụ, cấy giống theo tỷ lệ 1:10. Đậy thau, chậu
bằng vải mỏng hoặc giấy báo. Giữ nhiệt độ phòng ở 28 – 32 0C trong vòng 9 - 15
ngày. Trong thời gian này tránh khuấy động môi trường để tránh làm cho lớp thạch
đang hình thành bị tách lớp.
2.3.2.4. Thu nhận Nata de coco thô
- Sau khoảng 9-15 ngày, dùng vợt đề vớt khối cellulose ra khỏi dịch lên men.
Sau đó rửa khối cellulose bằng nước lạnh.
- Vì thạch dừa thô chỉ là khối hemicellulose nên không mùi, không vị. Chính vì
vậy cần phải chế biến để phù hợp với khẩu vị của người tiêu dùng.
- Dùng máy cắt để cắt khối cellulose tạo các miếng nhỏ, đều đặn.
- Ngâm sản phẩm trong dung dịch Na2CO3 3 – 5 % trong 15’ để trung hoà acid
acetic còn sót bên trong thạch. Sau đó xả lại bằng nước lạnh.
- Đun sôi để làm trong sản phẩm và tao độ dai bằng cách bổ sung chất tạo dai.
- Ngâm đường tạo đô ngọt và tăng độ trong cho sản phẩm.
- Bổ sung màu, mùi để hoàn thiện giá trị cảm quan.
2.3.3. Bảo quản Nata de coco
- Ức chế vi khuẩn và nấm men bằng cách sử dụng nồng độ đường cao. Với
nồng độ đường khoảng 70 - 80 % nó sẽ tạo ra một áp suất thẩm thấu cao, sẽ hoàn
toàn có thể ức chế được hoạt động của vi khuẩn và nấm men. Phương pháp bảo
quản này được áp dụng đối với sản phẩm mứt thạch dừa.
- Sử dụng muối natribenzoate : với nồng độ muối sử dụng khoảng 0,05 –
0,1 %, sản phẩm thạch dừa có thể giữ được phẩm chất ban đầu sau 4 tháng.
- Có thể bảo quản bằng cách ngâm miếng thạch dừa thô trong dung dịch acid
acetic có độ chua cao (pH < 3) và không để miếng thạch tiếp xúc với không khí.
- Sau khi sản xuất thạch dừa thô, trong thực tế người ta không bảo quản nguyên
miếng thạch thô mà cắt ra thành viên thạch nhỏ hình vuông có kích thước từ 9 -12
mm, ép kiệt đóng bao ny lon và bao ngoài bằng bao PP, đem đến nơi sản xuất thạch
dừa thành phẩm (thường là dạng thạch dừa nước đường).

- 23 -


Nghiên cứu sản xuất Nata de coco

- Không nên sử dụng chất tẩy trắng có Clo hoặc sunfurơ như clorin, chất tẩy
đường (natri hydro sunfit), meta bisunfit,.. các chất này ngấm vào viên thạch sẽ có
dư lượng cao, đồng thời cách bảo quản này cũng không hiệu quả. Ngoài ra, cũng
không nên bảo quản bằng phèn chua vì viên thạch sẽ có hàm lượng nhôm cao, hoặc
phèn thường lẫn các kim loại khác như sắt thì sản phẩm thạch thành phẩm có màu
không được trắng, do đó không đạt yếu tố cảm quan và an toàn thực phẩm.
- Để cắt miếng thạch thô thành viên, các cơ sở cơ khí đều có thể làm được các
máy cắt thạch theo yêu cầu kích thước (thông thường thạch tiêu thụ trong nước có
kích thước viên thạch từ 10 – 12 mm lớn hơn viên thạch xuất khẩu sang Đài Loan 8
– 10 mm).
- Trước khi nấu thạch thành phẩm, cần phải xả sạch nước chua trong viên thạch
bằng cách ép nước chua và ngâm lại nước sạch xả nhiều lần hoặc để nguyên miếng
thạch xả nước theo cách ngâm xả hoặc xả chảy tràn (cách này rất hao nước). Dù
theo cách nào đi nữa cũng cần phải trung hòa chất chua bằng các chất kiềm (như
sođa, natri bicacbonnat, không nên dùng xút) trước khi nấu thạch thành phẩm.
2.3.4. Những biến động trong quá trình lên men
- Sự thay đổi pH trong quá trình lên men : một trong những điều kiện quan
trọng để có được sự hoạt động sống của VSV là độ acid của môi trường.
Acetobacter xylinum là một lòai chịu acid nên môi trường được điều chỉnh về pH
3,5 - 5 bằng acid acetic.
- Các quá trình đồng hóa và dị hóa của vi sinh vật có liên quan đến việc tạo
thành các acid hữu cơ như là sản phẩm trung gian và những sản phẩm cuối cùng của
sự trao đổi chất. Nếu nguồn C không được vi khuẩn sử dụng hết thì có thể có sự tích
lũy acid hữu cơ tương ứng trong dịch nuôi cấy. Sự tích lũy và tỷ lệ acid hữu cơ phụ
thuộc vào từng chủng trong mỗi loài vi khuẩn , vào thành phần của môi trường ,vào

sự thông khí và các nhân tố khác. Đối với Acetobacter xylinum việc lên men đi liền
với hình thành các acid dicacboxylic không bay hơi (acid malic, fumaric, sucxinic),
các keto acid (acid oxaloacetic, pyruvic) như là các sản phẩm trung gian và các acid

- 24 -