Nghiên cứu phản ứng thủy phân các glycozit tự nhiên bằng enzym B-Glucosidase và đánh giá hoạt tính sinh học của các sản phẩm nhận được

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………

LÊ THỊ TÚ ANH

NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG THỦY PHÂN MỘT SỐ GLYCOZIT TỰ
NHIÊN BẰNG ENZYM
β-GLUCOSIDASE VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC
SẢN PHẨM NHẬN ĐƯỢC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2018


Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Lê Trường Giang
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Đoàn Duy Tiên

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại Học
viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Lê Thị Tú Anh, Đoàn Duy Tiên, Bá Thị Châm, Nguyễn Văn Tuyến,
Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật thủy phân glycosit thành
aglycon có hoạt tính sinh học cao. Tạp chí Hóa học, 2016 , 54 (6e2):
84-89

2. Lê Thị Tú Anh, Bá Thị Châm, Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Thanh Trà,
Nguyên Văn Tuyến, Nghiên cứu thủy phân astilbin trong rễ Thổ phục
linh (Similax glabra) bằng vi sinh vật, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (6e2):
223-227

3. Nguyễn Thị Thu Hà, Phạm Thị Thu Hằng, Nguyễn Thanh Trà, Bá Thị
Châm, Lê Thị Tú Anh, Đặng Thị Tuyết Anh, Nguyễn Hà Thanh,
Thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym khử HMG-Coenzym A
của vỏ đậu xanh (Vigna radiata), Tạp chí hóa học 2017, 55 (4e23), 2126.

4. Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Trà, Bá Thị Châm, Lê Thị Tú
Anh, Đặng Thị Tuyết Anh, Nguyễn Hà Thanh, Thành phần hóa học và
hoạt tính ức chế enzym khử HMG-Coenzym A của lá Sen hồng

(Nelumbo nucifera), Tạp chí hóa học 2017, 55 (4e23), 261-266.


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Hiện nay, vấn đề bảo vệ môi trường đã trở nên cấp thiết với mọi lĩnh vực
của cuộc sống. Trong lĩnh vực hóa học, tìm kiếm những enzym xúc tác, hỗ trợ cho
các quá trình chuyển hóa, tổng hợp hữu cơ được coi là hướng phát triển xanh thân
thiện môi trường. Nhờ những ưu điểm vượt trội so với xúc tác thông thường, xúc
tác enzym không chỉ giúp tăng hiệu suất phản ứng mà còn góp phần giảm thiểu ô
nhiễm môi trường..
β-Glucosidase (BGL) thuộc nhóm enzym có khả năng thủy phân liên kết
glycosid trong các hợp chất carbohydrat. BGL có thể tác động lên nhiều cơ chất
khác nhau, trong đó thủy phân liên kết glycosid ở các hợp chất tự nhiên, giải phóng
các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, dễ hấp thụ là một lĩnh vực đang được quan
tâm nghiên cứu, đem lại nhiều kết quả hứa hẹn.
Flavonoit là một trong những nhóm hợp chất phong phú, đa dạng, được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực như y dược học, thực phẩm, mỹ phẩm. Flavonoit tồn tại
ở hai dạng là dạng tự do (aglycon) và liên kết với các phân tử đường (glycozit).
Trong đó, dạng aglycon có hoạt tính sinh học cao và dễ hấp thụ vào cơ thể, dạng
glycosid chiếm tỉ lệ lớn tuy nhiên khó hấp thụ và có hoạt tính thấp. Do đó việc phát
triển các xúc tác sinh học thủy phân glucozit tạo aglycon và nghiên cứu hoạt tính
của các cặp chất này có ý nghĩa hết sức quan trọng và có tính ứng dụng cao.
Quá trình nghiên cứu, phát triển xúc tác enzym không tránh khỏi việc nuôi
cấy vi sinh vật (VSV). Những vi sinh vật này khi được thải ra môi trường có thể tạo
ra những ảnh hưởng không tốt, do đó để đảm bảo một quy trình nghiên cứu thân
thiện với môi trường, việc xử lý và khử trùng những vi sinh vật này trước khi loại bỏ
cũng hết sức cần thiết.

Nhằm mục đích nghiên cứu, tìm kiếm những glycozit, aglycon thực vật có
hoạt tính sinh học, có tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn đồng thời phát triển
phương pháp nghiên cứu mới – sinh chuyển hóa bằng xúc tác sinh học, chúng tôi
lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phản ứng thủy phân các glycozit tự nhiên bằng
enzym β-glucosidase và đánh giá hoạt tính sinh học của các sản phẩm nhận
được”. Trong nghiên cứu này, chủng vi nấm P.citrinum được phân lập từ rễ cây
Bọ Mẩy (Clerodendron cyrtophyllum Turcz), định danh và sinh tổng hợp enzyme
β-glucosidase. Các flavonoit glycozit tách chiết từ thực vật Việt Nam được thủy
phân bởi enzym β-glucosidase từ vi nấm. Các flavonoit và sản phẩm chuyển hóa


2

tương ứng được đánh giá hoạt tính sinh học. Vi nấm sau quá trình lên men được
nghiên cứu khử trùng bằng công nghệ oxy hóa tiên tiến thân thiện với môi trường.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym vào quá trình thủy phân các hợp
chất glycozit thực vật, tạo nên các sản phẩm có hoạt tính cao hơn đồng thời phát
triển hướng nghiên cứu xanh trong hóa hữu cơ.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Phân lập, định danh chủng vi sinh vật có khả năng sinh β-glucosidase.
- Lên men sinh tổng hợp, đánh giá các thông số động học của β-glucosidase
dạng tự do và cố định từ P. Citrinum.
- Nghiên cứu khử trùng sau lên men bằng phương pháp oxy hóa tiên tiến.
- Nghiên cứu tách chiết các hợp chất glycozit từ thực vật Việt Nam.
- Nghiên cứu thủy phân các hợp chất glycozit từ thực vật với enzym βglucosidase.
- Đánh giá hoạt tính sinh học các hoạt chất thu được.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Enzym β-D-glucosidlase
Trình bày những nội dung liên quan đến β-glucosidase: những nội dung

cơ sở liên quan đến định nghĩa, phân loại, cơ chế phản ứng, cách tinh chế và
đánh giá hoạt tính enzym. Tiếp đó, những nội dung về đa dạng và khả năng sinh
tổng hợp các β-glucosidase ở các VSV, về cải tạo nguồn giống với mục đích
tăng sản xuất BGL và liên quan đến sản xuất BGL thương mại. Cuối cùng, về
những ứng dụng đa ngành của β-glucosidase.
1.2 Hợp chất flavonoit
Trình bày những nội dung liên quan đến flavonoit: khung cơ sở, sự phân
loại các nhóm, sinh tổng hợp, phương pháp nhận biết bằng các thuốc thử và hoạt
tính sinh học của nhóm chất.
1.3 Flavonoit glycozit và aglycon của chúng
Trình bày những nội dung liên quan đến hấp thu, chuyển hóa của
flavonoit glycozit từ đó cho thấy tiềm năng của các aglycon so với glycozit của
chúng. Tiếp theo là tổng quan về các nghiên cứu sinh chuyển hóa flavonoit
glycozit đã công bố trên thế giới.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu
Mẫu bã đậu nành (Glycine max) từ Công ty cổ phần dầu thực vật Quang Minh,
Kim Động, Hưng Yên. Mẫu lá sen (Nelumbo nucifera) và vỏ đậu xanh (Vigna


3

radiata) thu tại Hà Nội và Bắc Giang. Mẫu hoa hòe (Styphnolobium
japonicum (L.) Schott) thu tại Nam Định. Mẫu Cốt khí củ (Rhizoma Polygoni
cuspidati) được thu tại Thôn Nghĩa Trai - xã Tân Quang - Huyện Văn Lâm Hưng Yên.
2.2. Hóa chất, thiết bị
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp phân lập, định danh và lưu vi sinh vật sinh enzym
2.3.1.1 Phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết:

2.3.1.2. Phương pháp định danh: đại thể, vi thể, định danh chủng nấm phân lập
bằng PCR và giải trình tự
2.3.2 Phương pháp xác định họat độ enzym: đánh giá khả năng thủy phân pnitrophenyl-β-glucopyranosid (pNPG)
2.3.3 Phương pháp cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất glycozit: sắc ký
cột và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân
2.3.4 Các phương pháp thủy phân: với enzym tự do và enzym cố định.
- Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
- Xử lý số liệu thí nghiệm và tối ưu hóa thực nghiệm
2.3.5 Phương pháp khử trùng vi sinh vật nghiên cứu
2.3.6 Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học
- Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa trên hệ DPPH
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
- Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzym Angiotensin I
2.3.7. Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân
Tối ưu hóa bằng pp qui hoạch thực nghiệm với phần mềm Modde 5.0.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM
3.1. Nghiên cứu phân lập chủng nấm sinh enzym β-glucosidase
3.1.1 Phân lập chủng sinh enzym β-glucosidase
Từ mẫu rễ cây Bọ Mẩy (Clerodendron cyrtophyllum Turcz), tiến hành phân
lập các chủng nấm mốc thuần chủng có khả năng sinh β-glucosidase. Chủng nấm
mốc có khả năng sinh enzym β-glucosidase với hoạt tính cao nhất sẽ được định
danh và sử dụng xuyên suốt nghiên cứu.
3.1.2 Định danh chủng vi nấm phân lập
Phương pháp vi thể, đại thể, PCR và giải trình tự gen.
3.2. Nghiên cứu phân lập và các thông số động học β-glucosidase
Lên men với môi trường Pd, sử dụng phương pháp muối tách với bằng
(NH4)2SO4, rửa muối bằng cột Sephadex và đông khô thu enzym sạch.


4

Hằng số phân ly biểu kiến Km và Vmax của β-glucosidase trên cơ chất βpNG với nồng độ β-pNG trong khoảng 0.05mM đến 2.0mM, phản ứng diễn ra
trong 10 phút ở 60oC và đo ở bước sóng 410nm. BGL-P còn được nghiên cứu
cố định trên calci alginat và bã cà phê. Hiệu suất cố định enzym (%) tính theo
công thức:
Hiệu suất cố định (%) =(Et- Es)/Et x100
Et là hoạt độ enzym trước cố định, Es là hoạt độ enzym sau cố định
3.3. Nghiên cứu phân lập các glycozit trong một số thực vật Việt Nam
3.3.1 Phân lập các glycozit và aglycon từ khô đậu tương
200g khô đậu tương
-

EtOH: H2O (80:20)
Cô loại dung môi

Cao lỏng màu nâu
-

Chiết aceton x 3 lần
Cô kiệt dung môi

-

Hòa tan bằng EtOAc
Chiết bằng nước

Cặn Aceton
-

Dịch EtOAc

-

Cô kiệt dung môi
Cột
silica gel:
EtOAc:H2O
EtOAc:H2O:EtOH (95:3:2)

F3-F4

F1-F2

F5

Sephadex LH-20, EtOH

F1.
1
Kết tinh CH2Cl2

D1.1
(12.8mg
)

Dịch nước

Chạy cột silica gel:
EtOAc:MeOH (96:4)

D5.3

(251.2mg)

F1.
2

Kết tinh CH2Cl2

D1.2
(3.4 mg)

(97:3)

F6

và

F7-F10

Chạy cột silica gel:
EtOAc:MeOH (95:5)

D6.4
(198.7mg)


5

3.3.2 Phân lập các glycozit và aglycon từ lá Sen

3.3.3 Phân lập các glycozit từ vỏ đậu xanh

6

3.3.4 Phân lập rutin từ hoa Hòe
Đặc điểm của hợp chất phân lập được: Nhiệt độ nóng chảy: 242oC
1
H NMR (500 MHz, DMSO-d6): =0,99 ppm (3H, d, J= 6,5Hz, HRha-6’’’); 3,095,00 (các proton CH-OH của đường); 5,2 (1H, brs, HRha-1’’’); 5,34 (1H, d, J=
7,0 Hz, HGlc-1’’); 6,19 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6); 6,38 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-8);
6,84 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-5’); 7,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’); 7,55 (1H, dd,
J=2,0; 8,0 Hz, H-6’); 12,58 (1H, s, OH-5).
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  156,5 (C-2); 133,3 (C-3); 177,4 (C-4);
161,2 (C-5); 100,1 (C-6); 164,1 (C-7); 93,6 (C-8); 156,4 (C-9); 103,9 (C-10);
121,1 (C-1’); 115,2 (C-2’); 144,7 (C-3’); 148,4 (C-4’); 116,2 (C-5’); 121,5(C6’); 101,2 (CGlc-1’’); 74,1 (CGlc-2’’); 76,4 (CGlc-3’’); 70,3 (CGlc-4’’); 75,8 (CGlc5’’); 66,9 (CGlc-6’’); 98,7 (CRha-1’’’); 70,5 (CRha-2’’’); 71,3(CRha-3’’’); 71,8
(CRha-4’’’); 68,2 (CRha-5’’’); 18,6 (CRha-6’’’).
3.3.5 Phân lập các glycoszit và aglycon từ củ Cốt khí
`

Cặn CC(15 g)
- SKC Silicagel 0,063 ÷ 0,2
- CH2Cl2 : CH3OH

F1

F2

- Cô kiệt

F3

F4

- SKC Silicagel
0,04÷0,063
- CH2Cl2

- SKC Silicagel
0,04 ÷ 0,063
- CH2Cl2 : CH3OH

- Kết tinh

F8

F7 (2,0g)

F6

F5 (2,4g)

C2.1
(290mg)

7-1

7-2

7-3

7-4

7-5

- Cô, kết tinh

5-1

5-2

5-3

5-4

C7.3 (155mg)

- Cô, kết tinh
C5.2 (97mg)

C8.4 (20mg)

3.4. Sinh chuyển hóa các hợp chất glycozit
Hiệu suất thủy phân được tính theo công thức [140]:

C8.5 (15mg)


7

Trong đó:

Qc: là lượng sản phẩm thủy phân
Qo: lượng glucozit ban đầu đưa vào phản ứng
M1: khối lượng phân tử của glycozit
M2: khối lượng phân tử sản phẩm thủy phân
3.5. Khử trùng vi sinh vật nghiên cứu bằng phương pháp oxi hóa tiên tiến
3.5.1 Chuẩn bị thiết bị và mẫu vi sinh vật và phân tích mẫu điện phân
3.5.2. Thiết kế quy trình điện phân với bào tử B. cereus
3.5.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ dòng điện đến khả năng diệt khuẩn
3.5.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng pH dung dịch đến khả năng diệt khuẩn
3.5.3 Nghiên cứu khả năng diệt khuẩn của thiết bị với P. citrinum
3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học của các glycozit và sản phẩm thủy phân
tương ứng
3.6.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH [117-119]
Thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp phụ của DPPH chưa
phản ứng bằng máy Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. % bắt gốc tự do
(scavenging capacity %) DPPH của mẫu thử được tính theo công thức:
SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%).
EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của
chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.
3.6.2 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase [120-123]
Thí nghiệm được ủ ở nhiệt độ 37o C. Phản ứng được dừng bằng 100 µl
Na2CO3. Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước
sóng 410 nm (A). Khả năng ức chế enzyme - glucosidase của mẫu thử được xác
định bằng công thức:
Độ ức chế (%) = [A(đối chứng âm) – A(mẫu thử)] / A(đối chứng âm) x 100%
IC50 - half maximal inhibitory concentration - nồng độ chất thử ức chế
50% hoạt động của -glucosidase, tính bằng phần mềm Tablecurve.
3.6.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym ACE [124-126]:
Phản ứng ở nhiệt độ 37o C, pH 7,0, 30 phút. Độ hấp thụ sau phản ứng
được xác định trên máy BioTek với bước sóng 410 nm (A).

Phần trăm ức chế hoạt độ ACE của mẫu thử tính theo công thức:
% ức chế = (Ađối chứng dương - Amẫu thử)/(Ađối chứng dương – Ablank)
Trong đó, mẫu đối chứng dương: không chứa chất thử; mẫu blank: cơ
chất HHL được thay bằng đệm phản ứng. Chất tham khảo: captopril.


8

Giá trị IC50 (nồng độ của chất thử ức chế 50% hoạt độ của ACE trong
điều kiện thí nghiệm) được tính theo phần mềm excel table curve.

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả nghiên cứu phân lập chủng nấm sinh enzym β-glucosidase
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu thủy phân các hợp chất glycozit từ
thực vật. Flavonoit rất phổ biến ở thực vật với khoảng 15.000 hợp chất đã
được xác định cấu trúc, phần lớn trong số đó đều là glycozit và rất nhiều hợp
chất tồn tại ở dạng liên hết β-glycozit. Do đó, nhóm nghiên cứu trước tiên
tiến hành phân lập chủng vi sinh vật sinh enzym β-glucosidase.
4.1.1 Kết quả phân lập chủng vi nấm sinh β-glucosidase và khả năng sinh
enzym của chúng

Hình 4.1: Khuẩn lạc thu được từ mẫu rễ Bọ Mẩy ở nồng độ pha loãng 10-5
Từ các khuẩn lạc thu được, thực hiện cấy chuyển, tinh sạch, thu được 5
loài nấm mốc với đặc điểm hình thái khuẩn lạc khác nhau, ký hiệu C1-5.
Nuôi cấy và xác định hoạt độ enzym từ các chủng nấm mốc theo các mốc
thời gian 1-10 ngày, nhận thấy: chủng C5 sau 6 ngày nuôi cấy cho enzym có
hoạt độ cao nhất là 33,628U/ml. Kiểm tra khả năng sinh enzym của các
chủng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau và khẳng định C5 có khả năng
sinh enzym tốt nhất
4.1.2. Kết quả định danh chủng vi nấm phân lập

Bằng phương pháp quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc và soi vi thể
của bào tử và cấu tạo sợi nấm, C5 được xác định thuộc chi Penicillium. Kết
quả giải trình tự hai chiều DNA sản phẩm PCR bằng cặp mồi ITS1/ITS4 và


9

so sánh với dữ liệu gen trên NCBI bằng công cụ BLAST nucleotide đã chỉ ra
rằng trình tự DNA sản phẩm PCR của mẫu nấm phân lập là Penicillium
citrinum (độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu là 100%)

Hình 4.4: Khuẩn lạc, bào tử và sợi nấm C5
4.2 Kết quả nghiên cứu phân lập β-glucosidase từ dịch nuôi cấy và
đánh giá các thông số động học của enzym
Qua các công đoạn loại bỏ protein tạp, muối tách, rửa trên cột và đông
khô để thu enzym tinh sạch. Hoạt độ của enzym tinh sạch tính trên khối
lượng bột khô theo phương pháp soi màu ở bước sóng 410nm với cơ chất βpNG thu được là 62,412U/mg (BGL-P). BGL-P được sử dụng ở dạng tự do
hoặc cố định trên các chất mang calci alginat và bã cà phê.
4.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt động của enzym tự do
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến hoạt động của enzym tự
do:
Enzym BGL-P có vùng hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 50 oC - 70
o
C với hoạt tính đạt xấp xỉ 90% so với hoạt tính tối đa ở 60 oC. Tại nhiệt độ
60oC, enzym hoạt động tốt ở khoảng pH từ 5,0-6,5 với hoạt tính đạt trên 90%
so với hoạt tính tối đa ở pH 6,0.
Kết quả nghiên cứu động học enzyme BGL-P trên cơ chất β-pNG :
Xây dựng đồ thị theo phương trình nghịch đảo (Lineaweaver và Burk
1934), thu được kết quả Km = 0,01µmol và Vmax = 13,91 µmol/phút.
4.2.2 Kết quả nghiên cứu hoạt động của enzym cố định:

Kết quả cố định β-glucosidase trên alginat:
Hệ gel cố định với natri alginat 4% - CaCl2 4% được đánh giá có hiệu
lực cố định tốt BGL-P (72,3%) và có khả năng tái sử dụng 7 lần với cơ chất
pNPG trước khi mất 50% hoạt tính.
Kết quả cố định β-glucosidase trên bã cà phê:


10

Bã cà phê Trung nguyên được hoạt hóa bằng glutaraldehyt được sử
dụng làm chất mang BGL-P, đạt hiệu suất 82%. Tuy nhiên, chỉ có thể tái sử
dụng 2 lần với cơ chất pNPG trước khi mất 50% hoạt tính.
Bảng 4.3 Thông số động học của enzym BGL-P tự do và cố định
Dạng enzym
Nhiệt độ
pH
Vmax
Km
R2 *
Tự do
60
6.0
13,91
0,011
0,9994
Cố định/alginat
50
6.0
13,09
0,034

0,9978
Cố định bã cà phê
40
6.0
14,45
0,022
0,9992
2
* là hệ số R của phương trình đồ thị Lineaweaver và Burk
4.2 Kết quả nghiên cứu phân lập các glycozit trong một số thực vật Việt
Nam
Bằng các phương pháp phổ, 20 hợp chất phân lập từ 5 loài thực vật được xác
định cấu trúc hóa học như sau:
TT Kí hiệu
Cấu tạo
Tên hợp chất
Nguồn gốc
1

2

3

D1.1

D1.2

D5.3

Genistein

Đậu nành

Daidzein

Đậu nành

Genistein 7-O-

Đậu nành

beta-D-glucoside

4

D6.4

Daidzein7-O-

Đậu nành

beta-D-glucoside

5

S3.1
MB5

catechin

Lá sen
hồng, vỏ
đậu xanh


11

6

7

S5.2

S7.3

quercetin-3-O-β-

Lá sen

galactoside

hồng

quercetin

Lá sen
hồng

8

S8.4

kaemferol

Lá sen
hồng

9

S8.5

isorhamnetin-3-

Lá sen

O-β-D-

hồng

glucuronide
10

11

S8.6

HO

MB3

OH

OH

4''
6''

3''
5''
2''

HO
HO

7

O

3'
2'

1''

8

1'

O

9

2
6
5

12

MB4

Lá sen

D-glucuronide

hồng

apigenin-6-C-

Vỏ đậu

glucoside

xanh

(vitexin)

5'
6'

3

10

OH

OH
4'

quercetin-3-O-β-

4

O

apigenin-6-C-

Vỏ đậu

glucoside

xanh

(isovitexin)


12

13

MB1

luteolin

Vỏ đậu
xanh

14

MB2

taxifolin

Vỏ đậu
xanh

15

OH

HH1
2'
HO
7

8

6
5
OH

1'

O
2

9
10

4
O

3

HO
O

4'

2''

17

C2.1

C5.2

(rutin)

3'' OH 4''

O

OH

5''

1''

6''

4'''HO

Hoa hòe

rutinoside

5'

6'

6''' 5'''
H3C
HO

16

quercetin-3-O-

OH

3'

O
1'''

O
3'''

2'''
OH

resveratrol

Cốt khí củ

Resveratrol 3 –

Cốt khí củ

beta-mono-Dglucoside
(picied)
18

C7.3

emodin

Cốt khí củ

19

C8.4

emodin-8-O-β-D-

Cốt khí củ

glucopyranoside


13

20

C8.5

physcion-8-O-β-

Cốt khí củ

Dglucopyranoside

Ví dụ: Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất vitexin (MB1)
Hợp chất MB1 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt, đnc:
247-249ºC. Phổ khối ESI-MScho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 433 [M+H]+.
Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm OH và nhóm carbonyl ở 3410,
1656, 1566cm1. Trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 4 proton dạng AA’BB’ ở
H 8,01 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’, H-6’); 6,89 (2H, dd, J = 8,0 Hz, H-3’, 5’)
chứng tỏ vị trí C-4’ của vòng B bị thế. Ngoài ra, tín hiệu của 2 proton vòng
thơm dưới dạng singlet ở H 6,75 (1H, s, H-3); 6,24 (1H, s, H-6) và 1 proton
anomeric ở H 4,71 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-1’’) cũng được quan sát thấy trên phổ

1
H-NMR. Tất cả các dữ liệu phổ trên gợi ý đây là một hợp chất flavone gắn với
1 phân tử đường glucose. Hằng số tương tác lớn (J = 9,0 Hz) của proton
anomeric H-1’’ cho phép xác định cấu hình β của phần đường glucose.Tín
hiệu của OH ở H 13,15 đặc trưng cho liên kết cầu hydro nội phân tử ở vị trí C-5
cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR.Trên phổ 13C-NMR và phổ DEPT
của của MB1 cho biết sự có mặt của 21 nguyên tử cacbon trong đó 15 cacbon
sp2 và 6 cacbon sp3 tương ứng với 1 nhóm carbonyl ở C 182,1 (C-4), 6 nhóm
methin vòng thơm ở C 102,4 (C-3);98,4 (C-6), 129,7 (C-2’, C-6’); 115,9 (C-3’,
C-5’), 1 nhóm methylen ở C 61,4 (C-6’’), 5 nhóm oxymethin và 8 cacbon bậc
4.
Các mảnh cấu trúc này sau đó được kết nối nhờ phân tích phổ HMBC.
Tương tác HMBC giữa proton của OH-5 (δH13,15) và C-5 (δC160,4)/C-6
(δC98,4)/C-10 (δC104,6), tương tác giữa proton H-6 (δH6,24) với C-5 (δC
160,4)/C-7 (δC 162,8)/C-8 (δC 104,7)/C-10 (δC 104,7) và tương tác giữa proton
H-1’’ (δH4,71) với C-7 (δC 162,8)/C-8 (δC 104,7)/C-9(δC 156,1) xác nhận cấu
trúc của vòng A bị thế ở 5 vị trí và cho phép xác định đường glucose gắn với
khung flavone ở vị trí C-8 của vòng A.Tương tác HMBC giữa H-2’,
6’(δH8,01) với C-2 (δC164,2) và tương tác giữa H-3’, 5’ (δH 6,89) và C-1’
(δC121,1)/C-4’ (δC161,1) xác nhận cấu trúc của vòng B và liên kết giữa C-1’ và
C-2. Ngoài ra, cấu trúc vòng C được thiết lập qua các tương tác xa trên phổ
HMBC giữa H-3 (δH6,75) với C-2 (δC164,2)/C-4 (δC182,1)/ C-10 (δC104,7)


14

Kết hợp các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS, HSQC, HMBC và so
sánh với tài liệu tham khảo [32] cho phép xác định MB1 là vitexin.

Hình 4.44. Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC của

chất vitexin
4.4 Kết quả nghiên cứu thủy phân các hợp chất glycozit trong thực vật Việt
Nam sử dụng enzym BGL-P:
Các glycozit đã phân lập trong đề tài đều có liên kết β, do đó việc ứng dụng
BGL-P tách chiết từ chủng P. citrinum hứa hẹn nhiều khả thi.
4.4.1 Kết quả thủy phân sử dụng enzym β- glucosidase tự do:
4.4.1.1 Nghiên cứu thủy phân các glycozit của quercetin:
Tiến hành thủy phân quercetin -3-O-beta-galactoside với các nồng độ
enzym BGL-P khác nhau là 0,1U/ml; 0,55U/ml và 1,0U/ml, trong thời gian 2h,
4h, 6h; thu được hiệu suất thực tế của các thí nghiệm. Từ các số liệu thực tiễn thu
được, tiến hành giải bài toán quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0.
Khi dựng phương trình hồi quy trên hệ trục không gian 3 chiều bằng phần mềm
Modde 5.0 thu được đồ thị hình 4.74.
Hình 4.74: Đồ thị biểu diễn phương
trình hồi quy thể hiện vùng tối ưu
của cặp yếu tố nồng độ enzym và
thời gian thủy phân trên hệ trục
không gian ba chiều

Hình 4.75: Đồ thị biểu diễn
mặt đáp ứng của nồng độ enzym và
thời gian phản ứng tới hiệu suất
thủy phân.
Sau khi thực hiện tối ưu hóa
bằng phương pháp quy hoạch thực


15

nghiệm, nhận thấy: enzym thực hiện phản ứng tốt nhất với hiệu suất 98,3% ở

nồng độ 0,6U/ml trong thời gian 4,5h. Tuy nhiên khi giảm nồng độ enzym và
tăng thời gian ủ thì vẫn thu được hiệu suất cao. Dựa vào đồ thị, chọn nồng độ
enzym là 0,4U/ml và thời gian phản ứng 5h, kết quả thực nghiệm thu được
hiệu suất là 98%, tương tự như kết quả quy hoạch.
Thủy phân quercetin-3-O-β-D-glucuronide
Điều kiện thủy phân tối ưu hóa sử dụng để thủy phân quercetin-3-O-β-Dglucuronide: nồng độ enzym 0,4U/ml, nhiệt độ phản ứng 60oC trong 5h, đạt
hiệu suất 90%. Trong khi đó, theo nhiều tài liệu tham khảo, việc thủy phân
glucoronides với xúc tác hóa học là vô cùng khó, ngay cả khi dùng acid đặc
cũng chỉ đạt dưới 20% [128].

Hình 4.77 Thủy phân các hợp chất quercetin bằng enzym BGL-P
Tiến hành thủy phân quercetin-3-O-rutinoside (rutin)
Với cấu tạo gồm phần aglycon là quercetin gắn với đường rutinose, do đó để
tiếp cận liên kết β-glucozit enzym BGL-P bị cản trở bởi 1 phân tử đường α-Lrhamnopyranosyl mà nó không thể phân cắt. Vì vậy, hiệu suất thủy phân của
BGL-P với rutin là khá thấp, chỉ 25% với thời gian kéo dài hơn và cần sự khuấy
trộn nhẹ.
4.4.1.2 Nghiên cứu thủy phân các flavonoid glycozit khác
Tương tự với các flavonoit glucozit khác, nhóm cũng thu được hiệu suất
phản ứng cao.


16

Tiến hành thủy phân genistin và daidzin trong điều kiện: nồng độ enzym
BGL-P là 0,4U/ml với thời gian ủ là 5h, phản ứng được dừng bằng cách thêm
10ml MeOH. Kết quả thủy phân cho thấy, hiệu suất phản ứng đạt cao với cả 2
chất là genistin và daidzin là 98%.

Hình 4.78 Thủy phân các hợp chất genistin và daidzin
Với picied, nhóm nghiên cứu đạt hiệu suất 99% sau 5h thủy phân ở 60oC.

Cao hơn rất nhiều so với những nghiên cứu trước đây trên thế giới, 40% với
phương pháp hóa học và 60% với phương pháp enzym [131].

Hình 4.79 Thủy phân hợp chất picied
Trong điều kiện tương tự, việc thủy phân isorhamnetin-3-O-β-Dglucuronide, cũng cho hiệu suất đến 85% sau 5h, hiệu suất này thấp hơn khi
thủy phân hợp chất chứa gốc đường bản chất là glucose.

Hình 4.80 Thủy phân hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide
Enzym BGL-P cũng có khả năng thủy phân isoapigenin-6-C-glucoside và
apigenin-8-C-glucoside, với hiệu suất tương đương nhau.


1''

2''

3''

5''

4''

6''

60
oC
,5
h,
95
%

17

Hình 4.81 Thủy phân hợp chất isoapigenin-6-C-glucoside và apigenin-8-Cglucoside
4.4.1.3 Nghiên cứu thủy phân các anthraquinone glycozit
Thủy phân emodin-8-O-β-D-glucopyranoside (19) và physcion-8-O-β-Dglucopyranoside (20) nhận thấy: với cấu trúc liên kết O-glucozit, việc thủy phân
các hợp chất anthraquinone glycozit này cũng cho hiệu suất cao tương đương
khi thủy phân các glycozit ở trên.

Hình 4.82 : Ứng dụng BGL-P thủy phân các hợp chất các anthraquinone
glycozit
Sản phẩm thủy phân physcion-8-O-β-D-glucopyranoside (20) sau đó
được xác định cấu trúc bằng phổ NMR cho thấy đó là physcion.


18

4.4.2 Kết quả thủy phân sử dụng enzym β- glucosidase cố định:
Tiến hành thí nghiệm trên cơ chất quercetin -3-O-beta-galactoside với enzym cố định ở cá

Hình 4.84: Đồ thị biểu diễn khả năng tái sử dụng enzym
khi cố định trên các chất mang
Enzym BGL-P khi được cố định vào ca-alginat có thể tái sử dụng 5 lần
trước khi mất 50% hoạt tính. Đây là một kết quả khả quan để ứng dụng việc
cố định enzym trong thủy phân các hợp chất góp phần nâng cao hiệu quả sử
dụng enzym và giảm chi phí sản xuất.
4.5. Kết quả hoạt tính sinh học của các hợp chất glycozit và aglycon tương
ứng:
4.5.1 Khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do DPPH
Nghiên cứu tiến hành nghiên cứu khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do

DPPH của các hợp chất thu được trong đề tài:
Bảng 4.14 : Hoạt tính trung hòa gốc oxy hóa tự do DPPH
của các aglycon và glycozit
EC50
STT
Tên hoạt chất
(mM)
(µg/ml)
1 Quercetin
0,027
8,2
2 quercetin-3-O-β-galactoside
0,055
25,6
3 quercetin-3-O-rutinoside
0,143
87,4
4 quercetin-3-O-β-D-glucuronide
0,047
22,5
5 Luteolin
0,015
4,3
6 Kaemferol
0,060
17,2
7 Isorhamnetin
0,032
10,1
8 isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide

0,133
65,5


19

9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

Apigenin
0,047
12, 6
apigenin-6-C-glucoside
0,055
23,8
apigenin-8-C-glucoside
0,055
23,8

Genistein
>0,948
>256
Genistein 7-O-beta-D-glucoside
0,256
110,7
Daidzein
0,532
135,3
Daidzein7-O-beta-D-glucoside
>0,615
>256
Resveratrol
0,036
8,2
Resveratrol 3 –beta-mono-D-glucoside
0,043
16,8
Emodin
0,205
55,4
emodin-8-O-β-D-glucopyranoside
>0,592
>256
Physcion
0, 731
207,8
physcion-8-O-β-D-glucopyranoside
>0,573
>256

Catechin
0,038
11,0
Các flavonoid thu được đều có hoạt tính chống oxy hóa và hầu hết các
aglycon có hoạt tính cao hơn glycozit của chúng. Khả năng trung hòa gốc tự
do DPPH của các nhóm aglycon và glucozit tương ứng xếp theo thứ tự giảm
dần như sau: quercetin > quercetin-3-O-β-D-glucuronide > quercetin-3-O-βgalactoside > rutin; hay resveratrol > resveratrol 3 –beta-mono-D-glucoside;
isorhamnetin > isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide. Việc thủy phân các
glycozit thành aglycon giúp tạo ra những hợp chất có tiềm năng chống oxy
hóa cao hơn tăng khả năng ứng dụng.
4.5.2 Khả năng ức chế enzym alpha- glucosidase:
Để đánh giá khả năng ứng dụng vào điều trị bệnh tiểu đường, tiến hành
thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của một số hợp chất thu được.
Bảng 4.15 : Kết quả hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase
IC50
STT
Tên hoạt chất
(µg/ml)
(mM)
1
quercetin
6,3
0,021
2
quercetin-3-O-β-galactoside
44,1
0,095
3
quercetin-3-O-rutinoside
131,9

0,216
4
quercetin-3-O-β-D-glucuronide
68,9
0,144
5
apigenin
53,46
0,198
6
apigenin-6-C-glucoside
117,2
0,271
7
apigenin-8-C-glucoside
107,2
0,248
8
genistein
13,5
0,050


20

9
10
11
12

genistein 7-O-beta-D-glucoside
>256
>0,592
daidzein
26,9
0,106
daidzein7-O-beta-D-glucoside
>256
>0,615
acarbose
192,1
0,297
Nhóm hợp chất flavonoit từ thực vật Việt Nam có tiềm năng to lớn để
ứng dụng trong điều trị tiểu đường, nhiều hợp chất có khả năng ức chế enzym
α- glucosidase cao hơn chất đối chứng acarbose (hoạt chất được sử dụng
trong điều trị bệnh). Trong phép thử này quercetin, apigenin, genistein và
daidzein đều đạt giá trị IC 50 ở nồng độ thấp hơn glycozit của chúng.
456.3 Khả năng ức chế enzym ACE của các hợp chất
Với mục đích so sánh khả năng ức chế enzym Angiotensin I (gây co
mạch và làm tăng huyết áp) của aglycon sau thủy phân so với các glycozit
tương ứng, tiến hành thử khả năng ức chế enzym Angiotensin I của các hợp
chất quercetin. Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.16: Kết quả khả năng ức chế ACE của các hợp chất
IC50
Tên hoạt chất
(µg/ml)
(mM)
Quercetin
23,6
0,078

quercetin-3-O-rutinoside
70,34
0,115
quercetin-3-O-β-D-glucuronide
>256
>0,535
Captopril
0,000326
0,000015
Như vậy, khả năng ức chế ACE của các chất nghiên cứu dù còn thấp
hơn chất đối chứng nhiều lần, tuy nhiên kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng:
hoạt tính quercetin cao hơn các glycozit của chúng
Từ các nghiên cứu về hoạt tính sinh học nêu trên, nhóm nghiên cứu
nhận thấy trong hầu hết các thử nghiệm in vitro, hoạt tính của aglycon thường
cao hơn glycozit của chúng. Đó là một dấu hiệu tốt cho khả năng ứng dụng
các hợp chất này vào thực tế mặc dù trong tự nhiên, các flavonoit thường tồn
tại ở dạng glycozit nhưng bằng việc sử dụng enzym thủy phân, việc tạo ra
lượng lớn aglycon là khả thi.
4.6 Kết quả nghiên cứu khử trùng vi sinh vật băng phương pháp điện hóa
Trong các nghiên cứu có sử dụng vi sinh vật, việc giữ an toàn môi trường,
kiểm soát sự phát tán vi sinh vật trong và sau nghiên cứu là hết sức quan trọng.
Do đó, sau mỗi thí nghiệm vi sinh vật đều cần được tiệt trùng cẩn thận trước khi
thải bỏ. Trên cơ sở đảm bảo an toàn sinh học, nhóm nghiên cứu trước tiên tiến
hành thí nghiệm trên một chủng vi khuẩn chỉ thị. Dựa vào sức sống bền bỉ của


21

bào tử trong các điều kiện khắc nghiệt, nghiên cứu chọn bào tử B. cereus làm
chỉ thị cho nghiên cứu mô hình. Nhóm nghiên cứu thu được kết quả điều kiện

tối ưu trong phương pháp điện hóa: dòng điện có cường độ 2A, nồng độ dung
dịch Cl- 50mg/L và pH 6,8 với đệm phosphate 0,01M, có khả năng diệt 100%
bào tử B. cereus ở nồng độ 105 tế bào/ml sau thời gian lưu mẫu 30 phút.
Áp dụng kết quả nghiên cứu trên, nhóm nghiên cứu tiến hành khử trùng đối
với mẫu bào tử nấm P. citrinum. Thí nghiệm được tiến hành bằng cả 2 phương
pháp là trực tiếp (dung dịch điện phân chứa bào tử đi qua buồng điện phân) và
gián tiếp(dung dịch điện phân được thêm vào bình chứa bào tử nấm). Kết quả
nhận thấy, có thể khử trùng bào tử nấm theo cả 2 cách trong đó cách trực tiếp
thời gian lưu mẫu cần thiết là 30 phút và gián tiếp thời gian lưu mẫu cần thiết là
60 phút.

Hình 4.88: Ảnh hưởng của thời gian lưu trữ mẫu đến khả năng diệt bào tử P.
citrinum bằng phương pháp điện hóa
KẾT LUẬN
1. Phân lập và định danh được chủng nấm Penicillium citrinum có khả
năng sinh tổng hợp β-glucosidase cao từ rễ cây Bọ mẩy (Clerodendron
cyrtophyllum Turcz):
- Phân lập được 05 chủng nấm thuần khiết từ mẫu rễ cây Bọ mẩy và
đánh giá khả năng sinh β-glucosidase của chúng trên một số môi trường.
- Chủng nấm có khả năng sinh β-glucosidase tốt nhất được định danh
bằng phương pháp đại thể, vi thể, sinh học phân tử, xác định là Penicillium
citrinum với độ tương đồng 100% từ cơ sở dữ liệu của NCBI.


22

2. Lên men sinh tổng hợp và đánh giá được các thông số động học của βglucosidase dạng tự do và cố định từ P. citrinum:
- P. citrinum được nuôi cấy trên môi trường lỏng Pd, 6 ngày, 27oC, 200
rpm. Enzym được kết tủa bằng phương pháp muối tách, loại muối bằng
Cephadex G200, tinh sạch, đông khô, enzym hoạt độ 62,412 U/mg.

- Enzym tự do: to: 60oC, pH: 6,0, Km= 0,011 µmol, Vmax= 13,91
µmol/phút
- Enzym cố định trên calci alginat: 50 oC, pH: 5,5-6,2, Km= 0,034 µmol,
Vmax = 13,09 µmol/phút. Tái sử dụng được 7 lần với β-NPG và 5 lần với
quercetin-3-O-beta-galactoside
- Enzym cố định trên bã cà phê: to: 40oC, pH: 6,0, Km= 0,022 µmol,
Vmax= 14,45 µmol/phút. Khả năng tái sử dụng kém.
3. Phân lập và xác định được cấu trúc bằng phương pháp phổ hiện đại với
17 hợp chất flavonoit glycozit và aglycone: Genistein, daidzein, genistin,
daidzin, catechin, hyperoside, quercetin, kaempferol, isorhamnetin-3-O-β-Dglucuronide, quercetin-3-O-β-D-glucuronide, vitexin, isovitexin, luteolin,
taxifolin, rutin, resveratrol, picied, 3 hợp chất anthraquinone glycozit và
aglycon: emodin, emodin-8-O-β-D-glucopyranoside, physcion-8-O-β-Dglucopyranoside
4. Xác định được quy trình thủy phân các hợp chất bằng enzym BGL-P
phân lập từ P. citrinum cho hiệu suất cao: Phản ứng diễn ra với enzym ở
nồng độ 0,4U/ml trong đệm citrat pH 6,0, thời gian ủ 5h ở nhiệt độ 60 oC.
5. Tiến hành thủy phân 10 hợp chất glycozit đã phân lập trong điều kiện
tối ưu cho hiệu suất cao từ 85 đến 98%, ngoại trừ rutin với hiệu suất 25%
6. Xác định được điều kiện phù hợp để khử trùng VSV sau quá trình lên
men:
- Thiết kế quy trình điện phân với bào tử B. cereus
- Xác định được điều kiện khử trùng (100%) trên đối tượng P. citrinum:
Phương pháp điện hóa với thiết bị của hàng A-dept (Đan mạch), cường độ
dòng 2A, đệm phosphat pH 6,8, nồng độ Cl - 50mg/L, thời gian 60 phút, nhiệt
độ phòng.
7. Hoạt tính sinh học của đa số các aglycon là cao hơn so với dạng
glycozit tương ứng, xét trên khả năng chống oxy hóa (hệ DPPH), điều trị tiểu
đường (α-glucosidase), điều trị cao huyết áp (enzyme Angiotensin I), đem lại
những tiềm năng trong ứng dụng thực tiễn.