Nghiên cứu tách chiết phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme và đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn oligochitin thu được

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
----o0o----

HUỲNH THẢO HÂN

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHITIN PHÂN TỬ
LƯỢNG THẤP (OLIGOCHITIN) TỪ CHITIN CHIẾU XẠ,
CHIẾU XẠ KẾT HỢP ENZYME VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
SINH HỌC PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITIN THU ĐƯỢC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Nha Trang, tháng 06 năm 2015


BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
----o0o----

HUỲNH THẢO HÂN

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHITIN PHÂN TỬ
LƯỢNG THẤP (OLIGOCHITIN) TỪ CHITIN CHIẾU XẠ,
CHIẾU XẠ KẾT HỢP ENZYME VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
SINH HỌC PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITIN THU ĐƯỢC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: ThS. TRẦN VĂN VƯƠNG

Nha Trang, tháng 06 năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án này
Trước hết em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha
Trang, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, Phòng Đào tạo sự kính trọng
cho em được học tập tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin dành cho thầy: Trần Văn Vương – Bộ môn –
Trường Đại học Nha Trang đã tài trợ kinh phí, tận tình hướng dẫn động viên em
trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp này.
Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong bộ môn
Công nghệ Thực phẩm và tập thể cán bộ trong các phòng thí nghiệm- Trung tâm
Thực hành Thí nghiệm- Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo
điều kiện thuận lợi cho em suốt quá trình thực hiện đồ án này.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ em vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua.
Nha Trang, ngày 29 tháng 06 năm 2015
Sinh viên
Huỳnh Thảo Hân


ii

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG.iii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ iv
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... vi
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN ............................. 3
1.1. Tổng quan về chitin. .......................................................................................... 3
1.1.1. Lịch sử hình thành và cấu tạo của chitin ........................................................ 3
1.1.2. Độ kết tinh của chitin ..................................................................................... 7
1.1.3. Tính chất của chitin ........................................................................................ 7
1.2. Tổng quan về oligochitin. .................................................................................. 8
1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin, oligochitin. ....................................... 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................... 9
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. ............................................................... 12
1.4. Khả năng ứng dụng của chitin và oligochitin. ................................................ 14
1.4.1. Ứng dụng của chitin. .................................................................................... 14
1.4.2. Ứng dụng của oligochitin ............................................................................. 15
1.5. Tổng quan về phương pháp sản xuất oligochitin và đánh giá hoạt tính.......... 16
1.5.1. Tổng quan về phương pháp hóa học ............................................................ 16
1.5.2. Tổng quan về phương pháp chiếu xạ ........................................................... 18
1.5.3. Tổng quan về phương pháp sinh học ........................................................... 22
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 28
2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 28
2.1.1. Vật liệu chính ............................................................................................... 28
2.1.2. Vật liệu phụ .................................................................................................. 28
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 28
2.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu.................................................... 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 29
2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................. 30
2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu ............................................................................. 36

iii

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử
lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ ............................................ 37
3.2. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết
hợp với phương pháp enzyme ..............................................................................38
3.3. So sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp
(oligochitin) sản xuất giữa 2 phương pháp và lựa chọn phương pháp sản xuất..... 40
3.4. Lựa chọn phương pháp sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp
(oligochitin) ............................................................................................................ 41
3.5. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn chitin phân tử
lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ và phương pháp
chiếu xạ kết hợp enzyme ........................................................................................ 42
3.5.1. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn chitin phân tử
lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ .............................. 42
3.5.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn chitin phân tử
lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ... 44
3.5.3. So sánh khả năng chống oxi hóa của các phân đoạn chitin phân tử lượng
thấp (oligochitin) giữa hai phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết
hợp enzyme ............................................................................................................ 46
3.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn oiligochitin ....... 49
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ............................................... 52
4.1. Kết luận ........................................................................................................... 52
4.2. Đề xuất ý kiến.................................................................................................. 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 53
PHỤ LỤC I ............................................................................................................. 55
PHỤ LỤC II ........................................................................................................... 59
PHỤ LỤC III .......................................................................................................... 64

iv

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
PGS – TS: Phó giáo sư – tiến sĩ
HPLC

: High Performance Liquid Chromatography

DPPH

: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl.

LB

: Luria Bertami

E.coli

: Escherichia coli

B.cereus : Bacillus cereus
S.aureus : Staphylococcus aureus


v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ

của phân đoạn A ........................................................................................................59
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ
của phân đoạn B ........................................................................................................59
Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ
của phân đoạn C ........................................................................................................59
Bảng 3.4. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ
kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn A .......................................................60
Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ
kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn B .......................................................60
Bảng 3.6. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ
kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn C .......................................................60
Bảng 3.7. So sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin theo hai phương pháp
...................................................................................................................................60
Bảng 3.9. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn B 61
Bảng 3.10. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn C
...................................................................................................................................61
Bảng 3.11. Kết quả đo bước sóng 517 nm của vitamin C ........................................62
Bảng 3.12. Xác định khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo phương pháp chiếu
xạ ...............................................................................................................................62
Bảng 3.13. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp
enzyme phân đoạn A .................................................................................................62
Bảng 3.14. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp
enzyme phân đoạn B .................................................................................................63
Bảng 3.15. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp
enzyme phân đoạn C .................................................................................................63


vi

Bảng 3.16. Xác định khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo phương pháp chiếu

xạ kết hợp enzyme .....................................................................................................63
Bảng 3.17. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn oligochitin ......64


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc chitin .............................................................................................4
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử chitin trong không gian ...................................................4
Hình 1.3. Cấu tạo chitin và cellulose ..........................................................................5
Hình 1.4. Cấu trúc các dạng mạch chitin ....................................................................6
Hình 1.6. Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin ....................................................16
Hình 1.7. Sơ đồ sản xuất oligochitin .........................................................................17
Hình 1.9. Qui trình xử lí chitin tạo các dẫn xuất của chitin ......................................24
Hình 2.1 Enzyme Hemicellulase ...............................................................................28
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp
(oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ ở các liều chiếu xạ khác nhau .................37
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lương thấp
(oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với enzyme .................................39
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp
(oligochitin) bằng hai phương pháp ..........................................................................40
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn kết quả đo bước sóng 517 nm qua các nồng độ của phân
đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ ......................................42
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của phân đoạn
oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ ...............................................43
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn kết quả đo bước sóng 517 nm qua các nồng độ của phân
đoạn oligochitin theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ..................................44
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của phân đoạn
oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme .....................45
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn A

giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ...................46
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn B
giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ...................47
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn C
giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ...................48


1

LỜI MỞ ĐẦU
Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng
nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu,
tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xáp chiếm từ 7 - 80% công suất chế biến.
Hàng năm, các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu khá lớn (khoảng
70.000 tấn/năm) nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản
xuất chitin và các sản phẩm có giá trị cao từ chitin.
Chitin là một polymer có trọng lượng phân tử lớn, không tan trong nước nên
có nhiều hạn chế cho việc ứng dụng. Vì vậy hiện nay người ta đang có xu hướng
nghiên cứu sản xuất các chế phẩm từ chitin nhằm khắc phục các hạn chế của nó.
Oligochitin là một sản phẩm được hình thành sau quá trình cắt mạch chitin.
Nó có những đặc tính như: khả năng hòa tan trong nước tốt, có hoạt tính sinh học
(khả năng chống oxy hóa, khả năng kháng khuẩn), an toàn và còn được ứng
dụng trong y học nhằm cải thiện tình trạng thiếu máu, điều hòa huyết áp trong
máu, điều hòa lượng cholesterol, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, chống ung
thư máu. Ngoài ra, oligochitin còn có khả năng kháng nấm, kháng bệnh cho cây
trồng vật nuôi.
Oligochitin là một polymer có hoạt tính sinh học và được sản xuất bằng
nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, sinh học, chiếu xạ và enzyme. Hiện
nay, vấn đề liên quan đến khả năng chống oxi hóa và phương pháp sản xuất
oligochitin được nhiều người quan tâm, vì vậy tôi làm đề tài: “Nghiên cứu tách chiết

phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp
enzyme và đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn oligochitin thu được”.
Nội dung đề tài:
1. Xây dựng quy trình tách chiết các phân đoạn oligochitin từ chitin chiếu xạ,
chiếu xạ kết hợp enzyme.
2. Xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin từ chitin chiếu xạ,
chiếu xạ kết hợp enzyme.
3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn oligochitin thu được.


2

4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn oligochitin thu được.
Mục tiêu của đề tài:
Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 3 phân đoạn oligochitin sản xuất bằng
phương pháp chiếu xạ và enzyme để tìm ra phân đoạn có khả năng chống oxi hóa
cao nhất.
Ý nghĩa khoa học của đề tài: nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của một số
phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ và
enzyme
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: hiện nay chúng ta đang cần tìm ra phân đoạn
oligochitin có khả năng chống oxi hóa được sản xuất theo phương pháp nào có hiệu
quả cao để ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN
1.1. Tổng quan về chitin
1.1.1. Lịch sử hình thành và cấu tạo của chitin



Lịch sử hình thành

Chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811 [12]. Lần đầu tiên
ông phân lập được chitin như một hợp chất không tan trong kiềm của một số loại
nấm. Hợp chất do Braconnot phân lập được còn lẫn rất nhiều tạp chất nhưng ông
khẳng định đây không phải là gỗ. Năm 1823, Odier đã cô lập được chitin từ cánh
cứng của con bọ cánh cứng và cũng phân lập được chitin khi loại khoáng vỏ cua. Từ
đó, Odier cho rằng đây là hợp chất cơ bản trong vỏ giáp xác và côn trùng, một chất
từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hi Lạp có nghĩa là vỏ giáp,
nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó.
Chitin là chất hữu cơ chủ yếu trong vỏ mai (bộ xương ngoài động vật không
xương sống). Theo Richard, chitin được tìm thấy trong lớp vỏ cutin của loài chân
đốt. Ngoài ra, chitin còn được tìm thấy trong tế bào ống của loài mực, ở lớp vỏ bao
ngoài của loài Bọ cánh cứng, trong lớp vỏ mai của loài giáp xác, trong loài nhện và
bướm. Người ta đưa ra các giả thiết khác nhau về sự hiện diện của chitin hoặc
cenlulose làm cơ sở cho mối quan hệ phát sinh giữa các nhóm của giống nấm đặc
biệt là phycomecetus. Qua phân tích bằng tia X, Frey đã xác nhận rằng chitin và
cenlulose không hiện diện đồng thời. Chitin không hiện diện một mình trong lớp vỏ
ngoài của loài nấm mà nó được liên kết với những thành phần khác. Lượng chitin
được tinh chế từ một số loài nấm thông thường từ 3 - 5%.


Cấu tạo của chitin

Chitin là một polymer phổ biến trong tự nhiên, sau cellulose, chúng được tạo
ra rất trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất. Chitin tham gia vào thành
phần cấu tạo của vách tế bào nấm, cấu tạo nên bộ khung xương của vỏ tôm, cua,
côn trùng, các động vật giáp xác,…Chitin rất ít khi ở dạng tự do mà luôn liên kết

với protein ở dạng phức hợp, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác, gây
khó khăn cho việc tách chiết. Chitin là một polisacharid được cấu tạo bởi các


4

monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu nối 1,4-glucozit. Công thức phân tử là
(C8 H13 O5)n trong đó cacbon chiếm 47,29%, hydro chiếm 6,45% và oxi chiếm
39,37%.

Hình 1.1. Cấu trúc chitin
Chitin có cấu trúc hóa hoc giống cellulose ngoại trừ nhóm hydroxyl thứ hai
trên nguyên tử carbon alpha trên phân tử cellulose được thay thế bằng nhóm
acetomaide [5]. Cũng nhờ vào cấu trúc này mà việc ứng dụng của chitin vào xử lý
nước thải nhả in nhuộm là một việc rất có triển vọng.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử chitin trong không gian


5

Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong thế giới động
vật chitin là thành phần có cấu trúc quan trọng của một số động vật không xương
sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong thế giới thực vật
chitin có ở tế bào nấm Zygemycethers và một số tảo Chlorophiceae.
Động vật thủy sản đặc biệt là cua, ghẹ, tôm là nguồn nguyên liệu tiềm năng
sản xuất chitin, từ đó sản xuất các sản phẩm khác từ chúng.
Công thức cấu tạo của chitin và cellulose:

Hình 1.3. Cấu tạo chitin và cellulose

Công thức phân tử của chitin: (C8 H13 O5)n
Trong đó n thay đổi là do từng loại nguyên liệu
Ở tôm thẻ chân trắng n= 400 - 500
Ở tôm hùm n= 700 - 800
Ở cua n= 500 - 600
Phân tử lượng chitin Mchitin = (203.09)n [6].
Chitin là một polysaccharide chứa đạm không độc hại, có khối lượng phân tử
lớn. Cấu trúc của chitin là một tập hợp các phần tử liên kết nhau bởi các cầu nối
glucozit và hình thành một mạng các sợi tổ chức. Chitin rất hiếm tồn tại ở trạng thái
tự do, hầu như luôn liên kết bởi các cầu nối đẳng trị với protein, CaCO3 và các hợp
chất hữu cơ khác trong vỏ tôm, cua, ghẹ [6].


6

Chitin cũng có màu trắng giống cellulose, chitin có tính kị nước cao (đặc biệt
đối với α-chitin), không tan trong nước trong kiềm, trong các acid loãng và các
dung môi hữu cơ như ete, rượu. Tính không tan của chitin là do cấu trúc chặt chẽ,
có liên kết trong và liên phân tử mạnh mẽ thông qua các nhóm hydroxyl và
acetamin. Tuy nhiên, cần lưu ý là β-chitin, không giống như α-chitin, có tính trương
nở với nước cao.
Cấu trúc các dạng trên xuất phát từ nguồn chiết rút chitin, chitin từ tôm, cua
có dạng α-chitin, chitin từ mực có dạng β-chitin. Ba dạng chitin nêu trên có sự khác
nhau về tính hydrat hóa, kích thước của mỗi đơn vị cấu trúc và số mạch
chitin trong mỗi đơn vị cấu trúc, α-chitin có độ kết tinh cao nhất và ở dạng rắn chắc
và các mạch chitin xếp song song nhưng ngược chiều nhau, β-chitin bao gồm
các mạch chitin song song cùng chiều, có độ kết tinh thấp, tính hydrat hóa cao, γchitin sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều thì lại có một mạch ngược chiều.
Trong tự nhiên, α-chitin có mặt nhiều nhất và thường rất cứng trong khi 2 loại kia
thì tạo nên tính dẻo, dai cấu trúc hóa học của chitin với các liên kết hidro nối phân
tử giữa các phân tử đường trong chitin rất chặt chẽ vì vậy làm cho phân tử chitin có

độ rắn chắc cao và khó hòa tan.

Hình 1.4. Cấu trúc các dạng mạch chitin
γ, β-chitin do mắt xích ghép lại với nhau theo kiểu song song (β-chitin) và
hai song song một ngược chiều (γ-chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro.
Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho
cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Dạng β tồn tại ít nó được tìm ra trong protein của
mực ống, còn dạng γ thì rất hiếm. Vì thế mà người ta thường thủy phân dạng αchitin do nó tồn tại nhiều và phổ biến.


7

1.1.2. Độ kết tinh của chitin
Chitin có cấu trúc tinh thể rắn chắc so với polymer sinh học khác, chitin có
độ kết tinh cao và biến đổi theo từng loại chitin được chiết rút từ nguồn nguyên liệu
khác nhau. Phổ nhiễu xạ tia X của α-chitin từ vỏ tôm và β-chitin từ xương mực cho
thấy mẫu α-chitin có vòng nhiễu xạ mạnh, ở vòng trong thì không có tính hydrat
hóa mạnh, trong khi mẫu β-chitin có vòng tương tự nhưng yếu hơn và có tính hydrat
hóa mạnh.
1.1.3. Tính chất của chitin
Chitin là một polysaccharide có tính kiềm, bền trong môi trường kiềm nhưng
kém bền trong môi trường acid. Dựa vào tính chất này người ta đã sản xuất
glucosamine bằng phương pháp hóa học từ chitin bằng cách đun nóng chitin trong
acid HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao, chitin sẽ bị thủy phân hoàn toàn, tạo thành 88,5%
D-Glucosamin và 12,5% acid acetic [6].
Khi đun nóng chitin trong dung dịch kiềm đặc, chitin bị mất gốc acetyl tạo
thành chitosan. Dựa vào đặc tính này người ta đã sản xuất chitosan từ chitin.
Chitin

NaOH 40 - 50%

chitosan

Phản ứng ester hóa:
Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat.
Chitin tác dụng với ahydrit trong pyridin. Dioxan và N,N-dimetylanilin cho
sản phẩm chitin sunfonat.
Chitin ở dạng tinh thể, màu trắng ngà không định hình, không tan trong
nước, trong acid loãng, kiềm, chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schweizei
Sapranora. Điều này có thể do nhóm acetamit (-NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành
phức chất cần thiết. Chitin hòa tan trong dung dịch đặc nóng của các muối:
thioxianat Liti (LiSCN), thioxianat Canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo. Chitin
có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 cm-1 [6].
Chitin ổn định với các chất chống oxy hóa khử như: Thuốc tím (KMnO4),
oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Clorua vôi Ca(ClO)2… từ đó lợi dụng tính
chất này người ta sử dụng các chất oxy hóa để khử màu cho chitin [6].


8

Chitin là một vật liệu chứa cả 2 nhóm chức –OH và –NH2 cho liên kết với
enzyme, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng. Chitin có cấu trúc
mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liên kết hydro hình thành trong chuỗi mà
còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin là một polymer kỵ nước,
độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học. Dựa vào đặc
tính này, gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme trên chitin, chủ yếu bằng
phương pháp hấp phụ và liên kết cộng hóa trị qua cầu nối glutaradehyt. Tuy nhiên,
do tính chất kị nước nên bề mặt tiếp xúc của enzyme cố định và cơ chất rất hạn chế.
Vì vậy hoạt tính của ezyme cố định trên chitin thường rất thấp [1].
Chitin hòa tan được trong dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4,

dimethylacetamide chứa 5% lithium chloride.
Chitin tương đối ổn định với các chất chống oxi hóa khử, thuốc tím, oxy già,
nước gia ven (NaOCl), hay Ca(ClO)2...lợi dụng tính chất này người ta sử dụng màu
cho chitin.
Chitin khó tan trong thuốc thử Schwweizel sapranora. Điều này có thể do
nhóm acetamit (-NHCOOCH3) ngăn cản sự tạo thành phức chất cần thiết.
1.2. Tổng quan về oligochitin
Oligochitin là đoạn mạch polymer của N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết
với nhau bằng liên kết 1,4-glucozit. Oligochitin được tạo thành qua quá trình thủy
phân/cắt mạch bằng phương pháp hóa học, phương pháp sinh học, phương pháp
chiếu xạ bằng bức xạ năng lượng cao như γ hoặc chùm điện tử gia tốc.
Oligochitin là một saccharide, được kết hợp bởi các monosaccharide từ 2 –
10 trong cấu trúc của chitin. Oligochitin có khối lượng phân tử thấp, nó có khả năng
hòa tan tốt trong nước và là một chất có tính sinh học cao.
Oligochitin được xem như một thực phẩm chức năng, có khả năng chống nấm
mốc, vi khuẩn, chống oxy hóa lipid, chống ung thư, chống bướu, chống bệnh tim mạch
[6].


9

Công thức cấu tạo của oligochitin:

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của oligochitin
Oligochitin có dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng, không mùi, vị đặc biệt.
chúng có khả năng tan tốt trong nước, độ nhớt thấp, phân tử lượng nhỏ và dễ
kết tinh, có hoạt tính sinh học cao như: Cải thiện thiếu máu, bệnh gan, điều hòa
huyết áp trong máu, điều hòa lượng Cholesterol, làm tăng khả năng hấp thụ
canxi, chống ung thư máu,…Ngoài ra, oligochitin còn có khả năng kháng nấm,
kháng bệnh cho cây trồng vật nuôi.

1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin, oligochitin
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Nước ta là nước có ngành chế biến thủy sản khá phát triển nên các phế phẩm
từ thủy sản đang là vấn đề được quan tâm rất lớn đối với các công ty chế biến. Các
phế phẩm từ đầu tôm, mai mực, mai ghẹ nếu thải ra môi trường sẽ làm ô nhiễm
nặng, mà trong các phế phẩm đó có một lượng lớn chitin nếu được xử lí thu hồi
chitin thì không những vấn đề môi trường được giải quyết mà còn kiếm được một
nguồn lợi nhuận cao từ phế phẩm thủy sản.Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất chitin,
oligochitin và ứng dụng của chúng rất phổ biến và được quan tâm. Tuy nhiên việc
nghiên cứu sản xuất oligochitin còn là một vấn đề khá mới mẻ, mới bắt đầu được
quan tâm và đi vào nghiên cứu. Ở nước ta, trường Đại học Nha Trang bắt đầu
nghiên cứu tách chiết chitin từ năm 1978 với quy trình của cô Đỗ Minh Phụng
nhưng chưa có ứng dụng trong sản xuất cụ thể. Gần đây với yêu cầu bức bách trong
xử lí phế phẩm từ thủy sản, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin, chitosan
cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học bắt tay vào


10

nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, đồng thời nghiên cứu quá trình thủy
phân chitin tạo các sản phẩm mới có ứng dụng cao trong sản xuất và thực phẩm,
cũng như đời sống.
Hiện nay, có nhiều cơ sở đang nghiên cứu sản xuất chitin trong đó Trung tâm
Chế biến Trường Đại học Nha Trang là nơi sản xuất chitin có chất lượng cao.
Ở miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp Thủy sản Hà
Nội sản xuất chitin và ứng dụng của nó.
Ở miền Nam, trung tâm Công nghệ Sinh học và Sinh học Thủy sản phối hợp
với một số cơ quan khác như: Đại học Y dược Hồ Chí Minh, Phân viện Khoa học
Việt Nam, viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam… đang nghiên cứu sản xuất và
ứng dụng chitin trong các lĩnh vực nông nghiệp, y dược.

Năm 2003 một dự án sản xuất thử nghiệm chitin đã hoàn thành tại trường Đại học
Nha Trang. Trường Đại học Nha Trang đã chuyển giao công nghệ sản xuất chitin cho
một số cơ sở sản xuất. Sản phẩm chitin của Trung tâm Chế biến Thủy sản của Trường
Đại học Nha Trang đang có uy tín cao, sản phẩm bắt đầu ứng dụng mạnh mẽ vào một số
cơ sở sản xuất và được đưa đi chào hàng ở Thái Lan. Sản phẩm chitin của trường Đại
học Nha Trang đã góp phần giảm nhập khẩu chitin từ nước ngoài.
Năm 2005 Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất olygosaccharide từ chitin
– chitosan bằng phương pháp hóa học. Hiện nay công nghệ đã được hoàn thiện, sản
phẩm đang tiếp tục được sản xuất tuy nhiên năng suất còn nhỏ.
Năm 2006 Trần Thị Luyến triển khai sản xuất olygosaccharide bằng enzyme.
Đây là một hướng nghiên cứu mới, cần được tiếp tục nghiên cứu trên nhiều đối
tượng enzyme khác nhau.
Một số quy trình sản xuất chitin và oligosaccharide ở trong nước
Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy sản Hà Nội
Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lí tách
khoáng lần 1 trong dung dịch HCl 4% trong thời gian τ = 24 giờ ở nhiệt độ phòng
với tỉ lệ w/v = ½. Sau đó vớt ra rửa trung tính và dùng NaOH 2% để tách protein
lần 1 với tỉ lệ w/v = ½, ở nhiệt độ t0 = 90 - 950C trong thời gian τ = 3 giờ. Sau đó


11

rửa trung tính và khử khoáng lần 2 cũng bằng HCl 4% với tỉ lệ w/v = ½, ở nhiệt độ
phòng trong thời gian τ = 24 giờ và đem rửa trung tính. Để tách protein lần 2 ta
ngâm trong dung dịch NaOH 2% với tỷ lệ ½ ở nhiệt độ t0 = 90 - 950C sau 3 giờ vớt
ra và rửa trung tính rồi tiến hành khử khoáng lần 3 giống 2 lần trên. Sản phẩm đem
phơi hoặc sấy khô ta thu được chitin [6].
Ưu điểm: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu.
Nhược điểm: Tốn hóa chất. Thời gian sản xuất kéo dài, nồng độ hóa chất sử
dụng cao, thời gian xử lí dài làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến

độ nhớt giảm. Hóa chất độc hại ảnh hưởng tới môi trường.
+ Quy trình của Đỗ Minh Phụng – Đại học Nha Trang (1980)
Nguyên liệu là vỏ tôm khô, được xử lý sạch không lẫn tạp chất được đem đi
khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/m = 1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ vớt ra
và rửa trung tính. Tiếp theo ngâm trong NaOH 8% ở nhiệt độ to = 100oC trong thời
gian τ = 2 giờ với tỷ lệ w/m = 1/2,5 để khử protein, sau đó vớt ra và rửa trung tính.
Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10% trong 60 phút
,sau đó đem rửa sạch và tiếp tục tẩy màu bằng Na2SO3 1,5% trong thời gian 15 phút
rồi vớt ra rửa sạch ta thu được chitin [6].
Ưu điểm: Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp.
Nhược điểm: Sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó ảnh hưởng đến độ nhớt của
sản phẩm, thời gian xử lý dài [4].
+ Quy trình sử dụng enzyme papain sản xuất chitosan của PGS - TS Trần Thị Luyến
Vỏ tôm khô được xử lý trong điều kiện: Dung dịch HCl 10% với tỷ lệ w/m =
1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ. Nguyên liệu vỏ tôm tươi được xử lý tương
tự nhưng với tỷ lệ w/m = 1/5. Sau đó tiến hành rửa sạch và khử protein bằng enzyme
papain theo phương pháp bổ sung dung dịch 13% papain vào khối vỏ tôm đạt tỷ lệ w/m
= 1/5, dùng HCl điều chỉnh pH về 5 – 5,5 và nâng nhiệt độ lên 70 - 80oC trong thời gian
4 giờ. Sau đó rửa sạch, làm khô ta thu được sản phẩm chitin [3].


12

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Năm 1859 nhờ vào phát minh đầu tiên của Rouget khi đun sôi chitin trong
dung dịch HCl đậm đặc. Và về sau đã có nhiều công trình nghiên cứu về chitin và
các sản phẩm thủy phân từ chitin [12].
Shigermase cùng cộng tác viên (1944) đã cho rằng liozyme có khả năng thủy
phân chitin- chitosan rất tốt trong điều kiện t = 38oC pH = 5,4.
Aiba va Muraka (1996) cho rằng (GlcNAc)n, n = 1 – 7, có thể sản xuất được

bằng cách dùng enzyme, enzyme cellulose và hemicellulase thủy phân chitosan.
Muzzarelli (1996) cho rằng enzymer cellulose và hemicellulase, papain
lipase thủy phân chitosan ở những độ khác nhau hemicellulase thủy phân chitosan,
sản (GlcNAc)n , n = 6, thu được 18%, Muzzare (1997) cũng cho rằng Strepmyces
grigeus HUT 6037 tiết ra enzyme ngoại bào chitinase và chitosanase ứng dụng thủy
phân một số loài giáp xác.
Hằng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5,11 triệu tấn trên toàn thế giới [14].
Theo đánh giá của FAO, nhu cầu dùng chitin trên thế giới còn tăng cao trong thế kỷ tới.
Do những hạn chế về khả năng hòa tan của chitin nên người ta tiến hành
nghiên cứu các chế phẩm từ chitin.
Năm 1994 Shigermase và các cộng sự cho rằng Lysozyme có khả năng thủy
phân chitin rất tốt trong điều kiện to = 37oC, pH = 5,4 với phương pháp:
Phương pháp A (sử dụng một lượng nhỏ Lysozyme): Sự thủy phân chất
keo chitin bởi Lysozyme. Cho một ít chất keo chitin (0.5% w/v, 10 ml) trong 0,2
M dung dịch đệm acetate (pH = 5,4) với 0,05% NaN3, được ủ với lysozyme (2
mg/ml, 1 ml), tại 370C trong 3 ngày và sau đó cho thêm dung dịch enzyme
lysozyme vào (1ml). Sau 3 ngày, lấy đi ly tâm và những sản phẩm trên bề mặt
dung dịch mang đi phân tích bởi HPLC.
Phương pháp B (sử dụng một lượng lớn enzyme lysozyme): Chitosan đã
được deacetyl 30 – 72%. Cho thêm vào 20mg enzyme lysozyme, tạo nên một
hỗn hợp, đem đi ủ ở 37oC. Trong thời gian ủ, tách ra 0,5 ml đưa ra ngoài và phân
tích bằng HPLC .


13

Năm 1997 Muzzarelli cho rằng Strepmyces griseus HUT 6037 tiết ra enzyme
ngoại bào chitinase ứng dụng thủy phân chitin của loài giáp xác.
Quy trình sản xuất chitin của Hackman
Vỏ tôm được làm sạch bằng cách cạo và rửa dưới vòi nước chảy rồi sấy khô

trong lò sấy ở nhiệt độ 100oC. Lượng dùng là 220 gam được ngâm trong 2 lít HCl
2N trong thời gian 5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó vớt ra rửa kỹ với nước và sấy ở
100oC. Sau đó nghiền thành bột, bột nhuyễn này được trích trong bình cầu và lắc
mạnh trong 48 giờ với 0.5 lít HCl 2N, ly tâm bỏ phần lỏng, phần rắn được rửa kỹ,
và tiếp tục được chiết bằng cách lắc mạnh trong 12 giờ với 0,5 lít NaOH 1N ở
100oC. Quy trình trích ly trong dung dịch kiềm được thực hiên 3 lần, sau đó phần
rắn được thu hồi và rửa nhiều lần với nước cho đến khi trung tính. Cuối cùng rửa
với ethanol và ether, rồi sấy khô, chitin thu được có màu vàng .
Quy trình sản xuất chitin của Wistler và Beniller
Lọc vỏ tôm được rửa sạch, sấy khô trong lò sấy chân không ở 50oC. Dùng
500 gam xây nguyễn rồi ngâm trong dung dịch NaOH 10% ở nhiệt độ phòng trong
3 ngày dung dịch kiềm được thay đổi hằng ngày. Những hạt đã được loại protein
được rửa với nước rồi nghiền với ethanol 95% cho đến khi phần nước lọc gần như
không màu (thao tác này dùng khoảng 6 lít ethanol 95%). Phần rắn lại tiếp tục đem
nghiền với khoảng 1 lít acetone, 2,5 lít ethanol và 0,5 lít ether, sau đó lọc những hạt
thu được gần như không màu, sấy khô ở áp suất kém và được ngâm trong dung dịch
HCl 37%, ở 20oC trong 4 ngày. Những hạt trương phồng được ly tâm tách ra ở 0oC
và rửa với nước ở 0oC cho đến khi hết acid. Hiệu suất là 20% (100g) hàm lượng
nitơ là 7,1%.
Quy trình sản xuất chitin của Roseman
Vỏ tôm được khử Ca giống như phương pháp Hackman ở trên. Cân 100 gam
được lắc rung cơ học trong 18 giờ với 100 ml dung dịch acid formic đặc (90%) ở
nhiệt độ phòng. Lọc lấy phần bã, rửa kỹ với nước và được xử lý trong 2 giờ với
dung dịch NaOH 10%. Đem lọc, phần bã thu được có màu trắng, rửa dưới vòi nước
đến khi trung tính, sau đó rửa vài lần với ethanol và ether rồi sấy khô dưới áp suất


14

kém, hiệu suất khoảng 50 - 60%, hàm lượng nitơ là 8,5%, hàm lượng acetyl là

19,2%.
1.4. Khả năng ứng dụng của chitin và oligochitin
1.4.1. Ứng dụng của chitin.
- Trong thực phẩm
Chitin, chitosan là một polymer tự nhiên không độc và rất an toàn đối với
thực phẩm, với tính năng kháng khuẩn, chống ẩm, tạo màng, có khả năng hấp phụ
một số kim loại nặng, nên chitosan được nghiên cứu ứng dụng trong ngành công
nghệ sản xuất thực phẩm và bảo quản. Ngoài ra, chitin có thể ứng dụng làm chất
phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai cho thực phấm thay thế một số chất không
cho phép (như hàn the…).
- Trong công nghệ sinh học
Trong lĩnh vực công nghệ sinh học chitin-chitosan là một chất mang phù hợp
cho sự cố định enzyme tế bào. Enzyme cố định tế bào là một chất xúc tác sinh học
hoạt động trong một không gian linh hoạt. Enzyme cố định cho phép mở ra việc sử
dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học, khoa học, khoa học phân
tích,...enzyme cố định được sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác như là
trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước quả. Sử dụng enzyme cố định rất
thuận lợi và đạt hiệu quả cao.
- Trong công nghiệp giấy
Chỉ cần bỏ ra 1% chitin tính theo trọng lượng vào bột giấy cũng đã đủ làm
tăng sức dẻo dai của giấy. Nhờ đó, các nhà máy có thể dùng ít chất sợi hơn nhưng
vẫn giữ được phần tốt cuả giấy. Theo ước tính các nhà sản xuất có thể tiết kiệm
được 90% năng lượng tiêu thụ vì bây giờ họ không cần đánh bột giấy để rút nước
ra. Loại giấy được chế tạo từ chitin dễ in hơn giấy bình thường và khó rách hơn khi
giấy bị ướt. Với đặc tính này chitin được ứng dụng chế tạo tã lót cho trẻ em, khăn
giấy và bao giấy gói hàng.


15

- Trong công nghiệp khác
Chitin và các dẫn xuất của nó phổ biến là chitosan, đã được ứng dụng vào
quá trình xử lí nước, là chất thêm vào trong dầu gội, làm da nhân tạo, chất chống
nấm, các chất xơ... [10].
1.4.2. Ứng dụng của oligochitin
Trong công nghệ thực phẩm: Oligochitin được dùng để bảo quản cá, tôm,…
- Trong nông nghiệp
Oligochitin được dùng để tạo lớp phủ ngoài bảo quản hạt giống, điều hòa
đất, làm tăng trưởng lá, tiêu diệt mầm bệnh, kháng nấm,…
Oligochitin còn ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của cây.
Chế phẩm oligosaccharide ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của
ngô. Với nồng độ phun thích hợp là 40 ppm, số lần phun là 3 lần/vụ, liều lượng là
300 lít/ha, năng suất sau khi sử dụng tăng 20% so với đối chứng ( theo nghiên cứu
cứu của Đại học Nông nghiệp I Hà Nội) [6].
Nguyễn Anh Dũng (2004) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm
oligosaccharide lên lá đậu phộng, đậu tương đến số nốt sàn ở rễ. Kết quả cho thấy
nồng độ 40 ppm đã làm tăng 50% số lượng nốt sần so với mẫu đối chứng phun
nước lã [2].
- Trong y học
Oligochitin và các chế phẩm của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích
các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây
bệnh. Đồng thời oligochitin còn được sử dụng làm thuốc để hạ cholesterol trong
máu [4]. Trường Đại học Pukyong National Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công
ứng dụng của oligochitin trong việc tăng sức đề kháng điều hòa lượng cholesterol,
cải thiện máu và bệnh gan, điều hòa áo suất trong máu, làm tăng khả năng hấp thụ
canxi, điều trị các bệnh: Viêm loét dạ dày, bệnh tiêu chảy,…
Oligochitin có tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nên được sử dụng để làm
chất bảo quản nguyên liệu thủy sản.

16

1.5. Tổng quan về phương pháp sản xuất oligochitin và đánh giá hoạt
tính
1.5.1. Tổng quan về phương pháp hóa học
Thủy phân chitin bằng phương pháp hóa học là sử dụng các chất acid để cắt
mạch chitin ở nhệt độ cao. Quá trình thủy phân tạo thành các phân tử glucosamine
có hoạt tính sinh học cao, quá trình này xảy ra ở các mối nối 1,4-glucozit, sau đó
loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3) tạo thành thành 88,5% D-Glucosamin và 12,5%
acid acetic [6].
Phương trình thủy phân:
(C32H54N4O21)x + 2(H2O)x = (C28H50N4O19)x + 2(CH3COOH)x

ot

Acid đậm
đặc

Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin bằng phương pháp hóa học:

Hình 1.6. Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin