Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của interleukin 2 tái tổ hợp sản xuất tại việt nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆN KH&CN VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04.21/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA
INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM
DÙNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ”
(MÃ SỐ: KC.04.21/06-10)

Cơ quan chủ trì đề tài:

Viện Công nghệ sinh học

Chủ nhiệm đề tài:

PGS. TS. Trương Nam Hải
8414
Hà Nội – 2010

Bản báo cáo hoàn thành ngày 08/12/2010.
Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC.04.21/06-10.
Mọi sao chép phải được sự đồng ý của Viện Công nghệ sinh học.


BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆN KH&CN VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04.21/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA
INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM
DÙNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ”
(MÃ SỐ: KC.04.21/06-10)

Chủ nhiệm đề tài:

Cơ quan chủ trì đề tài:

PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI
TL Bộ Khoa học và Công nghệ
Vụ Khoa học và Công nghệ
các ngành KT-KT

Giám đốc Văn phòng các chương trình

Hà Nội - 2010


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10

MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................5
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................................7
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ..............................................................................9
LỜI MỞ ĐẦU ....................................................................................................................13
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................................... 16
1.1. Cytokine và ung thư ............................................................................................................................... 16
1.1.1. Cơ chế ung thư............................................................................................................................... 17
1.1.2. Tình hình bệnh ung thư ................................................................................................................. 18
1.1.3. Các phương pháp điều trị bệnh ung thư........................................................................................ 20
1.1.4. Liệu pháp điều trị bằng cytokine- hiện trạng và tương lai ........................................................... 22
1.2. Interleukin-2 ........................................................................................................................................... 24
1.2.1. Cấu trúc gen của IL-2 của người................................................................................................... 25
1.2.2. Mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của IL-2 người............................................................. 25
1.2.3. Ứng dụng của IL-2 trong điều trị .................................................................................................. 28
1.2.3.1. Điều trị ung thư biểu mô tế bào thận và u hắc tố ác tính ..................................................... 29
1.2.3.2. Điều trị bệnh nhân nhiễm HIV ............................................................................................. 31
1.3. Sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp ........................................................................................................... 33
1.3.1. Công nghệ sản xuất trên thế giới................................................................................................... 34
1.3.2. Sản xuất tại Việt Nam ................................................................................................................... 35
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................ 37
2.1. Vật liệu ................................................................................................................................................... 37
2.1.1. Vật liệu sinh học (chủng vi sinh vật, vector, động vật thí nghiệm) ............................................. 37
2.1.2. Các loại vật tư, hóa chất và sinh phẩm ......................................................................................... 38
2.1.3. Máy móc và thiết bị....................................................................................................................... 40
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................................ 46
2.2.1. Kỹ thuật PCR................................................................................................................................. 46
2.2.2. Tách dòng gen trong vecor đầu bằng pJET1/Blunt ...................................................................... 46
2.2.3. Phương pháp cắt và nối ghép gen vào vector pET22b(+) ............................................................ 47

2.2.4. Phương pháp biến nạp gen vào tế bào E. coli............................................................................... 48
2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid.......................................................................................... 49
2.2.6. Phương pháp biểu hiện gen il-2 dạng đơn trong tế bào vi khuẩn E. coli .................................... 50
2.2.7. Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào E. coli..................................................................... 50
2.2.8. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô tiền tinh chế ......................................................................... 51

1


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
2.2.9. Phương pháp biểu hiện gen il-2 trong tế bào P. Pastoris............................................................. 52
2.2.10. Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào P. pastoris............................................................ 52
2.2.11. Phương pháp thu hồi và bảo quản sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thô sau lên men nấm men P.
pastoris..................................................................................................................................................... 53
2.2.12. Phương pháp lọc – cô mẫu – trao đổi đệm qua hệ lọc tiếp tuyến MidJet .................................. 53
2.2.13. Phương pháp sắc ký lỏng nhanh trên hệ thống FPLC ................................................................ 54
2.2.14. Phương pháp tinh chế trên hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC ................................................. 55
2.2.15. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE................................................................................... 55
2.2.16. Xác định hàm lượng protein bẵng kỹ thuật phân tích hình ảnh SDS-PAGE trên phần mềm
chuyên dụng Quantity One...................................................................................................................... 57
2.2.17. Kỹ thuật Western blot.................................................................................................................. 58
2.2.18. Phương pháp kiểm tra hoạt tính IL-2 sau khi tạo công thức trên dòng tế bào đặc hiệu CTLL259
2.2.19. Định lượng độ ẩm tồn dư trong sản phẩm đông khô [76]. ......................................................... 61
2.2.20. Phương pháp xác định tính vô trùng cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp........................................... 62
2.2.21. Phương pháp xác định an toàn chung cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp [76] ................................. 64
2.2.22. Thiết kế thí nghiệm để đánh giá chất lượng IL-2 tái tổ hợp trên dòng tế bào lympho người. .. 64
2.2.23. Tách tế bào lympho máu ngoại vi............................................................................................... 65
2.2.24. Thử nghiệm nuôi cấy tăng sinh tế bào lympho........................................................................... 65
2.2.25. Thử nghiệm chế tiết cytokine...................................................................................................... 66
2.2.26. Hoạt hóa và nhân nuôi các dòng tế bào gây ung thư.................................................................. 67

2.2.27. Gây u thực nghiệm cho chuột ..................................................................................................... 68
2.2.28. Tách tế bào từ khối u................................................................................................................... 68
2.2.29. Làm tiêu bản mô học ................................................................................................................... 69
2.2.30. Gây u và tác động thuốc lên chuột.............................................................................................. 70
2.2.31. Xác định sự tăng trọng lượng của chuột trong quá trình thí nghiệm ......................................... 71
2.2.32. Xác định tỷ số phát triển và tỷ số ức chế u ................................................................................ 71
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................................. 73
3.1. Nghiên cứu tạo IL-2 tái tổ hợp quy mô phòng thí nghiệm.................................................................... 74
3.1.1. Tách dòng gen il-2 trong tế bào E. coli......................................................................................... 75
3.1.2. Tạo vector biểu hiện gen pET22-IL2MN ..................................................................................... 76
3.1.3. Biểu hiện gen il-2 đơn trong tế bào E. coli BL21........................................................................ 77
3.1.4. Kiểm tra lại dòng tế bào E. coli sử dụng làm MCB. ................................................................... 78
3.1.5. Tối ưu quá trình tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp dạng thô............................................................... 80
3.1.5.1. Tối ưu dòng tế bào vi khuẩn E. coli ..................................................................................... 80
3.1.5.2. Tối ưu dòng tế bào nấm men P. pastoris ............................................................................. 87
3.1.6. Đánh giá và so sánh hiệu quả tổng hợp sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ hai dòng tế bào E. coli và P.
pastoris..................................................................................................................................................... 96

2


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
3.1.6.1. So sánh chất lượng IL-2 của hai loại sản phẩm lên men bằng kỹ thuật Western Blot........ 96
3.1.6.2. So sánh hàm lượng IL-2 sau lên men trên SDS-PAGE ....................................................... 97
3.1.7. Tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ nguồn lên men dòng tế bào P. pastoris .......................................... 100
3.1.7.1. Xử lý mẫu IL-2 thô tiền tinh chế (từ dòng tế bào P. pastoris) .......................................... 100
3.1.7.2. Tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dòng tế bào P. pastoris lần 1 (FPLC) .................................... 104
3.1.7.3. Tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dòng tế bào P. pastoris lần 2 (HPLC).................................... 105
3.1.8. Tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ nguồn lên men dòng tế bào E. coli. ................................................ 108
3.1.8.1. Xử lý mẫu IL-2 thô tiền tinh chế (từ dòng tế bào E. coli) ................................................. 109

3.1.8.2. Tinh chế IL-2 tái tổ hợp (từ dòng tế bào E. coli) ............................................................... 112
3.1.9. So sánh hiệu quả tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ hai hệ tế bào E. coli và P. pastoris.............. 114
3.1.10. Tạo công thức sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế ............................................................. 118
3.2. Sản xuất thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trong điều kiện chuẩn GMP ..................................... 123
3.2.1. Tiêu chuẩn GMP cho sản xuất thử nghiệm................................................................................. 124
3.2.1.1. Con người............................................................................................................................ 125
3.2.1.2. Hệ thống nhà xưởng ........................................................................................................... 125
3.2.1.3. Quy định hướng (chiều) đi của quy trình, con người và nguyên vật liệu.......................... 128
3.2.1.4. Vệ sinh khu sản xuất - trang thiết bị................................................................................... 132
3.2.2. Sản xuất thử nghiệm 05 loạt sản phẩm ....................................................................................... 133
3.2.2.1. Hồ sơ (Chi tiết kết quả xem thêm sản phẩm Hồ sơ sản xuất 05 loạt IL-2 tái tổ hợp) ...... 133
3.2.3. Tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp.......................................................................... 137
3.2.4. Đánh giá chất lượng và an toàn cho sản phẩm đã sản xuất theo tiêu chuẩn cơ sở (chi tiết trong
sản phẩm dạng II - Hồ sơ kiểm định sản phẩm IL-2 tái tổ hợp) .......................................................... 140
3.2.4.1. Cảm quan ............................................................................................................................ 141
3.2.1.2. Độ ẩm tồn dư (Hàm ẩm)..................................................................................................... 141
3.2.1.3. Độ pH.................................................................................................................................. 141
3.2.1.5. Vô khuẩn (vô trùng)............................................................................................................ 142
3.2.1.6. Nội độc tố vi khuẩn............................................................................................................. 142
3.2.1.7. Thử nghiệm an toàn chung (độc tính bất thường).............................................................. 143
3.2.1.8. Độ tinh khiết (độ tinh sạch) ................................................................................................ 144
3.2.1.9. Đặc hiệu miễn dịch và trọng lượng phân tử....................................................................... 145
3.3. Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trên các dòng tế bào động vật và trên động vật thực
nghiệm ......................................................................................................................................................... 146
3.3.1. Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trên các dòng tế bào lympho người ................ 147
3.3.1.1. Thay đổi hình thái và số lượng tế bào ................................................................................ 147
3.3.1.2. Thử nghiệm MTT ............................................................................................................... 149
3.3.1.3. Phương thức đáp ứng của tế bào phụ thuộc liều của 2 chế phẩm IL-2 ............................. 150
3.3.1.4. Thay đổi nồng độ cytokine trong dịch nuôi cấy tế bào được kích thích bằng hai chế phẩm
IL-2 tái tổ hợp và PHA .................................................................................................................... 152

3


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
3.3.2. Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trên động vật thực nghiệm .............................. 155
3.3.2.1. Kết quả hoạt hóa, nhân nuôi và duy trì các dòng tế bào ung thư ...................................... 156
3.3.2.2. Kết quả gây u thực nghiệm cho động vật........................................................................... 158
3.3.2.3. Kết quả thử hoạt tính ức chế khối u của IL-2 VN và IL-2 TQ trên động vật mang khối u
thực nghiệm...................................................................................................................................... 161
3.4. Kiểm định sản phẩm IL-2 tái tổ hợp theo tiêu chuẩn cơ sở ................................................................ 166
3.4.1. Kiểm định trong nước ................................................................................................................. 166
3.4.2. Kiểm định Quốc tế....................................................................................................................... 167
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................................................ 169
4.1. Kết luận ................................................................................................................................................ 169
4.2. Kiến nghị .............................................................................................................................................. 170
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 171
PHỤ LỤC ......................................................................................................................................................... 177
1. Trình tự nucleotide của gen il-2 người và trình tự dịch mã ra amino acid của IL-2 sử dụng trong quá
trình biểu hiện gen....................................................................................................................................... 177
2. So sánh trình tự DNA của gen il-2 trong vector tác dòng với gen il-2 lý thuyết................................... 180
3. Các sơ đồ vector sử dụng trong Đề tài................................................................................................... 182
4. Kết quả kiểm nghiệm trong nước với sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của Đề tài .......................................... 184
5. Kết quả kiểm nghiệm Quốc tế với sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của Đề tài ............................................... 185
6. Các sáng chế liên quan đến sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của Đề tài .......................................................... 190
7. Kiểm tra trình tự amino acid của IL-2 tái tổ hợp.................................................................................... 191
7.1. r-IBinleukin-2 (IL-2 tái tổ hợp của Đề tài) .................................................................................... 191
7.1.1. Phổ khối các peptide r-IBinleukin-2 được phân tích trên hệ LC-ESI-ion TRAP ................ 191
7.1.2. Nhận diện protein rBInleukin-2............................................................................................. 195
7.2. IL-2 tái tổ hợp của Trung Quốc .................................................................................................... 198

7.2.1. Phổ khối các peptide của sản phẩm IL2 của Trung Quốc được phân tích trên hệ LC-ESI-ion
TRAP................................................................................................................................................ 198
7.2.2. Nhận diện IL2 thương phẩm của Trung Quốc ...................................................................... 201
8. Tính giá thành sản phẩm r-IBinleukin-2 của Đề tài theo loạt sản xuất (1000 lọ/loạt) .......................... 203
9. Một số sản phẩm protein tái tổ hợp đã thương mại hóa mang amino acid Methionine ở đầu N .......... 206
9.1. Somatrem Product .......................................................................................................................... 206
9.2. G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)......................................................................... 206
9.3. IL-2 human ..................................................................................................................................... 207

4


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

3LL
Amp
APS
BCG
BMGY
BMMY
bp
CML
CTL
ĐCUT
DMEM

DNA
dNTP
dOT
E. coli
EDTA
ELISA
EPO
FDA
FPLC
G-CSF

Tế bào ung thư biểu mô phổi
Ampicillin
Ammonium Persulfate
Baccillus Calmette-Gurin
Buffered Minimal Glycerol Media
Buffered Minimal Methanol Media
Base pair
Chronic Myeloid Leukaemia
Cytolytic T lymphocyte (tế bào lympho T độc)
Đối chứng ung thư
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium
Deoxyribonucleic acid
Deoxyribonucleotide triphosphate
Dissolved oxygene tensions
Escherichia coli
Ethylen diamin tetra acid acetic
Enzyme-linked immunosorbent assay
Erythropoietin
Food and Drug Administration

Fast Protein Liquid Chromatography
Granulocyte-colony stimulating factor (yếu tố kích thích dòng bạch cầu
hạt)
Growth factors (các nhân tố sinh trưởng)
Granulocyte-macrophage colony stimulating factor ( yếu tố kích thích
dòng bạch cầu hạt-đại thực bào)
Good Manuafacturing Practice (điều kiện thực hành sản xuất tốt)
Tỷ số phát triển khối u
Human immunodeficiency virus
High Performance Liquid Chromatography
The International Agenecy for Research on Cancer
Interferon
Interleukin-2
Thời gian sống thêm
Isopropylthio-β-D-galactoside
Tỷ số thoái lui
Kilobase
Kilo Dalton
Lymphokine-activated killer (tế bào diệt hoạt hóa bởi lymphokine)
Luria and Bertani
Lysyl hydroxylase 1
Lysate

GFs
GM-CSF
GMP
GR%
HIV
HPLC
IARC

IFN
IL-2
ILS
IPTG
IR%
Kb
kDa
LAK
LB
LH1
LS

5


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
MCB
MWCB
NK
OD
P. pastoris
PBS
PDGF
PMSF
PVDF
Sar. 180
SDS-PAGE
TBS
TBUT
TEMED

TNF
YNB
YPD

Master Cell Bank
Manufacturer’s Working Cell Bank
Natural killer (tế bào diệt tự nhiên)
Optical Density
Pichia pastoris
Phosphate Buffered Saline
Platelet-derived growth factor (yếu tố tăng trưởng tiểu huyết cầu)
Phenyl Methane Sulphonyl Fluoride
Polyvinylidene fluoride
Tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180
Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Tris Buffered Saline
Tế bào ung thư
Tetramethylethylenediamine
Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử ung thư)
Yeast Nitrogen Base
Yeast Peptone Dextrose

6


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1: Thành phần môi trường M9 ...............................................................................38
Bảng 2. 2. Danh sách trang thiết bị sử dụng trong sản xuất IL-2 tái tổ hợp ........................41

Bảng 2. 3: Bảng đánh giá hiệu lực của H. Itokawa .............................................................72
Bảng 3. 1: So sánh các thông số trong quá trình tạo sản phẩm IL-2 tinh chế từ hai nguồn E.
coli và P. pastoris ..............................................................................................................117
Bảng 3. 2: Các thông số về kiểm tra hoạt tính IL-2...........................................................122
Bảng 3. 3. Kết quả chuẩn bị chủng sản xuất E. coli ..........................................................133
Bảng 3. 4. Kết quả OD sau nuôi cấy vi khuẩn E. coli trên nồi lên men Marubishi 10L ...134
Bảng 3. 5. Kết quả thu hoạch sinh khối E. coli sau lên men .............................................135
Bảng 3. 6. Kết quả thu được sau xử lý protein thô ............................................................135
Bảng 3. 7. Kết quả thu IL-2 sau tinh chế HPLC................................................................136
Bảng 3. 8: Số lượng IL-2 thành phẩm thu được sau sản xuất............................................137
Bảng 3. 9. Kết quả kiểm tra cảm quan của 05 loạt IL-2 ....................................................141
Bảng 3. 10. Kết quả đo độ ẩm tồn dư của 05 loạt IL-2 thành phẩm..................................141
Bảng 3. 11. Kết quả pH của 05 loạt IL-2 thành phẩm .......................................................141
Bảng 3. 12. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học 05 loạt IL-2 thành phẩm........................142
Bảng 3. 13. Kết quả thử nghiệm vô khuẩn 05 loạt IL-2 ....................................................142
Bảng 3. 14. Kết quả kiểm tra nội độc tố vi khuẩn .............................................................143
Bảng 3. 15. Kết quả kiểm tra an toàn chung của 05 loạt IL-2 ...........................................144
Bảng 3. 16. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của 05 loạt IL-2 .............................................144
Bảng 3. 17. Tỷ lệ tạo khối u trên chuột nhắt.....................................................................158
Bảng 3. 18: Bảng phân lô và lịch trình thí nghiệm trên mô hình u báng..........................161
Bảng 3. 19: Bảng phân lô và lịch trình thí nghiệm trên mô hình u rắn dưới da ................161
Bảng 3. 20: Bảng phân lô và lịch trình thí nghiệm theo dõi thời gian sống kéo dài thêm của
chuột...................................................................................................................................161

7


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
Bảng 3. 21: Tổng hợp kết quả khảo sát tác dụng của IL-2 lên chuột mang u báng Sar. ...162
Bảng 3. 22. So sánh hiệu lực kháng u rắn 3LL dưới da của IL-2 tái tổ hợp......................164

Bảng 3. 23. Thời gian sống trung bình (TGSTB) và thời gian sống kéo dài thêm (ILS) của
chuột ở các lô thí nghiệm...................................................................................................165

8


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
Hình 1. 1: Mô hình quá trình chuyển biến từ tế bào bình thường thành ung thư ................18
Hình 1. 2: Sự phân bố của bệnh ung thư trên toàn cầu..........................................................1
Hình 1. 3: Cấu trúc không gian của Interleukin-2 .................................................................1
Hình 1. 4: Sự khác nhau giữa 3 loại thụ thể IL-2 hình thành nên 3 dạng..............................1
Hình 1. 5: Minh họa 04 giai đoạn phát triển của ung thư biểu mô tế bào thận [43]............29
Hình 1. 6: U hắc tố ác tính [48] ...........................................................................................30
Hình 1. 7: Sơ đồ miêu tả quá trình IL-2 kích hoạt các yếu tố miễn dịch trong bệnh nhân
nhiễm HIV [55]....................................................................................................................32
Hình 2. 1: Hệ thống lên men Bioflo 110, bình 5 lít (NBS, Mỹ) ..........................................44
Hình 2. 2: Hệ thống lọc tiếp tuyến MidJet (GE Healthcare) .................................................1
Hình 2. 3: Hệ sắc ký lỏng nhanh FPLC (Amersham Pharmacia Biotech).............................1
Hình 2. 4: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC (Shimadzu, Nhật Bản).................................1
Hình 2. 5: Các loại cột được sử dụng để tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC ........................1
Hình 3. 1: Sơ đồ quá trình nghiên cứu để sản xuất thử nghiệm sản phẩm ..........................74
Hình 3. 2: Điện di kiểm tra sản phẩm DNA trên gel agarose 0,8%.......................................1
Hình 3. 3: Kiểm tra sản phẩm DNA trong quá trình tạo vector biểu hiện trên gel agarose
0,8%. ......................................................................................................................................1
Hình 3. 4: Kiểm tra sản phẩm IL2 biểu hiện dạng đơn trong tế bào E. coli BL21................1
Hình 3. 5: Hình thái tế bào E. coli tái tổ hợp sử dụng làm MCB. .........................................1
Hình 3. 6: Kiểm tra sự biểu hiện của dòng tế bào E. coli mang gen il-2MN với các nồng độ
chất cảm ứng IPTG khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6%. ...........................................1

Hình 3. 7: Kiểm tra sự biểu hiện của dòng tế bào E. coli mang gen il-2MN ở các môi
trường khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6%. ................................................................1
Hình 3. 8: Xác định sự biểu hiện IL-2 phụ thuộc điều kiện pH môi trường..........................1
Hình 3. 9: Động thái trong quá trình lên men dòng tế bào E. coli biểu hiện IL-2 tái tổ hợp
trên hệ thống lên men Bioflo 110 dung tích 5 lít. ..................................................................1

9


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
Hình 3. 10: Kiểm tra sản phẩm IL-2 trên gel polyacrylamide 12,6%....................................1
Hình 3. 11: Kiểm tra kiểu hình dòng tế bào P. pastoris ........................................................1
Hình 3. 12: Kiểm tra sản phẩm biểu hiện trên gel polyacrylamide 12,6%............................1
Hình 3. 13: Kiểm tra sản phẩm lên men ở các điều kiện pH khác nhau trên gel
polyacrylamide 12,6%. ..........................................................................................................1
Hình 3. 14: Kiểm tra sản phẩm lên men ở các điều kiện pH khác nhau bằng kỹ thuật
Western Blot. .........................................................................................................................1
Hình 3. 15: Kiểm tra sản phẩm IL-2 tạo ra theo thời gian bằng SDS-PAGE........................1
Hình 3. 16: Động thái của quá trình lên men IL-2 trên chủng P. pastoris thể hiện qua các
thông số dO2 và OD600 ..........................................................................................................1
Hình 3. 17: Kiểm tra sản phẩm IL-2 tạo ra theo thời gian trên bằng kỹ thuật Western blot. 1
Hình 3. 18: So sánh chất lượng sản phẩm lên men thô IL-2 tạo ra từ các chủng vi sinh vật
tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot....................................................................................1
Hình 3. 19: So sánh sản phẩm IL-2 tạo ra từ các chủng vi sinh tái tổ hợp khác nhau trên gel
polyacrylamide 12,6% ...........................................................................................................1
Hình 3. 20: Phân tích phổ protein từ gel polyacrylamide 12,6%...........................................1
Hình 3. 21: Chiến lược tinh chế IL-2 từ sản phẩm lên men nấm men P. pastoris ................1
Hình 3. 22: Kiểm tra sản phẩm protein trên gel polyacrylamide 12,6%. ..............................1
Hình 3. 23: Sắc ký đồ tinh chế và kiểm tra sản phẩm đã tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ nấm
men trên cột Hitrap ANX.......................................................................................................1

Hình 3. 24: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 lần 2 từ tế bào P. pastoris trên hệ thống HPLC ...........1
Hình 3. 25: Kiểm tra sản phẩm IL-2 tinh chế qua hệ thống HPLC trên gel polyacrylamide
12,6%. ....................................................................................................................................1
Hình 3. 26: Chiến lược tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ sản phẩm lên men vi khuẩn E. coli........1
Hình 3. 27: Kiểm tra tính tan của IL-2 trong các nồng độ Gu-HCl khác nhau trên gel
polyacrylamide 12,6%. ..........................................................................................................1
Hình 3. 28: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC .....................................................1
Hình 3. 29: Kiểm tra sản phẩm tinh chế IL-2 bằng kỹ thuật SDS-PAGE. ............................1
Hình 3. 30: Kiểm tra sản phẩm tinh chế IL-2 bằng kỹ thuật SDS-PAGE. ............................1

10


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
Hình 3. 31: Kiểm tra độ sạch của các sản phẩm protein........................................................1
Hình 3. 32: Sơ đồ quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp thành phẩm tại Công ty Vắcxin và
sinh phẩm số 1 .......................................................................................................................1
Hình 3. 33: Sơ đồ khu vực sản xuất IL-2 tái tổ hợp tại Công ty Văcxin và sinh phẩm số 1 .1
Hình 3. 34: Chiều đi của quy trình sản xuất Interleukin-2 ....................................................1
Hình 3. 35: Chiều đi của nhân viên trong khu sản xuất.........................................................1
Hình 3. 36: Đường vào của nguyên liệu đầu .........................................................................1
Hình 3. 37: Đường ra của rác thải – dụng cụ.........................................................................1
Hình 3. 38: Kết quả so sánh sinh khối vi khuẩn (OD) của 05 loạt lên men E. coli ...........134
Hình 3. 39: Các lọ sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thành phẩm......................................................1
Hình 3. 40: Phân tích độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 . .......................................................1
Hình 3. 41: Kiểm tra 05 loạt sản phẩm IL-2 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot. ............1
Hình 3. 42: Hình thái tế bào đáp ứng với IL-2 và chất kích thích phân bào PHA ............148
Hình 3. 43: Hoạt tính gây đổi mầu cơ chất MTT ..............................................................149
Hình 3. 44: Đáp ứng của tế bào với nồng độ IL-2 khác nhau............................................151
Hình 3. 45: Nồng độ 9 cytokine trong dịch nuôi cấy tế bào (n = 8) ..................................153

Hình 3. 46: Biến đổi nồng độ của 5 cytokine có thay đổi nồng độ (n = 8)........................154
Hình 3. 47: Hình ảnh TBUT Sar.180 sau 48h trong môi trường nuôi cấy (A) và trên tiêu
bản dàn, nhuộm HE (B), độ phóng đại 600x .....................................................................157
Hình 3. 48: Hình ảnh TBUT dòng 3LL sau 24h (A) và 72h (B)trong môi trường nuôi cấy,
độ phóng đại 200x .............................................................................................................157
Hình 3. 49: Hình ảnh chuột Swiss mang u báng Sar.180 ..................................................159
Hình 3. 50: Hình ảnh chuột Swiss mang u rắn Sar.180 ở đùi phải...................................159
Hình 3. 51: Hình ảnh chuột BALB/c mang u rắn 3LL ở đùi phải .....................................159
Hình 3. 52: Hình ảnh chuột BALB/c mang u rắn 3LL dưới da .........................................159
Hình 3. 53: Các đại thực bào (mũi tên) xuất hiện tại vùng mô bị xâm lấn bởi các tế bào ung
thư (1000x) ........................................................................................................................160
Hình 3. 54: Biểu đồ về tỷ số phát triển và ức chế u ở các lô thí nghiệm ...........................163

11


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
Hình 3. 55: Đồ thị tăng trưởng kích thước trung bình của u rắn ở các lô thí nghiệm........164
Hình 3. 56: Đồ thị về tỷ lệ chuột sống sót ở các lô trong 33 ngày tiến hành thí nghiệm...166

12


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10

LỜI MỞ ĐẦU
Cytokine là một sản phẩm của hệ miễn dịch, chúng do nhiều loại tế bào
tiết ra, tác dụng đa hướng, đa năng, thậm chí có thể tác dụng ngược lên chính
bản thân tế bào tiết ra chúng. Đối với bệnh ung thư, cytokine được phát hiện
là có sự liên quan không chỉ với nguyên nhân gây ra ung thư mà còn liên quan

đến khả năng chữa trị bệnh ung thư. Sự chọn lựa chính xác các yếu tố liên
quan đến quá trình hình thành và phát triển của bệnh ung thư mang tính quyết
định đến việc sử dụng cytokine trong liệu pháp điều trị bệnh.
Theo hướng ứng dụng để điều trị, các loại cytokine đã được nghiên cứu
và phát triển nhằm tạo ra được sản phẩm thương mại. Trong số các cytokine
đó, Interleukin-2 tái tổ hợp là một trong những loại cytokine được thương mại
hóa sớm nhất và cũng sớm được Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ
(FDA) cấp phép sử dụng trong điều trị (1992). Ngoài việc điều trị ung thư đặc
biệt là ung thư biểu mô tế bào thận và u hắc tố ác tính, loại cytokine này còn
thể hiện được hiệu quả khi điều trị kết hợp với các loại thuốc khác đối trên
bênh nhân mắc các bệnh ung thư khác như ung thư vú, ung thư phổi… Gần
đây, các nhà nghiên cứu còn đang mở rộng khả năng điều trị cho bệnh nhân
nhiễm HIV nhằm kích thích hệ miễn dịch, nâng cao số lượng tế bào CD8+.
Trước nhu cầu ngày càng lớn về sinh phẩm Interleukin-2, đã có nhiều
công trình nghiên cứu nhằm tạo ra IL-2 tái tổ hợp với giá thành hợp lý hơn.
Trong thực tế, đã có một số công trình nghiên cứu thành công và chuyển giao
cho các công ty để sản xuất ra được sản phẩm IL-2 thương phẩm. Sản phẩm
IL-2 thương phẩm đã thể hiện được tính ưu việt của một liệu pháp miễn dịch
nên được sử dụng ngày càng nhiều trong điều trị bệnh ung thư và bổ trợ điều
trị cho các bệnh khác cần tăng cường hệ miễn dịch.
13


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
Việt Nam là một nước đang phát triển, nền kinh tế đang trong quá trình
tăng trưởng mạnh mẽ. Tuy nhiên, đi kèm với sự phát triển đó là hàng loạt các
hệ lụy về môi trường, chế độ dinh dưỡng, tập quán sống. Đó cũng là nguyên
nhân lý giải tại sao tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang tăng nhanh. Ước tính trên cả
nước, có hơn 150000 ca ung thư mới mắc mỗi năm. Tỷ lệ mắc bệnh này đang
không ngừng gia tăng không loại trừ bất kỳ lứa tuổi nào. Chính vì vậy, bên

cạnh các phương pháp điều trị truyền thống như phẫu trị hay xạ trị, phương
pháp điều trị sử dụng liệu pháp miễn dịch cũng nên áp dụng rộng rãi nhằm
góp phần giảm bớt hậu quả do căn bệnh chết người này gây ra.
Tuy nhiên, trong thực tế, không chỉ có IL-2 tái tổ hợp mà các sinh
phẩm tái tổ hợp nói chung vẫn chưa thể tự sản xuất tại Việt Nam. Hầu hết các
sản phẩm đó đều nhập ngoại với giá thành cao. Đây cũng chính là lý do lý
giải cho việc sử dụng liệu pháp điều trị miễn dịch như IL-2 tái tổ hợp vẫn còn
bị bỏ ngỏ.
Xuất phát từ nhu cầu về dạng sinh phẩm tái tổ hợp trên, Viện Công
nghệ sinh học đã tập trung nghiên cứu nhằm phát triển các sinh phẩm tái tổ
hợp sử dụng trong điều trị nói chung và sinh phẩm IL-2 người tái tổ hợp nói
riêng. Năm 2005, Viện đã có thể tiến hành tạo ra được sản phẩm IL-2 tái tổ
hợp ở quy mô thí nghiệm. Tuy nhiên, sản phẩm tái tổ hợp này vẫn chưa thể
đáp ứng được tiêu chí cho một sinh phẩm sử dụng trong điều trị là chất lượng
và an toàn. Chính vì vậy, Đề tài “ Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của
Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị
ung thư” được tiến hành với mục đích chính là tạo ra được sản phẩm IL-2 tái
tổ hợp đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho một sinh phẩm sử dụng trong điều trị.
Cụ thể các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài như sau:
1) Xác định hệ vi sinh vật chủ (host cell) với khả năng biểu hiện tối ưu
cho quá trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp.
14


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
2) Chuẩn hóa quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp.
3) Đánh giá hiệu lực sản phẩm Interleukin-2.

15

Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cytokine và ung thư
Trong hệ miễn dịch của cơ thể, một chất hóa học do một tế bào tiết ra để
kích hoạt hoặc kìm hãm tác dụng của một tế bào khác được gọi là cytokine.
Cytokine do nhiều tế bào tiết ra, tác dụng đa hướng, đa năng, thậm chí có thể
tác dụng ngược lên chính bản thân tế bào tiết ra chúng. Vì vậy, ngoài tên
chung là cytokine, chúng còn có nhiều tên khác dựa theo chức năng hoặc dựa
theo tế bào đã tiết ra chúng.
Hầu hết các cytokine hoạt động hoặc được tạo ra dựa trên các tế bào
bạch cầu. Chúng là thành phần quan trọng trong việc điều khiển hệ thống
miễn dịch và viêm của cơ thể. Tất cả các cytokine đều có bản chất là
glycoprotein hoặc protein. Theo Thomson A.W., các cytokine được phân làm
04 nhóm chính sau [1]:
- Các Interferon (IFNs)
- Các Interleukin
- Các nhân tố hoại tử ung thư (TNFs)
- Các nhân tố sinh trưởng (GFs)
Ngoài ra, cytokine cũng có thể đặt tên dựa trên phụ thuộc vào nguồn gốc
tế bào tổng hợp ra chúng. Ví dụ như lymphokine (các cytokine được tổng hợp
bởi lymphocytes), monokine (cytokine được tổng hợp bởi tế bào đơn nhân –
monocytes), chemokine (cytokine với các hoạt tính chemotactic) và
interleukin (cytokine được tổng hợp bởi leukocyte và tác động lên các
leukocytes khác).
Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá
trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Tất
cả các loại tế bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối
16

Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
u (tumor). Các khối u này có thể là lành tính (benign) hoặc có thể biến thành
ác tính (malignant). Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không
cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và
chúng không đáp ứng với các tín hiệu chết theo chương trình của tế bào bình
thường (apoptosis). Đặc tính chung của các bệnh ung thư là sự sinh trưởng
không kiểm soát của tế bào và khả năng di căn hay lan rộng đến các vùng
khác nhau trên cơ thể người bệnh [2]. Đối với bệnh ung thư, cytokine được
phát hiện là có sự liên quan không chỉ với nguyên nhân gây ra ung thư mà còn
liên quan đến khả năng chữa trị bệnh ung thư. Tùy thuộc vào các kiểu khối u
khác nhau, các quy luật liên quan đến căn nguyên và cách điều trị bệnh ung
thư có sự liên quan mật thiết đến các cytokine khác nhau. Chính vì vậy, đối
với mỗi bệnh ung thư, sự chọn lựa chính xác các yếu tố liên quan đến quá
trình hình thành và phát triển của bệnh ung thư mang tính quyết định đến việc
sử dụng cytokine hay chất chống cytokine (anti-cytokine) trong liệu pháp điều
trị bệnh.
1.1.1. Cơ chế ung thư
Quá trình chuyển biến từ tế bào bình thường sang tế bào ác tính hay
yếu tố ung thư có thể diễn ra trong thời gian từ một vài tuần đến vài năm
(hình 1.1). Sự biến đổi ác tính đó có thể là do sự thừa hưởng về mặt di truyền.
Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, sự biến đổi ác tính đó là do sự đột
biến từ tế bào soma. Có vô số các biến cố có thể gây ra ung thư có liên quan
đến sự đột biến bao gồm như sự hoạt hóa các gen tiền ung thư
(protooncogen), sự bất hoạt gen ức chế khối u, hay sự đột biến với gen sửa sai
DNA trong chu kỳ tế bào. Các đột biến đó có thể xảy ra trong quá trình phân
chia tế bào bình thường, sự tăng bất thường của các tín hiệu kích thích phân
bào để biệt hóa, hoặc do các tác nhân gây ung thư ngoài môi trường. Quá
trình phát triển thành khối u là sự phát triển quá mức của các tế bào ung thư

17


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
và không chịu sự kiểm soát thông thường của cơ chế điều khiển quá trình biệt
hoá tế bào trong cơ thể. Các tế bào ung thư mới nhân lên cũng giống với tế
bào ung thư ban đầu và không thực hiện chức năng thông thường của tế bào
bình thường.
Tế bào bình thường

Tế bào sinh ung thư

Quá trình chuyển biến

Ung thư

- Các sai sót di truyền xảy
ra trong quá trình tái bản:
- Hoạt hóa gen ung thư
- Bất hoạt gen ức chế
khối u.
- Đánh hỏng gen sửa sai
DNA.
- Các tác nhân gây đột
biến: vật lý, hóa học…
- Biến đổi do virus.

- Tăng sinh dòng tế

Ung thư

bào ung thư.

- Phát triển không
kiểm soát.

- Di căn và xâm lấn
sang các mô khác.

- Mất chức năng sinh
học thông thường.

- Mất hoặc thay đổi
chỉ thị tế bào bình
thường

- Do di truyền.

Hình 1. 1: Mô hình quá trình chuyển biến từ tế bào bình thường thành ung thư

Phân loại các dạng ung thư có thể dựa trên dạng tế bào khởi nguồn. Các
dạng ung thư phát triển từ các tế bào biểu mô được xác định là ung thư biểu bì
(carcinomas). Ung thư bắt nguồn từ trung mô như ung thư hạch bạch huyết
(lymphomas), ung thư máu (leukemias), hoặc ung thư mô liên kết (sarcomas).
Ngoài ra, ung thư cũng có thể phân loại dựa trên dạng khối u. Ví dụ, ung thư
thể rắn như ung thư phổi, ung thư vú hoặc dạng bệnh máu ác tính như các
dạng ung thư phát triển ở máu, ở tủy xương, hoặc bạch huyết [1].
1.1.2. Tình hình bệnh ung thư
Theo ghi nhận của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trong năm 2008, có
hơn 12,4 triệu trường hợp mới mắc bệnh ung thư mới (trong đó 6672000 nam

giới, 5779000 nữ giới), 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư (4293000
18


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
nam giới, 3300000 nữ giới) và 28 triệu người bị mắc bệnh ung thư được phát
hiện trong vòng 5 năm (hình 1.2). Theo ước tính đến năm 2030, khả năng mắc
ung thư mới mỗi năm khoảng 27 triệu người, 17 triệu người khác bị chết vì
ung thư và 75 triệu bệnh nhân bị ung thư được phát hiện trong vòng 5 năm
[3]. Số lượng bệnh nhân bị ung thư đang tăng dần tại các nước đang phát triển
do tỷ lệ tử vong ở trẻ em và số người chết do các bệnh nhiễm trùng có xu
hướng giảm và nhiều người có khả năng sống lâu hơn. Hơn nữa, người dân ở
những nước này đang ngày càng thích ứng với lối sống của các nước phát
triển như hút thuốc, uống rượu, ăn nhiều thực phẩm giàu calo và chất béo.

Hình 1. 2: Sự phân bố của bệnh ung thư trên toàn cầu
(Cảnh báo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2008)

Theo Cơ quan nghiên cứu thế giới về ung thư IARC (The International
Agency for Research on Cancer), trong số các trường hợp mắc bệnh ung thư
và tử vong do ung thư trên thế giới, các nước có thu nhập thấp và trung bình
là những nơi chiếm tỷ lệ ung thư cao (chiếm 2/3 trường hợp ung thư trên toàn
thế giới). Tỷ lệ dạng ung thư khác nhau cũng tùy thuộc vào mức độ thu nhập
19


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
của các quốc gia, tập quán của người dân [4]. Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh ung thư
chủ yếu tập trung vào các dạng ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú, ung
thư ruột già, ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận, ung thư da,

ung thư giáp trạng, ung thư buồng trứng… [3].
Tình hình bệnh ung thư ở Việt Nam
Trước đây, ở Việt Nam, mô hình bệnh tật điển hình là của một nước thu
nhập thấp, kém phát triển, có đời sống chưa cao, ý thức vệ sinh thấp, vùng khí
hậu nhiết đới nóng bức ẩm ướt, nên các bênh tật chủ yếu là những bệnh
truyền nhiễm và các bệnh suy dinh dưỡng. Hiện nay, cùng với sự thay đổi
mạnh mẽ về kinh tế, mô hình bệnh tật đã có xu hướng của nước phát triển với
các bệnh ung thư, tim mạch… Hơn nữa, cùng với quá trình phát triển của nền
kinh tế cũng kéo theo một loạt các vấn đề nhức nhối khác, đặc biệt là vấn đề ô
nhiễm môi trường, nguồn thức ăn... Việc sống trong điều kiện môi trường ô
nhiễm có thể là lý do chính để lý giải tại sao tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang có
chiều hướng gia tăng nhanh. Theo số liệu thống kê, chỉ trong giai đoạn từ
1/1/2001 đến 31/12/2004 có 32.944 ca ung thư mới được ghi nhận trên 5 tỉnh
thành Hà Nội, Hải Phòng, Thái Nguyên, Huế, Cần Thơ. Ước tính trên cả
nước, có khoảng 77.457 đến 112.842 ca ung thư mới mắc mỗi năm. Những
loại ung thư phổ biến nhất người bệnh thường gặp là phổi, dạ dày, gan, đại
trực tràng, vòm họng, thận, da, vú, cổ tử cung…[5]
1.1.3. Các phương pháp điều trị bệnh ung thư
Mặc dù ung thư được xác định là một căn bệnh nan y nhưng nếu được
phát hiện sớm và được chữa trị kịp thời, bệnh hoàn toàn có thể chữa khỏi.
Hiện nay, có 5 phương pháp được sử dụng để điều trị ung thư bao gồm: phẫu
trị, xạ trị, hoá trị liệu, hoocmon trị liệu, liệu pháp miễn dịch hay còn gọi là

20


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
liệu pháp sinh học. Các phương pháp này không nhất thiết phải tách rời nhau
mà có thể phối kết hợp trong quá trình điều trị [6].
Trong các phương pháp điều trị ung thư, phẫu trị là phương pháp xuất

hiện sớm nhất. Bằng việc cắt bỏ khối u, bác sĩ có thể cắt bỏ một số mô xung
quanh hoặc một số hạch bạch huyết gần khối u. Tuy nhiên, phương pháp này
phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm kích thước khối u, vị trí khối u, cách
phẫu thuật và tình trạng của bệnh nhân [7]. Biện pháp xạ trị và hóa trị liệu
cũng được dùng khá phổ biến trong việc điều trị ung thư. Biện pháp này sử
dụng các tác nhân vật lý hay hóa học tác dụng trực tiếp vào vị trí bị ung thư
để tiêu diệt tế bào ung thư. Điều trị bằng phương pháp này vừa tác động lên tế
bào ung thư, vừa gây ra các tác động không mong muốn lên tế bào bình
thường làm ảnh hưởng không tốt đến toàn bộ cơ thể. Ngoài ra, trong trường
hợp tế bào ung thư chịu ảnh hưởng bởi hoocmon do cơ thể chủ tiết ra, ung thư
có thể bị ức chế hoàn toàn mà chỉ cần sử dụng phương pháp hoocmon trị liệu.
Ưu điểm chính của phương pháp hoocmon là hiệu quả tác dụng chính xác lên
tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc xử lý mất bất kỳ hoocmon nào trong cơ thể
cũng đều gây nên nhưng hiệu quả không mong muốn.
Để khắc phục nhược điểm của các phương pháp trên, liệu pháp sinh
học đã được áp dụng gần đây để điều trị một số bệnh ung thư. Liệu pháp này
có thể sử dụng riêng lẻ, nhưng thông thường được sử dụng như một liệu pháp
hỗ trợ (nghĩa là dùng đồng thời hay dùng ngay sau liệu pháp điều trị khác kết
thúc) để giúp thêm tác dụng chống ung thư của liệu pháp chính [6]. Điểm nổi
trội của liệu pháp điều trị mới này là khả năng điều trị ngăn chặn chính xác
ung thư mà không cần phá hủy (ví dụ như các vaccine phòng ung thư), có thể
giúp đưa tế bào ung thư trở lại bình thường (ví dụ các liệu pháp gen) hay có
thể điều trị với cách tác động nhẹ nhàng hơn làm ức chế ung thư (ví dụ liệu

21


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
pháp kháng sinh mạch, các độc miễn dịch đặc hiệu tế bào đích, các chất điều
biến sinh học nâng cao hệ miễn dịch).

Ở Việt Nam, theo số liệu cung cấp của bệnh viện K, các phương pháp
chủ yếu được sử dụng để điều trị bệnh ung thư là phẫu trị và xạ trị. Phương
pháp hoá trị liệu cũng được áp dụng nhưng hạn chế sử dụng do thường được
điều trị các bệnh nhân đã bị di căn toàn thân. Hơn nữa, điều trị hoá chất không
chỉ do giá thành hoá chất điều trị đắt mà còn do tác dụng phụ. Phương pháp
điều trị nội tiết cũng được đánh giá khá tốt nhưng chỉ được áp dụng trên một
số dạng ung thư nhất định như các chất dẫn corticoid hay sử dụng trong phác
đồ điều trị ung thư máu, ung thư hạch bạch huyết, testoresteron điều trị ung
thư vú, progesterone dùng trong ung thư tuyến tiền liệt... Phương pháp điều trị
miễn dịch cũng đã được quan tâm nhưng vẫn còn trong thời kỳ nghiên cứu.
Một số chất miễn dịch không đặc hiệu đang được thử nghiệm trên động vật và
người như BCG, LH1... Do vậy, để bắt kịp những tiến bộ của nền Y học thế
giới, cần phải có phương thức nghiên cứu và ứng dụng phù hợp hơn.
1.1.4. Liệu pháp điều trị bằng cytokine- hiện trạng và tương lai
Mặc dù ở Việt Nam, việc sử dụng liệu pháp cytokine được coi là hướng
điều trị tích cực mới với bệnh nhân ung thư nhưng ở trên thế giới, liệu pháp
này đã được sử dụng từ hơn 20 năm trước [8]. Có hàng loạt các cytokine
khác nhau đã được sản xuất và thử nghiệm trong điều trị lâm sàng. Tuy nhiên,
tính đến thời điểm hiện tại, số lượng cytokine đã được phép sử dụng tại Hoa
Kỳ để chữa ung thư và các bệnh liên quan đến ung thư chỉ bao gồm: IL-2,
IFN-α, G-CSF, GM-CSF, IL-11 và erythropoietin (EPO) [1], [9]. Các
cytokine khác cũng đã được cho phép sử dụng song vẫn còn những hạn chế
do chưa kiểm soát hoàn toàn được khả năng loại thải cũng như các hiệu ứng
phụ khác như TNF-α, IL-12…
22


Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10
Ưu điểm nổi trội của cytokine trong việc điều trị ung thư là việc kiểm
soát được ung thư và các ảnh hưởng của ung thư. Việc điều trị với GM-CSF

và G-CSF tiếp sau phương pháp hóa trị liệu hoặc cấy ghép tủy xương có thể
thúc đẩy nhanh khả năng phục hồi của các tế bào myeloid, giảm rủi ro xảy ra
từ việc lây nhiễm khác. Bệnh thiếu máu liên quan đến ung thư có thể làm
giảm bớt nhờ điều trị bằng EPO [10]. IL-11 có thể kích thích sự tạo thành tiểu
cầu và được áp dụng trong điều trị với bệnh thrombocytopenia (một loại bệnh
thiếu tiểu cầu) sau khi đã được hóa trị liệu [11]. IL-2 được cấp phép để điều
trị bệnh ung thư thận và ung thư da. IFN-α không những có thể sử dụng độc
lập mà còn có thể kết hợp điều trị với cytokine khác (ví dụ: IL-2) để điều trị
một số bệnh như: các khối u ác tính, ung thư tế bào biểu mô, ung thư hệ bạch
huyết, ung thư bạch cầu nguyên bào tủy cấp (CML), bệnh ung thư da có liên
quan đến nhiễm HIV Kaposi sarcoma … Các cytokine khác cũng đang được
áp dụng để điều trị thử nghiệm chữa trị bệnh hay các ảnh hưởng của bệnh ung
thư khác: IL-3 có thể sử dụng điều trị bệnh thiếu tiểu cầu, IL-7 ứng dụng hồi
phục mạch bạch huyết sau khi xử lý phẫu thuật với tủy xương [12], IL-12 mặc
dù hiệu quả sử dụng để điều trị khối u là không cao nhưng cytokine này lại có
thể sử dụng như là một tá chất cho vaccine [13], [14].
Như vậy, cytokine, nếu sử dụng riêng để điều trị các bệnh ung thư thì
vẫn chưa thực sự thể hiện được hiệu quả vượt trội. Tuy nhiên, với những ưu
điểm của liệu pháp sinh học, các cytokine lại thể hiện được đặc tính ưu việt
nếu có sự kết hợp hoặc điều trị bổ trợ với các phương pháp điều trị khác [1],
[8], [15-17]. Hiện nay, các cytokine vẫn đang tiếp tục được thử nghiệm tiền
lâm sàng và lâm sàng để điều trị các bệnh không chỉ liên quan đến ung thư mà
còn với các bệnh khác. Các cytokine có thể kết hợp với kháng thể đơn dòng
để tạo nên hiệu quả miễn dịch cao để sử dụng cho mục đích khác, ví dụ như tá
chất cho vaccine [18]. Liệu pháp kết hợp IL-2 và kháng thể đơn dòng có thể
23