Phát hiện ADN phôi thai tự do trong huyết tương máu ngoại vi mẹ ứng dụng cho chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp

PHÁT HIỆN ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG HUYẾT TƯƠNG MÁU
NGOẠI VI MẸ: ỨNG DỤNG CHO CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BẰNG
BIỆN PHÁP KHÔNG CAN THIỆP
Trần Văn Khoa, Nguyễn Duy Bắc
Hồ Hữu Thọ, Nguyễn Viết Trung
Học viện quân y
Tóm tắt
ĐẶT VẤN ĐỀ: Gần đây, sự phát hiện ra ADN phôi thai trong huyết thanh mẹ đã
mở ra một phương pháp mới chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp.
Mục đích của nghiên cứu này là tách chiết ADN phôi thai tự do trong trong máu
ngoại vi mẹ để sử dụng cho chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: AND phôi thai được tách
chiết từ huyết tương máu ngoại vi của 29 phụ nữ mang thai với tuổi thai từ 7 đến 38
tuần. Gen đặc hiệu giới tính nam – SRY được phân tích bằng kỹ thuật PCR. KẾT
QUẢ VÀ BÀN LUẬN: 15 trong số 29 thai đã được xác định là nam qua phân tích
PCR với gen đặc hiệu giới tính nam. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả
kiểm tra giới tính qua siêu âm cũng như giới tính sau sinh. KẾT LUẬN VÀ KIẾN
NGHỊ: ADN tự do phôi thai tách chiết được từ huyết thanh máu ngoại vi mẹ rất có
giá trị để chẩn đoán trước sinh bệnh di truyền bằng biện pháp không can thiệp.
*Từ khoá: AND phôi thai tự do, chẩn đoán trước sinh
1. Đặt vấn đề
Lo và cộng sự, 1996 đã phát hiện ra ADN phôi thai trong huyết thanh trong máu
ngoại vi mẹ [3]. Điều này mở ra một triển vọng mới trong công tác chẩn đoán trước
sinh bằng biện pháp không can thiệp.
Trên thế giới cũng như Việt Nam chẩn đoán trước sinh bằng các biện pháp can
thiệp là phương pháp được tiến hành chủ yếu từ trước tới nay. Tuy nó mang lại
nhiều lợi ích như xác định sớm các trường hợp thai mang bệnh di truyền để giúp
cho công tác tư vấn di truyền y học, song chẩn đoán qua chọc dò xét nghiệm dịch
1

ối, sinh thiết nhau thai… cũng gặp phải tỷ lệ tai biến từ 0,5-1%. Chính vì vậy nhiều
nhà khoa học trên thế giới trong những năm gần đây tập trung vào việc nghiên cứu
tách chiết ADN phôi thai trong máu mẹ để có thể áp dụng chẩn đoán trước sinh
bằng biện pháp không can thiệp qua phân tích ADN của bào thai lưu hành trong
máu mẹ [1, 2, 6]. Trong thực tế đã có nhiều tác giả thành công trong lĩnh vực này
như áp dụng chẩn đoán giới tính [4] hay chẩn đoán nhóm máu Rh [7], chẩn đoán
bệnh di truyền [6, 9, 10]. Có tác giả đã sử dụng ADN phôi thai tự do phân tích đột
biến và nhận dạng cá thể của thai trong hình sự pháp y [5].
Đề tài được thực hiện nhằm một số mục tiêu sau:
- Nghiên cứu tách chiết ADN thai trong huyết tương máu mẹ.
- Xác định ADN phôi thai tự do trong huyết tương máu mẹ bằng kỹ thuật PCR.
2. Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng: 29 phụ nữ mang thai vào khám thai tại phòng khám bệnh Viện
quân y 103 và Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh - Y - Dược học, Học viện quân
y với tuổi thai từ 7-38 tuần. Mẫu chứng dương được lấy từ nam giới; mẫu chứng
âm được chọn từ phụ nữ chưa mang thai lần nào.
Thu và chuẩn bị mẫu: Máu ngoại vi toàn phần được lấy vào tuýp lấy máu vô
khuẩn được chống đông bằng EDTA. Mỗi mấu lấy 5ml máu. Máu sau khi lấy được
li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Bảo quản huyết tương thu được trong tủ lạnh
âm – 80oC cho tới khi tách ADN.
Phương pháp tách chiết ADN phôi thai từ huyết tương máu mẹ: ADN phôi
thai được tách chiết từ huyết thanh máu mẹ bằng QIAgen Blood KIT (Qiagen) theo
qui trình của nhà sản suất có cải biên [4].
Phương pháp nhân gen In vitro (PCR): gen đặc hiệu giới tính nam - SRY
nằm nhiễm sắc thể giới tính Y được khuyếch đại với mồi đặc hiệu trên máy nhân
gen ABI 9800 FAST. Trình tự mồi: SRY-F 5’-GGT GTT GAG GGC GGA GAA
ATG-3’; SRY-R 5’-ATA AGA AAG TGA GGG CTG TAA GTT-3’. Chu trình

2

nhiệt: biến tính 5 phút/ 940C, gắn mồi 2phút/ 550C, nối dài 720C/3 phút; tổng số 2530 chu kỳ.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR phát hiện băng đặc hiệu.
Nghiên cứu được thiết kế theo kiểu mù đơn, mù kép kết hợp với tiến cứu.
Giới tính thai nhi được kiểm chứng qua siêu âm thai sau tuần thứ 25 và sau
sinh.
3. Kết quả và bàn luận
Tách chiết được ADN phôi thai trong huyết tương mẹ qua gen đặc hiệu giới
tính nam - SRY trên nhiễm sắc thể Y.
Hình ảnh kết quả
điện di xác định gen
đặc hiệu giới tính
nam-SRY của ADN
phôi thai tự do tách
chiết từ máu ngoại vi
của mẹ:
1: thang ADN chuẩn;
2: mẫu chứng +;
3,4,7,8: thai nam;
5,6,8: thai nữ

Kết quả tách chiết ADN phôi thai tự do trong huyết thanh mẹ và xác định qua
phân tích PCR gen SRY được trình bày ở bảng sau:
Trường Tuổi thai
hợp
(Tuần)

SRY
(+/-)

1

10

+

2

18

+

3

7

+

4

28

-

Giới tính Trường
hợp
(SÂ/SS)
Sau sinh
16
(Nam)

Siêu âm
17
(nam)
Siêu âm
18
(Nam)
Siêu âm
19
(nữ)

Tuổi thai
(Tuần)

SRY
(+/-)

32

+

8

+

13

-

14

-

Giới tính
(SÂ/SS)
Sau sinh
(Nam)
Chưa có
kết quả
Siêu âm
(nữ)
Siêu âm
(nữ)
3


Siêu âm
Sau sinh
20
32
+
(nam)
(Nam)
Siêu âm
Sau sinh
6
9
21
32
(nữ)
(nữ)

Siêu âm
Siêu âm
7
12
22
18
+
(nữ)
(nam)
Sau sinh
Siêu âm
8
36
23
27
(Nữ)
(nữ)
Siêu âm
Siêu âm
9
17
+
24
24
+
(nam)
(nam)
Sau sinh
Siêu âm
10

38
+
25
24
(Nam)
(nữ)
Siêu âm
Sau sinh
11
23
26
34
+
(nữ)
(nam)
Siêu âm
Sau sinh
12
20
+
27
31
(nam)
(nữ)
Siêu âm
Siêu âm
13
15
+
28

20
(nam)
(nữ)
Siêu âm
Sau sinh
14
28
29
35
+
(nữ)
(nam)
Siêu âm
15
15
(nữ)
Từ bảng kết quả trên cho thấy: trong số 29 trường hợp, 15 thai được xác định là
5

22

+

nam, 14 thai được xác định là nữ. Trong đó 28/29 trường hợp đã được xác định qua
siêu âm sau tuần thứ 25 hoặc sau sinh. Kết quả phân tích cho thấy có độ chính xác
cao.
Nghiên cứu của nhiều tác giả khác trên thế giới cũng cho thấy khả năng tách
chiết và xác định giới tính qua phân tích ADN phôi thai tự do trong máu mẹ cũng
có độ chính xác cao:
Chungwen Wei và cộng sự (2001), nghiên cứu tách chiết ADN phôi thai tự do

trong 30 phụ nữ mang thai đã chẩn đoán chính xác 100% giới tính (19 thai nam),
đặc biệt đã phát hiện sự tăng cao bất thường nồng độ ADN phôi thai tự do trong
máu mẹ ở thai trisomy-21. Kết quả này cũng đã được xác chẩn qua phân tích kiểu
nhân (Karyotyping) [4]. Zhao Y và cộng sự (2004) cũng dùng kỹ thuật PCR xác

4


định giới tính qua phân tích ADN phôi thai tự do trong máu mẹ trên 44 phụ nữ
mang thai từ 7 đến 41 tuần với độ chính xác 100% [10].
Về cơ chế xuất hiện và mất đi của ADN phôi thai tự do trong máu mẹ vẫn còn
nhiều điều chưa rõ [3]. Khác với tế bào phôi thai trong máu mẹ có ba loại chính là
bạch cầu lymhpo, tế bào màng nuôi (trophoblast) và tế bào hồng cầu có nhân của
phôi thai (fetal nucleated red blood cell) tồn tại lâu sau khi sinh hoặc sẩy thai, ADN
phôi thai tự do tồn tại một thời gian rất ngắn: ngày thứ tư sau sinh hoặc sẩy thai đã
không còn được phát hiện thấy [8].
4. Kết luận và kiến nghị
Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi đi đến một số kết luận sau:
-Tách chiết được ADN phôi thai tự do lưu hành trong máu ngoại vi của mẹ.
-Dùng kỹ thuật PCR khuếch đại gen đặc hiệu giới tính nam cho phép phát
hiện và khẳng định sự có mặt của ADN phôi thai trong huyết tương máu ngoại vi
mẹ với độ nhạy cao.
ADN phôi thai tự do trong máu mẹ rất có giá trị dùng để chẩn đoán trước
sinh bệnh di truyền liên kết giới tính và nhiều bệnh lý di truyền khác bằng biện
pháp không can thiệp qua phân tích gen đặc hiệu góp phần cho công tác tư vấn di
truyền y học.
Tài liệu tham khảo
1. Ana Bustamante et al. (2006). Detection of a Paternally Inherited Fetal mutation
in maternal Plasma by the use of Automated Sequencing. Ann. NY. Acad.
Sci.1075: 108-117.

2. Avent ND; Chitty LS. (2006). Non-invasive diagnosis of fetal sex; utilisation of
free fetal DNA in maternal plasma and ultrasound. Prenat Diagn. 26(7): 598-603
(ISSN: 0197-3851).
3. Chiu RW; Lo YM. (2006). Noninvasive prenatal diagnosis by analysis of fetal
DNA in maternal plasma. Methods Mol Biol.; 336:101-9 (ISSN: 1064-3745).

5


4. Chungwen Wei et al. (2001). Screening cell-free fetal DNA in maternal plasma.
Clin. Chem.47, 336. Reference QIAGEN News, 14-16.
5. Deng Z; Wu G; Li Q; Zhang X; Liang Y; Li D; Gao S; Lan Y. (2006).
Noninvasive genotyping of 9 Y-chromosome specific STR loci using circulatory
fetal DNA in maternal plasma by multiplex PCR. Prenat Diagn; 26(4): 362-8
(ISSN: 0197-3851).
6. Denis L Y.M. et al. (1998). Quantitatve Analysis of Fetal DNA in Maternal
Plasma and Serum: Implication for noninvasive Prenatal Diagnosis.
Am.J.Hum.Genet., 62: 768-775.
7. Finning K; Martin P; Daniels G A. (2004). Clinical service in the UK to predict
fetal Rh (Rhesus) D blood group using free fetal DNA in maternal plasma. Ann
NY Acd Sci. 1022: 119-23 (ISSN: 0077-8923).
8. Smid M; Galbiati S, Vassallo A, Gambini D, Ferrari A, Viora E, Pagliano M,
Restangno G, Ferrari M, Cremonesi L. (2003). Noevidence of fetal DNA
persistence in materanl plasma after pregnancy. Hum genet. 112 (5-6: 617-8
(ISSN: 03406717).
9. Warunee Tungwiwat et al. (2006). Development and Application of a RealTime Quantitative PCR for Prenatal Detection of Fetal Thalassemia from
maternal Plasma. Ann. NY. Acad. Sci.1075: 103-107.
10. Zhao Y; Zou L. (2004). Application of fetal DNA in maternal plasma in
noninvasive prenatal diagnosis. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci.
24(1): 59-61(ISSN: 1672-0733).

6


Summary
DETECTION OF CELL-FREE FETAL DNA IN MATERNAL
PERIPHERAL BLOOD: IMPLICATIONS FOR NON-INVASIVE
PRENATAL DIAGNOSIS
Khoa Tran Van, Bac Nguyen Duy,
Tho Ho Huu, Trung Nguyen Viet
Military Academy of Medicine
INTRODUCTION: Recent discovery of the presence of fetal DNA in maternal
plasma has opened up a new method for non-invasive prenatal diagnosis. The aim
of this study was to extract cell-free fetal DNA in maternal peripheral blood with a
view of using for non-invasive prenatal diagnosis. MATERIALS AND
METHODS: Fetal DNA was extracted from maternal plasma of 29 pregnant
women during the 7th to 38th weeks of gestation. PCR analysis of the SRY gene
was performed. Routine ultrasound was also performed on the pregnant women
after 25 weeks of gestation to confirm fetal gender.

RESULTS: 15 of 29

pregnancies were found male fetuses by PCR analysis with male specific geneSRY. Which were totally correlated to the results by ultrasound examination or
confirmed by the gender determining after birth. CONCLUSIONS: Cell-free fetal
DNA extracted in maternal plasma seems to be useful for non-invasive prenatal
diagnosis of inherited diseases.
*Key words: Cell-free fetal DNA, prenatal diagnosis

7