Phát hiện DNA phôi thai trong máu mẹ bằng kỹ thuật sinh học phân tử nhằm chẩn đoán và đánh giá một số bệnh di truyền

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI



BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ

PHÁT HIỆN DNA PHÔI THAI TRONG MÁU MẸ
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
NHẰM CHẨN ĐOÁN
VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN


CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. NGUYỄN THANH THUÝ
CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ Y TẾ
THỜI GIAN THỰC HIỆN: 9/2005 – 9/2008

(Quyết định phê duyệt số 3303/QĐ-BYT ngày 9 tháng 9 năm 2005)





7000
14/10/2008


HÀ NỘI - 2008

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI



BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ



PHÁT HIỆN DNA PHÔI THAI TRONG MÁU MẸ
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
NHẰM CHẨN ĐOÁN
VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. NGUYỄN THANH THUÝ
CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
ĐƠN VỊ PHỐI HỢP: VIỆN PHỤ SẢN HÀ NỘI
VIỆN NHI QUỐC GIA
CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ Y TẾ
THỜI GIAN THỰC HIỆN: 9/2005 – 9/2008

(Quyết định phê duyệt số 330 /QĐ-BYT ngày 9 tháng 9 năm 2005)

Tổng kinh phí thực hiện đề tài : 300 triệu đồ
ng
Trong đó: Kinh phí SNKH : 300 triệu đồng
Nguồn khác (nếu có) : 0 triệu đồng

HÀ NỘI - 2008

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài
Khoa học công nghệ cấp Bộ


1. Tên đề tài: “Phát hiện DNA phôi thai trong máu mẹ bằng kỹ thuật sinh
học phân tử nhằm chẩn đoán và đánh giá một số bệnh di truyền.
2. Chủ nhiệm đề tài : TS. Nguyễn Thanh Thúy.
3. Cố vấn đề tài : GS. Vũ Triệu An.
4. Cơ quan chủ trì đề tài :
Trường Đại học Y Hà Nội.
5. Thời gian thực hiện đề tài: 36 tháng (từ 9/2005−9/2008; đã được phê
duyệt số 3303/QĐ−BYT ngày 9/9/2005).
6. Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng; trong đó kinh phí từ ngân
sách là 300 triệu đồng.
7. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:
7.1. Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc:
Đề tài đã hoàn thành các nội dung công việc mà đề c
ương đã đặt ra về
các bước để hoàn chỉnh kỹ thuật, về số lượng mẫu, để đánh giá độ chính xác,
tin cậy của kỹ thuật cũng như tiến độ thực hiện của đề tài.
Sau đây là bảng thống kê số lượng mẫu khi triển khai thực hiện so với
số mẫu tối thiểu mà đề cương đặt ra:

TT Nội dung công việc
Thời
gian dự
kiến

Thời gian tiến hành
Đánh
giá
1 Thông qua đề cương 3/2005 8/2005
Hoàn
thành
2
Xây dựng quy trình tách DNA và
hoàn chỉnh kỹ thuật PCR lồng.
3/2005-
12/2005
8/2005-12/2005
Hoàn
thành
3
− Thu thập mẫu và triển khai kỹ thuật
PCR lồng để phát hiện DNA phôi thai
t
rong máu mẹ.
− 1 bài báo.
1/2006-
12/2006
1/2006-12/2006
Bài báo đăng ở Tạp
chí nghiên cứu Y
học-Đại học Y Hà
Nội, tập 47-số 2-
5/2007, tr 6-9.
Hoàn
thành

4
− Triển khai áp dụng kỹ thuật trên
v
ào xác định NST X và Y của phôi
qua các thời kỳ mang thai khác nhau;
V
à áp dụng trong gia đình có tiền sử
b
ệnh tật di truyền như: tăng sản
t
hượng thận bẩm sinh, loạn dưỡng cơ
Duchene.
− 1 bài báo.
1/2007-
6/2008
Bài báo đăng ở Tạp
chí Y học Việt Nam,
số 2 tháng 5/2008, tr
13-17

Hoàn
thành
¾ Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lượng đối với sản phẩm tạo ra, dạng kết quả:
Chất lượng cần
đạt
Số lượng sản
phẩm tạo ra
STT
Tên sản phẩm
và chỉ tiêu chất lượng chủ yếu

Dự
kiến
Đạt
được
Dự
kiến
Đạt
được
1
Phát hiện DNA phôi trong máu mẹ tỷ
lệ 1/300 000 tế bào theo các tháng:
3 tháng đầu
3 tháng giữa
3 tháng cuối


75%
80%
80%


90,9%
97,2%
100%


30 mẫu
30 mẫu
30 mẫu

41 mẫu
30 mẫu
31 mẫu
2
Phát hiện DNA phôi ở thời kỳ 3 tháng
đầu trong máu các thai phụ trong gia
đình có tiền sử bệnh di truyền như:
tăng sản thượng thận bẩm sinh, loạn
dưỡng cơ Duchene.Tiến hành phát
hiện đột biến nếu có thể , chẩn đoán
trước sinh không xâm phạm.

3-5
mẫu
3 mẫu

7.2. Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của sản phẩm KHCN
7.2.1. Đối chiếu với mục tiêu và các sản phẩm đặt ra trong đề cương,đề tài đã
hoàn thành đúng theo 2 mục tiêu nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu có tính
khoa học và tin cậy. Kết quả nghiên cứu đã trả lời đúng cho mục tiêu nghiên
cứu.
Đã hoàn chỉnh quy trình phát hiện DNA phôi thai trong máu mẹ bằng
kỹ thuật sinh học phân tử không xâm phạm PCR lồng theo các b
ước sau:
− Các tác giả đã tiến hành hoàn chỉnh việc chiết tách DNA phôi trên 10
mẫu huyết thanh sản phụ lấy khi chuyển dạ đẻ, trong đó 6 sản phụ sinh con
trai và 4 sản phụ sinh con gái. Sau khi chiết tách DNA thì lựa chọn cặp mồi
để thực hiện kỹ thuật PCR lồng kiểm tra DNA đã chiết tách và phát hiện
DNA phôi thai.

− Sau đó tiến hành lấy máu 114 sản phụ, trong đó: 45 sản phụ có thai từ
6–12 tuần; 39 sả
n phụ có thai từ 12–24 tuần; 30 sản phụ có thai từ 24–36
tuần.
− Chiết tách DNA phôi thai từ các mẫu huyết thanh của các thai phụ này.
Tiến hành kỹ thuật PCR lồng để phát hiện gen SRY của DNA phôi và đánh
giá độ chính xác của kỹ thuật.
Kết quả cho thấy độ đặc hiệu là 100%, còn độ nhạy và độ chính xác
thay đổi lần lượt như sau: 3 tháng đầu độ nhạy là 81,8% và 90,9%; 3 tháng
giữa là 94,4% và 97,2%; 3 tháng cuối là 100%. Kết quả chung củ
a các thai
phụ từ 6–36 tuần có độ nhạy là 91,4% và độ đặc hiệu là 100%, độ chính xác
kỹ thuật là 95,7%.
Sau khi hoàn chỉnh kỹ thuật, các tác giả bước đầu ứng dụng phát hiện
DNA phôi thai từ máu mẹ theo dõi phát hiện đột biến chẩn đoán trước sinh
cho 3 thai phụ của 3 gia đình có tiền sử bị bệnh di truyền: 2 gia đình có tiền
sử bị teo cơ Duchenne và 1 gia đình có tiền sử bị tăng sản thượng thận bẩm
sinh. Kết quả: 2 trong 3 thai phụ sinh con nữ lành lặn khoẻ mạnh.
¾ Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả của việc ứng dụng kết quả nghiên cứu:
Việc hoàn chỉnh kỹ thuật này đã đư
a ra một marker mới cho việc sàng
lọc gen để thực hiện chẩn đoán trước sinh không xâm phạm, nhất là thai phụ
trong gia đình có bệnh di truyền liên kết với giới tính: nếu là các thai nam thì
biết trước và xét nghiệm gen học xem thai có bị bệnh hay không, từ đó có kế
hoạch huỷ thai sớm nhằm hạn chế tối thiểu những ảnh hưởng tới mẹ. Bên
cạnh đó, đối với các thai phụ mang thai nữ
thì hạn chế các nguy cơ thăm dò
không cần thiết do thai nhi không bị bệnh. Còn đối với các thai phụ trong gia
đình có tiền sử tăng sản thượng thận bẩm sinh thì có kế hoạch điều trị sớm đối
với các thai nữ để chỉnh hình bộ phận sinh dục ngay từ trong bụng mẹ, và hạn

chế các thăm dò không cần thiết đối với các thai nam…
7.2.2. Đề tài đã đăng tải được 2 bài báo trên T
ạp chí Nghiên cứu khoa học
trường Đại học Y Hà Nội và Tạp chí Y Học Việt Nam:
1. Nguyễn Thanh Thúy, Vũ Triệu An, Nguyễn Duy Ánh. Kết quả bước
đầu xác định DNA phôi thai trong máu mẹ bằng kỹ thuật PCR lồng. Tạp chí
nghiên cứu Y học−Đại học Y Hà Nội, tập 47, số 2−5/2007, tr 6−9.
2. Nguyễn Thanh Thuý, Nguyễn Duy Ánh. Phát hiện DNA phôi thai từ
huyết thanh mẹ bằng kỹ thuật PCR lồng – hướ
ng tới một marker mới cho
sàng lọc gen. Y học Việt Nam số 2, 5/2008.tr 13-17.
7.2.3. Đề tài đã giúp Sinh viên Ngô Thị Thúy – Lớp Cử nhân KTYH 2004
– 2008: hoàn thành khoá luận “ Phát hiện DNA phôi thai trong huyết thanh
thai phụ 3 tháng cuối bằng kỹ thuật PCR lồng”. Đã bảo vệ ngày 5/6/2008
theo QD số 1215/QD –YHN ,khoá luận đạt loại xuất sắc.
Ngoài ra, giúp 3 Kỹ Thuật Viên của bộ môn nâng cao kỹ thuật của mình về
Sinh học phân tử:
− Kỹ sư T
ạ Thị Mến: Chiết tách DNA bằng QIAgen Kit và chiết tách
DNA phôi.
− KTV. Nguyễn Thị Thanh Bình và KTV. Nguyễn Văn Tuất: Làm
quen với kỹ thuật Sinh học phân tử và chạy thành thạo điện di phát hiện DNA
phôi thai.
7.3. Về tiến độ thực hiện:
Theo đúng dự đoán sáng suốt của Hội đồng Khoa học công nghệ tư vấn
tuyển chọn, Bộ Y Tế và Hội đồng khoa học đề tài s
ử dụng kỹ thuật mới nên
có khó khăn về việc hoàn chỉnh kỹ thuật trong quá trình nghiên cứu, nên chủ
nhiệm đề tài đã chủ động đi học thêm kỹ thuật tại CHRU Lille Cộng hòa Pháp
bằng kinh phí do Cộng hòa Pháp tài trợ. Sau khi triển khai kỹ thuật tại Bộ

môn Miễn dịch − Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội, cho kết quả tốt thì
mới triển khai trên nhóm đánh giá độ tin cậy kỹ thuật và nhóm bệnh nhân.
Vì vậy mặc dù khó khăn nhưng đề tài vẫn đảm bảo tiến độ theo đúng kế
hoạch vạch ra trong đề cương, và vượt mức một số chỉ tiêu đặt ra như: nhóm
đã đánh giá độ tin cậy kỹ thuật thêm 14 sả
n phụ và độ tin cậy kỹ thuật cao
hơn mức đề cương đặt ra. Nhóm bước đầu áp dụng đạt yêu cầu của đề cương
nghiên cứu đặt ra.
8.1. Về những đóng góp mới của đề tài:
8.1. Về giải pháp khoa học – công nghệ:
Là một trong những nghiên cứu đầu tiên sử dụng biện pháp không xâm
phạm vào việc chẩn đoán trước sinh. Trên cơ sở đó xây dựng quy trình chẩn
đoán trước sinh.
8.2. Về phương pháp nghiên cứu: Không
8.3. Những đóng góp mới khác:
Đã xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh ứng dụng cho một số bệnh
di truyền.

Hà Nội, ngày tháng năm 2008
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI



TS.
Nguyễn Thanh Thúy



DANH SÁCH NHỮNG CÁ NHÂN VÀ ĐƠN VỊ
THAM GIA THỰC HIỆN

Chủ nhiệm đề tài : TS. Nguyễn Thanh Thuý.

Những người tham gia chính:
1. GS.Vũ Triệu An - Cố vấn đề tài.
2. KS. Nguyễn Thị Thanh Bình - Thư ký đề tài.
3. PGS.TS Nguyễn Thị Phượng − Phó chủ nhiệm bộ môn Nhi.
4. ThS. Nguyễn Duy Ánh − Phó giám đốc Viện phụ sản Hà nội.
5. KS. Tạ Thị Mến.
6. KS. Đặng Đức Hiếu.
7. KTV. Nguyễn Vă
n Tuất.
8. Sinh Viên Y4 Ngô Thị Thuý.

Đơn vị phối hợp nghiên cứu:
Đề tài đã nhận được sự phối hợp nghiên cứu của khoa Nội tiết −
Chuyển hoá − Di truyền Viện Nhi Trung Ương ; Viện Phụ sản Hà nội.

VIẾT TẮT

AFP Alpha Feto Protein.
ATL1 Gen 216 bp đặc hiệu trên NST X.
bp base pair = Cặp base.
CK Creatinin kinase.
cs Cộng sự.
CYP21 Cytochrome 450 protein gene 21.
CYP21P Cytochrome 450 protein pseudogene 21.
DMD Dychenne Muscular Dystophy = Bệnh loạn dưỡng cơ
Duchenne

DNA Deoxyribonucleic Acid.
dNTP Deoxyribo Nucleic Triphosphate.
Exon Đoạn DNA mang thông tin di truyền của gen.
FISH Fluorescent In Situ Hybridization = Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh
quang.
GEq Genome Equivalents = Đương lượng gen.
hCG Human Chorionic Gonadotropin.
hCYCLO human Cyclophillin gene (7p13).
Kb Kilobase.
NST Nhiễm sắc thể.
OD Optical Density = Mật độ quang học.
PCR Polymerase Chain Reaction = Ph
ản ứng khuếch đại chuỗi.
QF–PCR Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction = Kỹ
thuật PCR định lượng huỳnh quang.
RhD Rhesus D.
RNA Ribonucleic Acid.
SRY Sex determining Region on the Y chromosome = Vùng quyết
định giới tính trên NST Y.
TBE Hỗn hợp Tris, Boric acid và EDTA.
TDF Testis Determining Factor = Yếu tố quyết định phát triển tinh
hoàn.
TSTTBS Tăng sản thượng thận bẩm sinh.
uE
3
Unconjugated Estriol = Estriol không liên hợp.

MỤC LỤC
VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 3
1.1. Vài nét về tình hình chung và lịch sử phát hiện 3
1.2. Nguồn gốc DNA phôi thai trong huyết thanh mẹ 5
1.2.1. Những tế bào thai có nhân lưu hành trong tuần hoàn mẹ 5
1.2.2. Rau thai 7
1.2.3. Sự trao đổi trực tiếp của các phân tử DNA giữa mẹ và thai 8
1.3. Ứng dụng lâm sàng 8
1.3.1. Phát hiện giới tính 9
1.3.2. Chẩn đoán thai lệch bội lẻ 9
1.3.3. Phát hiện các trường hợp mang thai có nguy cơ tiền sản giật 10
1.3.4. Phát hiện những biến chứng khác khi mang thai 11
1.3.5. Xác định tính trạng RhD và bệnh β−thalassemia của thai 11
1.4. Các kỹ thuật phát hiện DNA phôi thai lưu hành trong tuần hoàn
mẹ 12

1.4.1. Kỹ thuật PCR thông thường 12
1.4.2. Kỹ thuật PCR lồng 12
1.4.3. Kỹ thuật PCR định lượng 12
1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 13
1.5.1. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước 13
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 15
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Chất liệu nghiên cứu 16
2.2. Đối tượng nghiên cứu 16
2.2.1. Đối tượng để hoàn chỉnh kỹ thuật 16
2.2.2. Đối tượng đánh giá độ chính xác kỹ thuật 16
2.2.3. Đối tượng áp dụng bước đầu 17
2.3. Phương pháp, kỹ thuật nghiên cứu 17
2.3.1. Kỹ thuật nghiên cứu 17

2.3.1.1. Yêu cầu về kỹ thuật 17
2.3.1.2. Chiết tách DNA 17
2.3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của DNA để đánh giá sơ bộ nồng độ
bằng máy quang phổ kế Backman 18

2.3.1.4. Nguyên lý kỹ thuật PCR lồng 18
2.3.1.5. Phát hiện sản phẩm 18
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.2.1. Các bước để hoàn chỉnh kỹ thuật 18
2.3.2.2. Đánh giá độ chính xác kỹ thuật 21
2.3.2.3. Bước đầu áp dụng 21
2.4. Địa điểm nghiên cứu 22

2.5. Thời gian nghiên cứu 22
2.6. Đạo đức nghiên cứu 22
2.7. Xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 23
3.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật 23
3.2. Kết quả của việc chuẩn kỹ thuật 25
3.3. Đối tượng bước đầu áp dụng 28
3.3.1. Phả hệ 1: PTL, 39 tuổi 28
3.3.2. Phả hệ 2: NTNL, 40 tuổi 29
3.3.3. Phả hệ 3: Thai phụ LTH, 32 tuổi, thai 6 tuần 30
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 33
4.1. Bàn luận về hoàn chỉnh kỹ thuật 33
4.2. Bàn luận về độ chính xác kỹ thuật 35
4.2.1. Bàn luận về DNA chiết tách từ huyết thanh thai phụ 35
4.2.2. Bàn luận về độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật 38
4.2.3. Bàn luận về các trường hợp âm và dương tính giả của kỹ thuật41

4.2.4. Bàn luận về thời điểm bắt đầu lấy mẫu 42
4.3. Bàn luận về đối tượng bước đầu áp dụng 43
4.3.1. Về phả hệ 1 và 2 43
4.3.2. Phả hệ 3 44
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 47
KIẾN NGHỊ 48
PHỤ LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tật di truyền bẩm sinh vốn bị quan niệm là tai hoạ trời giáng. Việc
sinh ra những đứa con bị bệnh di truyền hoặc các dị tật bẩm sinh là bất hạnh
và là gánh nặng cho cả gia đình và xã hội không chỉ về mặt tâm lý mà còn cả
về kinh tế. Vì vậy, cùng với sự tiến bộ của Y học, các nhà khoa học trên thế
giới ngày càng tập trung nghiên cứu nhiều hơ
n về bệnh tật di truyền. Khi chưa
tìm ra một phương pháp điều trị đặc hiệu thì việc phát hiện sớm trước sinh
bệnh tật di truyền bẩm sinh vẫn được đặt lên hàng đầu.
Từ trước những năm 1990, chẩn đoán trước sinh sử dụng kỹ thuật sinh
học phân tử thường đi từ nguyên liệu là các tế bào của thai nhi được lấy bằng
chọc ố
i, sinh thiết tua rau Nhưng các kỹ thuật xâm phạm này có khả năng
gây nguy cơ rủi ro cho cả mẹ và thai như nhiễm trùng ối, chảy máu tử cung và
nặng hơn sẽ gây sảy thai. Vì vậy, chẩn đoán trước sinh xâm phạm chỉ được
chỉ định đối với những phụ nữ có nguy cơ cao sinh con bất thường về gen.
Việc phát hiện ra các tế bào thai có nhân lưu hành trong vòng tuần hoàn
mẹ đã mở ra triển vọ

ng phát triển các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh không
xâm phạm hầu như không có nguy cơ [40,41]. Nhưng do các tế bào này có số
lượng rất ít nên giá trị chẩn đoán không cao và khó được ứng dụng phổ biến
trong lâm sàng thường quy [46,72].
Từ năm 1989, Lo và cs đã công bố sự có mặt của NST Y của phôi thai
trong máu ngoại vi của mẹ khi mang thai; đến năm 1990, Lo và cs công bố
thành công trong việc sử dụng kỹ thuật PCR lồng (nested PCR) có thể phát
hiện đượ
c NST Y của thai trong máu ngoại vi của mẹ. Sau đó, năm 1997 tác
giả phát hiện được sự lưu hành của các mảnh DNA phôi thai tự do ngay trong
huyết thanh mẹ, mở ra một lĩnh vực mới trong y học đó là chẩn đoán trước
sinh bằng các kỹ thuật không xâm phạm [54]. Hiện tượng này đã thu hút sự
quan tâm của các nhà nghiên cứu và nhanh chóng phát triển với nhiều thành
tựu mới như: Phát triển kỹ thuật PCR thông thường, PCR lồng và PCR đị
nh
lượng phát hiện DNA phôi thai tự do trong huyết tương và huyết thanh mẹ;
Ứng dụng DNA phôi thai vào chẩn đoán nhiều bệnh tật di truyền bẩm sinh
như các bệnh liên kết với giới tính, thalassemia, tăng sản thượng thận bẩm
sinh (TSTTBS), teo cơ Duchenne, trisomy 21 Trên cơ sở đó nhiều tác giả đã
nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật không xâm phạm để chẩn đoán trước sinh
bất đồng nhóm máu Rh mẹ con, xác định giớ
i tính thai nhi để đưa ra lời
khuyên di truyền trong các gia đình có nguy cơ sinh con bị bệnh di truyền liên
kết giới tính [54,61,72].

2
Ở Việt Nam, cho đến nay hầu hết vẫn sử dụng các kỹ thuật xâm phạm
để chẩn đoán trước sinh, còn các xét nghiệm sàng lọc thì chỉ sử dụng các
marker có tính đặc hiệu không cao lắm như ΑFP, hCG, uE3… Chưa tác giả
nào áp dụng kỹ thuật chiết tách DNA phôi thai từ huyết thanh mẹ làm tiền đề

cho việc chẩn đoán trước sinh bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.
Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Phát hiện DNA phôi
thai trong máu mẹ bằng kỹ thuật sinh học phân tử nhằm chẩn đoán và
đánh giá một số bệnh di truyền” với mục tiêu là:
1. Hoàn chỉnh quy trình chiết tách DNA phôi thai trong máu mẹ, và phát
hiện nó bằng kỹ thuật PCR lồng (nested PCR) .Đánh giá độ chính xác của kỹ
thuật PCR lồng trong nghiên cứu này.
2. Bước đầu ứng dụng kỹ thuật đó cho việc chẩn đoán và đánh giá một
s
ố bệnh di truyền do biến đổi trong nhân nhằm nâng cao chất lượng sinh sản .

3
CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN

1.1. Vài nét về tình hình chung và lịch sử phát hiện
Năm 1989, Lo và cs đã phát hiện sự phát triển của một đơn vị thai – rau
thai rất giống với một khối u phát triển không ngừng (trích dẫn của Lo và cs,
1997) [54]. Bên cạnh đó, DNA tuần hoàn đã được nghiên cứu từ khá lâu để
ứng dụng vào chẩn đoán không can thiệp một số bệnh tật, chẳng hạn như phát
hiện DNA tuần hoàn để chẩ
n đoán ung thư. Từ đó, kết hợp với nhận xét: Sự
di căn và tái diễn của ung thư có liên quan với nồng độ cao của DNA có
nguồn gốc khối u trong huyết thanh những bệnh nhân ung thư, Lo và cs đã đặt
ra câu hỏi: Khi mang thai, DNA phôi thai có giống DNA khối u và có thể xuất
hiện trong huyết tương, huyết thanh mẹ hay không? [54]. Dùng kỹ thuật PCR
thông thường khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu cho NST Y rồi điện di
trên thạch agarose, Lo và cs đã phát hiện được DNA phôi thai trong hầu hết
các mẫu huyết tương hoặc huyết thanh của những thai phụ mang thai nam.

Sau đó, tác giả dùng kỹ thuật PCR định lượng tính toán số lượng DNA chiết
tách được từ huyết tương, huyết thanh mẹ thông qua sự khuếch đại gen
β−globin. Kết quả cho thấy có sự khác nhau giữa nồng độ DNA trong huyết
tương với nồng độ DNA trong huyết thanh mẹ, và khác nhau qua các giai
đo
ạn mang thai: Trong giai đoạn sớm nồng độ DNA trong huyết thanh là
0,130% (từ 0,014–0,54%) và trong huyết tương là 3,4% (từ 0,39–11,9%);
tương ứng trong giai đoạn muộn là 1,0% (từ 0,032–3,97%) và 6,2% (từ 2,33–
11,40%) so với DNA tổng số (bao gồm cả DNA phôi thai và DNA mẹ) [58].
Tác giả giải thích rằng sự khác nhau đó là do số lượng lớn DNA mẹ trong
huyết thanh được thu hút vào quá trình đông máu. Chính nồng độ cao của
DNA phôi thai đã cho phép phát hiện các gen SRY thai trong huyết tương và
huyết thanh của mọi thai phụ mang thai nam. Lo và cs (1998) c
ũng đã chứng
minh rằng nồng độ DNA phôi thai tăng tương ứng với sự phát triển của thai
và tăng đột ngột vào 3 tháng cuối [58].
Những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử đã cung cấp nhiều công
cụ mới có độ nhạy cao cho phân tích gen học từ những tế bào chiết tách từ
máu mẹ. Tuy nhiên, giới hạn chính của việc áp dụng những kỹ thuật này vào
lâm sàng chính là số lượ
ng thấp của những tế bào thai được tìm thấy trong
tuần hoàn mẹ (khoảng 1 tế bào thai trong 1 ml máu mẹ) [18]. Vì vậy, phân

4
tích DNA phôi thai tự do trong huyết tương, huyết thanh mẹ là một lĩnh vực
mới đã và đang được nghiên cứu ở nhiều nước.
DNA phôi thai tồn tại trong tuần hoàn mẹ là hiện tượng đáng ngạc
nhiên, có lẽ bởi chúng được bảo vệ trong những tế bào chết theo chương
trình. Hiện tượng DNA phôi thai tự do được giải phóng với số lượng lớn và
biến đổi nhanh chóng đã cung cấp một bứ

c tranh sôi động về các sự kiện xảy
ra trong thời kỳ mang thai. Nồng độ DNA trong huyết tương là 10–100 ng
hoặc 10
3
–10
4
genome equivalents trong 1 ml (GEq/ml) [83]. DNA này có thể
có nguồn gốc từ thai và/hoặc rau thai và từ mẹ. Từ đó có thể thấy rằng DNA
phôi thai trong vòng tuần hoàn mẹ có nguồn gốc chủ yếu là từ rau thai và một
phần từ các tế bào thai có nhân trong tuần hoàn mẹ.
Theo Bianchi và cs (1996), các tế bào bạch cầu của thai nhi có thể tập
trung trong lách hoặc gan của mẹ và tồn tại ở đó một thời gian dài sau khi
sinh nở, sau đó chúng tan rã và có thể gây nên kết quả dương tính giả
về DNA
phôi thai trong lần xét nghiệm sau [19]. Theo Invernizzi và cs (2002), có sự
tồn tại kéo dài của DNA phôi thai trong huyết tương mẹ sau khi sinh [47].
Khả năng định lượng nhanh và không xâm phạm khi sử dụng DNA
phôi thai tự do trong huyết tương hoặc huyết thanh mẹ đã đưa ra nhiều ứng
dụng lâm sàng mới. Nhìn chung các ứng dụng lâm sàng đó chủ yếu dựa trên
việc xác định trình tự DNA phôi thai và phát hiện các trình tự gen đặc hiệu
cho thai chỉ có trên NST Y của thai mà mẹ không có. Do vậy, trình tự
DNA
đặc hiệu NST Y có nguồn gốc thai nam có thể được khuếch đại và tìm thấy
trong huyết tương, huyết thanh mẹ một cách đơn giản.
Lý do đầu tiên và quan trong nhất của việc ứng dụng DNA phôi thai tự
do để chẩn đoán trước sinh là do DNA phôi thai trong huyết tương mẹ có
nồng độ cao. Lý do thứ hai là sự đào thải DNA phôi thai nhanh chóng khỏi
tuần hoàn mẹ: Lo và cs (1999) đã xác định được thời gian bán hủy t/2 của
DNA phôi thai tự do là 16,3 phút (từ
4–30 phút), do đó DNA phôi thai trong

huyết tương mẹ có thể được dùng làm marker để kiểm soát các trường hợp
bệnh lý của mẹ và thai [59]. Lý do thứ ba là các kỹ thuật PCR để phát hiện
DNA phôi thai trong huyết tương mẹ hiện đã có độ nhạy cao: Smid và cs
(1999) đã dùng kỹ thuật PCR thông thường phát hiện được trình tự NST Y
đặc hiệu của thai trong huyết tương mẹ với độ nhạy là 94% [72]; Honda và cs
(2002) phát hiện được NST Y từ tuần thứ 5 bằng kỹ
thuật PCR định lượng với
độ nhạy 100% [44]; Bằng kỹ thuật PCR định lượng, Lo và cs (1997) đã phát
hiện được trình tự DNA trên NST Y của thai ở tất cả những thai phụ mang
thai nam mà không có kết quả dương tính giả [54]. Lý do cuối cùng là do có

5
thể thu được số lượng lớn DNA phôi thai một cách đơn giản bằng cách thực
hiện kỹ thuật PCR định lượng. Từ những lý do đó cho phép đưa DNA phôi
thai tự do ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh không can thiệp trên phạm vi
rộng nhằm hạn chế các nguy cơ rủi ro cho mẹ và thai.
1.2. Nguồn gốc DNA phôi thai trong huyết thanh mẹ
Mặc dù DNA phôi thai trong huyết tương mẹ đã được biết đến với
nhi
ều ứng dụng tiềm năng nhưng lại ít được biết về cơ chế sinh học. Có khả
năng một trong những nguồn gốc của DNA phôi thai tuần hoàn là các tế bào
thai có nhân trong máu mẹ [58]. Mới đây, Sekizawa và cs (2000) đã thấy rằng
có một lượng lớn tế bào thai có nhân chết theo chương trình và có thể giải
phóng DNA phôi thai vào huyết tương mẹ [68]. Đó cũng là lý do mà số lượng
tế bào thai và nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết t
ương thai phụ bị tiền
sản giật hoặc có nguy cơ sinh con lệch bội lẻ đều tăng cao bất thường
[40,53,56]. Mặc dù thời gian bán huỷ của DNA phôi thai trong huyết tương
mẹ cũng đã được coi là dấu ấn sau sinh [59] nhưng tần số thấp của tế bào thai
có nhân trong máu mẹ (0,0035–0,0080%) là rất khó cho việc giải thích cách

thức mà những tế bào thai này có thể góp phần làm tăng nồng độ của DNA
phôi thai tự do trong huyế
t tương mẹ (2,33–11,4% DNA tổng số trong huyết
tương mẹ). Từ đó, Lo và cs đưa ra một giả thuyết khác là DNA phôi thai tự do
có thể được giải phóng thẳng từ mô thai vào máu mẹ qua rau thai [58]. Đồng
thời, Hahn và cs (2002) cũng thấy rằng lượng tế bào chết theo chương trình
trong mô thai tăng cao cùng với nồng độ cao của DNA phôi thai trong huyết
tương mẹ trong các trường hợp tiền sản giật [40]. Như vậy, DNA phôi thai
trong huyết tương mẹ chính là k
ết quả của một phần tế bào chết theo chương
trình của thai, hoặc được giải phóng từ các tổ chức mô học của thai và mẹ.
Theo Lo và cs (1999), DNA phôi thai tự do được giải phóng ở các thời kỳ
khác nhau không chỉ theo một cách hoặc từ một nguồn gốc [59].
Có nhiều phỏng đoán về nguồn gốc mô học của DNA phôi thai tuần
hoàn. Trong đó có 3 khả năng là: những tế bào thai có nhân lưu hành trong
vòng tuần hoàn mẹ
, rau thai, và sự trao đổi trực tiếp của các phân tử DNA.
1.2.1. Những tế bào thai có nhân lưu hành trong tuần hoàn mẹ
Theo Rudin và cs (1997), hàng ngày có sự phân chia 10
11
–10
12
tế bào
và một lượng tương đương sẽ mất đi để duy trì sự cân bằng mô, do vậy có
khoảng 1–10 g DNA có thể bị thải trừ mỗi ngày ở người và có mặt trong
huyết tương [64]. Còn Bianchi và cs (1997) tiến hành kỹ thuật PCR định
lượng dựa trên các tế bào nguyên vẹn trong máu mẹ đã phát hiện được

6
khoảng 1 tế bào thai có nhân trong 1 ml máu toàn phần của thai phụ mang

thai bình thường. Từ đó, tác giả cho rằng các tế bào thai có nhân trong tuần
hoàn mẹ có thể là nguồn gốc mô học thích hợp của DNA phôi thai tuần hoàn
[18]. Trước đó, năm 1993, Fournie và cs đã chứng minh rằng DNA huyết
tương mẹ là dấu hiệu của các tế bào chết theo chương trình [35], do vậy
Bianchi và cs (2004) giả thuyết rằng DNA tự do có thể được giải phóng vào
tuần hoàn mẹ bởi sự phá h
ủy của những tế bào thai lưu hành trong đó [16]. Để
xem xét những tế bào thai trong tuần hoàn mẹ đang trải qua sự chết theo
chương trình, Sekizawa và cs (2000) dùng phương pháp nhuộm màu tế bào và
thấy khoảng 42,7% những tế bào hồng cầu có nhân của thai đang trải qua sự
chết theo chương trình [68]. Căn cứ vào kết quả đó, Bianchi và cs (2004) cho
rằng DNA tự do được giải phóng vào huyết tương mẹ là do tác động của hệ
thống miễ
n dịch của mẹ đối với các tế bào thai chết theo chương trình [16].
Tuy nhiên, những tế bào thai nguyên vẹn trong máu mẹ rất ít và không
chắc rằng với số lượng ít ỏi đó chúng lại đặc trưng cho cả số lượng và tốc độ
thay thế của DNA phôi thai tự do trong tuần hoàn mẹ. Các tế bào và các
nucleic acid của thai trong vòng tuần hoàn mẹ đều tăng trong các biến chứng
thai nghén như tiền sản giật và thai lệch bội lẻ
, điều này cho phép nghĩ rằng
giữa chúng có thể tồn tại một mối liên quan nào đó. Để trả lời câu hỏi: Liệu
các tế bào hồng cầu có nhân của thai có liên quan gì với nồng độ DNA phôi
thai tự do trong huyết tương mẹ hay không?, Zhong và cs (2002) đã sử dụng
máu toàn phần của các thai phụ mang thai nam (bao gồm: thai phụ bình
thường, thai phụ có nguy cơ tiền sản giật, đẻ non) rồi tiến hành đồng thời hai
phươ
ng pháp: lai tại chỗ huỳnh quang (FISH – fluorescent in situ
hybridization) để đếm số tế bào thai và kỹ thuật PCR xác định nồng độ DNA
tự do [86]. Kết quả cho thấy không có mối liên quan giữa số lượng các tế bào
thai và nồng độ DNA phôi thai trong trường hợp mang thai bình thường hay

có nguy cơ tiền sản giật hoặc đẻ non. Điều đó gợi ý rằng, các tế bào hồng cầu
có nhân của thai không phải là nguồn gốc của DNA phôi thai trong huyết
tương các thai ph
ụ có nguy cơ đẻ non, vì trong nhóm này lượng DNA phôi
thai tăng một cách có ý nghĩa mà không có sự tăng tương ứng của các tế bào
hồng cầu có nhân của thai.
Angert và cs (2003) cũng đã đặt ra câu hỏi: Liệu các tế bào huyết học
của thai trong các ống máu xét nghiệm có phải là nguồn gốc của DNA phôi
thai tự do hay không?. Nhóm nghiên cứu của Angert đã giả sử rằng sau khi
lấy máu, các tế bào thai chết theo chương trình sẽ tan rã hết trong ống lấy máu
và giả
i phóng DNA của chúng; hoặc các tế bào thai bị tan rã sau khi tiếp xúc

7
với hệ thống miễn dịch của mẹ và dẫn đến giải phóng DNA phôi thai nhiều
hơn. Sau đó nhóm nghiên cứu này tiến hành nghiên cứu các mẫu huyết tương
thai phụ được lấy hai lần vào hai thời điểm khác nhau là 3 tháng đầu và 3
tháng cuối rồi định lượng DNA trên NST Y – có vai trò như là một marker
thai, và DNA β−globin – có vai trò như là một marker của DNA của cả thai
và mẹ ở các thời điểm trong vòng 24 giờ. Kết quả là ở
cả 2 giai đoạn của thai
kỳ đều không có sự tăng DNA phôi thai trong vòng tuần hoàn mẹ trong vòng
24 giờ [12]. Như vậy, những tế bào huyết học của thai ở trong ống lấy máu
không phải là nguồn gốc duy nhất và quan trọng nhất của DNA phôi thai.
1.2.2. Rau thai
Trái với những kiến thức từ lâu cho rằng rau thai tạo thành một màng
ngăn không cho thấm qua giữa mẹ và thai, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cả
nhữ
ng tế bào thai nguyên vẹn lẫn các nucleic acid của thai đều lưu hành tự do
trong máu mẹ.

Với kích thước và hoạt động phong phú, rau thai được coi là một nguồn
gốc hợp lý của DNA phôi thai tuần hoàn. Nhiều nghiên cứu trước đó đã cho
thấy tồn tại mối liên quan giữa số lượng DNA phôi thai tự do trong tuần hoàn
mẹ với tuổi thai [23,44,58]. Guibert và cs (2003) đã phát hiện được gen SRY
từ ngày thứ 18 sau thụ thai trong trường hợp có thai đôi, vào ngày thứ 22
trong trường hợp mang thai đơn, và ngày thứ 37 trong tất cả những phụ nữ
đượ
c nghiên cứu; và phát hiện được DNA phôi thai trong máu của 80% thai
phụ ở ngày thứ 28 (rau thai được hình thành sau khi có thai 28–30 ngày) [39].
Ngoài ra, năm 2004, Wataganara và cs đã phát hiện được DNA phôi
thai trong huyết tương mẹ từ ngày thứ 32 của thai kỳ, và nồng độ của chúng
tăng trung bình 4,2 GEq/ml huyết tương trong một tuần thai. Tác giả cũng
phát hiện được DNA phôi thai trong 11 ngày sau khi sảy thai − kết quả này là
bằng chứng chứng minh tua rau có khả năng lưu giữ một lượng nhỏ DNA
phôi thai [80]. Và theo Smid và cs (2003) , không có sự khác bi
ệt về nồng độ
DNA phôi thai giữa hai nhóm mang thai đôi (n=17) và nhóm mang thai đơn
(n=7) [71]. Như vậy, nguồn gốc của DNA phôi thai không phải chỉ từ các tế
bào thai có nhân trong tuần hoàn mẹ, mà hầu hết là từ lá nuôi hợp bào.
Để làm rõ nguồn gốc của DNA phôi thai tự do trong huyết tương mẹ,
Sekizawa và cs (2003) đã phân tích các cặp mẫu huyết tương lấy từ 15 phụ nữ
mổ đẻ, và từ máu dây rốn của trẻ mới sinh của họ.
Đối tượng nghiên cứu bao
gồm 5 phụ nữ tiền sản giật mức độ mạnh, và 10 phụ nữ mang thai bình
thường (đã được lựa chọn tương xứng về tuổi thai). Và sử dụng 7 marker
khác nhau trên các NST 13, 18 và 21 để phân biệt DNA phôi thai với DNA

8
mẹ. Kết quả cho thấy nồng độ trung bình của DNA phôi thai trong huyết

tương mẹ là 14,3% (từ 2,3–60%), và trong huyết tương dây rốn là 0,9% (từ
0,2–8,4%). Từ đó Sekizawa và cs khẳng định rằng DNA phôi thai có nguồn
gốc từ rau thai [70].
1.2.3. Sự trao đổi trực tiếp của các phân tử DNA giữa mẹ và thai
Nghiên cứu của nhiều tác giả khác nhau cho thấy có thể phát hiện được
trình tự DNA phôi thai trong một số dịch cơ thể khác nhau của mẹ
, bao gồm
nước tiểu [9,21], dịch não tủy [11] và dịch ổ bụng [27]. Và phát hiện được
nồng độ DNA phôi thai tự do trong dịch ối cao gấp 200 lần so với trong huyết
tương mẹ. Điều này cho phép nghĩ đến sự trao đổi trực tiếp của các phân tử
DNA qua rau thai hoặc qua dịch ối [17].
Tốc độ thay thế của DNA phôi thai tuần hoàn cũng đã được nghiên cứu
bởi các nghiên cứu về sự th
ải trừ DNA phôi thai tuần hoàn sau sinh [59].
Theo kết quả nghiên cứu của Lo và cs, hầu hết những phụ nữ đã được nghiên
cứu (7 trong số 8 phụ nữ) không phát hiện được nồng độ DNA phôi thai tuần
hoàn sau sinh 2 giờ. Thời gian bán hủy t/2 của DNA phôi thai đã được ước
lượng vào khoảng 16,3 phút (từ 4–30 phút) [59]. Do đó, với giả thuyết không
có những thay đổi đột ngột sự thải trừ DNA phôi thai tuần hoàn do quá trình
sinh nở, các tác giả tính toán rằ
ng để duy trì tình trạng ổn định, DNA phôi thai
có thể được giải phóng tiếp tục vào tuần hoàn mẹ với tốc độ trung bình 2,24–
104 bản copy/phút. Với tốc độ giải phóng và thải trừ nhanh chóng, số lượng
DNA phôi thai đã cung cấp một bức tranh toàn cảnh và chi tiết theo thời gian
về sự sản xuất và thải trừ DNA phôi thai, và vì vậy sẽ có ích cho giám sát thai
nghén.
Như vậy, có thể cho rằng phần lớn DNA phôi thai tự do trong tuần
hoàn mẹ
có nguồn gốc từ rau thai, một ngoại lệ là có nguồn gốc từ các tế bào
thai có nhân trong tuần hoàn mẹ và có khả năng từ chính thai thông qua trao

đổi trực tiếp.
1.3. Ứng dụng lâm sàng
Phương pháp định lượng DNA phôi thai trong huyết tương, huyết thanh
mẹ đã được ứng dụng trong lâm sàng để phát hiện thai lệch bội lẻ, xác định
thai phụ tiền sản giật, chẩn đoán không can thiệp kiểu gen Rh của thai và một
số đột biến đơn gen. Với sự tiến bộ của các kỹ thuật mới, có thể tin tưởng
rằng DNA phôi thai sẽ cho phép kiểm soát gen thai không xâm phạm như là
một phần của sàng lọc trước sinh thường quy trong tương lai gần.

9
DNA phôi thai trong huyết tương mẹ cũng có giá trị tiềm năng đối với
chẩn đoán trước sinh không xâm phạm các đột biến thần kinh [10], thai lệch
bội lẻ bộ NST [56], đột biến liên kết với giới tính [28], nhóm máu Rh của thai
[34] và TSTTBS [63].
1.3.1. Phát hiện giới tính
Từ những hiểu biết về DNA phôi thai nam trong huyết tương, huyết
thanh mẹ có thể sử dụng chúng để phát hiện không xâm phạm các thai nam có
nguy cơ bị bệnh di truyề
n liên kết với NST X. Năm 2002, Honda và cs sử
dụng kỹ thuật PCR thông thường phân tích DNA phôi thai tự do trong tuần
hoàn mẹ có thể đạt độ nhạy 100% ở tuần thai thứ 7, và với kỹ thuật PCR định
lượng có thể đạt độ nhạy 100% từ tuần thai thứ 5 để phát hiện các thai nam.
Từ đó, tác giả đề xuất rằng việc phát hiện giới tính thai thông qua phân tích
DNA trong huyết tương mẹ có thể cung cấp một pre–test nhằ
m quyết định
xem có nên tiến hành các kỹ thuật kiểm tra có xâm phạm đối với thai phụ
mang thai có nguy cơ mắc bệnh di truyền liên kết NST X như : loạn dưỡng cơ
Duchenne, hay Hemophilia A,… hay không [44]. Theo nghiên cứu của
Rijnders và cs (2001), việc phát hiện chính xác giới tính thai nhi sẽ cho phép
xác định những thai phụ cần chỉ định tiêm dexamethasone như là một liệu

pháp điều trị cho thai nữ có nguy cơ mắc bệnh TSTTBS [63]. Tuy nhiên, hạn
chế của kỹ thuật này là ch
ỉ phát hiện được các trình tự DNA đặc hiệu cho thai
nam trên NST Y chỉ có ở thai mà mẹ không có.

1.3.2. Chẩn đoán thai lệch bội lẻ
Chẩn đoán không can thiệp phát hiện thai lệch bội lẻ rất được các nhà
khoa học quan tâm, đó là do nguy cơ sảy thai mà các quy trình chẩn đoán có
xâm phạm (kỹ thuật chọc dịch ối, sinh thiết tua rau) gây ra. Dùng các tế bào
trong máu toàn phần của mẹ, Bianchi và cs thấy rằng DNA được giải phóng
từ những t
ế bào thai nguyên vẹn trong máu mẹ tăng gấp 6 lần khi thai bị
trisomy 21 [18]. Và nồng độ DNA phôi thai ở các thai phụ mang thai trisomy
21 và thai nam lệch bội lẻ lần lượt là 48,2 GEq/ml và 16,3 GEq/ml [16]. Số
liệu tương ứng của Lo và cs (1999) lần lượt là 46 GEq/ml và 23,3 GEq/ml
[56]. Theo nghiên cứu của Lee và cs (2002), nồng độ trung bình của DNA
phôi thai trong huyết thanh mẹ là 41,2 GEq/ml đối với các trường hợp bị hội
chứng Down, tương ứng ở các trường hợp bình thường là 24,2 GEq/ml. Như
vậy, nồng độ DNA phôi thai trong huy
ết tương thai phụ mang thai hội chứng

10
Down cao gấp khoảng 2 lần so với bình thường [51]. Spencer và cs (2003)
cũng đã chứng minh rằng nồng độ DNA phôi thai trong huyết tương, huyết
thanh mẹ tăng cao khi mang thai trisomy 21 [74].
Một ứng dụng lâm sàng quan trọng khác là định lượng DNA phôi thai
để chẩn đoán không can thiệp trisomy 13, 18 – trẻ cũng có một số triệu chứng
lâm sàng tương tự như ở trẻ trisomy 21 như: bất thường và chậm phát triển trí
tuệ. Áp dụng phương pháp bệnh – chứng, Wataganara và cs (2003) ti
ến hành

định lượng DNA phôi thai từ các mẫu huyết thanh được bảo quản đông lạnh
của 5 thai phụ mang thai nam bị trisomy 18, 5 thai phụ mang thai nam bị
trisomy 13 và 5 thai phụ bình thường để làm chứng (đã được chọn lựa phù
hợp về tuổi thai, giới tính thai và thời gian bảo quản đông lạnh). Kết quả cho
thấy nồng độ DNA phôi thai huyết thanh trong các trường hợp trisomy 13 là
97,5 GEq/ml (từ 29,2–187,0 GEq/ml), tương ứng ở các trường hợp trisomy 18
là 31,5 GEq/ml (từ
18,6–77,6 GEq/ml) và ở mẫu chứng là 40,3 GEq/ml (từ
3,7–127,4 GEq/ml). Như vậy, nồng độ DNA phôi thai trong các trường hợp
trisomy 13 tăng cao trong khi ở các trường hợp trisomy 18 không khác so với
các mẫu chứng. Đồng thời, sàng lọc huyết thanh mẹ trong 3 tháng giữa không
phát hiện được thai có nguy cơ trisomy 13 [81]. Vì vậy, định lượng DNA phôi
thai tự do nếu được bổ sung vào sàng lọc huyết thanh mẹ cơ bản có thể nâng
cao giá trị phát hiện các thai có nguy cơ bị trisomy 13.
1.3.3. Phát hiện các trường hợp mang thai có nguy cơ
tiền sản giật
Năm 2001, Leung và cs đã tiến hành nghiên cứu trên các thai phụ có
tiến triển tới giai đoạn cuối của tiền sản giật và thấy rằng nồng độ DNA phôi
thai tự do trong huyết tương các thai phụ này tăng cao hơn bình thường [53].
Hahn và cs (2002) cũng đã chứng minh rằng lượng DNA phôi thai trong
huyết tương thai phụ có triệu chứng tiền sản giật tăng gấp 5 lần so với bình
thường (t
ương ứng là 381 GEq/ml so với 76 GEq/ml) [40].
Năm 2004, Bianchi và cs phát hiện thấy nồng độ DNA phôi thai tự do
trong các mẫu huyết thanh tăng lên một cách có ý nghĩa lần đầu tiên từ tuần
thai thứ 17 và lần thứ hai vào thời điểm 3 tuần trước khi có triệu chứng lâm
sàng của tiền sản giật. Tác giả đưa ra giả thuyết rằng: nồng độ DNA tăng lần
đầu tiên là do sự hoại tử của rau thai hoặc các tế bào chế
t theo chương trình,
còn nồng độ DNA tăng lần thứ hai là do các triệu chứng của tiền sản giật làm

rối loạn các chức năng của mẹ kéo theo rối loạn sự bài tiết DNA phôi thai
[16].
Trước đó, Lo và cs (1999) cũng đã chứng minh rằng ở những thai phụ
bị tiền sản giật, bên cạnh nồng độ DNA phôi thai trong huyết thanh mẹ tăng

11
cao còn kèm theo tăng lưu hành của những tế bào thai có nhân trong huyết
tương mẹ [57].
Những nghiên cứu này gợi ý khả năng ứng dụng kỹ thuật định lượng
DNA phôi thai để sàng lọc và phát hiện các thai phụ có nguy cơ bị tiền sản
giật. Do vậy, hiện tượng tăng nồng độ DNA phôi thai tự do và các tế bào thai
trong vòng tuần hoàn mẹ ở các thai phụ tiền sản giật vẫn đang được các nhà
khoa học ti
ếp tục nghiên cứu để ứng dụng chúng vào chẩn đoán trong tương
lai gần.
1.3.4. Phát hiện những biến chứng khác khi mang thai
Theo Leung và cs (1998), nồng độ DNA phôi thai tự do tăng lên trong
tuần hoàn mẹ cũng có thể là một marker cho các trường hợp đẻ non. Chỉ
nghiên cứu những phụ nữ mang thai nam, nhóm nghiên cứu này đã thấy nồng
độ DNA phôi thai huyết tương mẹ trong nhóm các thai phụ đẻ non cao hơn
một cách có ý nghĩa so với các trường hợp mang thai bình thườ
ng cùng tuổi
thai. Như vậy, có thể sử dụng nồng độ DNA phôi thai trong huyết tương mẹ
để phát hiện các trường hợp có nguy cơ đẻ non [52].
Ngoài ra, nồng độ DNA phôi thai cũng tăng trong huyết tương mẹ
trong các trường hợp có bánh rau phụ [66] và những thai phụ nôn nhiều khi
có thai [69].
1.3.5. Xác định tính trạng RhD và bệnh
β−
thalassemia của thai

Phân tích DNA phôi thai tự do trong máu mẹ còn được ứng dụng vào
chẩn đoán không can thiệp nhóm máu RhD của thai. Ngoài NST Y, gen được
các nhà nghiên cứu quan tâm đầu tiên là RhD. Sự có mặt của gen RhD quy
định kiểu hình RhD (+), phát hiện được trình tự gen RhD của thai trong huyết
tương hoặc huyết thanh của những bà mẹ RhD (−) (không có gen RhD) nghĩa
là thai có RhD (+). Chẩn đoán xác định kiểu gen RhD của thai nhi rất có ý
nghĩa trong việc quản lý những thai phụ RhD (−) có chồng dị hợp tử gen
RhD, vì thế nhiều tác giả đã nghiên cứu phát hiện kiểu gen RhD của thai
thông qua phân tích DNA trong huyết tương hoặc huyết thanh mẹ và thấy đây
là kỹ thuật có độ tin cậy cao, đặc biệt là từ tháng thai thứ 4 trở đi [31,77]. Do
vậy, phân tích DNA phôi thai từ huyết tương, huyết thanh mẹ được coi là có
triển vọng trở thành test chẩn đoán thường quy cho chẩn đoán trước sinh
không can thiệp kiểu gen Rh của thai.
Ngoài ra, Chiu và cs (2002) đã chứng minh rằng s
ử dụng DNA phôi
thai tự do tuần hoàn trong huyết tương mẹ có tiềm năng cho chẩn đoán trước
sinh không can thiệp bệnh β−thalassemia [26].

12
1.4. Các kỹ thuật phát hiện DNA phôi thai lưu hành trong tuần hoàn mẹ
1.4.1. Kỹ thuật PCR thông thường
Năm 1985, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR, mở ra triển
vọng phát triển nhanh chóng các kỹ thuật sinh học phân tử [5] (trích dẫn của
Nguyễn Thanh Thuý, 2003).
Nguyên lý
Dựa trên đặc tính của DNA polymerase cho phép tổng hợp một đoạn
DNA bổ cứu với DNA khuôn nhờ một đoạn mồi tương ứng. Số lượng đoạn
DNA được khuếch đại trong kỹ thuật này tăng theo luỹ thừa.
Điều quan trọng là phải tổng hợp được cặp mồi có khả năng lai trong
giới hạn của nó và đảm bảo cho việc khuếch đại đoạn DNA mong muốn.

Muốn thực hiện được điều đó cần phải biết được trình tự nucleotid của đoạn
DNA cần khuếch đại.
1.4.2. K
ỹ thuật PCR lồng
Phản ứng PCR được thực hiện qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu khuếch
đại một đoạn DNA dài. Sản phẩm của phản ứng PCR ở giai đoạn này sẽ là
nguyên liệu cho phản ứng PCR ở giai đoạn hai với cặp mồi đặc hiệu và cho
sản phẩm là đoạn DNA có chiều dài ngắn hơn và nằm trong đoạn DNA được
khuếch đại ở giai đoạn một.
Ưu điểm của PCR lồng: được ứng dụng để phát hiện một lượng DNA
khuôn rất ít trong mẫu thử (<1 ng/µl).
Nhưng có nhược điểm là: hay bị nhiễm mẫu, do đó phải sử dụng đầu
côn có màng ngăn [5].
1.4.3. Kỹ thuật PCR định lượng
¾ Nguyên tắc của PCR định lượng
Sử dụng một phi
ến nhựa 96 giếng trong đó có: các hoá chất cần cho
phản ứng, DNA cần định lượng (hoặc DNA đã biết trước nồng độ để xây
dựng đường chuẩn), ngoài ra còn có đoạn thăm dò gắn fluor và các đoạn mồi
đặc hiệu. Phản ứng được thực hiện trên máy ABI Prism 7700 (Perkin Elmor)
diễn ra qua hai giai đoạn: một giai đoạn biến tính và một giai đoạn kết hợp
gắn m
ồi và kéo dài. Kết quả được so sánh, tính toán dựa trên đường chuẩn
[5].


13
1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.5.1. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước
Năm 1989, Lo và cs là người đầu tiên phát hiện được sự hiện diện của

đoạn DNA trên NST Y của thai nhi trong máu ngoại vi của mẹ [54] (trích dẫn
của Lo và cs, 1997).
Sau đó năm 1990, Camaschella và cs dùng kỹ thuật PCR lồng phát hiện
các trình tự DNA phôi thai lấy từ máu ngoại vi của mẹ nhằm chẩn đoán bệnh
Hemoglobin của thai [22].
Năm 1991, Arinami và cs, Wachtel và cs phát hiện được các trình tự
DNA phôi thai từ máu của thai phụ b
ằng kỹ thuật PCR lồng để xác định giới
tính của thai nhi [13,79].
Năm 1992, Kao và cs dùng kỹ thuật PCR lồng phát hiện được các trình
tự DNA phôi thai để chẩn đoán trước sinh giới tính thai nhi từ các mẫu máu
của các thai phụ được lấy một cách ngẫu nhiên [49].
Năm 1995, Thomas và cs [76] khẳng định rằng hầu hết các tế bào thai
được thải trừ sau khi sinh 2–3 tháng.
Năm 1997, Lo và cs phát hiện được DNA phôi thai tự do trong tuần
hoàn mẹ và các trình tự DNA phôi thai đặc hiệu cho NST Y tu
ần hoàn trong
huyết tương các thai phụ mang thai nam. Phát hiện này mở ra khả năng phát
triển các quy trình chẩn đoán trước sinh không can thiệp có độ tin cậy cao mà
không gây nguy cơ rủi ro cho mẹ và thai [54]. Smid và cs cũng chứng minh
rằng chẩn đoán trước sinh không can thiệp giới tính thai nhi trong 3 tháng đầu
có khả năng đạt độ chính xác cao bằng các kỹ thuật phân tích phân tử dựa trên
DNA đã chiết tách từ máu toàn phần hoặc từ huyết tương, huyết thanh mẹ
[73].
Nă
m 1998, Lo và cs dùng kỹ thuật PCR định lượng phát hiện nồng độ
cao của DNA phôi thai trong huyết tương mẹ, sau đó dùng DNA phôi thai
trong huyết tương và huyết thanh mẹ để chẩn đoán trước sinh không can thiệp
yếu tố Rh và bệnh tan máu sơ sinh do không phù hợp nhóm máu Rh mẹ –
con. Đồng thời, nhóm nghiên cứu này cũng phát hiện được các thai nam đạt

độ đặc hiệu là 94–100% khi phân tích DNA phôi thai chiết tách từ huyết
tương và huyết thanh mẹ sử dụng kỹ thuật PCR
định lượng [58].
Năm 1999, Lo và cs phân tích các mẫu máu của 12 thai phụ vừa mới
sinh con trai được 1–42 ngày và thấy rằng không thể phát hiện được DNA
phôi thai trong tuần hoàn của mẹ sau khi sinh được 1 ngày. Còn khi nghiên
cứu các thai phụ tiền sản giật, tác giả thấy nồng độ DNA phôi thai tự do trong

14
huyết thanh mẹ cao hơn 5 lần so với các thai phụ bình thường tương ứng về
tuổi thai [59].
Năm 2000, Amicucci và cs sử dụng DNA phôi thai để chẩn đoán trước
sinh không can thiệp các đột biến di truyền từ mẹ như bệnh loạn dưỡng cơ
Duchenne [10].
Năm 2001, Sekizawa và cs sử dụng DNA phôi thai trong huyết tương
và huyết thanh mẹ để chẩn đoán trước sinh không can thiệp giới tính thai [67].
Honda và cs, Sekizawa và cs đã chẩn đoán giới tính trướ
c sinh không can
thiệp sử dụng huyết tương và huyết thanh mẹ và thấy rằng huyết thanh mẹ ổn
định hơn so với huyết tương mẹ [45,67].
Năm 2002, Lau và cs phát hiện sự giảm thải trừ DNA phôi thai khỏi
huyết tương mẹ khi có biến chứng tiền sản giật: thời gian bán huỷ t/2 của
DNA phôi thai tự do ở các thai phụ tiền giật kéo dài 4 lần so với mẫu chứng
(tương ứng là 114 phút và 28 phút) [50]. González–González và cs dùng k
ỹ
thuật PCR phát hiện DNA phôi thai từ huyết tương và huyết thanh mẹ để chẩn
đoán không xâm phạm giới tính thai, nhóm máu RhD và các đột biến của thai
[37]. Honda và cs tiến hành kỹ thuật PCR định lượng để phát hiện gen SRY
và gen β−globin nhằm xác định giới tính thai nhi và tính toán nồng độ DNA
phôi thai trong huyết thanh mẹ ở giai đoạn mang thai sớm [44]. Costa và cs đã

mô tả kỹ thuật mới xác định động học của việc giải phóng DNA phôi thai vào
huyết thanh mẹ
[31].
Năm 2003, Guibert và cs phát hiện được gen SRY sớm nhất là sau 18
ngày kể từ khi thụ thai và trung bình là 37 ngày trong tất cả các trường hợp
[39].
Năm 2005, González–González và cs sử dụng kỹ thuật QF–PCR
(quantitative fluorescent polymerase chain reaction) phát hiện giới tính thai
nhi đạt độ nhạy là 90%. Kỹ thuật này cũng cho phép phát hiện được DNA
phôi thai từ tuần thai thứ 10 cho tới 2 giờ sau khi sinh [38].
Năm 2006, Chi và cs chẩn đoán trước sinh bệnh Hemophilia thông qua
xác định giới tính thai nhi trước sinh không can thiệp trong 3 tháng đầu bằng
siêu âm và phân tích DNA phôi thai tự do [24].
Năm 2007, Lo và cs tiến hành nghiên cứu phát hiện trisomy 21 thông
qua phát hiện sự mất cân bằng các alen A/G trên phân tử mRNA trong huyết
tương mẹ đặc hiệu cho rau thai. Kỹ thuật này cho phép phát hiện lệch bội lẻ
ngay cả khi nồng độ DNA phôi thai trong huyết tương mẹ rất thấp [55].
Dhallan và cs đã tiến hành thành công phương pháp làm giàu DNA phôi thai
từ huyết tương mẹ có formaldehyde [32].

15
Năm 2008, Chim và cs, Pineles và cs đã nghiên cứu về microRNAs
(miRNAs) là loại RNAs nhỏ có vai trò điều tiết rất quan trọng đối với các gen
cấu trúc, được tạo ra bởi rau thai và giải phóng vào huyết tương mẹ [25,60]
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước
Ở Việt Nam, cho đến nay hầu hết các kỹ thuật sử dụng để chẩn đoán
trước sinh đều là kỹ thuật xâm phạm như lấy mẫu dịch ối, sinh thiết tua rau,
chẳ
ng hạn:
Năm 1998, Nguyễn Thanh Thuý, Vũ Triệu An và cs sử dụng kỹ thuật

PCR tìm gen TDF để xác định giới tính thai nhi qua nước ối [6].
Năm 2001, Hoàng Ngọc Lan và cs dùng kỹ thuật PCR để xác định giới
tính thai nhi qua nước ối góp phần cho việc tư vấn di truyền trước sinh [4].
Năm 2006, Trần Thị Thanh Hương và cs định lượng AFP, hCG, uE
3

trong huyết thanh mẹ để sàng lọc trước sinh những thai nhi dị tật bẩm sinh
[1].
Năm 2007, Trần Thị Thanh Hương và cs chẩn đoán trước sinh hội
chứng Down, hội chứng Turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp
với phân tích NST của tế bào ối [2].
5/2007, Nguyễn Thanh Thuý và cs báo cáo về kết quả bước đầu xác
định DNA phôi thai trong máu mẹ bằng kỹ thuật PCR lồng [7].
12/2007, một số tác giả
khác: Nguyễn Thị Trang và cs báo cáo tại Hội
nghị chẩn đoán trước sinh về việc sàng lọc trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ
Duchenne cho một số thai phụ có nguy cơ [8]. Trần Văn Khoa và cs đã có kết
quả bước đầu về phân tích DNA phôi thai tự do trong máu mẹ [3].
Tuy nhiên, các kỹ thuật hầu hết là kỹ thuật xâm phạm, một số tác giả sử
dụng kỹ thuật không xâm phạm thì số bệnh nhân còn rấ
t ít, do vậy việc tiến
hành đề tài là cần thiết.