Nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khối phổ (Luận án tiến sĩ)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.11 MB, 231 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI
DƯỢC
HÀ NỘI
• HỌC
•
•
•
TỐNG THỊ THANH VƯỢNG
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC
TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC,
DIN OPHYSISTOXIN-1,
DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT
X.
~
Ẵ
9
9
9 .
SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở
BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ
LUẬN
ÁN TIÉN SĨ DƯỢC
HỌC
•
•
•
HÀ NỘI, NĂM 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI
DƯỢC
HÀ NỘI
• HỌC
•
•
•
TỐNG THỊ THANH VƯỢNG
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC
TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC,
DIN OPHY SISTOXIN-1,
DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT
SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở
BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ
LUẬN
ÁN TIÉN SĨ DƯỢC
HỌC
•
•
•
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 9720210
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Đình Chi
PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo
HÀ NỘI, NĂM 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình
nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tống Thị T hanh Vượng
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và hiệu
quả của nhiều cá nhân và tập thể, các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia
đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Lê Đình Chi, giảng viên bộ môn Hoá phân tích - Độc chất, Trường Đại
học Dược Hà Nội và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo, Viện trưởng Việm Kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, là hai người thầy, cô đã tận tình
hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, cho tôi những kiến thức quý báu và động viên
tôi quyết tâm hoàn thành luận án.
GS.TS. T hái Nguyễn H ùng Thu, nguyên Hiệu phó, trưởng chuyên ngành
Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội là người thầy
đã động viên, chỉ dẫn và đóng góp ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành luận án.
Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội và Ban L ãnh đạo Viện Kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
hoàn thành luận án đúng thời gian quy định.
Các thầy, cô Bộ môn Hoá phân tích - Độc chất và Phòng Sau đại học, Trường
Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Gia đình và những người thân
đã chia sẻ, động viên tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận án.
Tác giả luận án
Tống Thị T hanh Vượng
ii
MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN Đ Ề .........................................................................................................
1
CHƯƠNG 1. TỔNG Q U AN ................................................................................
3
1.1. ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN...............................................................................
3
1.1.1. Nguồn gốc.....................................................................................................
3
1.1.2. Tóm tắt quá trình nghiên cứu một số nhóm độc tố tảo đơnbào gây độc
cho con người......................................................................................
4
1.2. NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HOÁ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM
SOÁT ĐỘC TỐ DSP..................................................................................................
7
1.2.1. Nguồn gốc độc tố D SP.................................................................................
7
1.2.2. Cấu trúc hoá học độc tố D SP.........................................................................
8
1.2.3. Cơ ch ế tác dụng, độc tính độc tố D SP...........................................................
10
1.2.4. Ngộ độc cho người do độc tố D SP...............................................................
11
1.2.5. Quy định kiểm soát độc tố D SP.....................................................................
12
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ DSP..........................................
16
1.3.1. Các phương pháp xử lý m ẫu để chiết độc tố nhóm acid okadaic...............
16
1.3.1.1. Lựa chọn dung môi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn th ể...................
17
1.3.1.2. Các phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu.........................................
18
1.3.1.3. Các phương pháp thuỷ phân mẫu và làm sạch sau thuỷ phân..................
20
1.3.2. Các phương pháp sinh học để phân tích độc tố nhóm acid okadaic..........
21
iii
1.3.2.1. Các phương pháp định lượng sinh học in vivo.........................................
21
1.3.2.2. Các phương pháp định lượng qua gây độc tế bào.....................................
22
1.3.2.3. Các phương pháp hoá sin h .........................................................................
23
1.3.3. Các phương pháp hoá lý để phân tích độc tố nhóm acid okadaic..............
24
1.3.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao..........................................................................
24
1.3.3.2. Điện di mao quản........................................................................................
26
1.3.3 3. Sắc ký khí.....................................................................................................
27
1.4. ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NHÓM
ACID OKADAIC........................................................................................................
27
1.4.1. Các đặc trưng khối phổ của độc tố nhóm O A ...............................................
27
1.4.1.1. Khối phổ của OA trong kỹ thuật EI và C I.................................................
27
1.4.1.2. Khối phổ của OA trong kỹ thuật FAB......................................................
28
1.4.1.3. Khối phổ của OA trong kỹ thuật ESI.........................................................
29
1.4.1.4. Khối phổ dạng ester của O A .......................................................................
34
1.4.2. Phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA bằng LC - MS/M S........
36
1.4.2.1. Kỹ thuật ion hoá..........................................................................................
36
1.4.2.2. Lựa chọn phân tích khối.............................................................................
37
1.4.2.3. Điều kiện sắc k ý ..........................................................................................
38
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG TH IẾ T BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯ ƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U .......................................................................
43
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ..................................................................
43
2.1.1. Dung môi, hoá chất và chất chuẩn................................................................
43
2.1.1.1. Chất chuẩn...................................................................................................
43
iv
2.1.1.2. Dung môi, hoá chất....................................................................................
43
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích..........................................................................
43
2.1.2.1. Thiết bị phân tích.........................................................................................
43
2.1.2.2. Dụng cụ phân tích........................................................................................
44
2.2.
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................................................
45
2.2.1. Mẫu nhuyễn thể lấy tại các địa phương.........................................................
45
2.2.2. Mẫu thêm chuẩn.............................................................................................
45
2.2.3. Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố ..........................................................
45
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................
46
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 trong
nhuyễn thể..................................................................................................................
46
2.3.1.1. Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ......................................................
46
2.3.1.2. Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký ...........................................................
47
2.3.1.3. Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể..................................
48
2.3.1.4. Khảo sát điều kiện thuỷ phân để phân tích độc tố toàn phần...................
48
2.3.1.5. Thẩm định phương pháp.............................................................................
49
2.3.2. Lấy mẫu nhuyễn thể và bảo quản m ẫu.......................................................
51
2.3.2.1. Lựa chọn số lượng cá thể cho mỗi mẫu nhuyễn thể..................................
51
2.3.2.2. Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể...........................................
51
2.3.3. Phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể và biện giải kết quả.....................
51
2.3.3.1. Tiến hành phân tích trên mẫu thực.............................................................
51
2.3.3.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả phân tích độc tố trong nhuyễn thể.............
52
2.3.3.3. Các hướng biện giải, bàn luận kết quả......................................................
52
v
CHƯƠNG 3. K ẾT QUẢ NGHIÊN C Ứ U ...........................................................
53
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2..................
53
3.1.1. Khảo sát thiết lập điều kiện phân tích OA, DTX1 và DTX2 bằng M S......
53
3.1.1.1. Điều kiện của detector M S/M S.................................................................
53
3.1.1.2. Điều kiện sắc k ý ..........................................................................................
59
3.1.2. Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1 và DTX2 từ
nhuyễn thể..................................................................................................................
65
3.1.2.1. Đồng nhất m ẫu............................................................................................
65
3.1.2.2. Lựa chọn dung môi chiết độc tố .................................................................
65
3.1.2.3. Lựa chọn thể tích dung môi chiết...............................................................
67
3.1.2.4. Khảo sát điều kiện làm sạch dịch chiết.....................................................
68
3.1.2.5. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố ở dạng tự do..............................
73
3.1.2.6. Khảo sát thiết lập điều kiện thuỷ phân để phân tích OA, DTX1 và
DTX2 toàn phần trong nhuyễn thể..........................................................................
74
3.1.3. Khảo sát thiết lập điều kiện bảo quản nhuyễn thể.....................................
79
3.1.3.1. Đánh giá độ ổn định của độc tố trong nhuyễn thể ở một số điều kiện
nhiệt độ......................................................................................................................
79
3.1.3.2. Điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể..........................................................
82
3.2.
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2...........
82
3.2.1. Điều kiện của các phương pháp được thẩm định.........................................
82
3.2.1.1. Phương pháp phân tích độc tố tự do trên cột Cortecs...............................
82
3.2.1.2. Phương pháp phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax.........
84
3.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích độc tố trên cột Cortecs......................
85
vi
3.2.2.1. Độ đặc hiệu.................................................................................................
85
3.2.2.2. Độ thích hợp hệ thống................................................................................
87
3.2.2.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc.............................................
88
3.2.2.4. Độ chính xác................................................................................................
88
3.2.2.5. Độ đúng........................................................................................................
91
3.2.2.6. Độ nhậy........................................................................................................
92
3.2.3. Thẩm định phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax.................
94
3.2.3.1. Độ đặc hiệu..................................................................................................
94
3.2.3.2. Độ thích hợp hệ thống................................................................................
96
3.2.3.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc.............................................
97
3.2.3.4. Độ chính xác khi phân tích độc tố tự do....................................................
98
3.2.3.5. Độ chính xác khi xác định độc tố toàn phần..............................................
101
3.2.3.6. Độ đúng khi phân tích độc tố tự do............................................................
103
3.2.3.7. Độ đúng khi phân tích độc tố toàn phần....................................................
104
3.2.3.8. Độ nhậy........................................................................................................
104
3.3. PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ..................
107
3.3.1. Lấy mẫu nhuyễn thể và phân tích độc tố ......................................................
107
3.3.2. Kết quả phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể...........................................
109
3.3.2.1. Kết quả phát hiện độc tố tự do.....................................................................
109
3.3.2.2. Kết quả phát hiện độc tố sau khi thuỷ phân...............................................
111
3.3.3. Sự phân bố các mẫu phát hiện có độc tố ........................................................
113
3.3.3.1. Phân bố các mẫu có độc tố theo loại nhuyễn thể......................................
113
3.3.3.2. Phân bố các mẫu có độc tố theo địa điểm lấy m ẫu....................................
116
vii
3.3.3.3. Phân bố các mẫu có độc tố theo thời điểm lấy m ẫu...................................
119
CHƯƠNG 4. BÀN LU ẬN ......................................................................................
122
4.1. BÀN LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐƯỢC XÂY DỰNG....................
122
4.1.1. Điều kiện phân tích độc tố bằng LC - MS/M S.............................................
122
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu nhuyễn thể...................................................................
126
4.1.2.1. Cỡ mẫu nhuyễn thể......................................................................................
126
4.1.2.2. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố tự do..........................................
126
4.1.2.3. Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố toàn phần..................................
127
4.2. BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ TRONG NHUYỄN THỂ.......... 129
4.2.1. Loại độc tố phát hiện được, tỷ lệ xuất hiện và mức độ hàm lượng trong
nhuyễn thể..................................................................................................................
129
4.2.2. Dao động sự xuất hiện của độc tố trong nhuyễn thể cùng các yếu tố ảnh
hưởng.........................................................................................................................
131
4.3. NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG TỚI SỨC KHOẺ VÀ HƯỚNG KIỂM SOÁT ĐỘC
TỐ NHÓM OA TRONG NHUYỄN THỂ TRONG TƯƠNG LAI..............................
140
KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị...............................................................................
142
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
viii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẮT
Ký hiệu
Nội dung
ACN
Acetonitril
ADAM
9-anthryldiazomethan
ALP
Alkaline phosphatase
AOAC
Hiệp hội các cộng đồng phân tích (Association Of Analytical
Communities)
ASP
Mất trí nhớ do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Amnesic Shellfish
Poisoning)
AZA
Azaspiracid
AZP
Ngộ độc azaspiracid do thuỷ sinh vật vỏ cứng (Azaspiracid
Shellfish Poisoning
BAP
1-bromoacetylpyren
BNNVPTNT Bộ nông nghiệp và phát triên nông thôn
BrDMEQ
3-bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-quinoxalinon
BSA
Huyêt thanh bò (Bovine Serum Albumin)
CA
9-cloromethylanthracen
CI
Ion hoá hoá học (Chemical Ionization)
CE
Năng lượng băn phá ion sơ cấp (Collision Energy)
CEFAS
Trung tâm khoa học môi trường, ngư nghiệp và nuôi trồng hải sản
Anh (Centre for Environtment, Fisheries and Aquaculture Science)
CTX
Ciguatoxin
CXP
Thê khi ra khỏi buồng va chạm (Collision Cell Exit Potential)
1
DP
Thê tách chùm (Declustering Potential)
DSP
Tiêu chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish
Poisoning)
DTX
Dinophysistoxin
DTX1
Dinophysistoxin-1
DTX2
Dinophysistoxin-2
EC
Uỷ ban châu Au (European Commission)
EI
Ion hoá điện tử (Electron Ionization)
ELISA
Định lượng băng găn miên dịch liên kêt enzym (Enzym - Linked
ImmunoSorbent Assay)
ESI
Ion phun điện tử (Electrospray Ionization)
EU
Liên minh châu Au (European Union)
FAB
Băn phá nhanh nguyên tử (Fast-Atom Bombardment)
GC
Săc ký khí (Gas Chromatography)
HPLC
Săc ký lỏng hiệu năng cao (High Performace Liquid Chromatograph
HRP
Horseradish Peroxidase
IP
Điên định danh (Identification Point)
KB
Tê bào ung thư biêu mô
LC
Săc ký lỏng (Liquid Chromatography)
LC-MS
Săc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass Spectrometry)
LC-MS/MS
Săc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid Chromatography Tandem
Mass Spectrometry)
11
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ
Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)
MBA
Định lượng sinh học trên chuột (Mouse Bioassay)
MEKC
Săc ký điện động mixen (Micellar Electrokinetic Chromatography)
MeOH
Methanol
MRM
Theo dõi đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring)
MU
Đơn vị chuột (Mouse Unit)
NAFIQAD
Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thuỷ sản (National AgroForestry-Fisheries Quality Assurance Department)
NSP
Ngộ độc thần kinh do thuỷ sinh vật vỏ cứng (Neurotoxic Shellfish
Poisoning)
NRCC
Hội đồng nghiên cứu quốc gia Canada (National Research Council
Canada)
NT2MV
Nhuyên thê hai mảnh vỏ
OA
Acid Okadaic
PP
Protein Phosphatase
PSP
Tê liệt do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Paralytic Shellfish
Poisoning
PTX
Pectenotoxin
SD
Độ lệch chuân (Standard Deviation)
SDS
Sodium DodecylSulfate
SIM
Chê độ chọn lọc ion (Select Ion Monitoring)
S/N
Tín hiệu trên nhiêu nên (Signal/Noise)
SOP
Quy trình thao tác chuân (Standard Operation Procedure)
iii
SPE
Chiêt pha răn (Solid phase extraction)
TCVN
Tiêu Chuân Việt Nam
TFA
Acid trifluoroacetic
TT
Thông tư
TTX
Tetrodotoxin
UPLC
Săc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performace Liquid Chromatograpl
USFDA
Cơ quan quản lý Dược phâm và thực phâm Mỹ (United States Food
Drug Administation)
UV-Vis
Tử ngoại - Khả kiên (Ultra Violet - Visible)
YTX
Yessotoxin
iv
DANH MỤC
CÁC BẢNG,y BIỂU
•
T rang
Bảng 1.1
Quy định kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể theo
Thông tư 33/2015/TT - BNNVPTNT.........................................
Bảng 1.2
15
Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp LC - MS để xác định
độc tố nhóm O A ............................................................................
39
Bảng 2.1
Hàm lượng các độc tố trong mẫu chuân......................................
46
Bảng 3.1
Điêu kiện chạy nguồn ion hoá E SI...............................................
59
Bảng 3.2
Điêu kiện tách chùm ion sơ cấp và tạo ion thứ cấp của độc tố
nhóm D SP......................................................................................
59
Bảng 3.3
Chương trình gradient dung môi cho cột Cortecs.......................
64
Bảng 3.4
Khảo sát thể tích MeOH và số lần chiết.......................................
67
Bảng 3.5
Ảnh hưởng của các điêu kiện tác động lên dịch chiết M eOH....
69
Bảng 3.6
Khảo sát điêu kiện nạp mẫu và khả năng thu hồi độc tố .............
71
Bảng 3.7
Khảo sát thể tích rửa giải...............................................................
72
Bảng 3.8
Kết quả đánh giá khả năng làm sạch dịch chiết bằng ly tâm
Bảng 3.9
lạnh.................................................................................................
73
Đánh giá khả năng bảo tồn độc tố sau khi xử lý dịch thuỷ phân..
76
v
Bảng 3.10 Đánh giá thay đổi hàm lượng độc tố tự do trong các điêu kiện
bảo quản khác nhau.......................................................................
Bảng 3.11
79
Đánh giá thay đổi hàm lượng OA tự do và toàn phần trên mẫu
thực trong các điêu kiện bảo quản khác nhau..............................
80
Bảng 3.12 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Cortecs........................
87
Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm v i ệ c . .
88
Bảng 3.14 Thâm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột
Cortecs............................................................................................
89
Bảng 3.15 Thâm định ảnh hưởng của loại nên nhuyễn thể lên độ đúng, độ
chính xác với độc tố tự do..............................................................
91
Bảng 3.16 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Cortecs.............................
92
Bảng 3.17 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Zorbax Eclipse
Plus.................................................................................................
Bảng 3.18 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc....
97
97
Bảng 3.19 Thâm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột
Zorbax..........................................................................................
99
Bảng 3.20 Thâm định ảnh hưởng của loại nên nhuyễn thể lên độ đúng, độ
chính xác với độc tố tự do khi phân tích trên cột Zorbax.............
Bảng 3.21
100
Đánh giá độ đúng, độ chính xác trên mẫu chuân.......................... 102
Bảng 3.22 Thâm định độ chính xác với độc tố toàn phần trên mẫu thực.....
103
Bảng 3.23 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Zorbax Eclipse Plus........
105
Bảng 3.24 Kết quả lấy mẫu nhuyễn thể theo thời gian, địa điểm lấy mẫu
và loại m ẫu......................................................................................
108
Bảng 3.25 Tổng hợp kết quả các mẫu phát hiện có độc tố ............................
110
vi
DANH MỤC
CÁC HINH VE,y ĐO THỊ•
•
T rang
Hình 1. 1
Công thức cấu tạo của OA và các D TX ...........................................
Hình 1.2
Phổ khối của OA trong các điêu kiện khác nhau: (a) phổ EI, (b)
phổ CI ion dương, (c) phổ CI ion âm [19]......................................
Hình 1.3
33
Cơ chế phân mảnh ion thứ cấp từ ion [M+Na]+ của OA, DTX1,
DTX2 [24]........................................................................................
Hình 1.8
31
Phổ ion thứ cấp của ion [M+Na]+ của OA (a), DTX2 (b), DTX1
(c) [24]..............................................................................................
Hình 1.7
30
Phổ ion thứ cấp của ion [M-H]" của OA (a), DTX2 (b), DTX1
(c) [24] ..........................................................................................
Hình 1.6
29
Cơ chế phân mảnh ion thứ cấp từ ion [M-H]- của OA, DTX1,
DTX2 [24] .......................................................................................
Hình 1.5
28
Phổ khối FAB của OA: (a) chế độ ion dương, (b) chế độ ion
dương m/z từ 400 đến 1000, (c) chế độ ion âm [19].....................
Hình 1.4
8
34
Phổ ion thứ cấp của ion [M-H]" của OA (m/z 803) (a), OA
palmitat (m/z 1041) (b), DTX1 (m/z 817) (c) và DTX1 palmitat
(m/z 1055) (d) [123]........................................................................
vii
35
Các ion thứ cấp đặc trưng của các 7-O acyl ester có nguồn gốc
từ ion [M-H]- (ion (i) và (ii), và ion [M+Na]+ (các ion I, II, III,
IV) [123]..........................................................................................
35
Một số ester diol và ester hỗn hợp của độc tố nhóm OA, cơ chế
phân mảnh ion [M+Na]+ của các ester này [122]..........................
36
Chuẩn OA, DTX1, DTX2 của N RCC............................................
43
Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố của N RCC.......................
46
Phổ ESI - MS của O A .....................................................................
54
Phổ ESI - MS của DTX1................................................................
54
Phổ ESI - MS của DTX2................................................................
54
Kết quả khảo sát DP của O A ...........................................................
55
Kết quả khảo sát DP của DTX1.....................................................
55
Kết quả khảo sát DP của DTX2.....................................................
55
Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ cấp O A .............
56
Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp DTX1........
56
Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp D TX2........
56
Kết quả tối ưu hoá CE cho các ion thứ cấp....................................
57
Kết quả tối ưu hoá CXP cho các ion thứ cấp.................................
58
Sắc ký đồ chuẩn độc tố ở cùng tỷ lệ pha động sử dụng dung môi
là ACN (A,B) và MeOH (C,D).......................................................
60
Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid formic trong pha động
tới đáp ứng pic của các độc tố .........................................................
vill
61
Hình dạng pic khi phân tích trên cột Cortecs với pha động ACN
- H2O chứa 0,1% acid formic, rửa giải theo chương trình
gradient tại bảng 3.3........................................................................
62
Ảnh hưởng của amoni format tới hình dạng pic khi phân tích
trên cột Zorbax với pha động có tỷ lệ dung môi ACN - H2O
(35:65, tt:tt)......................................................................................
62
Ảnh hưởng của loại dung môi (A) và thể tích dung môi (B) tới
hiệu quả chiết các độc tố từ nhuyễn thể..........................................
66
Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả thuỷ phân dẫn
xuất ester của độc tố .........................................................................
77
Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Cortecs............................................
86
Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOQ với cột Cortecs...
93
Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Cortecs...
94
Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu trên cột Zorbax........................
95
Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOQ với cột Zorbax...
106
Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Zorbax...
107
Một số sắc ký đồ khi phân tích bằng M S/M S................................
112
Kết quả phát hiện độc tố trên vẹm xanh.........................................
113
Kết quả phát hiện độc tố trên hàu...................................................
114
Kết quả phát hiện độc tố trên sò lông.............................................
115
Kết quả phát hiện độc tố trên sò huyết............................................
116
Tỷ lệ phát hiện độc tố theo loại nhuyễn th ể...................................
116
Kết quả phát hiện độc tố theo địa phương lấy m ẫ u ......................
118
Hình 3.31
Kếtquả phát hiện độc tố trong nhuyễn thể theo thời gian lấy
m ẫ u ..................................................................................................
Hình 4.1
120
Dao động vê tỷ lệ mẫu phát hiện có độc tố theo thời gian lấy
m ẫu....................................................................................................
x
134
ĐẶT VẤN ĐỀ
•
Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề có tầm quan trọng thường
trực cho việc đảm bảo chất lượng cuộc sống của cả cộng đồng và đang nhận
được sự quan tâm sát sao của toàn xã hội tại Việt Nam hiện nay. Trong lĩnh vực
này, nổi cộm hơn cả là việc thực phẩm bị “nhiễm bẩn” bởi các tác nhân gây hại
tới sức khỏe con người có nguồn gốc rất đa dạng, song tựu chung lại có thể
phân loại thành 2 nhóm lớn: Thứ nhất, đó là những chất độc hại nhiễm vào thực
phẩm do các hoạt động vô ý hay cố ý của con người, như lạm dụng thuốc bảo
vệ thực vật trong canh tác cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hay việc lạm
dụng kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong nuôi trồng thủy sản, chăn
nuôi gia súc, hoặc những chất thải độc hại ngấm vào thực phẩm qua các hoạt
động khác của con người như sản xuất công nghiệp, xả thải công nghiệp, rác
thải sinh hoạt bừa bãi ra khí quyển, nguồn nước... Thứ hai là những độc tố mang
nguồn gốc tự nhiên xâm nhập, tích lũy trong thực phẩm, trong đó điển hình có
thể kể đến các độc tố vi nấm trong các loại hạt ngũ cốc, các độc tố vi tảo [13],
[88] và vi khuẩn trong các loại thủy hải sản, nhất là các loại nhuyễn thể. Trong
số các độc tố tự nhiên có thể tích lũy trong thực phẩm, cho tới nay những nghiên
cứu đã được công bố cho thấy các độc tố do các loài vi tảo hai roi sản xuất là
nguyên nhân gây ra rất nhiều hội chứng ngộ độc cho người. Khả năng gây độc
rất đa dạng, trong đó hay gặp nhất là các triệu chứng trên hệ thần kinh (gây tê
liệt, hôn mê, mất trí n h ớ . , có thể tử vong trong các vụ ngộ độc nghiêm trọng)
và hệ tiêu hóa (đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa...), dẫn tới những vụ ngộ độc ở
quy mô khác nhau tại nhiều nơi trên thế giới [33], [133]. Trong các hội chứng
ngộ độc đường tiêu hóa do độc tố của vi tảo hai roi gây ra có hội chứng tiêu
chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP)
với tác nhân là nhóm độc tố gồm acid okadaic (OA) và các dẫn xuất gọi chung
là dinophysistoxin (DTX) [11].
Hiện tại ở Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ban hành
Thông tư số 33/2015/TT-BNNVPTNT quy định về giám sát vệ sinh, an toàn
thực phẩm trong thu hoạch nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong đó có quy định giới
hạn tổng của OA, các DTX và pectenotoxin (PTX) là 160 ppb [1]. Tuy nhiên,
1
việc đánh giá nguy cơ có mặt của các độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại
Việt Nam vẫn chưa được thực hiện một cách có hệ thống, ngoại trừ một số
nghiên cứu khoanh vùng ở các khu nuôi thủy sảnnhư nghiên cứu của Viện
Nghiên cứu hải sản tiến hành ở 3 vùng nuôi ngao tập trung vào năm 2003 [5].
Bên cạnh đó, phương pháp chính thức hiện tại của TCVN 8341: 2010 [2] chỉ
cho phép xác định OA, không cho phép xác định các DTX, còn phương pháp
bán định lượng trên chuột (MBA) có thể cho kết quả dương tính cả với các
nhóm hợp chất thân dầu chưa ghi nhận có độc tính trên người như PTX,
yessotoxin (YTX). Do vậy, cần có phương pháp đặc hiệu hơn để xác định chính
xác OA và các DTX, thủ phạm chính gây hội chứng DSP. Để góp phầnđưa ra
các giải pháp phân tích đặc hiệu hơn, cũng như đánh giá toàn diện hơn sự có
mặt của độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam, luận án: “NGHIÊN
CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỒ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC,
DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG M Ộ T SỒ NHUYỄN
THỂ HAI M ẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC K Ý LỎNG KHỒI PHỔ "
được thực hiện nghiên cứu với 2 mục tiêu sau:
M ục tiêu 1: Xây dựng phương pháp định lượng các độc tố gây tiêu chảy acid
okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 bằng phương pháp sắc ký lỏng
khối phổ.
M ục tiêu 2: Xác định hàm lượng các độc tố kể trên trong một số nhóm nhuyễn
thể hai mảnh vỏ được lấy tại các vùng biển Việt Nam
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN
1.1.1. Nguồn gốc
Các loại hải sản đã từ lâu được con người coi là một nguồn thực phẩm lành mạnh
và được tiêu thụ ngày càng nhiều trên phạm vi toàn cầu. Tuy nhiên, cũng từ rất
sớm con người đã ghi nhận những trường hợp ngộ độc [64], thậm chí có thể dẫn
tới tử vong sau khi ăn hải sản. Cho tới nay, nguyên nhân gây ra ngộ độc cho người
đã được xác định là do các độc tố tồn tại trong hải sản mà con người tiêu thụ, còn
gọi là các độc tố sinh vật biển. Các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng bản
thân các loại hải sản chứa độc tố gây ngộ độc cho người không sản xuất ra những
độc tố này mà tích luỹ độc tố do ăn thực vật phù du biển, trong đó có tảo độc. Một
số loài tảo có khả năng sinh độc tố, một số không sinh độc tố nhưng có khả năng
phát triển mạnh gây ra hiện tượng “tảo nở hoa” - algal bloom, có thể làm thay đổi
màu nước biển (hiện tượng “thuỷ triều đỏ”), làm chết hàng loạt sinh vật biển [56].
Những loài tảo mang một hoặc cả hai đặc tính này được gọi chung là tảo độc.
Trong các loài tảo độc, tảo đơn bào hai roi và tảo silic là nhóm tác nhân sản xuất
ra nhiều loại độc tố có khả năng gây ngộ độc cho người nhất. Tảo đơn bào hai roi
chính là tác nhân sản xuất ra độc tố gây tiêu chảy (hay hội chứng DSP) [148], độc
tố gây liệt cơ (hay hội chứng PSP - paralytic shellfish poisoning) [72], độc tố gây
độc thần kinh (hay hội chứng NSP - neurotoxic shellfish poisoning) [26], độc tố
gây hội chứng AZP (azaspiracid shellfish poisoning) [120], độc tố gây ngộ độc
khi ăn cá (hay hội chứng ciguatera) [146], và palytoxin analog [130]. Tảo silic là
tác nhân sản xuất ra độc tố gây mất trí nhớ (hay hội chứng ASP - amnestic shellfish
poisoning) [16]. Vi khuẩn lam là tác nhân gây ra các hội chứng PSP [15], hội
chứng ngộ độc tảo biển (seaweed poisoning) [90] và hội chứng ngộ độc rùa biển
(turtle poisoning) [99]. Một số loài vi khuẩn cũng đã được chứng minh là tác nhân
sản xuất ra tetrodotoxin (TTX) [143], một độc tố thần kinh có độc tính rất mạnh.
Độc tố do các tác nhân này sản xuất ra sẽ theo nhiều con đường khác nhau (chẳng
hạn như qua chuỗi thức ăn, qua phơi nhiễm trong môi trường sống) xâm nhập và
tích lũy vào trong cơ thể các loài hải sản mà con người tiêu thụ, qua đó gây ngộ
độc cho người. Tùy thuộc tính chất của từng nhóm độc tố, sự phân bố của các loại
hải sản theo khu vực địa lý cũng như đặc điểm hoạt động nuôi trồng, đánh bắt,
3
mỗi nhóm độc tố có thể gây phơi nhiễm trên người thông qua những loài hải sản
khác nhau. Ngộ độc TTX đã được ghi nhận khi tiêu thụ cá nóc [143], con so biển
[68]. Các hội chứng DSP [148], PSP [72], ASP [16], NSP [26] và AZP [120] xảy
ra chủ yếu khi tiêu thụ các loài hải sản vỏ cứng không xương sống (NT2MV, giáp
xác, v .v ...). Ngộ độc do hội chứng ciguatera xảy ra chủ yếu khi tiêu thụ một số
loài cá biển vùng nhiệt đới [146]. Hội chứng ngộ độc do tảo biển xuất hiện khi
tiêu thụ rau câu [90], trong khi hội chứng ngộ độc rùa biển xuất hiện khi ăn một
số loài rùa biển [99]. Trên đây mới chỉ là những hội chứng ngộ độc và độc tố gây
ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người nên được nghiên cứu, tìm hiểu kỹ. Ngoài
ra, còn nhiều trường hợp sinh vật biển bị ngộ độc ở quy mô khác nhau đã được
ghi nhận, nhất là trong những đợt “tảo nở hoa” [56]. Hiện tượng “tảo nở hoa” là
hiện tượng tự nhiên đã có từ thời xa xưa, khi con người chưa tác động nhiều đến
các hệ sinh thái ven biển. Khi điều kiện môi trường thuận lợi như ánh sáng, nhiệt
độ, độ mặn của nước b i ể n . , các quần thể tảo phát triển nhanh chóng, chứa hàng
triệu tế bào tảo trong một lít nước biển và có thể đổi màu nước biển. Tuy nhiên
các khảo sát mới đây cho thấy tần suất các đợt nở hoa tảo độc xuất hiện ngày càng
thường xuyên trên khắp thế giới, khả năng phơi nhiễm của con người với độc tố
sinh vật biển qua tiêu thụ hải sản, nhất là độc tố của tảo đơn bào, sẽ ngày càng
tăng lên. Điều này cũng dẫn tới việc kiểm soát độc tố của tảo đơn bào trong hải
sản được cơ quan quản lý các nước trên thế giới quy định ngày càng chặt chẽ.
Cũng vì lý do kể trên, luận án này lựa chọn các độc tố chính thuộc nhóm độc tố
gây tiêu chảy (DSP), một nhóm độc tố của tảo đơn bào, làm đối tượng nghiên cứu.
1.1.2. Tóm tắ t quá trìn h nghiên cứu m ột số nhóm độc tố tảo đơn bào gây độc
cho con người
Tảo đơn bào (có kích thước 20 - 200 |um) là thức ăn chính của một số động vật
nhuyễn thể như hàu, vẹm, trai, sò, ngao, ố c . Cho tới nay đã xác định được nhiều
loại tảo đơn bào là tác nhân sản sinh ra các hợp chất có thể tích lũy trong những
loại hải sản ăn tảo đơn bào và gây độc cho con người theo chuỗi thức ăn. Khi con
người ăn hải sản nhiễm các độc tố này có thể gây nên tình trạng ngộ độc kèm thể
hiện ra bằng các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, liệt cơ, suy hô hấp, nặng có
thể mất trí nhớ, và có thể dẫn tới tử vong trong những trường hợp ngộ độc cấp
nghiêm trọng.
4
Được biết đến sớm hơn cả trong các chứng ngộ độc do độc tố sinh vật biển là
những tình trạng bệnh lý liên quan tới hệ thần kinh, do mức độ nghiêm trọng và
triệu chứng điển hình của chúng. Nhiều tài liệu đã ghi nhận hội chứng “ciguatera”
- được nhà sinh vật học Antonio Parra đặt tên năm 1787 khi ông nghiên cứu tình
trạng ngộ độc do loài ốc biển Cittarium pica gây ra ở vùng biển Caribe [156] với đặc điểm đặc trưng là các rối loạn về tiêu hóa, thần kinh và tim mạch xảy ra
ở vùng Ân Độ Dương (1601), Nam Thái Bình Dương (1774), Tân Caledonia
(1774) và vùng Polynesia thuộc Pháp (1792). Từ đầu thế kỷ 19, người ta bắt đầu
để ý ghi nhận hiện tượng thủy triều đỏ xuất hiện định kỳ ở vịnh Mexico và bờ
biển phía đông Florida, được biết đến như hiện tượng “thủy triều đỏ Florida”.
Trong thời gian diễn ra hiện tượng này, ăn nhuyễn thể có thể dẫn tới tình trạng
được gọi là chứng ngộ độc thần kinh do thuỷ sinh vật vỏ cứng (NSP) với các triệu
chứng thể hiện trên hệ tiêu hóa, thần kinh, tim mạch, và thậm chí phơi nhiễm với
hơi nước biển cũng có thể gây một hội chứng đường hô hấp. Tại châu Âu, từ năm
1689 đã có những mô tả khoa học về sự xuất hiện của chứng ngộ độc tê liệt do
thuỷ sinh vật vỏ cứng (PSP) [54].
Tuy nhiên, tác nhân thực sự gây ra những hiện tượng ngộ độc đó mới chỉ bắt đầu
được tìm ra và nghiên cứu một cách có hệ thống từ cuối thế kỷ 19, khi Taharain
phát hiện ra TTX, một loại độc tố có quan hệ chặt chẽ với hiện tượng ngộ độc khi
ăn một số loài cá nóc vào năm 1880 [64]. Sau đó, TTX cũng đã lần lượt được
phân lập từ nhiều loài sinh vật biển khác [95]. Hiểu biết của con người về “hội
chứng ciguatera” bắt đầu có những bước tiến đáng kể từ năm 1959, khi Randall
đưa ra giả thiết tác nhân gây ngộ độc được đưa vào chuỗi thức ăn do các loài cá
ăn thực vật đã tiêu thụ các loài vi tảo độc, rồi sau đó lại bị các loài cá ăn thịt lớn
hơn ăn [103]. Những tiến bộ mang tính đột phá đạt được bao gồm việc phát hiện
và phân lập được “ciguatoxin” (CTX) vào năm 1967 từ một loài tảo đơn bào hai
roi Gambierdiscus toxicus [88] tiết ra độc tố, xác định cấu trúc hóa học và các dẫn
xuất của CTX.
Nhóm độc tố là nguyên nhân gây ra bệnh NSP được phân lập vào thập niên 1970,
cấu trúc hóa học của chúng được xác định trong thập niên 1980. Nhóm độc tố này
do các loài tảo Karenia brevis tiết ra và được đặt tên là các “brevetoxin” [13].
Trong trường hợp của bệnh PSP, mối liên hệ chính xác giữa tình trạng ngộ độc
5
