SẢN XUẤT AMYLASE TỪ BACILLUS ƯA NHIỆT SP. BCC 02150 ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG BIỂN

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------o0o---------------

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC: CÔNG NGHỆ LÊN MEN
SẢN XUẤT AMYLASE TỪ BACILLUS ƯA NHIỆT SP. BCC 021-50
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG BIỂN

Sinh viên thực hiện:
Phạm Cẩm Duyên
Nguyễn Tú Anh
Nguyễn Xuân Uyên
Phạm Thị Mai Hương

1610531
1610089
1614048
1611470

Giáo viên hướng dẫn: Hoàng Anh
Hoàng

2


3

Contents

Sản xuất Amylase từ Bacillus ưa nhiệt sp. BCC 021-50 được
phân lập từ môi trường biển
Tóm tắt:
Thiết bị lên men có chi phí cao là một trong những rào cản kỹ thuật trong
sản xuất amylase từ các nguồn vi sinh vật. Amylase được sử dụng trong một số
quy trình, ngành công nghiệp. Ví dụ, trong ngành công nghiệp thực phẩm, đường
hóa, và trong ngành công nghiệp tẩy rửa và dệt may. Trong nghiên cứu này, các vi
sinh vật biển đã được phân lập để xác định vi sinh vật sản xuất amylase duy nhất
trong môi trường thạch. Hơn 50 chủng vi khuẩn có hoạt tính amylase dương tính,
được phân lập từ nước biển và đất, được sàng lọc để sản xuất amylase trong môi
trường thạch. Bacillussp. BCC 021-50 được tìm thấy là chủng sản xuất amylase tốt
nhất trong môi trường thạch và trong điều kiện lên men chìm. Tiếp theo, điều
kiện lên men được tối ưu hóa cho sự phát triển của vi khuẩn và sản xuất
enzyme. Nồng độ amylase cao nhất là 5211 U/mL thu được sau 36h ủ ở 50 ° C, pH
8.0, sử dụng 20 g/L mật rỉ đường làm nguồn năng lượng và 10 g /L peptone làm
nguồn nitơ. Từ quan điểm ứng dụng, amylase thô được đặc trưng về nhiệt độ và
pH. Hoạt tính amylase tối đa được ghi nhận ở 70°C và pH 7.5. Tuy nhiên, kết quả
cho thấy những ưu điểm rõ rệt cho sự ổn định của enzyme trong môi trường
kiềm, nhiệt độ cao và độ ổn định khi có mặt chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tẩy
trắng.
1. Giới thiệu:
Các enzyme Amyloglucosidase tham gia vào quá trình thủy phân các nguyên
liệu tinh bột thành các oligosaccharides và sản phẩm cuối cùng là các đơn phân
glucose. Amylase có ba loại, bao gồm α-amylase thủy phân liên kết α-1,4 và bỏ
4

qua các liên kết nhánh, β-amylase phá vỡ α-1,4 và không thể bỏ qua các liên kết
nhánh α-1,6 và tạo ra maltose làm sản phẩm, γ-amylase (glucoamylase) thủy phân
α-1,4 và α-1,6, do đó giải phóng monosaccharides là sản phẩm cuối cùng. Amylase
được áp dụng trong một số quy trình công nghiệp, bao gồm đường hóa của
nguyên liệu tinh bột, dược phẩm, thực phẩm, và các chất tẩy rửa và công nghiệp
dệt. Amylase được sản xuất từ tất cả các nguồn tự nhiên (thực vật, động vật, vi
sinh vật) và nhu cầu sản xuất liên tục tăng lên do có nhiều ứng dụng trong công
nghiệp. Do đó, các nguồn vi sinh vật được khai thác cho một số sản phẩm sinh học
công nghiệp quan trọng. Trong số các vi sinh vật, các chủng vi khuẩn được ưu tiên
hơn các chủng nấm để sản xuất enzyme và các sản phẩm giá trị gia tăng khác.
Một số vi sinh vật trên cạn đã được sử dụng để sản xuất enzyme, ví dụ,
protease, xylanase, amylase, chitinase, cellulase, lipase và inulinase. Tuy nhiên, có
ít các nghiên cứu đề cập đến lĩnh vực sản xuất α-amylase từ các chủng vi sinh vật
biển. Hơn nữa, vi sinh vật biển được nghiên cứu để sản xuất các enzyme có tính
chất công nghiệp quan trọng, chẳng hạn như ổn định ở nhiệt độ cao và điều kiện
pH kiềm. Những đặc tính của vi khuẩn có vai trò quan trọng đối với việc sản xuất
amylase bằng cách sử dụng các nguyên liệu có hiệu quả về kinh tế làm nguồn
năng lượng.
Chi phí của môi trường lên men cao là một trong những mối quan tâm
chính trong sản xuất amylase từ các nguồn vi sinh vật. Nhu cầu amylase liên tục
tăng lên và các nhà nghiên cứu đang cố gắng thiết lập các quá trình lên men có
tính kinh tế. Một số phụ phẩm của ngành công nghiệp và nông nghiệp đã được sử
dụng cho sản xuất amylase. Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các chủng vi sinh
vật mới để tạo ra các enzym amylase với các đặc tính phù hợp với ngành công
nghiệp. Ví dụ, amylase ổn định pH kiềm, ổn định nhiệt và chất hoạt động bề mặt
ổn định. Ngoài ra, những vi sinh vật này nên sử dụng nguồn nguyên liệu phế thải
nông nghiệp làm nguồn cacbon và nitơ để đạt hiệu quả về chi phí. Do đó, trong
nghiên cứu này, các vi sinh vật biển đã được phân lập và sàng lọc để sản xuất
amylase.

Nghiên cứu hiện tại đã được thực hiện để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho
sự phát triển của Bacillus sp. BCC 021-50 và sản xuất nồng độ amylase cao từ
chủng vi khuẩn biển được phân lập và có thể đóng vai trò hiệu quả trong quá trình
thương mại hóa sản xuất amylase.
5


2. Nguyên liệu và phương pháp
2.1. Cách ly và sàng lọc sản xuất vi khuẩn Amylase
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập từ đất biển và nước gần bờ biển để
sản xuất amylase. Bước sàng lọc để có được các chủng tốt nhất cho việc sản xuất
amylase bằng cách cấy trong môi trường thạch tinh bột. Môi trường chứa tinh bột
hòa tan (20 g /L), peptone (20 g /L), thạch agar (20 g /L) và các đĩa được ủ trong
48h. Sau 48h ủ, các đĩa được đổ ngập dung dịch iốt để quan sát sự hình thành
vùng ức chế do thủy phân tinh bột. Một số chủng vi khuẩn đã được sàng lọc và
kích thước của các vùng ức chế là 12-40 mm. Các chủng cho thấy kích thước vùng
32, 35 và 40 mm được chọn cho các thí nghiệm lên men. Bacillussp. BCC 021-50
được xác định và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo là chủng tốt nhất dựa trên
hình thái (nhuộm đơn và nhuộm gram) và phản ứng sinh hóa (catalase và VogesProskauer).
2.2. Điều kiện nuôi cấy Marine Bacteria
Trong bước đầu tiên, chủng được kích hoạt trên môi trường LB chứa 10 g /L
tryptone, 5 g /L cao nấm men, và 10 g /L NaCl. Sau đó, các tế bào vi khuẩn được ủ
ở 37°C trên máy lắc trong 24 giờ ở 150 vòng/phút. 10% v/v ( thể tích chất
tan/100ml dd) nuôi cấy đã được chuyển sang môi trường nuôi cấy cơ bản (basal
medium : không cần ưu tiên cho một loại tế bào nào phát triển) dùng để nuôi tiếp
theo hay dùng để tạo dòng: (glucose (20 g /L), cao nấm men (10 g /L),
MgSO 4·7H 2 O (1,0 g/L), NaCl (10 g/L) ), CaCl 2 (2 g/L), và KH2PO 4 (2 g/L)), và ủ ở
120 vòng/phút, ở 37°C trong 18h. Cuối cùng, 2% v/v cấy được sử dụng trong môi
trường để sản xuất enzyme (glucose (20 g/L), chiết xuất men (10 g/L),
MgSO 4·7H 2O (1,0 g/L), NaCl (10 g/L), CaCl 2 (2 g/L), và KH2PO 4(2 g/L)) và được ủ ở

37°C trong 120 giờ trên máy lắc. Các mẫu được thu nhận trong khoảng thời gian
đều đặn là 12 h và OD được đo ở 600 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS. Môi
trường nuôi cấy được ly tâm trong 10 phút để thu thập phần nổi trên mặt không
chứa tế bào cho hoạt tính α-amylase. Tất cả các dụng cụ đã được khử trùng ở 115
° C trong 20 phút trước khi cấy.
2.3. Kiểm tra hoạt tính amylase
Hoạt tính amylase được kiểm tra dựa trên việc xác định lượng đường khử:
Cho vào ống nghiệm 1.0 mL mẫu và môi trường (1.0% w / v tinh bột), lắc
kĩ, ủ ở 37ºC trong 15 phút trong nồi cách thủy. Sau 10 phút, phản ứng được dừng
6


lại bằng cách thêm 2,0 mL thuốc thử DNS rồi giữ trong nước sôi trong 5 phút. Làm
nguội đến nhiệt độ phòng và đo OD 540 nm, dùng môi trường để set blank. Các
thuốc thử khác được thêm vào cùng nồng độ.
Đơn vị hoạt độ amylase là lượng enzyme thủy phân 1 µmol glucose dưới
điều kiện thí nghiệm tối ưu.
2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sản xuất amylase được kiểm tra ở các nhiệt độ khác nhau:
Chất cấy đã được chuẩn bị trước đó 24 giờ với nồng độ 2% (v/v) được cho
vào 50ml môi trường lên men trong bình tam giác 250ml. Erlen được lắc trên máy
lắc ở những nhiệt độ khác nhau từ 30 đến 60ºC. pH ban đầu 7,0. Ly tâm ở 11,300
× g trong 10 phút ở 10°C. Xác định hoạt tính amylase từ dịch nuôi cấy.
2.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Bacillus sp. BCC 021-50 được nuôi trong erlen 250 ml chứa 50 mL môi
trường lên men, bổ sung 20 g / L nguồn carbon bao gồm glucose, siro, rỉ đường,
fructose, tinh bột, maltose và galactose. 2% v/v chất cấy được cấy vào mỗi bình
và nuôi cấy ở nhiệt độ 50°C trong 36 h. Ly tâm dịch nuôi cấy (11,300 × g trong 10
phút ở 10 ° C) thu nhận mẫu và bảo quản ở 4°C.
2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và ảnh hưởng của pH ban đầu

Các chất nitơ hữu cơ và vô cơ được đánh giá là nguồn nitơ cho sản xuất
amylase. Môi trường lên men được bổ sung với nitrate amoni, amoni clorua,
amoni sulfat, urê, cao nấm men, casein, tryptone, cao thịt và peptone ở nồng độ
10 g/L.
Ngoài ra, quá trình sinh tổng hợp amylase được xác định ở các giá trị pH
ban đầu khác nhau từ 5,0 đến 11,0. Quá trình lên men và phân tích sinh hóa được
thực hiện như mô tả ở trên.
2.7. Hoạt tính Amylase và độ ổn định ở các pH khác nhau
pH 6.0-11.0 được dùng để đánh giá hoạt động tối đa amylase bằng cách
sử dụng các dung dịch đệm khác nhau: đệm phosphat pH 6.0–7.5; dung dịch
đệm Tris – HCl pH 8,0–8,5 và dung dịch đệm glycine – NaOH pH 9,0–11,0.
Độ ổn định được xác định bằng cách ủ các enzyme trong các dung dịch
đệm trên trong 1 giờ ở 40°C và sau đó hoạt tính amylase được kiểm tra trong
các điều kiện khảo nghiệm.
2.8. Hoạt tính Amylase và tính ổn định ở các nhiệt độ khác nhau
Ảnh hưởng của nhiệt độ trên amylase thô được nghiên cứu bằng cách ủ
phản ứng ở các dải nhiệt độ khác nhau (30-85 °C) trong dung dịch đệm glycineNaOH (pH 7,5) trong 1 giờ. Khả năng chịu nhiệt được xác định bằng cách ủ trước
enzyme trong 1 giờ ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-85 ° C.
7


2.9. Tính ổn định của enzyme trong chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tẩy
trắng
Để ứng dụng amylase thô trong các quá trình công nghệ sinh học “đặc
biệt trong các công nghiệp chất tẩy rửa”, tính ổn định được xác định bằng chất
hoạt động bề mặt và chất tẩy trắng. Tính ổn định của amylase được thử nghiệm
với sự có mặt của Triton X-100, Tween 20 và 40, Sodium dodecyl sulfate (chất
hoạt động bề mặt) và sodium hypochlorite (chất tẩy trắng) trong điều kiện thí
nghiệm tối ưu (pH 7,5 và 40°C trong 1 giờ). Hoạt tính amylase với việc bổ sung
các hợp chất khác nhau được đo bằng phần trăm hoạt tính tương đối so với đối

chứng 100% (không có chất phụ gia).
2.10. Phân tích thống kê
Thí nghiệm được làm lại 3 lần. T-test được thực hiện tại p <0,05.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phân lập, sàng lọc và định danh vi sinh vật biển sản xuất Amylase
Chi phí môi trường lên men là một trong các yếu tố quan trọng trong sản
xuất enzyme từ vi sinh vật và việc sử dụng chất thải nông nghiệp-công nghiệp có
thể đóng vai trò đáng kể trong sự cắt giảm chi phí. Việc phân lập các chủng vi sinh
vật có tại địa phương và các chất nền giá rẻ có thể tạo ra amylase có giá thấp và
giảm chi phí sản xuất enzyme. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã cố gắng thiết
lập các quá trình lên men có tính kinh tế với chủng Bacillus sp. BCC 021-50.
Trước đây, sản xuất amylase đã được thực hiện từ một số chủng vi khuẩn và
nấm, bao gồm Bacillus megaterium [ 12 ], Bacillus amyloliquefaciens 04BBA15
[ 13 ],
chủng Bacillus
cereus BRSC-S-A26MB
[ 14 ], Bacillus sp. RKY3
[ 15 ], Penicillium expansum MT-1 [ 16 ], và Aspergillus fumigatus [ 17 ]. Vì việc sử
dụng amylase ngày càng tăng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, nhiều nhóm nghiên
cứu quan tâm đến việc phân lập và sàng lọc các chủng siêu sản xuất amylase từ
nhiều nguồn khác nhau. Trong quá trình nghiên cứu hiện tại, hơn 50 chủng vi
khuẩn đã được phân lập từ một bờ biển địa phương. Các chủng này được sàng lọc
cho hoạt động thủy phân tinh bột bằng môi trường thạch tinh bột. Một số chủng
cho thấy kết quả dương tính với hoạt tính amylase với sự hình thành vùng rõ ràng
và một vài trong số chúng được chọn để xác nhận thêm hoạt tính amylase ngoại
bào trong môi trường lên men. Loại tốt nhất được xác định là Bacillus sp. BCC
021-50 theo định danh Bergey. BCC 021-50 có thể tạo ra các enzyme ngoại bào và
điều kiện nuôi cấy được tối ưu hóa cho hiệu suất amylase cao nhất có thể.
8

3.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men cho sản xuất Amylase
Điều kiện lên men của vi khuẩn Bacillus sp. được tối ưu hóa về thời gian
nuôi cấy, nhiệt độ, nguồn cacbon, nguồn nitơ và ảnh hưởng của pH ban đầu đến
tăng trưởng và nồng độ α-amylase cao nhất. Biểu đồ thời gian sản xuất amylase và
sự tăng trưởng của BCC 021-50 được thể hiện trong Hình 1. Nồng độ amylase
trong môi trường nuôi cấy tăng theo thời gian, lên đến 1634 U/mL, sau 36h và
giảm sau đó. Từ đó cho thấy rằng sản xuất amylase phụ thuộc vào tăng trưởng của
vi sinh vật. Sự giảm nồng độ amylase trong thời gian ủ thêm có thể là do sự tăng
trưởng của tế bào, sự thiếu hụt chất dinh dưỡng và sự thay đổi pH [ 18 ].
Trong các nghiên cứu trước đây, sản xuất amylase cao nhất từ Bacillus
licheniformis sau 36 h dưới quá trình lên men trạng thái rắn, nguồn carbon sử
dụng là trấu [ 19 ], nhưng 20% nồng độ phần trăm thể tích chất cấy được dùng để
so với việc sử dụng 2% nồng độ phần trăm thể tích. Việc nồng độ chất cấy cao hơn
có thể hiệu quả về chi phí nếu thời gian xử lý giảm đáng kể cho sản xuất amylase
quy mô lớn. Một nghiên cứu khác [ 20 ] đạt được nồng độ amylase cao nhất
từ Bacillus amyloliquefaciens sau 42 giờ khi cám lúa mì và bánh dầu lạc được bổ
sung làm nguồn carbon. Elhalem và cộng sự [ 21 ] thu được sản lượng amylase tối
đa từ Bacillus amyloliquefaciens sau 48 h ủ trong điều kiện lên men ngập
nước. Ngược lại, Bozic và cộng sự [ 22 ] thu được năng suất amylase tối đa
từ Bacillus licheniformis sau 72 giờ trong điều kiện bình lắc. Ackan và cộng
sự [ 23 ] tìm thấy năng suất amylase tối đa từ Bacillus subtilis RSKK96 sau 72 giờ
ủ. Hoạt tính amylase được kích thích bởi các ion canxi (Ca 2+ ) [ 24 ], và hầu hết các
α-amylase là các metalloenzyme, do đó, CaCl 2 là nguồn nitơ tốt nhất cho môi
trường lên men.

9


Hình 1. Đồ thị lên men mẻ trong sản xuất amylase và sự sinh trưởng của Bacillus sp. BCC 021-50

trong môi trường tổng hợp chứa (g / L) glucose (20), chiết xuất nấm men (10), MgSO4 ⋅7H2O (1.0), NaCl
(10), CaCl2 (2.0) và KH2PO4 (2.0), ủ trong một thiết bị ủ dạng lắc ở 37 °C với pH ban đầu là 7.0. Các thí
nghiệm được thực hiện trong ba lần và dữ liệu được trình bày trong hình là trung bình của ba thí nghiệm
song song. Thanh lỗi được hiển thị cho độ lệch chuẩn.

Hình 2 thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên men trong quá trình tổng
hợp amylase từ Bacillus sp. BCC 021-50 (30-60 oC ), khi phát triển trong môi
trường lên men có chứa 20g/L glucose, 10g/L dịch chiết nấm men và ủ trong 36h,
pH ban đầu 7.0. Nồng độ enzyme tăng khi tăng nhiệt độ, và năng suất amylase tối
đa được ghi nhận ở 50oC (3314 U/mL ). Nhiệt độ tăng thêm làm giảm hoạt tính
amylase, có thể là do sự tăng trưởng của vi sinh vật và sự biến tính của enzyme ở
nhiệt độ cao hơn. Như đã báo cáo trước đây, nồng độ amylase cao nhất thu được
từ chủng Bacillus ở 45oC trên môi trường thạch tinh bột, và Bozic và cộng sự thu
được sự sản xuất amylase tối đa từ Bacillus licheniformis ở 37 oC, tìm được một
chuẩn độ amylase tối đa từ Bacillus subtilis RSKK96 ở 37 oC sau 72h ủ trong điều
kiện lên men chìm. Vi sinh vật ưa nhiệt được yêu cầu cho sản xuất amylase
thương mại để giảm thiểu nguy cơ bị nhiễm và thu được các enzyme chịu nhiệt.
Kết quả của chúng tôi cho thấy tính chất ưa nhiệt và tăng trưởng của chủng mới
được phân lập đã đạt được trong điều kiện lên men trong bình lắc để sản xuất
amylase. Các thí nghiệm khác được thiết kế dựa trên kết quả thu được để thực
10


hiện sản xuất amylase mở rộng có thể tiết kiệm chi phí và năng lượng khử trùng.
Ngoài ra, amylase thô sẽ được áp dụng làm nguyên liệu thủy phân tinh bột và
đường lên men có thể được chuyển đổi thành các sản phẩm sinh hóa cuối cùng.
Trong bước tiếp theo, ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau, bao
gồm glucose, date syrup, mật đường, fructose, tinh bột và galactose, được kiểm
tra nồng độ amylase; các kết quả được hiển thị trong Hình 3. Hàm lượng amylase
ảnh hưởng rất lớn bởi các nguồn carbon và năng suất enzyme cao nhất là

4827U/mL thu được khi 20g/L mật đường được bổ sung làm nguồn carbon so với
các loại đường khác. Trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, mật đường và
date syrup được đánh giá là nguồn carbon có hiệu quả chi phí cho sản xuất
protease, pectinase và alkaline phosphate. Tuy nhiên, dư lượng công nghiệp nông
nghiệp, mật đường và date syrup được sử dụng trong môi trường lên men để sản
xuất amylase từ Bacillus sp. BCC 021-50.

11


Hình 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến quá trình sản xuất amylase và sự tăng trưởng tế
bào (Bacillus sp. BCC 021-50) trong 36 giờ. Môi trường ban đầu chứa glucose (20 g / L) và chiết xuất nấm
men (10 g / L) là nguồn carbon và nitơ tương ứng. Độ pH ban đầu là 7. Các thí nghiệm được thực hiện
trong ba lần và dữ liệu được trình bày trong hình là trung bình của ba thí nghiệm song song. Thanh lỗi
được hiển thị cho độ lệch chuẩn.
Hình 3: Ảnh
hưởng
của
nguồn carbon
(nồng độ ban
đầu
20 g / L) đối
với
sản xuất αamylase và
Bacillus sp.
BCC
021-50 tăng
trưởng ở 37 °
C,
pH ban đầu là

7.0,
trong 60 giờ.
Các
thí
nghiệm
được
thực
hiện
trong ba lần
và dữ liệu có trong hình là trung bình của ba thí nghiệm song song. Thanh lỗi được hiển thị cho độ lệch
chuẩn.

Chất thải nông nghiệp công nghiệp, bao gồm rơm lúa mì, rơm rạ, ngô, bã
mía, mật đường và syro từ quả chà là, có thể được sử dụng làm nguồn năng lượng
thay thế thay cho đường tinh khiết để sản xuất các sản phẩm thương mại quan
trọng để giải quyết vấn đề xử lý chất thải và giảm chi phí môi trường lên men.
Nguồn cacbon là một trong những nguyên liệu đắt tiền được sử dụng trong môi
trường lên men và mục đích nghiên cứu của chúng tôi là giảm chi phí lên men
bằng cách thay thế đường tinh khiết bằng chất thải nông nghiệp không tốn kém
(mật đường và syro từ quả chà là). Trong nghiên cứu này, chúng tôi tính toán mật
rỉ đường và syro từ quả chà là làm nguồn năng lượng hiệu quả về mặt chi phí.
Abdullah và cộng sự. [28] đã tính toán nhiều nguồn chất thải nông-công nghiệp
làm nguồn carbon (như bánh dầu dừa, cám gạo, chất thải từ thực vật, vỏ chuối và
cám lúa mỳ) cho quá trình sản xuất amylase và nhận thấy thu được hàm lượng
amylase cao nhất khi bổ sung cám lúa mỳ vào môi trường lên men.

12


Nhiều hợp chất vô cơ và hữu cơ được sử dụng làm nguồn nitrogen ví dụ

như ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate, urea, cao nấm
men, casein, tryptone, cao thịt và peptone và kết quả được thể hiện trong hình 4.
Hàm lượng α-amylase cao nhất thu được khi bổ sung 10g/L peptone vào môi
trường khoáng làm nguồn nitrogen. Dựa trên những kết quả thu được, người ta
có thể rút ra được tế bào vi khuẩn tiết ra nồng độ amylase cao nhất là khi cho tế
bào sinh trưởng trên nguồn nitrogen vô cơ khi so với lúc cho tế bào tăng trưởng
trên nguồn nitrogen hữu cơ. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả thu được
bởi Dar và cộng sự. [29] khi sản xuất amylase từ Penicillium chrysogenum sử dụng
nguồn nitrogen là peptone. Bozic và cộng sự thu được nồng độ amylase cao nhất
từ Bacillus licheniformis khi sử dụng tryptone làm nguồn nitrogen chính. Ashwini
và những người có liên quan đã thông báo sản xuất được amylase từ Bacillus sp.
khi tinh bột và cao nấm men lần lượt được sử dụng làm nguồn carbon và nguồn
nitrogen. Những cách tiếp cận khác, như được báo cáo, đã thu được hàm lượng
amylase cao nhất khi sử dụng ammonium sulfate làm nguồn nitrogen trong môi
trường lên men. Nhìn chung, nồng độ carbon và nitrogen nội bào là khác nhau đối
với mỗi chủng vi sinh vật do sự ưu tiên của chu kỳ trao đổi chất trong mỗi chủng.

Hình 4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen (nồng độ ban đầu 10g/l) lên sự sinh tổng hợp amylase từ
vi khuẩn Bacillus sp. BCC 021-50 ưa nhiệt, sống dưới biển. Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường
khoáng nồng độ mật rỉ đường là 20g/l, và mẫu cấy được ủ ở 50⁰C trong 36 giờ. Thực hiện 3 lần và dữ
13


liệu
từ hình
bình
lần
hiện.
thể

thu được
là trung
của cả ba
thực
Thanh lỗi
hiện độ

lệch

chuẩn.

Hình 5
chứng
mình
được
ảnh
hưởng
của
pH ban
đầu
(từ 5.0
đến
11.0)
lên
sự tổng
hợp amylase với mật rỉ đường cà peptone lần lượt là nguồn carbon và nitrogen
chính trong môi trường khoáng, được ủ ở 50⁰C trong 36 giờ. Nồng độ amylase
thay đổi đáng kể với những giá trị pH ban đầu, và thu được lượng amylase nhiều
nhất là ở pH 8.0 và lượng amylase thu được giảm dần khi pH ngày càng tăng. Sản
xuất amylase từ Bacillus cereus bằng lên lên men ở trạng thái rắn là ở pH kiềm.

Ngược lại với kết quả của chúng tôi, Dar và những cộng sự thu được nồng độ
amylase cao nhất là ở pH acid từ Penicillium chrysogenum. Các chủng vi sinh vật
ưa kiềm-nhiệt được xem là quan trọng trong công nghiệp bởi giá trị thương mại
của chúng, đặc biệt là amylase bền trong pH kiềm tính, mà chúng được sử dụng
trong công thức tẩy rửa.

14


Hình 5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự sản xuất amylase và sự sinh trưởng của vi sinh vật
(Bacillus sp.BBC 021-50) ở 50⁰C trong 36 giờ trong môi trường khoáng chứa mật rỉ đường (nồng độ
20g/L) và peptone (nồng độ 10g/L) lần lượt là nguồn carbon và nitrogen. Thí nghiệm được thực hiện ba
lần và dữ liệu thể hiện trong hình là trung bình của ba lần. Thanh lỗi thể hiện độ lệch chuẩn .

3.3 Đặc tính của Amylase thô từ Bacillus sp.BBC 021-50
Đặc tính của enzyme cực kỳ quan trọng khi việc áp dụng vào công nghiệp và
thay đổi do yêu cầu của từng enzyme đối với mỗi lần áp dụng. Độ ổn định về pH,
nhiệt độ, chất hoạt động bề mặt, tác nhân oxy hóa và tẩy trắng của enzyme
amylase thô có lợi cho nhiều ứng dụng. Ảnh hưởng của pH lên hoạt động của
enzyme thô được điều chỉnh trong khoảng pH rộng (từ 6.0 đến 11.0).Tinh bột có
khả năng hòa tan được sử dụng làm cơ chất, phản ứng được ủ ở 35⁰C, phần biểu
diễn hoạt động trên từng độ pH của enzyme amylase thô được thể hiện trên hình
6. Hoạt động của amylase tăng đến khi đạt pH 7.5 và giảm dần khi pH tăng thêm.
Những kết quả phù hợp với Goyal và cộng sự với hoạt động amylase cao nhất là ở
pH 7.0 thu được từ Bacillus sp. I-3. Các thí nghiệm trước đây đã mô tả đặc điểm
của amylase thu được từ Bacillus KSM-K38 ưa nhiệt trong khoảng pH từ 8.0 đến
9.5. Amylase thô của chúng tôi ổn định trong khoảng pH rộng từ 7.0 đến 10.0.
Những kết quả tương tự cũng thu được bởi Hagihara và cộng sự [33] với độ ổn
định của amylase trong khoảng pH từ 6.0 đến 11.0.
Hoạt động cao nhất của amylase được điều chỉnh ở 70⁰C như được thể

hiện trong hình 7. Hoạt động diễn ra tương đối ở 30 và 85⁰C lần lượt là 70.32% và
73.48%. Những kết quả tương tự được ghi lại bởi Goyal và cộng sự, ở báo cáo của
họ, hoạt động cao nhất của amylase thu được ở 70⁰C. Enzyme này ổn định về
nhiệt cho tới 75⁰C và hoạt động ban đầu là 89.84%,76.92% và 59.89% sau 1 ở ủ
lần lượt ở 65, 70 và 75⁰C, như được thể hiện trong hình 7. Yang và cộng sự đã làm
tinh và mô tả đặc điểm của amylase về phương diện ổn định nhiệt và quan sát
thấy độ ổn định là từ 50 đến 60⁰C, trong khi Vieille và cộng sự nghiên cứu ra rằng
amylase từ Pyrococcus furiosus, thì ổn định ở nhiệt độ cao hơn từ 80 đến 100⁰C.

15


Hình 6. Ảnh hưởng của pH lên độ hoạt động và độ ổn định của amylase được tạo ra bởi Bacillus
sp. BBC 021-50. PH của phản ứng enzyme được điều chỉnh trong khoảng từ 6-11 với việc thêm các chất
đệm khác nhau. Kết quả thu được là trung bình của ba lần thí nghiệm.

Ảnh
của

Hình 7.
hưởng
nhiệt độ
16


và độ bền nhiệt của amylase thô được sản xuất từ Bacillus sp. BBC 021-50. Enzyme được trộn với cơ
chất và được ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong 30 phút. Phần trăm độ hoạt động tương đối được đo ở
điều kiện thí nghiệm. Độ bền nhiệt của amylase được xác định bằng cách ủ enzyme ở các nhiệt độ khác
nhau mà không thêm cơ chất trong 1 giờ. Phần trăm độ hoạt động được kiểm tra ở điều kiện thí nghiệm.
Kết quả là trung bình của ba lần thí nghiệm và dữ liệu được biểu diễn trong hình là trung bình của ba thí

nghiệm. Thanh lỗi được dùng để thể hiện độ lệch chuẩn.

Vì sự an toàn khi áp dụng với chất tẩy rửa, chúng tôi cần kiểm tra độ ổn
định của amylase khi có mặt chất tẩy rửa. Nhìn chung, việc tẩy rửa được thực hiện
trong khoảng nhiệt độ 30-40⁰C, chúng tôi đã sử dụng nhiệt độ là 40⁰C cho thí
nghiệm này. Enzyme amylase ổn định đối với tất cả chất hoạt động bề mặt, đặc
biệt là 0.1% SDS (thể tích/thể tích), nồng độ của chất này làm tăng độ hoạt động
của amylase lên tới 141.2% khi được ủ ở 40⁰C trong 1 giờ. Tuy nhiên, với nồng độ
SDS là 0.2% thể tích/thể tích thì độ hoạt động giảm còn 122.7% và kết quả được
thể hiện trong hình 8. Tóm lại, độ hoạt động tương đối của enzyme amylase được
tăng lên nhờ sự thêm vào các chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tác nhân tẩy rửa,
và các kết quả này chỉ ra sự thích hợp của amylase khi áp dụng vào công nghệ sinh
học.

Hình 8. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa, chất hoạt động bề mặt và tác nhân oxy hóa lên amylase thô
được sản xuất từ Bacillus sp. BCC 021-50 sau 1 giờ ủ ở 40⁰C, pH 7.5. Kết quả được so sánh giữa phần
trăm độ hoạt động tương đối khi cho thêm ngoại chất với khi không cho thêm ngoại chất. Thí nghiệm
17


được thực hiện 3 lần và dữ liệu trong hình là trung bình của ba lần thí nghiệm. Thanh lỗi được dùng chỉ
độ lệch chuẩn.

4. Kết luận
Chi phí môi trường lên men cao là một trong những trở ngại tài chính khi
sản xuất amylase từ nguồn vi sinh vật. Do vậy, trong nghiên cứu này, chất thải
nông-công nghiệp được sử dụng và các vi sinh vật biển được phân lập và sàng lọc
để sản xuất enzyme amylase. Nồng độ amylase cao nhất là 5211 U/mL thu được
sau khi ủ 36 giờ ở 50⁰C, pH 8.0, với cơ chất là mật rỉ đường có nồng độ 20g/L và
nguồn nitrogen là peptone có nồng độ 10g/L. Enzyme amylase thô được mô tả

đặc điểm để tối ưu hóa điều kiện phản ứng cơ chất enzyme và độ hoạt động cao
nhất của amylase được ghi lại ở 70⁰C và pH 7.5. Tuy nhiên, các kết quả của chúng
tôi cho thấy lợi ích của độ ổn đinh của enzyme trong pH kiềm, nhiệt độ cao, và độ
ổn định khi có mặt chất hoạt động bề mặt, tác nhân oxy hóa và tẩy trắng. Những
kết quả này vô cùng ý nghĩa và đóng góp vào sự phát triển của quy trình sản xuất
amylase có lợi về mặt kinh tế sử dụng chất thải công-nông nghiệp.

1.

2.

3.

4.

5.

Tư liệu tham khảo
Malik, S.; Iftikhar, T.; Haq, I.; Khattak, M.I. Process optimization for
amyloglucosidase by a mutant strain of aspergillus niger in stirred
fermenter. Pak. J. Bot. 2013, 45, 663–666.
Gupta, R.; Gigras, P.; Mohapatra, H.; Goswami, V.K.; Chauhan, B. Microbial
α-amylases: A biotechnological perspective. Process Biochem. 2003, 38,
1599–1616. [CrossRef]
Chakraborty, S.; Khopade, A.; Kokare, C.; Mahadik, K.; Chopade, B. Isolation
and characterization of novel α-amylase from marine Streptomyces sp. D1.
J. Mol. Catal. B 2009, 58, 17–23. [CrossRef]
Sivaramakrishnan, S.; Gangadharan, D.; Nampoothiri, K.M.; Soccol, C.R.;
Pandey, A. α-amylases from microbial sources—An overview on recent
developments. Food Technol. Biotechnol. 2006, 44, 173–184.

Qureshi, A.S.; Dahot, M.U. Production of proteases by staphylococcus
epidermidis EFRL 12 using cost effective substrate (molasses) as a carbon
source. Pak. J. Biotechnol. 2009, 6, 55–60.
18


De Azeredo, L.; Leite, S.; Freire, D.; Benchetrit, L.; Coelho, R. Proteases from
actinomycetes interfere in solid media plate assays of hyaluronidase
activity. J. Microbiol. Methods 2001, 45, 207–212. [CrossRef]
7. Hames¸-Kocabas¸, E.E.; Uzel, A. Alkaline protease production by an
actinomycete MA1–1 isolated from marine sediments. Ann. Microbiol.
2007, 57, 71–75. [CrossRef]
8. Sharma, A.D.; Kainth, S.; Gill, P.K. Inulinase production using garlic (Allium
sativum) powder as a potential substrate in Streptomyces sp. J. Food Eng.
2006, 77, 486–491. [CrossRef]
9. Stamford, T.; Stamford, N.; Coelho, L.; Araujo, J. Production and
characterization of a thermostable glucoamylase from streptosporangium
sp. Endophyte of maize leaves. Bioresour. Technol. 2002, 83, 105–109.
[CrossRef]
10. Ventosa, A.; Nieto, J. Biotechnological applications and potentialities of
halophilic microorganisms. WorldJ. Microbiol. Biotechnol. 1995, 11, 85–94.
[CrossRef] [PubMed]
11. Qureshi, A.S.; Dahot, M.U.; Rehman, A. Production of amylase by fungi
through submerged fermentation. Pak. J. Biotechnol. 2004, 1, 35–42.
12. Aqeel, B.M.; Umar, D.M. Effect of alternative carbon and nitrogen sources
on production of α-amylase by bacillus megaterium. World Appl. Sci. J.
2010, 8, 85–90. [CrossRef]
13. Fossi, B.T.; Tavea, F.; Fontem, L.A.; Ndjouenkeu, R.; Wanji, S. Microbial
interactions for enhancement of α-amylase production by Bacillus
amyloliquefaciens 04BBA15 and Lactobacillus fermentum 04BBA19.

Biotechnol. Rep. 2014, 4, 99–106. [CrossRef]
14. Halder, D.; Biswas, E.; Basu, M. Amylase production by Bacillus cereus
strain BRSC-S-A26MB under optimal laboratory condition. Int. J. Curr.
Microbiol. App. Sci. 2014, 3, 1035–1047.
15. Reddy, L.; Wee, Y.-J.; Yun, J.-S.; Ryu, H.-W. Optimization of alkaline protease
production by batch culture of Bacillus sp. RKY3 through Plackett–Burman
and response surface methodological approaches. Bioresour. Technol.
2008, 99, 2242–2249. [CrossRef] [PubMed]
6.

19


Erdal, S.; Taskin, M. Production of α-amylase by penicillium expansum MT-1
in solid-state fermentation using waste loquat (Eriobotrya japonica Lindley)
kernels as substrate. Romanian Biotechnol. Lett. 2010, 15, 5342–5350.
17. Singh, S.; Kaur, B.; Mann, N.K.; Cheema, S.K. Influence of calcium chloride
on growth and α-amylase production for wild and UV-mutated strains of
aspergillus fumigatus. Int. J. Biotechnol. Bioeng. Res. 2013, 4, 697–702.
18. Qureshi, A.S.; Bhutto, M.A.; Khushk, I.; Dahot, M.U. Optimization of cultural
conditions for protease production by bacillus subtilis EFRL 01. Afr. J.
Biotechnol. 2013, 10, 5173–5181.
19. Karatas¸, H.; Uyar, F.; Tolan, V.; Baysal, Z. Optimization and enhanced
production of α-amylase and protease by a newly isolated bacillus
licheniformis ZB-05 under solid-state fermentation. Ann. Microbiol. 2013,
63, 45–52. [CrossRef]
20. Gangadharan, D.; Sivaramakrishnan, S.; Nampoothiri, K.M.; Sukumaran,
R.K.; Pandey, A. Response surface methodology for the optimization of α
amylase production by bacillus amyloliquefaciens. Bioresour. Technol.
2008, 99, 4597–4602. [CrossRef] [PubMed]

21. Abd-Elhalem, B.T.; El-Sawy, M.; Gamal, R.F.; Khadiga, A.-T.A.A. Production of
amylases from Bacillus amyloliquefaciens under submerged fermentation
using some agro-industrial by-products. Ann. Agric. Sci 2015, 60, 193–202.
[CrossRef]
22. Božic´, N.; Ruiz, J.; López-Santín, J.; Vujcˇic´, Z. Production and properties of
the highly efficient raw starch digesting α-amylase from a bacillus
licheniformis atcc 9945a. Biochem. Eng. J. 2011, 53, 203–209. [CrossRef]
23. Akcan, N.; Uyar, F.; Aysel, G.A. α-Amylase production by Bacillus subtilis
RSKK96 in submerged cultivation. Kafkas Univ. Vet. Fak. Derg. 2011, 17, 17–
22.
24. Kumari, N.; Jain, V.; Malhotra, S. Purification and characterization of
extracellular acidophilic α-amylase from bacillus cereus MTCC 10205
isolated from soil. Afr. J. Microbiol. Res. 2013, 7, 5440–5448.
25. Asad, W.; Asif, M.; Ajaz, R.A.S. Extracellular enzyme production by
indigenous thermophilic bacteria: Partial purification and characterization
of α-amylase by Bacillus sp. Wa21. Pak. J. Bot. 2011, 43, 1045–1052.
16.

20


Qureshi, A.S.; Bhutto, M.A.; Chisti, Y.; Khushk, I.; Dahot, M.U.; Bano, S.
Production of pectinase by bacillus subtilis efrl 01 in a date syrup medium.
Afr. J. Biotechnol. 2012, 11, 12563–12570.
27. Qureshi, A.S.; Dahot, M.U.; Panhwar, S.I. Biosysnthesis of alkaline
phosphatase by escherichia coli efrl 13 in submerged fermentation. World
App. Sci. J. 2010, 8, 50–56.
28. Abdullah, R.; Shaheen, N.; Iqtedar, M.; Naz, S.; Tehreema, I.A. Optimization
of cultural conditions for the production of alpha amylase by aspergillus
niger (BTM-26) in solid state fermentation. Pak. J. Bot. 2014, 46, 1071–

1078.
29. Dar,G.H.;Kamili,A.N.;Nazir,R.;Bandh,S.A.;Jan,T.R.;Chishti,M.Z.Enhancedprod
uctionof α-amylaseby penicillium chrysogenum in liquid culture by
modifying the process parameters. Microb. Pathog. 2015, 88, 10–15.
[CrossRef] [PubMed]
30. Ashwini, K.; Gaurav, K.; Karthik, L.; Bhaskara Rao, K. Optimization,
production and partial purification of extracellular α-amylase from bacillus
sp. Marini. Arch. App. Sci. Res. 2011, 3, 33–42.
31. Vijayaraghavan, P.; Kalaiyarasi, M.; Vincent, S.G.P. Cow dung is an ideal
fermentation medium for amylase production in solid-state fermentation
by bacillus cereus. J. Genet. Eng. Biotechnol. 2015, 13, 111–117. [CrossRef]
32. Goyal, N.; Gupta, J.; Soni, S. A novel raw starch digesting thermostable αamylase from Bacillus sp. I-3 and its use in the direct hydrolysis of raw
potato starch. Enzyme Microb. Technol. 2005, 37, 723–734. [CrossRef]
33. Hagihara, H.; Igarashi, K.; Hayashi, Y.; Endo, K.; Ikawa-Kitayama, K.; Ozaki,
K.; Kawai, S.; Ito, S. Novel α-amylase that is highly resistant to chelating
reagents and chemical oxidants from the Alkaliphilic Bacillus isolate KSMK38. App. Environ. Microb. 2001, 67, 1744–1750. [CrossRef] [PubMed]
34. Yang, C.-H.; Liu, W.-H. Purification and properties of a maltotrioseproducing α-amylase from thermobifida fusca. Enzyme Microb. Technol.
2004, 35, 254–260. [CrossRef]
35. Vieille, C.; Zeikus, G.J. Hyperthermophilic enzymes: Sources, uses, and
molecular mechanisms for thermostability. Microb. Mol. Biol. Rev. 2001,
65, 1–43. [CrossRef] [PubMed]
26.

21


22