TỔNG hợp CÔNG NGHỆ GEN THỰC vật

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

PHẦN V

CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

345

CẤU TRÚC vector plasmid MANG GEN KHÁNG SÂU VÀ
ỨNG DỤNG TRONG TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN
THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,
gây đột biến…, ngành công nghệ sinh học với sự phát triển của công nghệ gen đã và
đang tạo ra những bước đột phá do công nghệ gen cho phép đưa các gen có lợi vào thực
vật để tạo ra những cây trồng có tính trạng mà chúng ta mong muốn.
Hàng năm trên thế giới tốn rất nhiều chi phí trong việc phòng trừ sâu hại. Các
nhà khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (Bacillus thuringiensis) vào cây
trồng để cây trồng tự sản sinh các protein gây chết sâu hại. Cây trồng mang gen kháng
sâu Bt là một trong những thành tựu của công nghệ sinh học trong việc cải tiến cây
trồng. Cây mang gen tạo độc tố này có khả năng kháng với các sâu hại chính thuộc bộ

Lepidoptera, Coleoptera và Diptera. Hiện nay ngoài việc cải tiến kỹ thuật chuyển gen
Bt còn phải cải tiến gen thích hợp sao cho gen Bt, một gen của vi khuẩn có thể biểu hiện
có hiệu quả trong thực vật. Phương pháp có hiệu quả để tạo cây chuyển gen là sử dụng
súng bắn gen; tuy nhiên, đối với những cơ sở nghiên cứu chưa thể trang bị được thiết bị
này thì việc chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp
được lựa chọn; ngoài ra phương pháp dùng vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens còn có
các ưu điểm riêng của nó mà các phương pháp khác không có đư ợc.
Theo hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp, chúng tôi đã nghiên cứu tái cấu trúc
vector plasmid mang ba gen là gen bar (gen chọn lọc), gen gusA (gen chỉ thị) và gen Bt
cryIA nhằm tạo một số vector plasmid mới - được đặt tên là plasmid pITB (Institute of
Tropical Biology).
Nội dung bài báo này, chúng tôi trình bày k ết quả nghiên cứu tái cấu trúc và sử
dụng các plasmid qua tái cấu trúc trong nghi ên cứu tạo cây cây hông và cây cải ngọt
chuyển gen.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Cấu trúc plasmid mới



Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 được sử dụng để chuyển gen.
Chuẩn E. coli DH5: được dùng làm vi khuẩn có khả năng biến nạp.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


346



Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Plasmid pCAMBIA 3301, plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi. cryIA(c).

2. Chuyển gen vào cây
Vật liệu và dòng vi khuẩn: Cây trong ống nghiệm được dùng làm vật liệu chuyển gen.
Sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) EHA 105 chứa plasmid ITB
mang gen cryIA(c), gen bar và gen gusA.
Phương pháp chuyển gen vào cây hông (Paulownia fortunei): Sử dụng vi khuẩn At
được lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá được nuôi cấy trên môi
trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1mg/l NAA và 10mg/l BA) có bổ sung
chất acetosyringone nồng độ 100 µM trong hai ngày. Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng
dung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá
sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa 4mg/l PPT v à 500mg/l cefotaxime. Cấy
truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 6 tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ược
cấy truyền sang môi trường cho ra rễ có chứa 4mg/l PPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ra
trồng ở vườn ươm.
Phương pháp chuyển gen vào cây cải ngọt (Brassica integrifolia L.): Lá mầm với
cuống lá dài 1-2mm của cây con từ hạt nẩy mầm 5-6 ngày tuổi được sử dụng làm mẫu
chuyển gen. Sử dụng vi khuẩn đ ã lắc qua đêm để gây nhiễm mẫu, sau đó các lá mầm
được nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 2mg/l NAA, 4mg/l
BA và 3,3mg/l AgNO 3) trong hai ngày (có bổ sung acetosyringone nồng độ 100 µM).
Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh 500 mg/l cefotaxime trong thời
gian 30 phút, chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa chất chọn lọc
PPT và 500mg/l cefotaxime. Cấy truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 4-5
tuần, mẫu có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi trường ra rễ (môi trường MS có
0,1mg/l NAA và 6mg/l PPT).
Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen:


Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá
chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37C, mẫu chuyển gen sẽ có màu
xanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu.



PCR gen cryIA(c): DNA thực vật được chạy PCR với cặp mồi chuy ên biệt, quy
trình tách DNA thực vật được thực hiện theo phương pháp của Dellaporta (1983).



Các cây chuyển gen được kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA(c) qua khả năng
kháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các mẫu lá trong đĩa pétri.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Cấu trúc plasmid mới
Việc gắn gen cryIA(b) và cryIA(c) vào plasmid pCAMBIA 3301 để tạo plasmid mới như
sau:

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

347



Vectơ plasmid CAMBIA 3301 có độ dài 12 Kb chứa gen gusA và gen bar. Có 14
enzyme giới hạn tại vị trí cloning site trong vùng T-DNA, ở đó cho phép tách hoặc ghép
các đoạn gen mong muốn. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn
Hind III (A/AGCTT) để cắt tạo hai đầu Hind III của chuỗi plasmid pCAMBIA 3301.
 Plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi.cryIA(c) ch ứa gen cryIA có độ dài 4 kb, ở hai
đầu của toàn bộ gen này (promoter-gen-terminator) có vị trí cắt bởi enzyme giới hạn
Hind III. Nên chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn Hind III để cắt ở hai vị trí này.
 Sau khi cắt bởi enzyme giới hạn Hind III các đoạn plasmid DNA đã được chạy điện di
cho kết quả: với plasmid pCAMBIA đã được mở ra với hai đầu cắt bởi Hind III và được
xử lý bởi AP (alkaline phosphat) để chúng khó có thể tự nối lại với nhau. C òn plasmid
pUbi.cryIA do có hai vị trí cắt nên tạo ra hai đoạn: 6 kb DNA tương ứng với thân còn lại
của plasmid và đoạn 4 kb tương ứng với đoạn gen cryIA.
Sau đó tiến hành nối kết 2 đoạn DNA plasmid pCAMBIA 12 kb v à đoạn gen cryIA 4
kb với nhau bởi enzyme ligase ở nhiệt độ 4 oC trong thời gian 16 giờ. Kết quả đã tạo được
2 plasmid mới dài khoảng 16 kb.
Để kiểm tra kết qủa này chúng tôi đã chuyển 2 plasmid mới vào vi khuẩn biến nạp
E.coli, nhân bản E. coli và tách chiết ADN. Sử dụng lại enzyme giới hạn Hind III để cắt
cho kết quả mỗi plasmid đã cho được hai băng DNA với 1 đoạn 12 kb v à 1 đoạn 4 kb
(xem ảnh 2 điện di) hoàn toàn phù hợp với kích thước plasmid mới được chúng tôi đặt tên
là plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) ch ứa 3 gen và được chuyển vào
dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105.
Chuyển gen vào cây hông:

Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn At, mẫu lá được đăt trên môi trường có PPT nồng
độ 4mg/l, đa số các mảnh lá bắt đầu vàng sau 2 tuần nuôi cấy, một số mảnh lá vẫn duy tr ì
màu xanh nhưng không hình thành mô sẹo, chỉ một số ít khoảng 10% h ình thành mô sẹo
và một số trong đó bắt đầu tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy. S au giai đoạn chọn lọc này các
chồi con được chuyển sang môi trường MS để ra rễ với 4mg/l PPT. Và chỉ có vài dòng
cây tiếp tục phát triển và ra rễ, được chúng tôi giả định là cây chuyển gen. Kết quả quá
trình chuyển gen được thể hiện như sau:

Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi và cây chuyển gen của các mảnh lá trên môi trường có 4mg/l
PPT sau khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens và mẫu lá đối chứng
Thí
nghiệm

Số mẫu
lá

Số mẫu lá
tái sinh
chồi
21

Số lượng
dòng cây
chuyển gen
5

Tần số chuyển gen
(%)

580

Số mẫu lá
tạo mô
sẹo
52

Chuyển
gen

Đối chứng

30

0

0

0

0

0,8

Để khẳng định đây là những cây hông chuyển gen, chúng tôi cấy cây hông giả định
chuyển gen và cây đối chứng vào môi trường ra rễ với chất chọn lọc PPT nồng độ 4mg/l để
thử khả năng chống chịu, sau 2 tuần toàn bộ cây đối chứng chết hoàn toàn, trong khi các cây
chuyển gen vẫn tiếp phát triển và ra rễ, giúp chúng tôi khẳng định đây là những cây hông đã
được chuyển gen.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


348

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Sự biểu hiện gen gusA của cây chuyển gen: Các chồi nhỏ, mảnh lá của cây chuyển gen
đã được xử lý với dung dịch X-Gluc, kết quả cho thấy chồi và mảnh lá này có màu xanh

chàm đặc trưng khẳng định sự biểu hiện của gen gusA trong cây chuyển gen.
Sự biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen: gen bar tạo tính trạng kháng thuốc trừ cỏ
đã được khẳng định trong cây in vitro, tuy nhiên chúng tôi muốn tiếp tục khảo sát sự tồn tại
ổn định và khả năng biểu hiện của gen này trên cây sau khi được trồng ra môi trường tự nhiên
ngoài vườn ươm. Chúng tôi sử dụng nồng độ 300mg/l PPT để phun l ên các cây đối chứng và
cây chuyển gen 1 tháng tuổi tại vườn ươm. Sau 2 tuần nhận thấy các cây hông chuyển gen
tiếp tục sinh trưởng và phát triển bình thường, chỉ có một dòng cây hơi bị vàng lá phía dưới
nhưng vẫn sống và phát triển cho phép chúng tôi khẳng định một lần n ữa đây là những cây
hông đã nhận được gen chuyển.
Sự hiện diện của gen cryIA(c) và khả năng kháng sâu của cây chuyển gen: Phân tích PCR
với cặp mồi chuyên biệt cho gen cryIA(c) cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen sau khi
chạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65 kb giống như mẫu đối chứng dương tính
plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn
toàn không có băng. Qua đó chúng tôi kh ẳng định sự hiện diện của gen cryIA(c) trong nhiễm
sắc thể của cây chuyển gen. Sau đó các cây hông chuyển gen đ ược chuyển ra trồng trong vườn
ươm. Để thử nghiệm tính kháng sâu các lá nhỏ đ ược đặt trong đĩa pétri cùng sâu xanh Heliothis
armigera. Sau 3 ngày, với các lá đối chứng diện tích lá bị hại lớn, kích th ước sâu tăng rõ rệt,
trong khi đó ở lá cây chuyển gen diện tích lá bị sâu ăn nhỏ, sâu tăng tr ưởng rất kém và sau 3
ngày sâu hoàn toàn không còn ăn và chết nhiều vào ngày thứ 5 hoặc 6.
Chuyển gen vào cây cải ngọt:
Với phương pháp sử dụng lá mầm của cây con từ hạt nẩ y mầm 5-6 ngày tuổi, cấy lá
mầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước khi nhúng cuống lá mầm v ào dịch vi khuẩn
để lây nhiễm, thời gian ủ với vi khuẩn l à hai ngày trên môi trường có bổ sung 100 µM
Acetosyringone và sau khi r ửa được cấy trên môi trường tái sinh có Cefotaxime
500mg/l và 4mg/l PPT thì sau 3-4 tuần các chồi tái sinh hình thành và chúng được cấy
truyền trên môi trường MS có 6mg/l PPT để kiểm tra khả năng kháng PPT của cây.
Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm chuyển gen nhiều lần với số mẫu trun g bình từ 80120 mẫu/lần. Kết quả được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Tỷ lệ tái sinh ch ồi và cây, trên môi trường có 4mg/l PPT, của các lá mầm được
nhiễm với Agrobacterium tumefaciens v à của mẫu lá mầm đối chứng
Thí nghiệm

Số lá mầm

Số lá mầm

Số lá mầm

thí nghiệm

tạo mô sẹo

tái sinh chồi

Chuyển gen

1380

Đối chứng

30

52
(3,7%)
0

21
( 1,5%)
0

Số lượng dòng cây

giả định chuyển gen

Tần số
chuyển gen (%)

2

0,14

0

0

Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy số lượng lá mầm chống chịu với chất chọn lọc
4mg/l PPT để hình thành mô sẹo khoảng 3,7% nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ở
mức 1,5% và gần như đa số các chồi đều không phát triển v à chết ở các lần cấy truyền sau,
theo chúng tôi đây là hiện tượng được coi là escape khá phổ biến trong quá trình chuyển

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

349

gen hoặc chồi ở thể khảm và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với
6mg/l PPT - điều này cho thấy tần số chuyển gen thấp (0,14%). Chúng tôi cho rằng khi
chuyển gen trên các đối tượng cây trồng khác như cây thuốc lá và cây hông thì mẫu lá có

khả năng tái sinh chồi cao từ xung quanh rìa lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có
thể xâm nhập vào nhiều vị trí có khả năng tái sinh này, trong khi ở cây cải ngọt lá mầm chỉ
có thể tái sinh tại cuống lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chỉ có một vị trí duy
nhất để có thể xâm nhiễm tạo cây chuyển gen. Các cây cải giả định chuyển gen đ ược phân
tích PCR với cặp mồi chuyên biệt của gen cryIA(c) - cho thấy các mẫu DNA của cây giả
định chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kíc h thước 0,65 kb giống
như mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c)
trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng.
KẾT LUẬN
Với việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid ITB
để chuyển gen, chúng tôi đã nhận được một số dòng cây hông và cây cải ngọt chuyển gen
mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera. B ằng các kỹ thuật sinh học phân tử
và sinh học chúng tôi đã xác định được của gen này hiện diện trong cây hông và cây cải
ngọt chuyển gen và gen chuyển đã có biểu hiện tính trạng khá rõ rệt.

Plasmid ITB (lane 2 và 3 mang
gen cryIA(b) và cryIA(c)

Phân tích PCR gen cryIA(c) ở
cây hông chuyển gen (băng
DNA 0,65 kb)

Cây cải ngọt giả định chuyển gen phát triển
trên môi trường chọn lọc PPT

Phân tích PCR gen cryIA(c) ở
cây cải ngọt chuyển gen (băng
DNA 0,65 kb)

Cây hông giả định chuyển gen phát triển

trên môi trường chọn lọc PPT

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


350

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương trình KC-04-13, Chương trình nghiên
cứu cơ bản đã tài trợ thiết thực cho nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Tạo cây hông (Paulownia
fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .
Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 1617/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1088-1090.
2. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Ảnh
hưởng của tác nhân chọn lọc đến mô cây cải ngọt ( Brassica integrifolia) và nghiên
cứu tạo cây cải ngọt chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học t oàn quốc
“Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y Hà Nội, Hà
Nội, 3/11/2005, tr. 1194-1197.
3. Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Khảo sát
khả năng tái sinh cây in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ
mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học
toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y
Hà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr. 498-500.
4. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu H ổ, 2003. Nghiên cứu hệ thống tái
sinh cây hông (Paulownia fortunei) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo cây
chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc,

Hà Nội, 16-17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 866-869.
5. Murashige, T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497.
6. Pua, E. C., Barfield D. G., 1991. Gene transfer in plants of Brassica juncea using
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Reports 10: 308-314.

SUMMARY

Construction of plasmid vector and utilization for production
of transgenic plants resistant to insect via Agrobacterium
tumefaciens
Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen
Institute of Tropical Biology
New plasmid vector pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) consisting bar,
cryIA(c) and gusA genes was constructed and applied to transfer into Agrobacterium
tumefaciens EHA 105 for Paulownia and Brassica plants genetic transformation. Many
transgenic lines of both plant cultivars were obtained. PCR analyses and indigogenic
GUS assay were performed to confirm the presence and the expression of bar, cryIA(c)
and gusA genes. Insect bioassays with larvae showed an improvement of resistance
against Heliothis armigera.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

351

TẠO CÂY THUỐC LÁ KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ
VÀ CÔN TRÙNG

Phạm Thị Hạnh, Phan T ường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

ĐẶT VẤN ĐỀ
Một trong những yếu tố làm giảm năng suất cây trồng trên đồng ruộng hiện nay là
những tác hại do sâu bệnh gây ra và việc phòng trừ dịch hại này thường gây sự ô nhiễm
môi trường ngày càng nghiêm trọng. Vấn đề này chỉ có thể được giải quyết thông qua
sự kết hợp giữa khoa học hiện đại v à ý thức giữ gìn sinh thái môi trường. Một trong
những ứng dụng của công nghệ sinh học để giải quyết vấn đề tr ên là tạo ra những cây
trồng tự bản thân có khả năng chống chịu với các loại sâu bệnh. Trong các loại côn
trùng gây hại thì rầy, rệp chiếm vai trò quan trọng, việc chích hút nhựa của chúng làm
cây không phát triển đồng thời chúng là nguồn lây lan một số bệnh virus quan trọng nh ư
virus gây bệnh khảm ở cây thuốc lá...
Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens được xem là một phương pháp có hiệu quả, là phương pháp qua đó k ết quả
chuyển gen thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA integration) t ương đối đơn giản,
phù hợp với ý muốn của các nh à công nghệ gen.
Nội dung báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu tái cấu trúc plasmid mới mang gen bar
(gen kháng thuốc trừ cỏ), gen gna (gen kháng côn trùng chích hút) và gen gusA; chuyển
plasmid mới cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và dùng dòng vi khuẩn
biến nạp trong nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ v à côn trùng.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu


Vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBluescript SK +-GNA mang cassette gen nguyên
vẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình tự mã hoá protein GNA (gen gna)

+ Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb.



Chủng vi khuẩn E. coli chứa pCAMBIA 3301 mang gen bar (gen kháng thuốc trừ
cỏ) và gusA (gen chỉ thị). Gen chỉ thị gusA: được phân lập từ vi khuẩn E. coli
(Jefferson & ctv., 1987), mã hóa enzym -glucuronidase (không màu). Enzyme
này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronide (không m àu) để tạo thành

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


352

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng dễ nhận biết. Glucuronide th ường dùng
gọi là X-gluc, công thức hóa học: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide.
Gen bar kháng chất phosphinothricin (PPT) đ ược phân lập từ vi khuẩn S.
hygroscopicus. Gen này mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyl transferase
(PAT), giúp biến đổi PPT từ dạng ức chế sinh tổng hợp glutamine gây chết cây
trồng sang dạng bị acetyl hóa không c òn gây độc cho cây. Vì vậy, ngoài tác
dụng chọn lọc trong quá trình chuyển gen ở thực vật, gen bar còn có vai trò
kháng thuốc trừ cỏ Basta trong sản xuất nông nghiệp.





Chủng vi khuẩn E. coli DH5 được dùng trong biến nạp nhằm khuếch đại số l ượng
bản sao các plasmid.
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dùng để biến nạp plasmid mới.
Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB) chứa kháng sinh được sử
dụng trong nuôi cấy và biến nạp.
Enzym giới hạn SacI, KpnI và enzym nối DNA ligase T4.

2. Phương pháp
a. Cấu trúc các plasmid mới
Phương pháp xử lý enzym để cắt DNA plasmid theo qui trình của Sambrook và ctv.
(1989). Các phản ứng nối kết được thực hiện ở nhiệt độ 14 0C trong thời gian 3-4g. Biến
nạp E. coli và Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp sốc nhiệt, 42 0C trong 2
phút. Môi trường LB được bổ sung các kháng sinh thích hợp để chọn lọc cá thể biến
nạp. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng các kháng sinh nh ư kanamycin (50mg/l) và
streptomycin (25mg/l). Các hợp chất hóa sinh như IPTG (Isopropyl-D-thiogalactoside)
50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl -D galactopyranoside) 40mg/l đư ợc bổ
sung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp để hoạt hoá enzym -galactosidase, cho
phép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng. Ph ương pháp tách DNA plasmid các khuẩn lạc
để kiểm tra cloning theo phương pháp của bộ kit công ty Promega.
b. Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng
Sử dụng giống thuốc lá sợi v àng Kutsaga 326. Lá cây thu ốc lá trong ống nghiệm
được cắt kích thước khoảng 1x1cm được dùng làm nguyên liệu chuyển gen.
Sử dụng vi khuẩn đã lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá đ ược
nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi tr ường MS có 0,1mg/l NAA v à 1mg/l
BA) trong hai ngày. Sau đó r ửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch Cefotaxim e 500mg/l
trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá sang môi tr ường tái sinh tạo chồi có 10mg/l
PPT và 500mg/l Cefotaxim e. Cấy truyền 2 tuần / lần trên cùng loại môi trường. Sau 6
tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi tr ường ra rễ có chứa 20 mg/l
PPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm.
Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen



Khảo sát khả năng phát triển v à ra rễ của cây chuyển gen v à cây đối chứng in vitro
trên môi trường MS có chứa chất chọn lọc nồng độ 20mg/l PPT.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

353



Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá v à
chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 370C, mẫu chuyển gen sẽ có màu
xanh chàm đặc trưng, còn mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu.



Sự hiện diện của gen gna trong cây được kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồi
chuyên biệt như sau: Mồi 1: 5’CGG ATC CAT GGC TAA GGC AAG TCT CCT
C-3’ và mồi 2: 5’CGG TAC CTC ATT ACT TTG AAG TCA CAA G -3’. Kích
thước đoạn DNA của gen gna khuếch đại của phản ứng PCR đ ược mong đợi là
0,47 kb.



Sự hiện diện của gen bar được kiểm tra qua phân tíc h PCR với các cặp mồi như
sau: Mồi 1: 5’ ATG AGC CCA GAA CGA CG 3’ v à mồi 2: 5’ TCA GAT CTC
GGT GAC GG 3’. Gen bar ở cây chuyển gen qua phân tích PCR sẽ có đoạn DNA
được khuếch đại là 0,5 kb.



Các cây chuyển gen và đối chứng được phun dung dịch Basta (PPT nồng độ 4g/l)
có bổ sung chất bám dính Tween 80 để kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Cấu trúc plasmid mới
Trong thí nghiệm này chúng tôi đã xử lý cassette gen nguyên vẹn [Bao gồm
Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình t ự mã hoá protein GNA (gen gna) + Terminator
Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb nằm tr ên plasmid Bluescript SK+
được cắt bởi hai enzym giới hạn Kpn I v à Sac I. Cassette này sẽ được chèn vào vị trí
Lac Z alpha (trong vùng T -DNA, cũng được cắt bởi Kpn I và Sac I) ở plasmid
pCAMBIA 3301.
Tiếp theo chạy điện di trên gel agarose 0,8% kết quả điện di sau khi cắt bởi 2
enzym cho thấy plasmid pBluescript SK+ -GNA được cắt làm hai đoạn, đoạn khoảng
gần 4 kb là nguyên cassette chứa gen gna còn plasmid pCAMBIA chỉ có 1 đoạn khoảng
12 kb. Tách và làm sạch đoạn cassette và plasmid backbone trước khi đưa vào nối kết
(ligation).
Phản ứng nối kết giữa gen gna v à vector pCAMBIA bằng enzym ligase T4 ở 14 oC
trong 3 giờ. Sau đó các sản phẩm tr ên được biến nạp vào E. coli DH5 khả biến trong
môi trường LB có 50 mg/l kháng sinh kanamycin, nuôi 37 oC qua đêm. Kết quả cho thấy
trên các đĩa đối chứng (biếp nạp không có plasmid), các tế b ào E. coli DH5 do không
được bổ sung plasmid khi thực hiện biến nạp n ên không có khả năng kháng Kanamycin,
do vậy chúng không sinh trưởng được trên môi trường LB có bổ sung kanamycin.
Ngược lại, các thể được biến nạp mang plasmid mới phát triển đ ược trên môi trường

chọn lọc này chứng tỏ chúng chính là các thể mong muốn. Bên cạnh đó, môi trường
chọn lọc có bổ sung X-gal, dựa trên nguyên tắc sàng lọc, các khuẩn lạc trắng tr ên đĩa
biến nạp sẽ được sơ chọn để nhân bản plasmid mới. Để xác định kết quả, chúng tôi lấy

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


354

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

một số khuẩn lạc màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng có 50mg/l kháng sinh
kanamycin, nuôi lắc qua đêm ở 370C. Sau khi tách DNA plasmid, ti ến hành xử lý 2
enzym SacI và KpnI cho plasmid m ới và pCAMBIA. Kết quả xử lý enzym, chạy điện di
trên gel 0,8% cho thấy plasmid mới chứa 2 đoạn DNA: một đoạn 12 kb (t ương ứng
pCAMBIA 3301 backbone) và m ột đoạn kích thước khoảng gần 4 kb (t ương ứng
cassette chứa gen gna); cho thấy plasmid đ ã được hình thành có kích thước khoảng gần
16 kb. Như vậy có thể khẳng định gen mục ti êu đã được lắp ghép thành công và plasmid
mới đã được nhân bản trong E. coli, plasmid này được ký hiệu là p3301-GNA. Sau đó
chúng tôi đã tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang plasmid n ày.
2. Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng
Trên môi trường có PPT nồng độ 10mg/l, các mảnh lá đối chứng bị mất m àu màu
xanh sau 2-3 tuần. Ngược lại, một số mảnh lá đ ã xử lý vi khuẩn chuyển gen vẫn c òn
màu xanh và hình thành d ần các cụm mô sẹo và chồi nhỏ. Sau 6 tuần chọn lọc, các chồi
này được chuyển sang môi trường ra rễ có 20mg/l PPT. Chồi thuốc lá qua xử lý chuyển
gen vẫn tiếp tục phát triển và ra rễ. Trong khi đó ở thí nghiệm đối chứng, chồi từ mô lá
không xử lý chuyển gen trên môi trường ra rễ chứa 20mg/l PPT dần dần vàng và chết
trong 2-3 tuần. Do đó chúng tôi cho rằng những chồi v à cây phát triển trên môi trường
20 mg/l PPT là những cá thể giả định chuyển gen. Qua thí nghiệm chuyển gen, cây sinh

trưởng tốt trên môi trường có 20mg/l PPT có sự biểu hiện của gen gusA, lá của các cây
này có màu xanh đặc trưng.
Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi của cá c mảnh lá trên môi trường có 20mg/l PPT sau khi
nhiễm với Agrobacterium v à mẫu lá đối chứng

Thí nghiệm

Số mẫu lá thử
nghiệm

Số lượng mẫu lá tái sinh
chồi

Tần số chuyển gen( %)

Chuyển gen

120

11

9,16

Đối chứng

20

0

0

Kiểm tra sự hiện diện của gen mục ti êu gna trong cây thuốc lá chuyển gen: Phản
ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen gna. Đối chứng dương là
plasmid pUbi-GNA và đối chứng âm là DNA bộ gen tách chiết từ nhiễm sắc thể của cây
không được chuyển gen. Kết quả cho thấy ở các dòng cây giả định chuyển gen có sự
hiện diện của vạch DNA mong đợi có kích th ước bằng với kích thước của vạch đối
chứng dương tính là 0,47 kb (so với thang chuẩn). Không thấy vạch này ở trường hợp
cây thuốc lá đối chứng. Kết quả n ày chứng minh gen mục tiêu gna từ plasmid của vi
khuẩn Agrobacterium đã được chuyển và sáp nhập vào bộ gen của cây.
Sự hiện diện của gen bar v à khả năng kháng thuốc trừ cỏ Basta: Kết quả phân tích
PCR cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen xuất hiện băng DNA với kích thước
khoảng 0,50 kb là kết quả của việc khuếch đại gen bar. Do đó, chúng tôi có th ể khẳng
định bước đầu gen bar đã được chuyển vào nhiễm sắc thể của cây. Sau khi trồng tại

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

355

vườn ươm khoảng 30 ngày, các cây thuốc lá đối chứng đã được kiểm tra khả năng
chống chịu với thuốc trừ cỏ Basta bằng cách phun thuốc với các n ồng độ 4 g/l PPT. Sau
14 ngày, tất cả cây thuốc lá đối chứng đều bị chết ở nồng độ nói tr ên nên chúng tôi đã
chọn nồng độ 4g/l PPT để xử lý số cây thuốc lá chuyển gen. Sau 14 ng ày, cây thuốc lá
chuyển gen vẫn tiếp tục sinh tr ưởng bình thường.
KẾT LUẬN
Như vậy bằng các kỹ thuật sinh học phân tử chúng tôi đ ã tạo được chủng

Agrobacterium tumefaciens mang gen bar, gen gna và gen gusA. Sau đó đã sử dụng vi
khuẩn này để tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen bar kháng thuốc trừ cỏ và gen gna
kháng côn trùng chích hút.
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Tp Hồ Chí Minh và
Trung tâm phát triển KHCN Trẻ - Thành Đoàn Tp Hồ Chí Minh đã tài trợ cho nghiên
cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gleave A. P., 1992. A versatile binary vector syste m with a T-DNA organisational
structure conductive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome.
Plant Molecular Biology 20: 1203 -1207.
2. Hilder V. A., Gatehouse M. R., Gatehouse J. A., Van Damme E., Boulter D., 1995.
Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic tobacco plants results in added
protection against aphids. Transgenic Research 4: 18 -25.
3. Kumar K. K., Sudhakar D., Raija J. A., Balasubramanian P., 1999. Engineering
resistance in elite indica rices to major diseases through Agr obacterium -mediated
transformation.General Meeting of The International Program on Rice
Biotechnology, September, 1999, Phuket, Thailand.
4. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.Ư
5. Rao K. V., Christou P., Gatehouse M. R., Gatehouse J. A, 1998. Expression of
snowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown
planthopper. Plant Journal 15(4): 469 -477.
6. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., 1989. Molecular Cloning - A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


356

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

SUMMARY

Production of transgenic tobacco plants ( Nicotiana tabacum
L.) resistant to insect and Basta R herbicide via Agrobacterium
tumefaciens
Pham Thi Hanh, Phan Tuong Loc, Le Ta n Duc, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology

Intact gna gene cassette was collected from the plasmid pBluescript SK + by
restriction enzymes KpnI và SacI and inserted in Lac Z alpha region on T-DNA of the
plasmid pCAMBIA 3301. Consequently, newly for med plasmid was introduced into
competent E. coli and Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (for transformation). After
co-cultivation, tobacco leaf disks were cultured on selection medium containing 10 mg/l
PPT (Phosphinothricin). Many transgenic tobacco plants with aphid resistance gene gna,
herbicide resistance gene bar, and reporter gene gusA were obtained via Agrobacterium
tumefaciens LBA 4404 carrying the plasmid pCAMBIA 3301-GNA. PCR analyses and
indigogenic GUS assay were pe rformed to confirm the presen ce and the expression of
gna, bar and gusA genes.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

357

.

Hình 1. Ảnh điện di của
plasmid pCAMBIA 3301 GNA (1) và pCAMBIA
3301 (2)

Hình 4: Cây thuốc lá chuyển
gen và đối chứng trên môi
trường chứa 20 mg/l PPT

Hình 2, 3: Kết quả phân tích PCR gen bar (h. 2) v à gna
(h. 3) ở cây thuốc lá chuyển gen. L: thang DNA 1 kb,
PC: đối chứng dương tính, NC: đối chứng âm tính,
1,2,3,4: cây chuyển gen

Hình 5: Chồi cây thuốc lá
chuyển gen biểu hiện
gen gusA qua ngâm
trong dung dịch X-gluc

Hình 6: Cây thuốc lá chuyển
gen và đối chứng sau khi
phun dung dịch Basta

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


358

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

NGHIÊN CỨU TÁI SINH in vitro VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN
TÍCH CÂY CÚC Dendranthema grandiflorum L. MANG
GEN ipt tạo cytokinin
Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Phạm Đức Trí,
Nguyễn Thị Thanh
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Trong ngành trồng hoa thương mại, một trong các vấn đề đ ược quan tâm nhiều nhất
là nghiên cứu giữ cho cây hoa nói chung v à hoa cắt cành nói riêng sao cho lâu tàn. Các
nhà sản xuất và kinh doanh hoa cảnh đã sử dụng một số tác nhân l àm cho hoa được tươi
lâu như dung dịch chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) cytokinin (dihydrozeatin hoặc
benzyladenin), dung dịch đường, dung dịch sát khuẩn,,, để xử lý hoa cắt cành hoặc xử lý
đối với cả cây hoa.
Cây hoa cúc là đối tượng cây hoa có nhu cầu tiêu thụ rất cao vì có hoa đẹp, đa dạng,
nhiều màu sắc nhưng thời gian bền tươi của hoa cắt cành không dài nhất là khi đưa vào
tiêu thụ giống cúc ôn đới hoặc trưng bày, bảo quản hoa trong điều kiện không thích hợp
nên nghiên cứu làm tăng độ bền tươi của cây hoa này là vấn đề cần được quan tâm.
Như chúng ta đã biết, các chất điều hoà sinh trưởng như auxin, gibberellin, ethylen,
acid abscisic, cytokinin có ý nghĩa rất lớn trong việc điều ho à sự lão hoá. Trong các
nhóm chất nêu trên, cytokinin chiếm vai trò quan trọng [5,9,10,11]. Trong công nghệ
nuôi cấy mô tế bào in vitro, cytokinin có vai trò rất rõ rệt trong việc giữ cho mô lá tách
rời chậm thoái hoá diệp lục tố - được xanh tươi lâu. Trong thực tiễn công tác giống cây
trồng, việc xử lý cytokinin, li ên quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu hoạch và
kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành, mang ý nghĩa thương mại rất cao.
Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu chuyển gen nạp ipt (mã hoá enzym

isopentenyl transferase có liên quan đ ến sinh tổng hợp cytokinin isopentenyl adenin,
zeatin và dihydrozeatin) vào cây tr ồng mục đích làm mô tế bào của chúng tự sản xuất
cytokinin. Thực tế nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng, ở một số tr ường hợp
như cây thuốc lá [25], Petunia [5,10] cây bông cải [11], cây cải xà lách [13,14] kể cả
cây cúc [8,9,10]…, tác d ụng của cytokinin nội sinh (sản phẩm của gen đ ược chuyển
nạp) đối với tuổi thọ của lá v à hoa của cây chuyển nạp gen là rất có ý nghĩa. Để tránh sự
tạo dư thừa (overproduction) cytokinin gây thay đồi h ình dạng cây, các nhà khoa học đã
sử dụng một số loại promoter khác nhau tạo sự biểu hiện gen khi cây ở điều kiện đặc

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

359

thù [1,5,9,10,13] trong đó có promote r SAG12 (tạo sự sinh tổng hợp cytokinin khi mô
đi vào trạng thái lão hoá) [5,13] mà chúng tôi s ử dụng trong nghiên cứu này.
Theo xu hướng trên, ở nghiên cứu này, qua kết hợp công nghệ nuôi cấy mô v à công
nghệ gen, chúng tôi nghiên cứu tái sinh cây in vitro và chuyển gen ipt vào cây hoa cúc
Dendranthema morifolium L. Với hy vọng sự hiện diện v à biểu hiện của gen ipt nói trên
sẽ có tác dụng góp phần làm cho cây hoa lâu héo tàn.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Giống lan: Sử dụng giống cúc đại đoá Đ à Lạt có hoa màu vàng.
Phương pháp
Môi trường nuôi cấy mô và thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin
1.

Môi trường nuôi cây: MS (Murashige -Skoog, 1962) [15 ] không ch ất điều hoà sinh
trưởng (ĐHST).

2.

Môi trường tái sinh chồi: MS có các chất ĐHST NAA , BA với các nồng độ khác
nhau.

3.

Môi trường vươn chồi tạo cây và ra rễ: như môi trường số 1.

4.

Môi trường thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin: nh ư môi trường 1
nhưng có hygromycin từ 5 - 10mg/l.
Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng/ng ày, nhiệt độ 25-28 oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy

Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid
pVDH396 (kích thước  15,9 kb) (do TS. Nguyễn Thị Thanh thiết kế) mang gen ipt (có
nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ) tạo enzyme isopentenyl t ransferase
[có promoter SAG12 (senescence associated gene 12, t ừ Arabidopsis thaliana), gen
gusA (có intron, promoter CaMV35S) và gen kháng hygromycin hph (promoter
CaMV35S).
Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin. Để nhân
giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc qua đêm trong môi
trường khoáng AB (Chilton v à cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin nh ư trên. Nhiệt
độ nuôi cấy: 25 - 280C.
Quy trình chuyển gen

Các mảnh lá với kích thước 0,6 x 0,6cm, từ cây in vitro trên môi trường MS không
chất điều hoà sinh trưởng, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen
1.

Nuôi cấy mảnh lá trên môi trường có 0,5mg/l NAA và 1mg/l BA trong thời gian 2
ngày.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


360

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

2.

Gây nhiễm các mảnh lá với vi khuẩn trong thời gia n 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm bớt
dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.

3.

Nuôi chung mảnh lá với vi khuẩn trong 2 ng ày. Sử dụng môi trường như trên
nhưng có acetosyringone 100 M.

4.

Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kết
hợp lắc nhẹ).

5.

Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường chọn lọc: như môi
trường ở bước 1 của quy trình nhưng có bổ sung 10 mg/l hygromycin, 500 mg/l
cefotaxime. Thời gian nuôi 15 ngày / chu kỳ chọn lọc và thực hiện 2 chu kỳ.

6.

Tiếp tục thực hiện sự chọn lọc thêm 3 chu kỳ (15 ngày/chu kỳ) trên môi trường
chọn lọc như trên nhưng có 5mg/l hygromycin đến khi có chồi tái sinh.

7.

Cấy truyền các chồi / cụm chồi tái sinh (cao khoảng 1 cm) sang môi trường MS
không chất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromy cin đến khi vươn chồi, thời gian
nuôi khoảng 1 tháng.

Kiểm tra cây chuyển gen
1.

Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền cũng sang môi tr ường MS
không chất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi s ự vươn chồi và ra rễ trong
thời gian khoảng 20 ngày.

2.

Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đ êm ở
370C (tủ ấm).

3.

PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gusA và gen ipt được kiểm tra dùng các cặp
mồi đặc hiệu.

Gen
hph:
HPH1:
CGTCGTTCGAGAAGTTTC,
HPH2:
0
TACTTCTACACAGCCATC; chương trình nhiệt: 94 C: 5 phút; 35 chu kỳ (940C: 1
phút, 62 0C: 1 phút, 72 0C: 1 phút); 72 0C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
Gen
gusA:
GUS1:
CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG,
GUS2:
0
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94 C: 3 phút; 30 chu kỳ (940C:
30 giây, 560C: 45 giây, 72 0C: 1 phút); 720C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .
Gen
ipt:
IPT1:
TCAACCGGAAGCGGACGACC,
IPT2:
0
GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương tr ình nhiệt: 90 C:10 phút; 40 chu kỳ (940C: 15
giây, 450C: 45 giây, 720C: 50 giây); 720C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

a. Tính chống chịu tự nhiên của mô lá đối với hygromycin
Theo một số tài liệu công bố về chuyển nạp gen qua sử dụng tác nhân chọn lọc l à
hygromycin thì cây cúc là đối tượng rất mẫn cảm đối với tác nhân chọn lọc n ày. Qua
triển khai thử nghiệm tính chống chịu đối với hygromycin d ùng vật liệu là mảnh lá và
cây con in vitro, kết quả cho thấy các mảnh lá (kích thước 0,6 x 0,6cm) và cây con (cao

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

361

khoảng 1,5 - 2cm) đều bị chết nâu trên môi trường MS không chất sinh trưởng có
10mg/l hygromycin. Trên môi trường có nồng độ 5mg/l hygromycin, ở mảnh lá có sự
hình thành mô sẹo nhưng mô sẹo đen dần và không có khả năng tái sinh chồi, và nếu có
sự tái sinh chồi xảy ra th ì chồi rất yếu ớt, xanh nhạt; đối với thử nghiệm tr ên cây con thì
cây tuy cũng có sự phát triển nhất định nh ưng chậm, rễ ra ngắn và có màu nâu đen, các
lá gần gốc ở trạng thái héo nâu, rũ.
Kết hợp thử nghiệm riêng trên giống cúc thí nghiệm và theo tài liệu đã công bố,
chúng tôi chọn nồng độ hygromycin 10mg/l để chọn lọc tế bào chuyển gen ở giai đoạn
đầu (1 - 2 chu kỳ) qua sử dụng phiến lá (không mang phần cuống) l àm vật liệu xử lý
chuyển gen. Tuy vậy, chúng tôi cũng quan tâm cân đối việc gia giảm nồng độ tác nhân
chọn lọc này để đảm bảo vừa có sự tái sinh ở mức t ương đối chấp nhận được vừa không
bị lúng túng do việc tái sinh nhiều cây không phải l à cây chuyển gen. Cũng qua thực tế
triển khai thử nghiệm này trên giống cúc đại đoá vàng Đồng Tháp (giống chịu nhiệt) th ì
giống này lại tỏ ra ít mẫn cảm hơn giống cúc nói trên (số liệu cá nhân).
b. Nghiên cứu nuôi cấy mô tái sinh cây phục vụ nghi ên cứu chuyển gen

Nói chung, trong nghiên cứu nuôi cấy mô và chuyển gen thì việc quan tâm trạng
thái sinh lý của lá là yêu cầu quan trọng. Tuy giống cúc n ày phát triển rất tốt trong bình
nuôi cấy, lá xanh đậm và to tạo thuận lợi cho việc lấy mẫu nh ưng theo kinh nghiệm
nghiên cứu thì việc lấy các lá không ở vị trí ngọn cũng nh ư gần gốc là điều cần thiết
nhất là đối với nghiên cứu chuyển gen. Điều này rất rõ đối với nghiên cứu nuôi cấy mô
và chuyển gen đối với cây hoa cát t ường (tài liệu cá nhân).
Chúng tôi đã bố trí một số môi trường thí nghiệm tái sinh tr ên cơ sở khoáng MS với
các nồng độ NAA 0,1; 0,5 và 1mg/l kết hợp với BA 1 và 2mg/l. Kết quả cho thấy, nói
chung, khi NAA cao (0,5; 1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2mg/l thì sự tái sinh chồi xảy
ra theo kiểu phát sinh cơ quan (organogenesis) [22] thông qua giai đo ạn trung gian là
mô sẹo. Ngược lại, khi nồng độ NAA thấp h ơn (0,1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2mg/l,
nhất là khi dùng 2mg/l, thì sự tái sinh chồi xảy ra ít qua giai đoạn mô sẹo, một số chồi
có vẻ hình thành trực tiếp từ mảnh lá [20,22,23]. Đặc biệt, sự hình thành trực tiếp này là
thường theo kiểu sinh phôi sô-ma [19], xảy ra nhiều khi chỉ dùng BA từ 1 - 2mg/l mà
không bổ sung NAA (số liệu cá nhân).
Theo một số tác giả nước ngoài nghiên cứu chuyển gen trên cây cúc, sự tái sinh
theo dạng trực tiếp này không có lợi cho nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi
phù hợp ý kiến nêu trên. Về vấn đề này, thực tế nghiên cứu cho thấy khả năng nhận
được cây chuyển gen sẽ cao h ơn khi điều chỉnh sự tái sinh thông qua mô sẹo v ì theo
chúng tôi tế bào chuyển gen, trước hết, cần được nhân lên và như vậy sẽ tạo cơ hội cao
cho sự tái sinh cây mang gen chuyển. Nói chung, hiện nay tr ên thế giới, nghiên cứu nuôi
cấy mô phục vụ nhân giống [2], sự phát sinh h ình thái [4,8, 20,22,26] và ph ục vụ
chuyển nạp gen [17,18] đã và đang được các nhà khoa học quan tâm rất nhiều ở đối
tượng cây trồng này.
c. Quy trình chuyển gen
Như đã nói ở trên do tính rất mẫn cảm với hygromycin nên chúng tôi, như đã trình
bày trong phần quy trình chuyển gen, sự chọn lọc được thực hiện ở giai đoạn đầu với

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

362

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

10mg/l hygromycin, sau đó giảm xuống còn 5mg/l nhằm tạo cơ hội cho sự tái sinh.
Cách làm này của chúng tôi phù hợp với cách thực hiện của một số tác giả n ước ngoài
vì theo các tác giả ấy, trên giống cúc cụ thể ở công bố, th ì sự tái sinh không thể xảy ra
dù đã có sự chuyển nạp gen (gen hph).
Cũng do quá mẫn cảm đối với hygromycin n ên quá trình chọn lọc tế bào chuyển
gen từ sau xử lý vi khuẩn đến khi nhận được cây thì khá dài. Điều này là do trên môi
trường có hygromycin tế bào tăng sinh chậm và cây khi đã có đầy đủ thân lá phát triển
cũng rất chậm. Và thực tế cũng cho thấy khi đ ã là cây chuyển gen nhưng chúng cũng
phát triển khá chậm trên môi trường có nồng độ hygromycin dù không phải ở mức quá
cao (5mg/l). Theo chúng tôi, đây là đi ểm đáp ứng đặc thù của các giống cúc khi sử dụng
tác nhân chọn lọc là hygromycin. Qua quá trình chuy ển gen, chúng tôi đã nhận được 3
dòng chồi có khả năng vươn cao thành cây. Chúng đư ợc kiểm tra về khả năng sinh
trưởng, ra rễ trên môi trường có hygromycin sẽ được trình bày dưới dây.
Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học dùng nhiều phương pháp khác nhau [3, 6,
12, 16, 17, 21, 23, 24, 27] để chuyển một số gen khác nhau nhằm tạo ra các đặc tính
mới cho cây cúc như cây chậm lão hoá [5, 9, 10, 13], tạo hoa có màu sắc mới lạ, kháng
virus [27].
d. Kiểm tra khả năng ra rễ trên môi trường có hygromycin
Các cây vươn cao t ừ 2cm trở lên được cấy sang môi tr ường MS không chất sinh
trưởng có 5mg/l hygromycin đ ể theo dõi sự sinh trưởng tiếp theo. So sánh với cây
đối chứng, sự sinh trưởng tiếp tục với biểu hiện k èm theo là có sự hình thành rễ là
hai hiện tượng xảy ra đồng thời đối với cây thực sự l à cây chuyển gen; ngược lại,
cây đối chứng mất hoàn toàn khả năng sinh trưởng dẫn đến sự chết sau đó tr ên cùng
loại môi trường.

e. Thử GUS
Điểm gây sự chú ý ở đây là các dòng chuyển gen đều cho kết quả âm tính đối với thử
nghiệm GUS. Điểm đặc biệt nữa l à không chỉ riêng giống cúc này trên các dòng chuyển
gen khác nhau mà đối với giống cúc khác (đại đoá v àng Đồng Tháp) tạo ra cũng bằng
phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium và bằng phương pháp chuyển gen khác (là bắn
gen) thì tất cả các dòng chuyển gen cũng đều cho kết quả âm tính (tài liệu của phòng). Theo
một tài liệu nước ngoài, hiện tượng âm tính đối với thử GUS này vẫn chưa giải thích được
khi dùng dòng vi khuẩn LBA 4404 để chuyển nạp v à khi dùng promoter CAMV35S cho
gen gusA. Tuy nhiên, theo chúng tôi, đây ch ỉ là gen chỉ thị nên dù có biểu hiện hay không là
điều không quan trọng, chỉ có điều nó gây cho ng ười nghiên cứu ít nhiều khó khăn khi
muốn kiểm tra nhanh cây chuyển gen khi ch ưa cần làm PCR.
f. Phân tich PCR các gen hph, gusA và ipt
Các dòng cây được kiểm tra bằng PCR chỉ khi chúng đã qua giai đoạn tạo rễ và có
sinh trưởng bình thường trên môi trường có 5mg/l hygromycin. Kết quả phân tích PCR
các gen hph, gusA, ipt v ới các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băng
DNA được khuếch đại tương ứng là 800 bp, 365 bp và 355 bp.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


363

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

hph

gusA

ipt

Hình hàng trên (từ trái sang phải): Phôi sô -ma, chồi hình thành trực tiếp và gián
tiếp từ mảnh lá
Hình hàng dưới (từ trái sang phải): Cụm chồi kháng hygromycin; phân tích PCR
gen hph (800 bp), gen gusA (365 bp) và gen ipt (355 bp)

KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu nuôi cấy tái sinh cây v à chuyển nạp gen trên cây cúc đại đoá vàng
Đà Lạt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi có một số kết luận sau:


Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp đồng thời cho việc tái sinh
cây và cho nghiên cứu chuyển nạp gen (ở khía cạnh cần sự tái sinh cây thông qua
mô sẹo) là môi trường MS có 0,5mg/l NAA v à 1mg/l BA.



Giống cúc nói trên rất mẫn cảm đối với hygromycin n ên việc chọn lọc áp lực cao
(10mg/l hygromycin) chỉ nên được thực hiện trong 1 - 2 chu kỳ đầu, sau đó cần
giảm xuống (5 - 6mg/l hygromycin) ở giai đoạn tái sinh để có thể nhận đ ược chồi
tái sinh.



Đã nhận được 3 dòng cây cúc mang gen ipt, gen hph và gen gusA. Sự hiện diện của
chúng đã được kiểm tra bằng phân tích PCR.

LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí

Minh đã tài trợ cho nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Aida, R., S. Nagaya, K. Yoshida, S. Kishimoto, M. Shibata , A. Ohmiya, 2005.
Efficient transgene expression in chrysanthemum, Chrysanthemum morifolium
Ramat., with the promoter of a gene for tobacco elongation factor 1  protein.
JARQ 39(4): 269-274.

2.

Bhattacharya, P., S. Dey, N. Das, B. C. Bhattacharya, 1990. Rap id mass
propagation of Chrysanthemum morifolium by callus derived from stem and leaf
explants. Plant Cell Rep. 9: 439-442.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


364

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

3.

Boase, M. R., J. M. Bradley, N. K. Borst, 1998. Genetic transformation mediated
by Agrobacterium tumefaciens of Florists’ chrysanthemum (Dendranthema
grandiflorum) cultivar ‘Peach Margaret’. In vitro Cell. Dev. Biol.- Plant 34: 46-51.

4.

Bush, R., E. D. Earle, R. W. Langhans, 1976. Plantlets from petal segments, petal
epidermis and shoot tips of the periclinal chimera, Chrysanthemum morifolium
‘Indianapolis”. Am. J. Bot. 63: 729-737.

5.

Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. Overproduction of
cytokinins in Petunia flowers transformed with P SAG12-IPT delays corolla
senescence and decreases sensitivity to ethylene. Plant Physiology 132: 2174-2183.

6.

De Jong, J., W. Rademaker, M. F. Van Wordragen, 1993. Restoring adventitious
shoot formation on chrysanthemum leaf explants following co -cultivation with
Agrobacterium tumefaciens . Plant Cell Tiss. Org. Cult. 32: 263-270.

7.

Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.
EMBO 6: 3901-3907.

8.

Kaul, V., R. M. Miller, J. F. Hutchinson, D. Richards, 1990. Shoot regeneration
from stem and leaf ex plants of Dendranthema grandiflora ‘Tzvelev’ (syn.
Chrysanthemum morifolium Ramat.). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 21: 21-30.

9.

Khodakovskaya, M. V., R. McAvoy, H. Liu, Y. Li, 1998. Ethylene -regulated
expression of the ipt gene increases flower number in trans genic Dendranthema
grandiflorum. Abstracts, Society for In Vitro Biology.

10. Khodakovskaya, M. V., Y. Li, J. Li, R. Vankova, J. Malbeck, R. McAvoy, 2005.
Effects of cor15a-IPT gene expression on leaf senescence in transgenic Petunia
hybrida and Dendranthema grandiflorum. Plant Growth Regulation 00: 00-00.
.
11. Kim Hong, N. T., E. J. Kane, P. J. Dix, 1998. Hormonal regulation of senescence in
cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) (Abstract). In: Altman A., Ziv M.,
Izhar S. (eds), Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21 st Century, IX
International Congress on Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht, The Netherlands, p. 164.
12. Ledger, S. E., S. C. Deroles, N. K. Given, 1991. Regeneration and Agrobacteriummediated transformation of chrysanthemum. Plant Cell Rep. 10: 195-199.
13. McCabe, M. S. et al., 2001. Effects of P SAG12-ipt gene expression on development
and senescence in transgenic lettuce. Plant Physiol., 127: 505-516.
14. McCabe, M. S., U. Mohapatra, F. Sch epers, K. Van Dun, J. B. Power, M. Davey,
1998. Delayed senescence in transgenic lettuce using an autoregulated ipt gene. J.
Exp. Bot. Suppl. 49: 49.
15. Murashige, T., F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue culture. Physiol. Plant .15: 473-497.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

365

16. Renou, J. P., P. Brochard, R. Jalouzot, 1993. Recovery of transgenic
chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum Tzvelev) after hygromycin resistance
selection. Plant Science 89: 185-197.i1
17. Sherman, J. M., J. W. Moyer, M. E. Dau b, 1998. A regeneration and
Agrobacterium-mediated transformation system for genetically diverse
chrysanthemum cultivars. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 123: 189-194.
18. Shinoyama, H., T. Kazuma, M. Komano, Y. Nomura, T. Tsuchiya, 2002. An
efficient transformation system in Chrysanthemum [ Dendranthema x grandiflorum
(Ramat.) Kitamura] for stable and non -chimeric expression of foreign genes. Plant
Biotechnology 19(5): 335-343.
19. Tanaka, K., Y. Kanno, S. Kudo, M. Suzuki, 2000. Somatic embryogenesis and
plant regeneration in chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.)
Kitamura). Plant Cell Rep. 19:945-953.
20. Teixeira da Silva, J. A., 2003. Thin cell layer technology for induced response and
control of rhizogenesis in chrysanthemum. Plant Growth Regulation 39: 67-76.
21. Teixeira Da Silva, J. A., S. Fukai, 2002. Increasing transient and subsequent stable
transgene expression in chrysanthemum following optimization of particle
bombardment and Agroinfection parameters. Plant Biotechnology 19(4): 229 -240.
22. Teixeira da Silva, J. A., S. Fukai, 2003. Chrysanthemum organogenesis through
thin cell layer technology and plant growth regulator control. Asian Journal of Plant
Sciences 2(6): 505-514.
23. Teixeira da Silva, J. A., S. Fukai, 2003. Four gene introduction methods affect the
shoot regeneration and localization of transgene expression in greenhouse stem
explants and in vitro-grown chrysanthemum stem thin cell layers. African Journal
of Biotechnology 2(5): 114-123.
24. Urban, L. A., J. M. Sherman, J. W. Moyer, M. E. Daub, 1994. High frequency
shoot regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum
(Dendranthema grandiflora). Plant Sci. 98: 69-79.
25. Wang, J., D. S. Letham, E. Cornish, K. R. Stevenson, 1997. Studies on cytokinins

action and metabolism using tobacco p lants expressing either the ipt or the gus gene
controlled by a chalcone synthase promoter: 1. Developmental features of the
transgenic plants. Aus. J. Plant Physiol. 24: 661-672.
26. Xiaohan, Y., J. Bo, Z. Yan, M. Ding, T. Xuemei, 2002. Enhancement of direct
shoot regeneration from internode segments of chrysanthemum by silver nitrate.
Propagation of Ornamental Plants 2(1): 28-37.
27. Yepes, L. C., V. Mittak, S -Z. Pang, C. Gonsalves, J. L. Slightom, D. Gonsalves,
1995. Biolistic transformation of chrysanthemum wit h the nucleocapsid gene of
tomato spotted wilt virus. Plant Cell Rep. 14: 694-698.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


366

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

SUMMARY

In vitro plant regeneration and transformation of
Dendranthema grandiflorum L. with the ipt gene for cytokinin
production
Nguyen Huu Ho, Le Tan Duc, Phan Tuong L oc, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh
Institute of Tropical Biology

The leaf disks of Dendranthema grandiflorum L. (0.6 x 0.6 cm) were co -cultivated
with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404. This Agro-strain contains the
plasmid pVDH396 harbouring the ipt gene (with SAG12 promoter) for the isopentenyl
transferase enzyme, the nptII gene (for kanamycin resistance) and the reporter gene

gusA. After 2 day co-cultivation, The leaf disks were transferred to the medium
containing hygromycin of 10 mg/l for sel ection. Through 4 - 5 rounds of selection, 3
independent transformed plants were obtained. The presence of the hph, gusA and ipt
genes was checked by the PCR analyses and / or the GUS assay [In the case of gusA
gene: positive in the PCR analysis; negative for the expression of gene in the different
organs of three in vitro transformed plant lines, in the GUS assay]. These transgenics
are being grown in the greenhouse for further studies.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

367

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HƯỚNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO
vắc-xin VIÊN GAN B TỪ CÂY TRỒNG
Nguyễn Hữu Hổ, Trương Thiện Trí, Lê Tấn Đức,
Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Hữu Tâm
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Thời gian gần đây, công nghệ sinh học đặc biệt l à công nghệ gen đã có những bước
tiến vượt bậc, qua đó các nhà khoa học nhiều nước (Mỹ, Cuba, Đức, Hàn Quốc, Trung
Quốc, Tây Ban Nha…) có thể sản xuất vắc -xin tái tổ hợp từ cây trồng
[9,10,11,15,16,17,19,20]. Hư ớng nghiên cứu sản xuất vắc-xin này được xem là hướng
có tiềm năng vô cùng lớn vì theo tính toán giá thành sản phẩm sẽ thấp hơn rất nhiều so
với giá thành các sản phẩm hiện dùng do có thể sản xuất ở quy mô lớn, lại khá đ ơn giản

trong khâu tổ chức sản xuất, vận chuyển v à bảo quản nguồn vắc-xin, sản phẩm không
chứa các virus gây bệnh cho người… - tạo điều kiện thuận lợi phục vụ tiêm chủng vắcxin mở rộng cho người dân ở các nước nghèo và các nước đang phát triển. Nêu đề tài
nghiên cứu này, chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu của mình, cùng với kết quả
nghiên cứu theo hướng này của các nhà khoa học khác trong nước, sẽ góp phần nhất
định vào sự phát triển của lĩnh vực nghi ên cứu, sản xuất vắc-xin từ các nguồn vật liệu
truyền thống nói chung và vắc-xin được sản xuất từ cây trồng nói ri êng.
Như chúng ta đã biết, nước ta là vùng lưu hành cao của bệnh viêm gan do siêu vi B
(HBV). Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10-15 % dân số (trên dưới 10 triệu
người). Tình trạng nhiễm này đã gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng. Bệnh này lây lan
theo hướng đa dạng và phức tạp, trường hợp bệnh mạn tính có thể dẫn đến x ơ gan và
ung thư gan, thời gian chữa trị kéo dài hơn nữa chi phí điều trị còn rất cao so với thu
nhập. Cách tốt nhất là phòng ngừa và một trong các biện pháp ph òng ngừa quan trọng là
chủng ngừa. Tuy nhiên, chi phí cho chủng ngừa bệnh cũng còn khá cao nếu tuân thủ
phác đồ điều trị tiêu chuẩn (tiêm nhiều mũi cách quãng thời gian).
Protein HBsAg của HBV là thành phần rất quan trọng giúp cho HBV bám dính v ào
màng tế bào và sau đó đi vào tế bào và huyết tương người bệnh và huyết tương có chứa
HBsAg là nguồn vật liệu quan trọng để sản xuất thuốc chủng ngừa có nguồn gốc huyết
tương (ngoài huyết tương, vắc-xin này còn được sản xuất từ nấm men, tế b ào động vật
hữu nhũ…). Đã có một số công bố khoa học li ên quan đến nghiên cứu chuyển nạp gen
HBsAg (mã hoá protein vỏ - HBsAg), dùng công nghệ chuyển gen vào nhân và lục lạp
tế bào, vào một số cây trồng, sản xuất sinh khối mô tế b ào cây chuyển gen, chiết tách
protein tinh khiết và nghiên cứu khả năng đáp ứng miễn dịch ở c ơ thể động vật qua tiêm

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn


368

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn

chích protein tinh khiết hoặc/và ăn trực tiếp sản phẩm cây chuyển gen. Qua các nghi ên
cứu nêu trên, nhận thấy protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hoá có
khả năng tạo đáp ứng miễn dịch tốt - mở ra triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gen này
vào các cây trồng có bộ phận ăn tươi được như quả, lá, thân, củ… Cũng qua một số
công bố nêu trên, kết quả nghiên cứu còn có mặt hạn chế là lượng protein (sản phẩm
của gen chuyển) trong cây chuyển gen c òn chưa cao nên trong nghiên c ứu này, chúng
tôi đặt vấn đề đưa hệ thống sao chép T7 của thực khuẩ n thể vào nghiên cứu ở đối tượng
thực vật (vấn đề đã gây được sự quan tâm đặc biệt chỉ trong v ài năm gần đây) kết hợp
với promoter PDS tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả nhằm hướng làm tăng hàm lượng
protein kháng nguyên trong lo ại mô này. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, gen HBsAg với
promoter PDS được nghiên cứu sự tích hợp và biểu hiện trước hết ở cây thuốc lá tuy
rằng protein biểu hiện chuyên biệt ở quả cây thuốc lá không có ý nghĩa sử dụng nh ư
“vắc-xin ăn được” và kết quả nghiên cứu chuyển gen này trên cây cà chua quả bi là kết
quả khoa học mang tính mới mẻ.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Giống thuốc lá, cà chua: Sử dụng giống thuốc lá sợi v àng K.326 và cà chua bi qu ả
dài (mua ngoài chợ). Hạt được khử trùng bằng nước Javel 50 % (v/v) trong 5 phút, rửa
sạch bằng nước cất và được cấy trên môi trường không chất sinh tr ưởng. Các mảnh lá
cây in vitro với kích thước khoảng 0,7 x 0,7cm (đối với thuốc lá) và lá mầm của cây
mầm 7-10 ngày tuổi (đối với cà chua) được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen.
Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy: Sử dụng môi tr ường cơ bản MS
(Murashige và Skoog, 1962) [13].
 Gieo hạt sau khử trùng và nuôi cây giai đoạn tạo rễ: MS không chất sinh tr ưởng.
1/ Tái sinh chồi, cây từ mảnh lá: MS + 0,1mg/l NAA + 1 mg/l BA (đối với thuốc
lá), MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA (đối với cà chua).
Điều kiện nuôi: Nhiệt độ 26-28°C, cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux.
Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
2/ LBA 4404 chứa plasmid pITB-HBsAg ( 16,78 kb) (do TS. Nguyễn Hữu Tâm
thiết kế) mang gen HBsAg (promot er T7, terminator T7;  0,7 kb), gen gusA (promoter

T7, terminator T7) và gen nptII kháng kanamycin (promoter CaMV35S). Gen HBsAg
mã hoá protein nhỏ S và gen gusA được điều khiển bởi hệ thống [promoter PDS
(phytoene desaturase,  2 kb) + T7-polymerase (2,7 kb)] tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở
quả. Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có 50mg/l kanamycin trước khi gây
nhiễm mô.
Quy trình chuyển gen:
 Cấy các mảnh lá (đối với thuốc lá) v à lá mầm (đối với cà chua) trên môi trường 2;
nuôi 2 ngày ngoài sáng.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn