Ứng dụng công nghệ gen động vật, vi sinh vật trong nông nghiệp, y tế

øng dông c«ng nghÖ gen ®éng vËt,
øng dông c«ng nghÖ gen ®éng vËt,
vi sinh vËt trong n«ng nghiÖp,
vi sinh vËt trong n«ng nghiÖp,


y tÕ
y tÕ
I. ChÈn ®o¸n ph©n tö
I. ChÈn ®o¸n ph©n tö
•
ChÈn ®o¸n bÖnh
•
ChÈn ®o¸n giíi tÝnh
•
NhËn d¹ng c¸ thÓ qua gi¸m ®Þnh
ADN
•
X¸c ®Þnh quan hÖ huyÕt thèng qua
ph©n tÝch ADN ty thÓ
1.1.ứ
1.1.ứ
ng dụng trong chẩn đoán bệnh
ng dụng trong chẩn đoán bệnh



Sử dụng các kỹ thuật của công nghệ gen để phát hiện,
chẩn đoán một cách chính xác, nhanh chóng các bệnh di

truyền và truyền nhiễm gây ra do nấm, khuẩn, virus
dựa trên cơ sở nguyên nhân gây bệnh làm xuất hiện axit
nucleic ngoại lai trong cơ thể bị bệnh hay do xuất hiện sự
biến đổi axit nucleic của chính các cơ thể đó

Trong các kỹ thuật thao tác trên ADN, ARN kỹ thuật lai
axit nucleic và khuếch đại axit nucleic là 2 kỹ thuật cơ
bản được sử dụng trong chẩn đoán bệnh bởi khả năng
ứng dụng rộng trên nhiều loại bệnh, tốc độ chẩn đoán
nhanh, chính xác.

Phổ biến hơn cả trong các phương pháp khuyếch đại axit
nucleic là phương pháp PCR và các dạng cải biến của nó
(real time PCR, RT-PCR ). Có hơn 100 bệnh có thể
chẩn đoán được bằng phương pháp này.
Nguyên lý
Nguyên lý

Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm : Xác định sự có mặt hay không
có mặt axit nucleic của tác nhân gây bệnh trong đối tượng
chẩn đoán để xác định cá thể mang bệnh ở ngay những giai
đoạn sớm (chưa có triệu chứng và dấu hiệu bệnh lý)

Chẩn đoán bệnh di truyền: phát hiện những biến đổi đặc trưng
của axit nucleic liên quan đến bệnh ở đối tượng chẩn đoán để
có thể phát hiện bệnh ở các giai đoạn phát triển cá thể, thậm
chí cả ở giai đoạn phôi.

Quá trình chẩn đoán bệnh nhờ lai và khuyếch đại axit nucleic
bao gồm các giai đoạn chính:

Thu thập mẫu để chẩn đoán

Tiến hành kỹ thuật phù hợp để phát hiện axits nuclei ngoại lai hay sự
biến đổi của axits nuclei nội tại của tế bào chủ trong mẫu chẩn đoán

Phân tích, đánh giá kết quả
PCR for Medical Diagnostics
Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm bằng PCR
Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm bằng PCR
ở Việt nam
ở Việt nam

Bệnh ung thư vòm họng do Epstein-Bar virus với cặp mồi:

TH1: 5 -AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3

TH2: 5 -GCTTGGATGGCCGAGTCAGCGACGG-3

Bệnh viêm gan B do Hepatitis B virus bằng PCR lồng
với hai cặp mồi:

Cặp mồi 1: HBV P1 và HBV M1:
5- AGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCC-3
5- AGTTGGCGAGAAAGTGAAAGCCTG-3

Cặp mồi 2:HBV P2 và HBV M2:
5- GACATGGAGAGCACAACATCCAGG-3
5- GCATTAAAGGCATCAAAGGCAGG-3
Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm bằng PCR

Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm bằng PCR
ở Việt nam
ở Việt nam

Bệnh sốt rét: trên 80% trường hợp sốt rét ở nước ta do nhiễm
ký sinh trùng Plasmodium falciparum, một số bệnh nhân
nhiễm phối hợp 2-3 loại ký sinh trùng sốt rét khác nhau (P.
vivax, P. ovale, P.malariae) Sử dụng phương pháp PCR lồng
với cặp mồi: Plu5-Plu6 (PCR lần1) và PCR lần 2 với các cặp
mồi: Fal1-Fal2 (P. falciparum), Viv1-Viv2 (P. vivax), Mal1-
Mal2 (P.malariae), ova1-ova2 (P. ovale) có thể chẩn đoán
nhanh và chính xác loài ký sinh trùng lây nhiễm ở bệnh nhân.

Bệnh cúm gia cầm H5N1: sử dụng RT-PCR với các mồi
(primes) và đầu dò (DNA probes) đặc hiệu cho các locus khác
nhau của gen HA phân lập từ mẫu bệnh phẩm của Việt nam đã
chẩn đoán nhanh, nhạy sự có mặt của chủng virus (bảng sau)
Giới thiệu về virut H5N1
Giới thiệu về virut H5N1

Thuộc họ orthomyxoviridae : gây bệnh đường hô hấp
trên người, động vật, gia cầm, chim.

Gồm typ A, B, C trong đó A gây dịch cúm chính, B nhẹ
hơn, C ít nguy hiểm cho người.

Virut cúm typ A, B thuộc chi influenzavirus truyền
bệnh qua sol khí, dòng nước, tiếp xúc.

Virion có vỏ đa hình thái, thường có hình cầu đường

kính 80-120nm.

Bề mặt virut có 2 loại gai: Hemaglutinin (H) và
neuraminidaza (N)

Virut typ A có 16 loại gai H trong đó H1, H2, H3 gây
bệnh cho người. Có 9 loại gai N trong đó N1, N2 gây
bệnh cho người.
Giới thiệu về virut H5N1
Giới thiệu về virut H5N1

Genome của virut có nhiều phân đoạn nên dẫn
đến sự thay đổi kháng nguyên liên tục:

Thay đổi lớn: hoán vị kháng nguyên, xảy ra khi có 2
hay nhiều chủng virut có nhiều đoạn ARN khác biệt
nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào. Các đoạn này
có thể hoán vị cho nhau, thí dụ thay đoạn mã hoá
cho Hemaglutinin của người bằng đoạn của động
vật, kết quả tạo chủng virut mới với kháng nguyên
thay đổi, kháng lại được kháng thể đã hình thành trư
ớc.

Thay đổi nhỏ: biến thể kháng nguyên, do đột biến
ngẫu nhiên, gây khó khăn cho việc sản xuất vacxin
hữu hiệu.



Oseltamivir

Thuèc ®iÒu trÞ:
(G©y bÊt ho¹t enzyme
neuraminidaza):
Amantadin
Rimantadin
Zanamivir
Oseltamivir
(Tamiflu)
The various types of influenza viruses in humans. Solid
squares show the appearance of a new strain, causing
recurring influenza pandemics. Broken lines indicate
uncertain strain identifications.[2]
Bắc MĩLợn
Non-structural
proteins NS1,
NEP (
Nuclear Export Protein
)
[86][87]
NS/NEP
Âu-ÁLợn
Matrix protein
M1, M2
M
Bắc MĩLợnNucleoprotein
[85]
NP
Bắc MĩChim
RNA polymerase
subunit PB2

[84]
PB2
1993 H3N2 strainNgười
RNA polymerase
subunit PB1
[83]
PB1
Bắc MĩChim
RNA polymerase
subunit PA
[81][82]
PA
Châu ÂuLợn (N1)NeuraminidaseNA
Bắc MĩLợn (H1)HemagglutininHA
Nguồn gốc gen của virus cúm A/H1N1 2009
[80]
Nguồn: “The identity card of a composite virus”, Le Monde, 2009/04/29. (Viết bằng tiếng Pháp
Chẩn đoán bệnh di truyền bằng PCR
Chẩn đoán bệnh di truyền bằng PCR
Bệnh máu khó đông (Hemophilia)

Bệnh máu khó đông là bệnh gây nên do di truyền đơn gen. Có
ba loại bệnh máu khó đông:
-
Hemophilia A do đột biến gây mất chức năng gen mã hóa protein
đặc hiệu được gọi là yếu tốVIII (F.VIII). Tần số mắc bệnh
1/10.000
-
Hemophilia B gây nên do rối loạn chức năng gen mã hóa yếu tố IX
(F.IX). Tần số mắc bệnh 1/50.000

(Hemophilia A v Hemophilia B khỏ ph bin. T l gp khong 1 trong s 10.000 n
ụng. Bnh di truyn ln, liờn quan n nhim sc th gii tớnh X. Ch yu bnh nhõn l
n ụng, 100 % con gỏi ca ngi bnh mang gen, chỏu trai ngoi cú biu hin bnh.. T
l Hemophilia A/Hemophilia B t 5 - 7 : 1.)
- Hemophilia C gây nên do rối loạn chức năng gen mã hóa yếu tố
IX (F.IX)
(B nh nhõn Hemophilia C him gp v cú biu hin lõm sng nh. Bnh di truyn ln, liờn
quan n nhim sc th thng vỡ vy c nam v n u cú th mc bnh.)

•
Có thể sử dụng nhiều kỹ thuật phân tử khác nhau để để phát
hiện nhanh bệnh máu khó đông: RFLP, PCR, lai ADN
•
RFLP: phát hiện đột biến trên gen F.VIII với RE BclI (đột biến
ở intron 18), HindIII (đột biến ở intron 19), XbaI và MspI (đột
biến ở intron 22). phát hiện đột biến trên gen F.IX với RE
TaqI (đột biến ở intron 4), XmnI (đột biến ở intron 3).
•
PCR: nhân đoạn intron 18 bằng mồi 8.1 và 8.2, nhân đoạn
intron 19 bằng mồi C3 và C4
•
Mồi 8.1: 5’–TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC-3’
•
Mồi 8.2: 5’- TTCGAATTCTGAAATTATCTTTGT-3’
•
Mồi C3: 5’-TTCCCGAGCTCTACATGCT-3’
•
Mồi C4: 5’- CTAATGTGTCCAGAAGCCAT-3’
(Viện Huyết học truyền máu và viện Vệ sinh dịch tễ trung ương)
Bệnh hồng cầu liềm

Bệnh hồng cầu liềm

Nguyên nhân gây bệnh là sư thay đổi nucleotid trong codon
của axit amin thứ 6 của chuỗi trong phân tử Hemoglobin (đổi
glutamic thành valin)

Cá thể đồng hợp tử về đột biến này(S/S) có hồng cầu biến dạng
thành hình liềm, không vận chuyển đủ oxy gây thiểu máu
nghiêm trọng, tổn thương nội quan . Thời gian tồn tại của thể
đồng hợp tử ngắn

Thể dị hợp tử (B/S): hồng cầu dạng bình thường, triệu chứng
bệnh biểu hiện khi gặp điềukiện khắc nghiệt (nhiệt độ cao) làm
giảm cung cấp oxy

Đột biến điểm nêu trên làm mất vị trí nhận biết của RE Dde1
(CTNAG). Do đó sau khi nhân PCR, xử lý cắt bởi RE và điện
di sẽ phát hiện được thể đột biến (chỉ có 2 vi trí căt cho Dde1)
Diagnosis of Sickle-Cell Anemia
lane 1 shows DNA size markers, lane 2 a no DNA control, and lane 3 a full length PCR product of the
beta-globin gene. Lanes 4 - 8 show beta- globin PCR products digested with the restriction
endonuclease Dde I. Lane 4 shows a no DNA control, lane 5 shows a normal individual (HbB/HbB),
lane 6 a carrier mother (HbB/HbS), lane 7 her carrier fetus (HbB/HbS), and lane 8 the carrier father
(HbB/HbS). HbS carriers are detected by the presence of the 381 bp DNA fragment. An affected
individual (HbS/HbS) would not have any 201 bp and 180 bp DNA fragments.
Diagnosis of Sickle-Cell Anemia
by PCR (BÖnh hång cÇu liÒm)
1.2. Chẩn đoán giới tính
1.2. Chẩn đoán giới tính

Nguyên lý:

Trên nhiễm sắc thể Y của người và động vật có vú
mang gen đặc trưng giới tính đực Sry (The sex
determining region Y gene). Gen này kích thích sản
sinh kháng nguyên HY và phát triển tinh hoàn ở cá
thể đực

Đã tiến hành giải trình tự gen Sry của người và nhiều
loài động vật có vú (chuột, lợn, bò, cừu ) Dựa trên
trình tự đặc hiệu của Sry thiết kế mồi để chẩn đoán
giới tính sớm của phôi thai nhờ PCR.

Đây là phương pháp chính xác, hiện đại và thông
dụng nhất hiện nay.
2. Chẩn đoán giới tính
2. Chẩn đoán giới tính



Để chẩn đoán sớm giới tính của phôi, người ta sử dụng một tế
bào đơn của phôi vừa hình thành sau thụ tinh in vitro (giai đoạn
6-10 tế bào) để tách ADN khuôn

Cặp mồi dùng để phát hiện Sry của người là:

SRY1: 5 - AAGTCGGTGCTCCATTCTTGAG-3

SRY2: 5 - AATATTCCCGCTCTCCGGA- 3

Cặp mồi để phát hiện Sry ở chuột:

SRY1: 5 -GAGGCATGGAGGGCCAT-3

SRY2: 5 -CCACTCCTCTGTGACACT-3

Trỡnh tự của mồi SE47, SE48 để xác định Sry ở cừu và hươu đỏ
Châu Âu:

5 - cagccaaacctccctctgc - 3 (SE47)

5 - cccgcttggtcttgtctgttgc - 3 (SE48)
( I. Pfeiffer and B. Brenig Department of Molecular Biology,
Institute of Veterinary Medicine, Goettingen, Germany )
1 aagctttgtt tttttaaaga taacatacac atatattgat aatgataaac aattcatata
61 gctttttgtg tcctctcgtt ttgtgacata aaaggtcaat gaaaaaattg gcgattaagt
121 caaattcgca tttttcagga cagcagtaga gcagtcaggg aggcagatca gcagggcaag
181 tagtcaacgt tactgaatta ccatgttttg cttgagaatg aatacattgt cagggtacta
241 gggggtaggc tggttgggcg gggttgaggg ggtgttgagg gcggagaaat gcaagtttca
301 ttacaaaagt taacgtaaca aagaatctgg tagaagtgag ttttggatag taaaataagt
361 ttcgaactct ggcacctttc aattttgtcg cactctcctt gtttttgaca atgcaatcat
421 atgcttctgc tatgttaagc gtattcaaca gcgatgatta cagtccagct gtgcaagaga
481 atattcccgc tctccggaga agctcttcct tcctttgcac tgaaagctgt aactctaagt
541 atcagtgtga aacgggagaa aacagtaaag gcaacgtcca ggatagagtg aagcgaccca
601 tgaacgcatt catcgtgtgg tctcgcgatc agaggcgcaa gatggctcta gagaatccca
661 gaatgcgaaa ctcagagatc agcaagcagc tgggatacca gtggaaaatg cttactgaag
721 ccgaaaaatg gccattcttc caggaggcac agaaattaca ggccatgcac agagagaaat
781 acccgaatta taagtatcga cctcgtcgga aggcgaagat gctgccgaag aattgcagtt
841 tgcttcccgc agatcccgct tcggtactct gcagcgaagt gcaactggac aacaggttgt
901 acagggatga ctgtacgaaa gccacacact caagaatgga gcaccagcta ggccacttac

961 cgcccatcaa cgcagccagc tcaccgcagc aacgggaccg ctacagccac tggacaaagc
1021 tgtaggacaa tcgggtaaca ttggctacaa agacctacct agatgctcct ttttacgata
1081 acttacagcc ctcactttct tatgtttagt ttcaatattg ttttcttttc tctggctaat
1141 aaaggcctta ttcatttcag ttttactggt atttcatttt aaacttaatt tcaagacaag
1201 ttgtgtcaac acgattaaca tgcaaagaaa taagacatcc agaagtgagc ctgcctatgt
1261 ttgtggccgt cagagtacta acttgataca aacggacact gtggcttact ttaaatgctc
1321 taatgagaaa cacacttgaa aattgtacca aaaaaaatca cacttctata tgcagcgtgt
1381 taagcagtcc tctctagacc gtgtattcat tggtctttca gctactttgt acgtgtctat
1441 aaattgcagg taactaagga atggatatgt aagcaggatc aaacttgttt ctttctctcc
1501 ccttcacgct gtggaaaaaa ccagttttac ctccacttgc aattcagttc ctttactcca
1561 tataaatcca aacggttgac atttcctttc aactagttat aaaatgcctc tggtaaaaca
1621 aaatatttaa ttccttgtca tttttgtatc tctatgaaac ttatcatttt gcctttcttc
1681 tgaaaactat cttttaaaat ggcaatctac ttgtttccat ggcctattaa cttttaagcc
1741 tgtggaatga aaaatacaga attttcattc tcaacaggaa tgttgagaac gccgactacc
1801 cagattatgg agatggaagg gcgggggctg gtgacccaac tggtttaatt tgatgggatt
1861 taaataaaaa tgtaatgcca agacttcata aaatttgcac ataagctaaa gcaggaaact
1921 agaagtttac aaataactgt aaaccacagt ttaaagtata aattacaaat aaatttttct
1981 acaataaaaa taaatcaaaa gtcaaaatta atggtatgta tcaaagtcag ctttccaata
2041 tttcaaaact tttcagagac attaccttaa ataataaaac tcaaacacta aaagagtgta
2101 tattagagat ggatgtcatg tttctcaaag ttcagggttt aaaaaaagct t
Tr×nh tù
Sry ë
ng­êi
BASE
COUNT
689 a
420 c
428 g
614 t
3D

structure
of human
Sry-DNA
complex
(PDB
accession
: 1HRY)