Thực tập kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng

TR

NG

I H C KHOA H C

KHOA CỌNG NGH SINH H C

TẨI LI U H

NG D N TH C HẨNH

H C PH N: TH C T P CHUYểN NGẨNH

N I DUNG: TH C T P K THU T XÉT NGHI M VI SINH LỂM SẨNG
(Trích trong tài li u h

ng d n th c hành k thu t xét nghi m vi sinh lâm sàng

Ban hành kèm theo Quy t đ nh s 1539/Q -BYT)

Cán b h

ng d n: Ths.

Th Tuy n

Ch c v : Gi ng viên
n v : Khoa Công ngh Sinh h c

Thái nguyên, 2018

Ch

ng I

K THU T XÉT NGHI M C

B N

BÀI 1. K THU T LẨM TIểU B N
1. M c đích: Quy trình này h

ng d n cách làm tiêu b n đ chu n b cho các ph

ng pháp nhu m

phát hi n hình th , cách s p x p, tính ch t b t màu c a vi sinh v t c ng nh các thành ph n khác trong
b nh ph m (n u có).
2. Ph m vi áp d ng Quy trình này đ

c áp d ng

Khoa/Phòng/B ph n vi sinh c a các B nh vi n.

3. Trách nhi m
- Ng

i th c hi n: ư đ

c đào t o và có ch ng ch ho c ch ng nh n v chuyên ngành Vi sinh y h c.

- Ng

i nh n đ nh, giám sát và phê duy t k t qu : Có trình đ đ i h c ho c sau đ i h c v chuyên

ngành Vi sinh y h c.
4. Nguyên t c: Không áp d ng
5. Trang thi t b , v t t
a. Trang thi t b
- T an toàn sinh h c (ATSH) c p 2
- Kính hi n vi quang h c.
- Máy ly tâm
- Máy tr n, l c.
- ng vô trùng có n p đ y.
- èn c n, que c y, lam kính, lá kính m ng, bút vi t kính, d u soi kính, gi y th m d u.
- Pipet Pasteur vô trùng.
b. Sinh ph m hóa ch t
- B thu c nhu m: Tùy vào k thu t nhu m mà s d ng b thu c nhu m phù h p
- Dung d ch n

c mu i sinh lỦ vô trùng 0,9%.

6. Ki m tra ch t l

ng

- Các hóa ch t dùng đ nhu m soi ph i đ

c ki m tra theo Quy trình ki m tra ch t l

l u l i k t qu sau khi ki m tra.
- C n có Ch ng âm, Ch ng d

ng tùy vào m i k thu t nhu m.

7. An toàn
- Th c hi n thao tác v i m u b nh ph m trong t ATSH
- S d ng các thi t b b o h cá nhân.
8. N i dung th c hi n
- Chu n b lam kính s ch, không x

c, v , nhúng vào dung d ch ethanol 95%.

- S d ng k p g p lam kính, đ ráo c n, h lam kính trên ng n l a đèn c n.
- Dán nhưn ho c ghi thông tin m u b nh ph m.

ng hóa ch t và


- Dùng bút vi t kính khoanh tròn, đánh d u v trí ph t b nh ph m

m td

i lam kính.

- Dàn tiêu b n theo hình xoáy trôn c t trong ra ngoài ho c hình zích z c.
-

i v i b nh ph m d ch nưo t y, d ch r a ph qu n và các d ch khác:

+ Ly tâm b nh ph m 3000 - 4000 rpm trong 10 phút, ch t b n

c n i.

+ Dùng pipet Pasteur nh 1 - 2 gi t b nh ph m lên lam kính, không dàn tiêu b n.
- V i b nh ph m n
- L c đ u ng n

c ti u:

c ti u, l y 10 µl b nh ph m ph t lên lam kính, không dàn tiêu b n.

- V i b nh ph m t t m bông (que gòn):
+ Yêu c u l y 2 t m bông (que gòn) riêng.
+ Tr

ng h p ch có m t t m bông (que gòn) b nh ph m, r t m bông (que gòn) trong n

c mu i sinh

lỦ ho c canh thang vô trùng, l n t m bông (que gòn) trên vùng đư đánh d u trên lam kính.
- Nh ng b nh ph m m đ c: Làm m ng tiêu b n b ng m t lam kính khác.
+

t m t lam kính th 2 s ch lên lam kính đư ph t tiêu b n.

+ Kéo nh nhàng lam kính th hai trên lam kính ban đ u.
+ N u tiêu b n ch a đ m ng, ti p t c l p l i v i m t lam kính s ch khác.
- Tr

ng h p ít b nh ph m, b nh ph m khô: Hòa loưng trong n

c mu i sinh lỦ, dàn tiêu b n.

- B nh ph m mô, m nh sinh thi t: Nghi n, c t nh b nh ph m, dàn tiêu b n.
- B nh ph m t môi tr

ng nuôi c y l ng, nh 1 - 2 gi t lên lam kính, dàn tiêu b n.

- B nh ph m t khu n l c (khóm): Pha huy n d ch vi khu n, dàn tiêu b n.
9. Di n gi i k t qu vƠ báo cáo: Tùy t ng lo i đ phi n cho các ph

ng pháp nhu m khác nhau s có

yêu c u riêng.
10. L u Ủ (c nh báo) Tiêu b n không quá dày, không quá m ng.
11. L u tr h s
- Ghi chép rõ ràng k t qu và các thông tin quy đ nh vào phi u tr l i k t qu và s k t qu xét nghi m.
- L u tr các bi u m u phi u ki m tra ch t l

ng theo đúng quy đ nh c a khoa.


BÀI 2. K THU T NHU M GRAM
1. M c đích Quy trình này h

ng d n nhu m tiêu b n b ng ph

ng pháp nhu m Gram đ phân lo i vi

khu n d a vào hình th , cách s p x p, tính ch t b t màu c a vi sinh v t.
2. Ph m vi áp d ng Quy trình này đ

c áp d ng

Khoa/Phòng/B ph n vi sinh c a các B nh vi n.

3. Trách nhi m
- Ng

i th c hi n: ư đ

c đào t o và có ch ng ch ho c ch ng nh n v chuyên ngành Vi sinh y h c.

- Ng

i nh n đ nh, giám sát và phê duy t k t qu : Có trình đ đ i h c ho c sau đ i h c v chuyên

ngành Vi sinh y h c.
4. Nguyên t c Vi khu n b t màu Gram âm hay Gram d
vách t bào c a vi khu n. Vi khu n Gram d
không b

nh h

không b nh h

ng do s khác nhau v thành ph n, c u trúc

ng có l p peptidoglycan d y, nhi u acid teichoic, chúng

ng b i s t y màu b ng c n, v n gi nguyên đ

c màu tím ban đ u n u vách t bào

ng b i các y u t nh tu i, tác d ng c a kháng sinh... Vi khu n Gram âm có m t l p

peptidoglycan g n v i l p phospholipid kép, xen k các protein

màng ngoài, l p màng này d b phá

h y b i c n khi t y màu, do đó ph c h p tinh th tím gentian - iod không b n, b t y màu và màu đ
thay b i các thu c nhu m khác.
5. Trang thi t b , v t t
a. Trang thi t b
- T an toàn sinh h c (ATSH) c p 2
- Kính hi n vi quang h c.
- Máy ly tâm
- Máy tr n, l c
- ng vô trùng có n p đ y.
- èn c n, que c y, lam kính, lá kính m ng, bút vi t kính, d u soi kính, gi y th m d u.
- Pipet Pasteur vô trùng.
b. Sinh ph m hóa ch t
- B thu c nhu m Gram:
+ Methanol
+ Tinh th tím: Hucker c i ti n, tinh th tím c a Kopeloff
+ Dung d ch t y màu ฀ Nh nh t: Ethanol 95%, ฀ Trung bình: C n acid ฀ M nh nh t: Aceton.
+ Hóa ch t nhu m l n 2 ฀ Safranin
c. Carbon Fuschin

- Fuschin c b n
- Safranin c a Kopeloff
- Dung d ch n

c mu i sinh lỦ vô trùng 0,9%.

6. Ki m tra ch t l

ng

c


- Các hóa ch t dùng đ nhu m soi ph i đ

c ki m tra theo quy trình ki m tra ch t l

ng, hóa ch t, l u

l i k t qu sau khi ki m tra.
- C n có ch ng chu n làm ch ng:
+ Staphylococcus aureus ATCC 25923: c u khu n Gram d

ng s b t màu tím đ m.

+ Escherichia coli ATCC 25922: tr c khu n Gram âm s b t màu h ng.
7. An toàn
- Th c hi n thao tác v i m u b nh ph m trong t ATSH.
- S d ng các thi t b b o h cá nhân.
8. N i dung th c hi n

a. Làm tiêu b n
- Chu n b lam kính s ch, không x

c v , nhúng vào dung d ch ethanol 95%.

- S d ng k p g p lam kính, đ ráo c n, h lam kính trên ng n l a đèn c n.
- Dán nhưn ho c ghi thông tin m u b nh ph m.
- Dùng bút vi t kính khoanh tròn, đánh d u v trí ph t b nh ph m, m t d

i lam kính.

- Dàn tiêu b n theo hình xoáy trôn c t trong ra ngoài ho c hình zích z c.
-

i v i b nh ph m d ch nưo t y, d ch r a ph qu n và các d ch khác:

+ Ly tâm b nh ph m 3000 - 4000 rpm trong 10 phút, ch t b n

c n i.

+ Dùng pipet Pasteur nh 1 - 2 gi t b nh ph m lên lam kính, không dàn tiêu b n.
- V i b nh ph m n

c ti u: L c đ u ng n

c ti u, l y 10 µl b nh ph m ph t lên lam kính, không dàn

tiêu b n.
- V i b nh ph m t t m bông (que gòn):
+ Yêu c u l y 2 t m bông (que gòn) riêng.

+ Tr

ng h p ch có m t t m bông (que gòn) b nh ph m, r t m bông (que gòn) trong n

c mu i sinh

lỦ ho c canh thang vô trùng, l n t m bông (que gòn) trên vùng đư đánh d u trên lam kính.
- Nh ng b nh ph m m đ c: Làm m ng tiêu b n b ng m t lam kính khác.
+

t m t lam kính th hai s ch lên lam kính đư ph t tiêu b n

+ Kéo nh nhàng lam kính th hai trên lam kính ban đ u.
+ N u tiêu b n ch a đ m ng, ti p t c l p l i v i m t lam kính s ch khác.
- Tr

ng h p ít b nh ph m, b nh ph m khô, hòa loưng trong n

c mu i sinh lỦ, dàn tiêu b n.

- B nh ph m mô, m nh sinh thi t: Nghi n, c t nh b nh ph m, dàn tiêu b n.
- B nh ph m t môi tr

ng nuôi c y l ng, nh 1 - 2 gi t lên lam kính, dàn tiêu b n.

- B nh ph m t khu n l c (khóm): Pha huy n d ch vi khu n, dàn tiêu b n.
a. C đ nh tiêu b n
-

tiêu b n khô t nhiên trong t ATSH ho c làm khô

60C.

- C đ nh tiêu b n:
+

lam kính lên máy s y lam

60C đ n khi tiêu b n khô.


+ C đ nh b ng nhi t:
+

a tiêu b n ngang qua ng n l a đèn c n 2 - 3 l n, m i l n 5 - 10 giây.

tiêu b n ngu i

+ C đ nh b ng hóa ch t: Nh methanol ph kín n i dàn tiêu b n, đ khô trong 1 phút, không h l a.
b. Ph thu c nhu m
- Ph

ng pháp Hucker c i ti n:

+ Nh dung d ch tím Gentian, ph kín n i dàn đ phi n, duy trì 1 phút.
tiêu b n d

i vòi n

dung d ch tím gentian, r a

c ch y nh .

+ Nh dung d ch lugol, duy trì 30 giây.

dung d ch lugol, r a tiêu b n d

i vòi n

c ch y nh .

+ T y màu: Nh c n 90 lên tiêu b n, nghiêng đi nghiêng l i đ cho c n ch y t c nh n sang c nh
kia, khi màu tím trên lam kính v a phai h t thì r a n

c ngay, lo i b h t c n d

i vòi n

c ch y nh .

+ Nh dung d ch đ fuchsin ho c safranin ho c carbon fuchsin lên tiêu b n, duy trì trong kho ng 30
giây đ n 1 phút.
- Ph

dung d ch, r a d

i vòi n

c ch y nh .

ng pháp Kopeloff c i ti n:

+ Nh dung d ch tím Gentian ph kín n i dàn đ phi n, sau đó thêm kho ng 5 gi t Na2CO3, nghiêng
đi nghiêng l i tiêu b n đ tr n dung d ch, duy trì 15 - 20 giây, có th đ đ n 2 phút.
+ Nh dung d ch I- t Kopeloff duy trì trong ít nh t 2 phút.
+ Nghiêng tiêu b n, t y màu tiêu b n b ng các hóa ch t t y màu, r a tiêu b n ngay l p t c d
n

i vòi

c ch y.

- Làm khô tiêu b n tr

c khi soi kính.

9. Di n gi i k t qu vƠ báo cáo
a. Quan sát tiêu b n

v t kính x10 và x40.

- ánh giá tiêu b n đư đ

c t y màu đúng ch a.

- Tùy theo m u b nh ph m mà màu n n c a tiêu b n ho c không màu ho c có màu Gram âm. N u có
m t c a BC N, BC N ph i b t màu Gram âm hoàn toàn.
- N u quan sát th y hình nh t bào, xác đ nh s l
trong 20 - 40 vi tr

ng. B qua các vi tr

trung bình cho các vi tr

ng trung bình t bào BC N và t bào bi u mô

ng không có t bào ho c vi khu n và không tính s l

ng

ng b qua.

b. Chuy n sang v t kính d u quan sát hình nh vi khu n và t bào
- V i lam nhu m tr c ti p t b nh ph m quan sát ít nh t 10 vi tr
vi tr

ng v i b nh ph m n

c ti u, 20 - 40

ng v i các b nh ph m khác.

- Quan sát hình th vi khu n

v t kính d u (x100).

+ Hình th : C u khu n, tr c khu n, xo n khu n, c u tr c khu n,...
+ Kích th

c: To/nh , đ ng đ u/đa hình thái,…

+ Tính ch t b t màu: Gram âm (b t màu đ ), Gram d
+ Cách s p x p:
+

ms l

ng (b t màu tím).

ng đ n l , x p thành t ng c p, x p thành chu i, x p thành t ng đám,…

ng và mô t các lo i t bào vi khu n sau:


+ Gram d

ng:

฀ C u khu n x p đôi (và chu i)
฀ C u khu n x p đám
฀ Tr c khu n l n
฀ Tr c khu n nh
฀ Tr c khu n chia nhánh
฀ Tr c kh n Coryneform
+ Gram âm:
฀ Song c u
฀ Tr c khu n
฀ Tr c khu n chia nhánh (ho c đa hình thái)
฀ Tr c kh n Coryneform Hình th trung gian: C u tr c khu n, ph y khu n
+ T bào n m n y ch i

+ S i gi
+ Bán đ nh l

*S l

ng đ

ng k t qu nhu m soi đ

c đánh giá d a trên b ng sau.

c đánh giá d a trên trung bình s l

ng t bào/vi khu n/n m trên t 20 - 40 vi tr

ng,

không áp d ng đ i v i tiêu b n nhu m t khu n l c (khóm).
10. L u Ủ (c nh báo)
- Tiêu b n không quá dày, không quá m ng.
- B t màu rõ ràng.
11. L u tr h s
- Ghi chép rõ ràng k t qu và các thông tin quy đ nh vào phi u tr l i k t qu và s k t qu xét nghi m
- L u tr các bi u m u phi u ki m tra ch t l

ng theo đúng quy đ nh c a khoa.


BÀI 3. K THU T NHU M XANH METHYLEN
1. M c đích Quy trình này h

ng d n nhu m tiêu b n b ng ph

ng pháp nhu m xanh Methylen đ

phát hi n hình th t bào, vi khu n.
2. Ph m vi áp d ng Quy trình này đ

c áp d ng

Khoa/Phòng/B ph n vi sinh c a các B nh vi n.

3. Trách nhi m
- Nhân viên th c hi n:

ưđ

c đào t o và có ch ng ch ho c ch ng nh n v chuyên ngành Vi sinh y

h c.
- Nhân viên nh n đ nh, giám sát và phê duy t k t qu : Có trình đ đ i h c ho c sau đ i h c v chuyên
ngành Vi sinh y h c.
4. Nguyên t c Thu c nhu m xanh Methylen là thu c nhu m cation, màng t bào mang đi n tích âm
nên khi cho thu c nhu m gây ra hi n t
là ph

ng b t màu do s k t h p c a hai lo i đi n tích trái d u.

ng pháp nhu m đ n gi n đ quan sát hình d ng c a t bào, vi khu n, đ

ây

c s d ng trong ph n

ng phình v , đ nh danh Corynebacterium diphtheriae
5.Trang thi t b , v t t
a. Trang thi t b
- T an toàn sinh h c (ATSH) c p 2
- Kính hi n vi quang h c.
- Máy ly tâm, Máy tr n, l c
- ng vô trùng có n p đ y.
- èn c n, que c y, lam kính, lá kính m ng, bút vi t kính, d u soi kính, gi y th m d u.
- Pipet Pasteur vô trùng.
b. Sinh ph m hóa ch t: thu c nhu m Xanh methylen.
6. Ki m tra ch t l

ng

- Các hóa ch t dùng đ nhu m soi ph i đ

c ki m tra theo quy trình ki m tra ch t l

ng, hóa ch t, l u

l i k t qu sau khi ki m tra.
- C n có ch ng chu n làm ch ng:
Escherichia coli ATCC® 25922: Màu xanh
Staphylococcus aureus ATCC® 25923: Màu xanh
Corynebacterium diphtheriae ATCC® 8028: T bào xu t hi n t ng đám, d i, có các h t nh trên n n
t bào ch t màu xanh

7. An toàn - Th c hi n thao tác v i m u b nh ph m trong t ATSH. - S d ng các thi t b b o h cá
nhân.
8. N i dung th c hi n
a. Nhu m đ n gi n
- Làm tiêu b n:


+ Chu n b lam kính s ch, không x

c v , nhúng vào dung d ch ethanol 95%.

+ S d ng k p g p lam kính, đ ráo c n, h lam kính trên ng n l a đèn c n.
+ Dán nhưn thông tin m u b nh ph m.
+ Dùng bút vi t kính khoanh tròn, đánh d u v trí ph t b nh ph m

m td

i lam kính.

+ Dàn tiêu b n theo hình xoáy trôn c ho c hình zích z c.
+

tiêu b n khô t nhiên trong t ATSH ho c làm khô

60C.

- C đ nh tiêu b n:
+

lam kính lên máy s y lam

+ C đ nh b ng nhi t:

60C đ n khi tiêu b n khô.

a tiêu b n ngang qua ng n l a đèn c n 2 - 3 l n, m i l n 5 - 10 giây.

tiêu

b n ngu i.
+ C đ nh b ng hóa ch t: Nh methanol ph kín n i dàn tiêu b n, đ khô trong 1 phút, không h l a.
- Ph thu c nhu m Xanh methylen duy trì 1 - 3 phút, r a d
- Làm khô tiêu b n tr

i vòi n

c ch y nh .

c khi soi kính.

- S d ng v t kính d u, quan sát hình th vi khu n.
b. Nhu m t bào
- Nh m t gi t b nh ph m lên lam kính.
- Nh 2 gi t thu c nhu m xanh methylen, tr n đ u.
-

t lamen lên v trí đư tr n b nh ph m và thu c nhu m.

-

tiêu b n trong 2 - 3 phút

- Quan sát

v t kính x10 và x40

9. Di n gi i k t qu vƠ báo cáo
- Quan sát hình th c a vi khu n, t bào.
- T bào vi khu n b t màu xanh trung tính trên n n xanh nh t.
- T bào b ch c u xanh sáng, có nhân màu xanh đ m.
tr

ms l

ng t bào, tính trung bình trên 1 vi

ng.

- V i C. diphtheriae xu t hi n t ng đám, d i, có các h t nh trên n n t bào ch t màu xanh đ m.
10. L u Ủ (c nh báo) Khi t bào, vi khu n C. diphtheria b t màu quá đ m không phân bi t đ
khác bi t gi a vi khu n và các thành ph n khác.

cs

ôi khi khó phân bi t Propionibacterium,

Actinomyces v i C. diphtheria.
11. L u tr h s
- Ghi chép rõ ràng k t qu và các thông tin quy đ nh vào phi u tr l i k t qu và s k t qu xét nghi m.
- L u tr các bi u m u phi u ki m tra ch t l

ng theo đúng quy đ nh c a khoa.


BÀI 4. K THU T C Y PHỂN VỐNG, C Y
1. M c đích Quy trình này h

M

ng d n cách c y phân vùng, c y đ m đ i v i vi khu n.

2. Ph m vi áp d ng Quy trình này đ

c áp d ng t i Khoa/Phòng/B ph n xét nghi m Vi sinh c a các

b nh vi n.
3. Trách nhi m
- Nhân viên th c hi n:

ưđ

c đào t o và có ch ng ch ho c ch ng nh n v chuyên ngành Vi sinh y

h c.
- Nhân viên nh n đ nh, giám sát và phê duy t k t qu : Có trình đ đ i h c ho c sau đ i h c v chuyên
ngành Vi sinh y h c.
4. Nguyên t c
- C y vi khu n là k thu t đ a b nh ph m ho c vi khu n vào môi tr
nh m m c đích t ng s l

ng nuôi c y đ chúng phát tri n

ng đ phân l p, xác đ nh tính ch t c a vi khu n.

- C y phân vùng là k thu t nuôi c y b nh ph m ho c h n h p các vi khu n nh m t o ra các khu n l c
(khóm) riêng r .
- C y đ m là k thu t nuôi c y nh m xác đ nh s l

ng vi khu n có kh n ng phát tri n t b nh ph m

ho c trong m t huy n d ch vi khu n.
5. Trang thi t b , v t t
a. Trang thi t b
- T an toàn sinh h c (ATSH) c p 2
- Máy ly tâm
- Máy tr n, l c
- ng vô trùng có n p đ y.
- èn c n, que c y
- Pipet Pasteur vô trùng.
b. Sinh ph m hóa ch t
-

a môi tr

ng nuôi c y

- Dung d ch n

c mu i sinh lỦ vô trùng 0,9%.

6. Ki m tra ch t l

ng

- Các lo i hóa ch t, môi tr
hành ki m tra ch t l

ng nuôi c y ph i còn h n s d ng và tr

ng đ đ m b o ch t l

- Các lo i d ng c , hóa ch t, môi tr
- Các môi tr

ng nuôi c y c n đ

c khi s d ng ph i đ

c ti n

ng.

ng nuôi c y ph i đ

c ki m tra đ đ m b o không b nhi m b n.

c ki m tra hàng tu n, m i lô m i l u l i k t qu sau khi ki m tra.

- Ki m tra trên các ch ng chu n ATCC.
7. An toàn

- Th c hi n thao tác v i m u b nh ph m trong t ATSH.


- S d ng các thi t b b o h cá nhân.
8. N i dung th c hi n
a. C y phân vùng
- Dán nhưn thông tin b nh ph m, ngày nuôi c y.
-

t que c y: C m que c y th ng đ ng, đ t đ u que c y

n a trên ng n l a đèn c n, khi đ u que c y

đ , c m ngang đ kh trùng ph n thân kim lo i, đ ngu i que c y.
- L y vi khu n vào môi tr

ng nuôi c y: Dùng que c y vô trùng l y b nh ph m ho c dùng pipet

Pasteur nh m t gi t b nh ph m vào ph n rìa c a đ a môi tr

ng nuôi c y dàn t o vùng có di n tích

kho ng 1 cm2 . N u l y b nh ph m b ng t m bông (que gòn), l n đ u t m bông (que gòn) lên môi
tr

ng t o vùng nguyên y di n tích kho ng 1cm2 .

- T o vùng th nh t: dùng que c y đư ti t trùng ria qua vùng nguyên y, t o thành vùng có di n tích
kho ng ¼ di n tích đ a th ch.
- T o vùng th 2:

t que c y đ ti t trùng, xoay đ a 90 ria đ t o vùng th 2.

vào m t đ u c a đ

ng ria cu i c a vùng ria th nh t. Di n tích vùng ria th 2 chi m kho ng 1/4 di n

tích đ a th ch, các đ

ng ria sau không đ

- T o vùng ria th 3:

ng ria đ u tiên c t

c phép ch m vào vùng ria th nh t n a.

t que c y đ ti t trùng, xoay đ a 90 ria t o vùng th 3, cách làm t

ng t nh

t o vùng th 2. Di n tích vùng th 3 b ng kho ng 1/4 di n tích đ a th ch.
- T o vùng ria th 4: Không c n đ t que c y, xoay đ a 90 ria t o vùng th 4, cách làm t

ng t nh

t o vùng th 2 và th 3. Di n tích vùng th 4 b ng kho ng 1/4 di n tích đ a th ch.
-

t kh trùng que c y.

- Cho vào t

m,

qua đêm.

Hình 1. K thu t c y phơn vùng trên đ a môi tr
Các đ

ng c y sát vào nhau càng t n d ng đ

ng

c di n tích th ch đ t o thu n l i cho các vi khu n m c

thành các khu n l c (khóm) riêng r .
b. C y đ m
- Pha huy n d ch ho c b nh ph m thành các n ng đ khác nhau 10-1 , 10-2 , … tr n đ u.
+ Dùng que c y.


+ Dùng que c y 1 µl ho c 10 µl đư ti t trùng l y b nh ph m: đ que c y th ng đ ng, ch nhúng đ u
que c y xu ng canh khu n, l y 1 ng b nh ph m ria m t đ

ng th ng

gi a đ a th ch t o đ

ng

nguyên y.
+ Không đ t que c y, ti p t c dàn đ u vi khu n ra toàn b đ a th ch, các đ

ng ria đi qua đ

ng

nguyên y.
+

t

m

đi u ki n thích h p.

Hình 2. K thu t c y đ m
- C y đ m b ng thanh g t và bàn xoay.
+ Nhúng thanh g t trong dung d ch ethanol 95%: ng p ph n cong và phía d

i c a ph n đ ng. H qua

ng n l a đèn c n đ kh trùng
+

t đ a th ch lên bàn xoay.

+ Dùng pipet ch nh th tích, hút m t l

ng b nh ph m ho c canh khu n nh vào trung tâm c a đ a

th ch.
+ B t nút bàn xoay.
+ Dùng thanh g t ch m nh vào đ a th ch, dàn đ u.
+ Kh trung thanh g t b ng cách nhúng vào c n 95% và h trên ng n l a đèn c n.
+ Cho vào t

m,

+

ng khu n l c (khóm) m c trên đ a th ch, tính s l

ms l

qua đêm.

(canh khu n).
9. Di n gi i k t qu vƠ báo cáo
- Mô t các d ng khu n l c (khóm) trên đ a nuôi c y:
+ Kích th

c:

฀ Nh : đ

ng kính khu n l c (khóm) nh h n 1mm

฀ Trung bình: đ

฀ To: đ

ng kính khu n l c (khóm) b ng 1mm

ng kính khu n l c (khóm) l n h n 1 mm.

+ Màu s c khu n l c (khóm)
+ Bi u hi n b m t: nh n, xù xì, l p lánh, h t…
+ Hình d ng khu n l c (khóm)

ng vi khu n có trong b nh ph m


+ M t đ khu n l c (khóm): đ c, m , trong su t
+ Tính ch t: nh y, m n, m …
- K t qu v s l

ng:

+ Tr k t qu v s l

ng + CFU/ ml v i b nh ph m n

c ti u, nh ng b nh ph m c y đ nh l

+ Tr CFU v i b nh ph m c y Catheter.
10. L u Ủ (c nh báo) C y phân vùng ph i t o đ

c khu n l c (khóm) riêng r .

11. L u tr h s
- Ghi chép rõ ràng k t qu và các thông tin quy đ nh vào phi u ti n trình nuôi c y vi khu n.
- L u tr các bi u m u phi u ki m tra ch t l

ng theo đúng quy trình l u tr h s .

ng.



BÀI 5. K THU T C Y VẨO MỌI TR

NG L NG,

NG TH CH NGHIểNG,

NG TH CH M M
1. M c đích
- Quy trình này mô t /h
- Môi tr

ng l ng đ

ng d n cách c y vi khu n vào môi tr

c dùng đ t ng s l

ng l ng, th ch m m, th ch nghiêng.

ng vi khu n, xác đ nh tính ch t sinh v t hóa h c c a vi

khu n.
- Th ch nghiêng có m t nghiêng, th

ng đ

c s d ng đ ki m tra đ thu n nh t c a m u vi khu n,

trong gi ch ng, xác đ nh tính ch t sinh v t hóa h c c a vi khu n.
- Th ch m m là môi tr

ng có t l th ch th p h n môi tr

ng đ c, nh ng ch a

tr ng thái l ng.

Dùng đ xác đ nh tính ch t di đ ng c a vi khu n, đôi khi c ng dùng đ gi ch ng trong m t th i gian
ng n.
2. Ph m vi áp d ng Quy trình này đ

c áp d ng

Khoa/Phòng/B ph n vi sinh c a các B nh vi n.

3. Trách nhi m
- Ng

i th c hi n: ư đ

c đào t o và có ch ng ch ho c ch ng nh n v chuyên ngành Vi sinh y h c.

- Ng

i nh n đ nh, giám sát và phê duy t k t qu : Có trình đ đ i h c ho c sau đ i h c v chuyên

ngành Vi sinh y h c.
- Quy trình này đ

c áp d ng t i khoa/phòng xét nghi m Vi sinh c a các b nh vi n

4. Nguyên t c: Không áp d ng
5. Trang thi t b , v t t
a. Trang thi t b
- T an toàn sinh h c (ATSH) c p 2
- Máy ly tâm
- Máy tr n, l c
- ng vô trùng có n p đ y.
- èn c n, que c y
- Pipet Pasteur vô trùng.
b. Sinh ph m hóa ch t: Các ng môi tr
6. Ki m tra ch t l

ng

- Các lo i hóa ch t, môi tr
hành ki m tra ch t l

ng nuôi c y ph i còn h n s d ng và tr

ng đ đ m b o ch t l

- Các lo i d ng c , hóa ch t, môi tr
- Các môi tr

ng đ nuôi c y, đ nh danh vi khu n.

ng nuôi c y c n đ

c khi s d ng ph i đ

c ti n

ng.

ng nuôi c y ph i đ

c ki m tra đ đ m b o không b nhi m b n.

c ki m tra hàng tu n, m i lô m i, l u l i k t qu sau khi ki m tra.

- Ki m tra trên các ch ng chu n ATCC.
7. An toàn
- Th c hi n thao tác v i m u b nh ph m trong t ATSH.
- S d ng các thi t b b o h cá nhân.


8. N i dung th c hi n
- Dán nhưn mư s b nh ph m, ngày nuôi c y trên các ng môi tr
t que c y: c m que c y th ng đ ng, đ t đ u que c y

-

ng.

n a trên ng n l a đèn c n, khi đ u que c y

đ , c m ngang ti t trùng ph n thân kim lo i, đ ngu i que c y.
- Dùng ngón tr và ngón cái c a tay thu n c m vào ng nghi m, đáy ng đ t vào hõm gi a 2 ngón tay
tr và cái c a tay kia. Trong quá trình thao tác, ng nghi m luôn c m

m t góc 45 so v i m t ph ng

ngang.
- M nút ng môi tr

ng: Dùng ngón cái và ngón tr c a tay còn l i c m que c y, ngón út k p vào

n m v a xoáy v a rút.
- C y vào môi tr

ng l ng:

+ Kh trùng que c y.
+ M n p ng môi tr
+
tr

ng l ng, h l a mi ng ng.

a que c y vào thành môi tr

nghiêng kho ng 45.

ng nuôi c y đ i di n v i môi tr

ng l ng.

+ Nghi n que c y vào thành ng cho vi khu n dính vào thành ng là đ
+ H l a mi ng ng, đ y n p và đ

ng nuôi c y m i vào khay.

t que c y

+ Ki m tra l i các n p ng đ m b o đ ch t (không quá ch t)
+

khu v c s có môi

ng khi d ng th ng ng (chú Ủ, trong quá trình đ a que c y, không ch m vào thành hay mi ng

ng). C ng có th đ a đ u que c y có vi khu n nhúng vào môi tr

+

ng l ng

t ng nuôi c y vào môi tr

ng thích h p

c.


C y vào môi tr

ng th ch m m:

+ Dùng que c y th ng không có vòng

đ u, đ t kh trùng que c y trên ng n l a đèn c n.

+ Ch m que c y vào m t khu n l c (khóm).
+ M nút ng nghi m, kh trùng mi ng ng trên ng n l a đèn c n.
+ C m đ u que c y vào chính gi a, sâu xu ng kho ng 1,5 - 2,5 cm so v i m t th ch.
+ Rút que c y ra sao cho đ

ng c y càng g n càng t t.

+ Kh trùng mi ng ng, đ y n p ng môi tr
+

t lên giá, cho vào t

- C y vào môi tr

ng.

m.

ng th ch nghiêng

+ Dùng que c y l y vi khu n, n u là huy n d ch thì l y m t vòng c y, n u là khu n l c (khóm) thì
ch m que c y lên ch ph ng nh t c a m t khu n l c (khóm).
+ M nút ng môi tr
+

ng, kh trùng mi ng ng.

t đ y que c y đư l y vi khu n vào ch th p nh t c a m t th ch, ria đi ria l i, v a ria v a đ a d n

que c y lên cao đ n h t m t th ch.
+ Kh khu n mi ng ng, đ y n p môi tr

ng, cho vào t

m

9. Di n gi i k t qu vƠ báo cáo: Không áp d ng
10. L u Ủ (c nh báo) Ch l y m t lo i khu n l c (khóm) thu n, b ng cách ch m ng vào đ u khu n l c
(khóm).
11. L u tr h s
- Ghi chép rõ ràng k t qu và các thông tin quy đ nh vào phi u ti n trình nuôi c y vi khu n.


- L u tr các bi u m u phi u ki m tra ch t l

ng theo đúng quy trình l u tr h s .

BÀI 6. TH
1. M c đích Quy trình này mô t /h

NGH M CATALASE

ng d n th c hi n th nghi m phát hi n tính ch t sinh catalase c a

vi khu n.
2. Ph m vi áp d ng Quy trình này đ

c áp d ng

Khoa/Phòng/B ph n vi sinh c a các B nh vi n.

3. Trách nhi m
- Nhân viên th c hi n:

ưđ

c đào t o và có ch ng ch ho c ch ng nh n v chuyên ngành Vi sinh y

h c.
- Nhân viên nh n đ nh, giám sát và phê duy t k t qu : Có trình đ đ i h c ho c sau đ i h c v chuyên
ngành Vi sinh y h c.
4. Nguyên t c Vi khu n sinh enzym catalase đ th y phân H2O2 thành H2O và O2, t o ra b t khí. Xét
nghi m này đ

c dùng đ phân tích đ c đi m ban đ u c a h u h t các vi khu n.

5. Trang thi t b , v t t
a. Trang thi t b
- T an toàn sinh h c (ATSH) c p 2
- Kính hi n vi quang h c.
- Máy ly tâm
- Máy tr n, l c
- ng vô trùng có n p đ y.
- èn c n, que c y, lam kính, lá kính m ng đ y (coverslip) bút vi t kính, d u soi kính, gi y th m d u.
- Pipet Pasteur vô trùng.
b. Sinh ph m hóa ch t
- H2O2 30% đ i v i Neisseria
- H2O2 15% đ i v i vi khu n k khí
- H2O2 3% đ i v i các vi khu n khác (mua ho c pha loưng dung d ch 30% t l 1:10 b ng n
ion tr

c kh

c khi s d ng)

6. Ki m tra ch t l
- Các hóa ch t đ

ng
c ki m tra theo Quy trình ki m tra ch t l

sau khi ki m tra.
- Ch ng:
+ Ch ng D

ng: Staphylococcus aureus ATCC 25923

+ Ch ng Âm: Streptococcus pyogenes ATCC 19615
7. An toàn
- Th c hi n thao tác v i m u b nh ph m trong t ATSH.
- S d ng các thi t b b o h cá nhân.
8. N i dung th c hi n
- Kh i đ ng t ATSH ít nh t 15 phút tr

c khi th c hi n.

ng sinh ph m, hóa ch t, l u l i k t qu


- S p x p các d ng c c n thi t vào t ATSH.
- Ch n m t khu n l c (khóm) tách bi t rõ, đư đ

c 18-24 gi , chuy n sang lam kính s ch.

- Nh 1 gi t thu c th H2O2 lên lam kính và quan sát trên n n t i ngay l p t c hi n t

ng s i b t.

- B lam kính vào thùng ch a v t s c nh n.
9. Di n gi i k t qu vƠ báo cáo
- Test d

ng tính khi có s i b t ngay l p t c.

- Ph n ng y u n u ch có 1-2 bóng khí.
- Ph n ng âm tính khi không có bóng khí ho c ch có m t ít bóng khí sau 20 giây.

10. L u Ủ (c nh báo)
- H ng c u c ng có catalase.

tránh d

ng tính gi , khi l y khu n l c (khóm) trên th ch máu tránh

l y c th ch.
- Không làm test t ch ng c y trên th ch Mueller-Hinton.
- L y khu n l c (khóm) b ng que g ho c nh a.
- Không làm test v i các khu n l c (khóm) đư quá 24 gi vì có th gây âm tính gi .
- Không làm ng

c l i trình t vì có th gây âm tính gi .

- Không tr n thu c th và khu n l c (khóm) lên.
- M t s ch ng S. aureus có th có catalase âm tính theo ph

ng pháp này. Xem test aminolevulinic

acid (ALA) đ xét nghi m thêm v i các ch ng nghi ng này
-

xác đ nh không có catalase đ i v i Gardenerella vaginallis, Reimer và Reller khuy n cáo ria trên

th ch chocolate nh làm kháng sinh đ và c y thêm m t ch m nh ch ng Streptococci viridans
(Streptococcus sanguis ATCC 35557). Vùng c ch xung quanh ch m S. viridans s kh ng đ nh là
không có catalase.
12. L u tr h s
- Ghi chép rõ ràng k t qu và các thông tin quy đ nh vào phi u tr l i k t qu và s k t qu xét nghi m

- L u tr các bi u m u phi u ki m tra ch t l

ng theo đúng quy đ nh c a khoa.


BÀI 7. TH
1. M c đích Quy trình này mô t /h

NGHI M S

D NG CITRAT

ng d n th c hi n th nghi m phát hi n s d ng citrat c a vi

khu n.
2. Ph m vi áp d ng Quy trình này đ

c áp d ng

Khoa/Phòng/B ph n vi sinh c a các B nh vi n.

3. Trách nhi m
- Nhân viên th c hi n:

ưđ

c đào t o và có ch ng ch ho c ch ng nh n v chuyên ngành Vi sinh y

h c.
- Nhân viên nh n đ nh, giám sát và phê duy t k t qu : Có trình đ đ i h c ho c sau đ i h c v chuyên

ngành Vi sinh y h c.
4. Nguyên t c Th ch citrate đ
c a vi khu n. Môi t

c s d ng đ ki m tra kh n ng s d ng citrate là ngu n n ng l

ng

ng có ch a citrate là ngu n các-bon duy nh t, mu i ammonium là ngu n ni-t

chính. N u có vi khu n phát tri n ch ng t có s d ng citrate. Khi vi khu n chuy n hóa citrate, mu i
ammonium s b giáng hóa thành ammoniac làm ki m hóa môi tr
trong môi tr

ng s chuy n t màu xanh lá cây sang màu xanh n

ng. Ch t ch th xanh bromthymol
c bi n khi pH trong môi tr

ng trên

7,6.
5. Trang thi t b , v t t
a. Trang thi t b
- T an toàn sinh h c (ATSH) c p 2
- Kính hi n vi quang h c.
- Máy ly tâm
- Máy tr n, l c
- ng vô trùng có n p đ y.
- èn c n, que c y, lam kính, lá kính m ng (coverslip) bút vi t kính, d u soi kính, gi y th m d u.

- Pipet Pasteur vô trùng.
b. Sinh ph m hóa ch t
- Th ch nghiêng ch a citrate, mu i ammonium, đ m, xanh bromthymol.
-N

c mu i sinh lỦ 0,9%.

6. Ki m tra ch t l
- Các hóa ch t đ

ng
c ki m tra theo Quy trình ki m tra ch t l

sau khi ki m tra.
- Ch ng:
+ Ch ng Âm: Escherichia coli ATCC 25922
+ Ch ng D

ng: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

7. An toàn
- Th c hi n thao tác v i m u b nh ph m trong t ATSH.
- S d ng các thi t b b o h cá nhân.

ng sinh ph m, hóa ch t, l u l i k t qu


8. N i dung th c hi n
- Dùng que c y l y m t khu n l c (khóm) riêng r (l y ph n ph ng nh t c a khu n l c (khóm)).
-

t mi ng ng th ch, ria c y lên b m t th ch nghiêng, đ y n p ng.
trong môi tr

ng hi u khí 35 - 37C t i đa trong 4 ngày.

9. Di n gi i k t qu vƠ báo cáo
-D
n

ng tính: có khi vi khu n phát tri n và làm đ i màu môi tr

ng t màu xanh lá cây sang xanh

c bi n trên b m t th ch nghiêng.

- Âm tính: không có vi khu n m c và môi tr

ng v n gi nguyên màu xanh lá cây.

10. L u Ủ (c nh báo)
- N u th nghi m cho k t qu không rõ ràng c n làm l i.
- Vi khu n phát tri n m nh trên th ch nh ng không làm đ i màu môi tr
d

ng tính, c n

ng có th là th nghi m

thêm ho c làm l i th nghi m v i ít khu n l c (khóm) h n.

- Không c y vi khu n vào ph n đ ng c a th ch.
- Không th nghi m b ng vi khu n t môi tr

ng l ng.

11. L u tr h s
- Ghi chép rõ ràng k t qu và các thông tin quy đ nh vào phi u tr l i k t qu và s k t qu xét nghi m.
- L u tr các bi u m u phi u ki m tra ch t l

ng theo đúng quy đ nh c a khoa.


BÀI 8. K THU T C Y CHUY N VI KHU N
1. M c đích Mô t k thu t c y chuy n vi khu n t môi tr
2. Ph m vi áp d ng Quy trình này đ

c áp d ng

ng này sang môi tr

ng khác.

Khoa/Phòng/B ph n vi sinh c a các B nh vi n.

3. Trách nhi m
- Ng

i th c hi n: Nhân viên xét nghi m đư đ

c đào t o và có ch ng ch ho c ch ng nh n v chuyên

ngành Vi sinh y h c.
- Ng

i nh n đ nh, giám sát và phê duy t k t qu : Nhân viên xét nghi m có trình đ đ i h c ho c sau

đ i h c v chuyên ngành Vi sinh y h c.
4. Nguyên t c
- C y chuy n ch ng vi khu n là k thu t vô trùng, chuy n vi sinh v t t môi tr
sang môi tr

ng đang nuôi c y

ng m i v i nhi u m c đích khác nhau: l y khu n l c (khóm) riêng r , gi ch ng, l u

ch ng,…đ l u gi ch ng, tùy lo i vi khu n c n c y chuy n đ nh k sau nh ng kho ng th i gian khác
nhau.
- Có 4 hình th c chính đ i v i c y chuy n:
+ C y chuy n t môi tr

ng đ c sang môi tr

ng đ c

+ C y chuy n t môi tr

ng đ c sang môi tr

ng l ng

+ C y chuy n t môi tr

ng l ng sang môi tr

ng đ c

+ C y chuy n t môi tr

ng l ng sang môi tr

ng l ng.

5. Trang thi t b , v t t
a. Trang thi t b
- T an toàn sinh h c (ATSH) c p 2
- Kính hi n vi quang h c.
- Máy ly tâm
- Máy tr n, l c
- ng vô trùng có n p đ y.
- èn c n, que c y, lam kính, lamen, bút vi t kính, d u soi kính, gi y th m d u.
- Pipet Pasteur vô trùng.
b. Sinh ph m hóa ch t Các môi tr
6. Ki m tra ch t l

ng nuôi c y c n thi t.

ng Các hóa ch t đ

c ki m tra theo Quy trình ki m tra ch t l

hóa ch t, l u l i k t qu sau khi ki m tra.
7. An toàn
- Th c hi n thao tác v i m u b nh ph m trong t ATSH.
- S d ng các thi t b b o h cá nhân.
8. N i dung th c hi n
a. Chu n b
- M c áo b o h , đ i m , đeo kh u trang, que c y tay

ng sinh ph m,


- Chu n b t s ch, que c y, đèn c n, đ a nguyên y, ng, đ a môi tr

ng m i.

- Ghi các thông tin sau lên đ a ho c ng nuôi c y m i: Mư b nh ph m, ngày c y, tên ch ng vi khu n.
b. C y chuy n
- L y khu n l c (khóm):
+ V i khu n l c (khóm) trên đ a th ch: Dùng tay trái m đ a nuôi c y m t kho ng đ đ thao tác, dùng
que c y ch m vào chóp 1 khu n l c (khóm) m c riêng r , rút que c y ra, đ y n p đ a l i, gi que c y
b ng tay ph i.
+ V i khu n l c (khóm) trên ng th ch nghiêng: M n p ng, h mi ng ng g n ng n l a đèn c n,
dùng que c y l y vi khu n m c trên b m t th ch nghiêng, đ y n p ng, gi que c y b ng tay ph i.
- C y chuy n t đ a th ch ho c ng th ch nghiêng sang đ a th ch m i (dùng k thu t c y phân vùng).

- L y đ a môi tr

ng m i (đ a c y chuy n), m m t kho ng v a đ đ thao tác, gi que c y song song

v i m t th ch, ria vùng 1 (3-5 đ

ng).

t que c y và đ ngu i t nhiên (Xem hình minh h a).

- M đ a c y chuy n, ria vùng 2 t vùng 1, ria kho ng 3-5 đ

ng.

t que c y và đ ngu i t nhiên.

- M đ a c y chuy n, ria vùng 3 t vùng 2, ria kho ng 3-5 đ

ng.

t que c y và đ ngu i t nhiên.

- M đ a c y chuy n, ria vùng 4 t vùng 3, ria kho ng 3-5 đ

ng, tránh ch m vào vùng 1.

-

y đ a c y chuy n, đ t que c y và đ đ a vào t

Chú ý: Ng

m trong đi u ki n phù h p.

i ta c ng có th c y trên đ a th ch m i thành các vùng nh đ t ng sinh, ho c c y đ m

trên đ a th ch m i tùy vào m c đích.


- C y chuy n t đ a th ch ho c ng th ch nghiêng sang ng th ch m i:
+ M n p ng th ch nghiêng, h mi ng ng g n ng n l a đèn c n.
+

a que c y c y vào ch th p nh t c a m t th ch, ria trên m t th ch nghiêng, v a ria v a đ a d n

que c y c y lên cao đ n h t m t th ch. Có hai cách c y trên th ch th

ng: ch c y trên m t th ch

nghiêng và c y c ph n đ ng và ph n nghiêng
+ Rút que c y ra, h mi ng ng g n ng n l a đèn c n, đ y n p.

- C y chuy n t môi tr

ng đ c sang môi tr

ng l ng.

+ L y khu n l c (khóm).
+ M n p ng môi tr
+
tr

ng nuôi c y m i, h l a mi ng ng.

a que c y c y vào thành môi tr

nghiêng kho ng 450 .

ng nuôi c y đ i di n v i môi tr

ng l ng.

+ Nghi n que c y vào thành ng cho vi khu n dính vào thành ng là đ
+ H l a mi ng ng, đ y n p và đ

ng nuôi c y m i vào khay.

t que c y.

+ Ki m tra l i các n p ng đ m b o đ ch t (không quá ch t).
+

khu v c s có môi

ng khi d ng th ng ng (chú Ủ, trong quá trình đ a que c y, không ch m vào thành hay mi ng

ng). C ng có th đ a đ u que c y có vi khu n nhúng vào môi tr

+

ng l ng

t ng nuôi c y vào môi tr

ng thích h p.

c.