PHÂN TÍCH kết QUẢ điện DI HEMOGLOBIN(Phân tích thành phần hb)

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
ĐIỆN DI HEMOGLOBIN
(Phân tích thành phần Hb)

GV: Lê Thị Hoàng Mỹ

1


MỤC TIÊU

1.
2.
3.
4.

Nêu nguyên lý kỹ thuật điện di.
Nêu chỉ định làm điện di hemoglobin.
Nêu các bước đọc kết quả điện di.
Phân tích được kết quả điện di hemoglobin.

2


ĐIỆN DI

•

Định nghĩa

–

•

Điện di là sự di chuyển của các phân tử tích điện trong một môi trường điện.

Các yếu tố ảnh hưởng

–

Tốc độ di chuyển của các phân tử phụ thuộc vào:

•
•
•
•
•
•

•

điện tích,
kích thước và hình dạng của phân tử,
pH của dung dich đệm,
đặc điểm của môi trường hỗ trợ,
khung thời gian cho phương pháp tiến hành
và nhiệt độ của hệ thống hoạt động.

Ứng dụng: điện di hemoglobin, điện di protein huyết thanh.

3

NGUYÊN LÝ

•

Phương pháp điện di

– phương pháp lý hóa
– dùng dòng điện một chiều làm di chuyển các phân tử mang điện.

•

Mục đích của phương pháp

– dựa trên sự tích điện của các phân tử, và tốc độ di chuyển khác nhau để tách
các thành phần mong muốn.
→ định tính và định lượng.

4


Thiết bị và thuốc thử

•

Nguồn điện

•

Bể chứa (môi trường đệm, môi

Electrophoresis tank

Cathode

trường hỗ trợ)

•

Thiết bị phát hiện và định lượng

Paper support
medium

Trong một hệ thống điện di, các phân tử tích điện di chuyển qua một môi trường hỗ trợ nhờ các lực
được phát ra từ môi trường điện.

5


Nguyên lý phân tách

• Theo điện tích
• Theo kích thước

6


(1) Theo điện tích

•

Khi những phân tử tích điện được đặt
trong môi trường điện, chúng di
chuyển về hai phía cả cực dương và
cực âm theo điện tích của chúng.

7


(2) Theo kích thước phân tử

8


(1) Normal (2) New born (3) Hb C trait [A-C] (4) Hb SC disease [S-C] (5) Sickle cell disease [S-S], (6) Sickle cell trait [A – S] (7) New born (8)
Normal.

9


•

Điện di hemoglobin có thể thực hiện

trên:

– Giấy lọc
– Màng cellulose acetate

– Gel tinh bột
– Gel citrate agar
– Gel agarose

10


Một số kỹ thuật điện di Hemoglobin

Alkaline (Cellulose Acetate) ở pH 8,6
Acid (Citrate agar) ở pH 6,2

11


Các kỹ thuật điện di Hemoglobin

Alkaline (Cellulose Acetate) ở pH 8,6


Điện di Hb với gel cellulose acetate ở pH kiềm: pp sàng lọc đầu tiên được sử dụng để phát hiện các Hb bất thường.



Những chuỗi globin bất thường sẽ khác nhau về số lượng, kiểu và trật tự các acid amin: điều này làm cho Hb có đặc tính
riêng. Tỷ lệ Hb chiếm nhiều nhất ở người là HbA.



Tất cả các phân tử Hb tích điện âm và di chuyển về phía cực dương tỷ lệ với điện tích âm của chúng.



Ở pH kiềm HbC, E, A2 và O di chuyển cùng nhau để hình thành 1 băng đơn giản, HbS, D và G cũng cùng di chuyển.

12


Các kỹ thuật điện di Hemoglobin

Acid (Citrate agar) ở pH 6,2
 Các phân tử Hb tách ra dựa trên sự khác biệt về điện tích và khả năng gắn kết với agar.
 Thường được sử dụng để phân biệt các Hb bất thường cùng di chuyển với nhau trên gel cellulose. (Vd
HbS với HbD và HbG, HbC với HbE).

 Ở pH acid HbC tách ra trừ E và O; và HbS tách từ D và G.

13


CHỈ ĐỊNH

•
•
•

Đánh giá những trường hợp thiếu máu tán huyết không giải thích được.
Thiếu máu HC nhỏ không liên quan đến giảm sắt, bệnh lý mạn tính, hoặc ngộ độc chì.
Một phết máu ngoại biên với những đặc điểm hồn cầu bất thường (như HC hình bia, hoặc
HC hình liềm, HC kiềm, đa sắc...)

•
•
•

Tiền sử gia đình có bệnh lý hemoglobin.
Kết quả sàng lọc trước sinh dương tính
Kết quả một số test sàng lọc HC liềm, bệnh HbH, HbE... dương tính.


BN

RBC

HGB

HCT

MCV

MCH

MCHC

RDW

Ferritin

Đột biến gen

1

4.95

10.0

32.4

65.5

20.2

30.9

12.9

35

Beta - thal

2

5.1

9.5

32.9

64.5

18.6

28.9

14.4

110

Beta - thal

3

6.68

13.5

46.3

69.3

20.2

29.2

13

67

Beta - thal

4

6.45

11.8

38.1

59.1

18.3

31

13.8

89

Beta - thal

5

5.76

10.1

34

59

17.5

29.7

14.4

210

Beta - thal

6

5.58

11.0

34.3

61.6

19.7

32

12.9

40

Beta - thal

7

5.73

11.0

36.3

63.4

19.2

30.3

13.7

190

Beta - thal

8

4.32

10.7

36.2

83.8

24.8

29.6

13.5

105

Beta - thal

9

6.65

14.4

40.8

61.4

21.7

35.3

12

72

Beta - thal

10

6.41

10.9

39.4

61.5

17

27.7

13.6

38

Beta - thal

11

4.93

9.4

31.5

63.9

19.1

29.8

13

125

Beta - thal


BN

RBC

HGB

HCT

MCV

MCH

MCHC

RDW

1

5.23

13.2

39.3

75.1

25.2

33.6

12.8

2

5.05

11.6

34.1

67.5

23

34

12.5

3

5.21

13.7

42.9

82.3

26.3

31.9

10.7

4

4.72

13.2

39.6

83.9

28

33.3

10.2

5

5.35

15.2

44.8

83.7

28.4

33.9

11.2

6

5.14

13.0

41.1

80

25.3

31.5

12


Đột biến gen

BN

RBC

HGB

HCT

MCV

MCH

MCHC

RDW

Điện di Hb

1

5.23

13.2

39.3

75.1

25.2

33.6

12.8

BT

Alpha-thal

2

5.05

11.6

34.1

67.5

23

34

12.5

BT

Alpha-thal

3

5.21

13.7

42.9

82.3

26.3

31.9

10.7

BT

Alpha-thal

4

4.72

13.2

39.6

83.9

28

33.3

10.2

BT

Alpha-thal

5

5.35

15.2

44.8

83.7

28.4

33.9

11.2

BT

Alpha-thal

6

5.14

13.0

41.1

80

25.3

31.5

12

BT

Alpha-thal


Bất lợi của kỹ thuật điện di

•
•

Tốn công
Không chính xác trong

– định lượng Hb bất thường với nồng độ thấp (HbA2)
– phát hiện các Hb bất thường di chuyển nhanh (HbH, Hb Barts)

•

Tính chính xác đối với HbA2 kém hơn so với HPLC (Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu
năng cao) và một số KT khác.

18


CHỈ ĐỊNH

•
•
•

Đánh giá những trường hợp thiếu máu tán huyết không giải thích được.
Thiếu máu HC nhỏ không liên quan đến giảm sắt, bệnh lý mạn tính, hoặc ngộ độc chì.
Một phết máu ngoại biên với những đặc điểm hồn cầu bất thường (như HC hình bia, hoặc
HC hình liềm, HC kiềm, đa sắc...)

•
•
•

Tiền sử gia đình có bệnh lý hemoglobin.

Kết quả sàng lọc trước sinh dương tính
Kết quả một số test sàng lọc HC liềm, bệnh HbH, HbE... dương tính.


MỘT SỐ KỸ THUẬT

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HEMOGLOBIN

•
•
•

IEF - Isoelectric Focusing: tập trung đẳng điện
HPLC – High Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Capillary electrophoresis (CE) - Điện di mao quản

20


ƯU ĐIỂM CỦA CE

•
•
•
•
•
•

Hoàn toàn tự động hóa
Thể tích mẫu tối thiểu

Dễ dàng giải thích: vì đường biểu diễn kết quả không bị ảnh hưởng bởi các đỉnh ngoại lai
Định lượng chính xác HbA2, HbF và HbS.
Tách HbE khỏi tỷ lệ HbA2 để dễ dàng xác định và định lượng
Định lượng HbH và Hb Barts rõ ràng, được thấy trong alpha thalassemia

21


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

22


Các chuỗi globin bình thường ở thời kỳ sau sinh
Chuỗi alpha

Chuỗi non-alpha

β

γ

δ

23


Bệnh lý thalassemia

Thiếu hụt 1 hay nhiều chuỗi globin

Giảm số lượng chuỗi globin bệnh

Mất cân bằng
chuỗi alpha
và
chuỗi non - alpha

24


Alpha - thalassemia

HbF

Hb Bart’s

α

γ

γ

γ

γ

γ

γ

Thời kỳ bào thai

α

HbA

HbH

α
β

β

β

β

β

β

Thời kỳ sau sinh

α

25