nguyên nhân cơ bản gây nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh

I. LỜI MỞ ĐẦU
1. Tình trạng:
- Vấn đề nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm thủy sản trong những năm gần
đây được Ngành Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đặc biệt quan tâm chỉ đạo, hướng dẫn
biện pháp khắc phục, nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đáp ứng yêu cầu của thị
trường xuất khẩu.
- Dư lượng hóa chất, kháng sinh trong thủy sản: Là tình trạng hóa chất, kháng sinh còn chứa
trong sản phẩm thủy sản ở dạng nguyên chất hoặc đã chuyển hóa, là một trong những nguyên
nhân gây mất an toàn thực phẩm, gây tác hại đối với sức khỏe của người sử dụng.
Hiện nay, nuôi trồng thủy sản của tỉnh Bạc Liêu có những bước phát triển nhảy vọt, được
đánh giá là ngành mũi nhọn trong chiến lược phát triển kinh tế của tỉnh, nhất là mô hình nuôi
tôm thâm canh, bán thâm canh, đối tượng chủ lực là tôm sú và tôm thẻ chân trắng được xuất
khẩu vào các thị trường lớn như: Thị trường EU, Nhật, Mỹ, v, v, ...
Tuy nhiên trong những năm gần đây, do việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong quá trình
phòng ngừa và điều trị bệnh đã gây ra dư lượng kháng sinh trong tôm nuôi, bị nhiều thị
trường nhập khẩu cảnh báo. Chẳng hạn, thị trường Braxin mới có văn bản dỡ bỏ lệnh tạm
ngừng cấp phép nhập khẩu thủy sản từ Việt Nam vào tháng 3 năm 2015; thị trường Nhật Bản
đã tiến hành kiểm tra chỉ tiêu Oxytetraxycline đối với 100% số lô tôm nhập khẩu từ Việt
Nam và không ít lô hàng bị trả về và thị trường EU đã có văn bản gửi Cục Quản lý Chất
lượng Nông Lâm sản và Thủy sản nêu tên 24 doanh nghiệp chế biến thủy sản của Việt Nam
có lô hàng bị phát hiện vi phạm trong năm 2015, đồng thời cảnh báo sẽ đình chỉ nhập khẩu,
nếu chất lượng tôm không được cải thiện, nhằm để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Châu
Âu.
Riêng đối với tỉnh Bạc Liêu, định kỳ hàng tháng Chi cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản
và Thủy sản có kế hoạch lấy mấu ngẫu nhiên để kiểm tra sự tồn lưu dư lượng hóa chất, kháng
sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng trong sản phẩm thủy sản nuôi, để kịp thời cảnh báo,
hướng dẫn biện pháp khắc phục.
Năm 2014, thu 197 mẫu, năm 2015 thu 201 mẫu và 06 tháng đầu năm 2016 thu 45 mẫu tôm.
Mẫu tôm sau khi thu được mã hóa và gửi đến Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản
vùng 5 để kiểm tra phân tích. Kết quả phân tích: Phát hiện 01 mẫu tôm bị nhiễm dư lượng
kháng sinh vượt mức giới hạn cho phép vào năm 2014. Chi cục Quản lý Chất lượng Nông

Lâm sản và Thủy sản đã phối hợp với Chi cục Nuôi trồng thủy sản tiến hành truy xuất nguồn
gốc, xác định nguyên nhân gây nhiễm kháng sinh, đề xuất biện pháp khắc phục và báo kết
quả về Cơ quan Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thủy sản Nam bộ theo quy định.
2. Một số nguyên nhân cơ bản gây nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh:
- Một là, do một số bộ phận nhỏ người dân chưa nắm được danh mục hóa chất, kháng sinh
cấm sử dụng, hạn chế sử dụng hoặc vì lợi nhuận kinh tế đã lạm dụng hóa chất, kháng sinh
trong phòng chống dịch bệnh trong nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh và không tuân thủ
thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch tôm.


- Hai là, do một số ít cơ sở còn sử dụng Urê, Hàn the để bảo quản nguyên liệu thủy sản khai
thác nhằm giữ độ tươi; sử dụng Trichlorfon diệt ruồi, muỗi, côn trùng dùng để bảo quản sản
phẩm khô.
- Ba là, do một số cơ sở thu mua, sơ chế, chế biến thực hiện chưa tốt hệ thống quản lý chất
lượng, chưa kiểm soát các mối nguy tới hạn tại các công đoạn sản xuất, kiểm soát chưa đầy
đủ các loại hóa chất, kháng sinh trong khâu tiếp nhận nguyên liệu hoặc vô ý gây nhiễm trong
quá trình sơ chế, chế biến do công nhân sử dụng thuốc bôi da.
3. Một số tác hại của dư lượng hóa chất, kháng sinh:
- Một là, Tác hại đối với môi trường nuôi trồng thủy sản: Do một số người dân còn lạm dụng
hóa chất trong xử lý nước, cải tạo ao nuôi đã tiêu diệt cả vi khuẩn có hại và vi khuẩn có lợi,
gây mất cân bằng hệ sinh thái trong môi trường nuôi; sử dụng kháng sinh không đúng cách
trong nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh, tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, gây
nên hiện tượng lờn thuốc, khi tôm có bệnh xảy ra sẽ rất khó điều trị.
- Hai là, Tác hại đối với người tiêu dùng: Khi người tiêu dùng ăn phải sản phẩm thủy sản gây
ảnh hưởng đến sức khỏe, gây ngộ độc, suy tủy, suy gan, suy thận, nếu tích tụ lâu ngày có thể
dẫn đến ung thư, đột biến gen.
- Ba là, Tác hại đối với quá trình xuất khẩu: Nếu các thị trường trên thế giới không nhập khẩu
tôm nuôi của Việt Nam do nhiễm dư lượng kháng sinh, khi đó thị trường trong nước sẽ
không thể tiêu thụ hết sản phẩm tôm nuôi trong dân, dẫn đến giá thành tôm nguyên liệu giảm
mạnh, ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế của nước ta, đặc biệt đối với lĩnh vực thủy

sản.
4. Biện pháp khắc phục và phòng ngừa:
Để kịp thời khắc phục tình trạng nhiễm dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản nuôi
như khuyến cáo của các thị trường nhập khẩu hiện nay, góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu
dùng và đáp ứng yêu cầu của các thị trường trong thời kỳ hội nhập quốc tế. Trong thời gian
tới, cần thực hiện tốt một số giải pháp sau:
* Đối với Cơ quan nhà nước.
Một là, Trong thời gian tới, các cơ quan quản lý chuyên ngành, chính quyền địa phương và
các tổ chức đoàn thể có liên quan: Cần tăng cường hơn nữa công tác tuyên truyền sâu, rộng
trong nhân dân đối với các văn bản quy phạm pháp luật có liên quan về an toàn thực phẩm
bằng nhiều hình thức và phương pháp phù hợp, dễ tiếp thu, để mọi người hiểu rõ hơn và thực
hiện đảm bảo theo quy định hiện hành.
Hai là, Tổ chức tuyên truyền về tác hại của việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng,
hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, trong sản xuất, kinh doanh thủy sản.
Ba là, Hướng dẫn cơ sở nuôi trồng thủy sản, thu mua, bảo quản, sơ chế, chế biến nguyên liệu
thủy sản áp dụng chương trình quản lý chất lượng, áp dụng quy trình sản xuất tốt, sản xuất
theo hướng bền vững.


Bốn là, Tăng cường công tác thanh tra, kiểm tra và xử lý nghiêm đối với những hành vi vi
phạm pháp luật về việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong sản xuất, kinh doanh nuôi trồng,
bảo quản, sơ chế và chế biến thủy sản, góp phần khắc phục tình trạng gây nhiễm dư lượng
hóa chất, kháng sinh như các thị trường cảnh báo hiện nay.
Năm là, Đẩy mạnh nghiên cứu khoa học - kỹ thuật và công nghệ, sớm chuyển giao những mô
hình nuôi tôm hiệu quả, đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm, để tuyên truyền, hướng dẫn
và nhân rộng mô hình nuôi trồng thủy sản trong nhân dân, góp phần thúc đẩy kinh tế phát
triển, phát huy thế mạnh và tiềm năng của tỉnh.
* Đối với tổ chức cá nhân tham gia sản xuất, kinh doanh.
- Một là, Nâng cao hơn nữa ý thức, trách nhiệm đối với hoạt động nuôi tôm thâm canh, bán
thâm canh, hoạt động bảo quản sản phẩm khai thác và sơ chế, chế biến nguyên liệu thủy sản.

- Hai là, Trong quá trình sản xuất, kinh doanh, cần ghi chép và lưu trữ đầy đủ thông tin có
liên quan về sử dụng thuốc, hóa chất, nhằm để phục vụ cho công tác truy xuất nguồn gốc đối
với những sản phẩm không đảm bảo chất lượng, an toàn thực phẩm.
- Ba là, Tuyệt đối không sử dụng hóa chất, kháng sinh cấm hoặc hóa chất, kháng sinh không
rõ nhãn mác, nguồn gốc xuất xứ.
- Bốn là, Phối hợp tốt với cơ quan quản lý chuyên ngành đối với việc thu mẫu phân tích kiểm
soát dư lượng, để kịp thời phát hiện và khắc phục các mối nguy về dư lượng hóa chất, kháng
sinh; tạo nên sản phẩm sạch, chất lượng, an toàn, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đáp
ứng yêu cầu của thị trường xuất khẩu thủy sản trong thời kỳ hội nhập quốc tế.
II. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU
1. Mục đích và yêu cầu
- Trong kiểm nghiệm hóa lí, công đoạn lấu mẫu được thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm
và là một công đoạn rất quan trọng trong kiểm định chất lượng thủy sản. Mọi sai sót trong
công đoạn này (Ví dụ: lượng mẫu không đủ, mẫu bị nhiễm bẩn từ môi trường ngoài, bị
nhiễm bẩn từ dụng cụ, bị biến đổi do các quá trình lý, hóa, sinh học trong khi bảo quản) đều
có thể đến những sai lệch nghiêm trọng trong kết quả phân tích. Vì vậy, thực hiện công đoạn
này nghiêm trúc và đúng quy cách sẽ góp phần không nhỏ vào sự chính xác của kết quả phân
tích.
- Việc lấy mẫu phải đảm bảo hai điều kiện sau:
+ Mẫu lấy phải đại diện được cho lô hàng hoặc nơi lấy mẫu (khi kiểm tra vệ sinh công
nghiệp) và được nhận dạng rõ ràng.
+ Hàng lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ khi
lấy mẫu đến khi phân tích.
- Để đáp ứng hai điều kiện trên, ngoài việc xây dựng kế hoạch, chương trình lấy mẫu cho các
thông tin cần thiết, phòng kiểm nghiệm còn phải thiết lập và tuân thủ nghiêm ngặt các quy


định trong thủ tục lấy và quản lý mẫu, mọi thành viên có liên quan cần phải đảm bảo duy trì
ổn định các đặc tính của mẫu trước khi được đưa vào thử nghiệm.
2. Thủ tục lấy mẫu và quản lý mẫu

2.1. Trách nhiệm của người phụ trách phòng kiểm nghiệm
- Chỉ định người lấu mẫu cụ thể: người đã được đào tạo hoặc đã được hướng dẫn kỹ thuật lấy
mẫu.
- Đảm bảo mẫu được lấy theo đúng yêu cầu: có đầy đủ chương trình/ kế hoạch, phương pháp
lấy mẫu thích hợp.
2.2.Trách nhiệm của người lấy mẫu
- Đọc kỹ tài liệu làm căn cứ lấy mẫu tương ứng.
- Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu phù hợp.
- Chuẩn bị biên bản lấy mẫu, nhãm mẫu.
3.3. Quy định lấy mẫu
- Kế hoạch lấy mẫu:
+ Lượng mẫu để kiểm tra lô hàng tùy thuộc vào sản phẩm cụ thể, nhưng không được ít
hơn yêu cầu kiểm nghiệm. Theo quy định của tiêu chuẩn Việt Nam thì lượng mẫu lấy không
lớn hơn 0,1% lô hàng, lô hàng càng lớn, tỷ lệ lấy mẫu càng thấp nhưng không ít hơn 3 đơn vị
sản phẩm.
+ Tùy vào mục đích kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng thủy sản sẽ có những phương
pháp lấy mẫu và cách lấy mẫu khác nhau. Và chọn các thiết bị phân tích tối ưu cho từng loại
chỉ tiêu đó.
- Vị trí lấy mẫu
+ Giá trị kết quả từ các phòng thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào vị trí và cách lấy
mẫu.
+ Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lô hàng thực phẩm, bằng không phải lấy
nhiều mẫu hơn. Mẫu kiểm của một lô hàng lớn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gói tối thiểu
phải đạt 200g, trong khi mẫu sản phẩm bao gói tối thiểu chỉ cần 100g, với sản phẩm bao gói,
chỉ những sản phẩm còn nguyên bao gói mới được dùng để phân tích.
- Dụng cụ lấy mẫu và thùng chứa mẫu
+ Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại vật liệu khác nhau như vật dụng dùng để
lấy mẫu đông lạnh là các khoan tay đã được vô trùn, hay các dao, thìa, kéo được hấp, sấy
hoặc rửa trong các dung dịch sát trùng… để cho mẫu vào trong bình chứa.

- Ghi ký hiệu – Nhận dạng mẫu thử
+ Phòng kiểm nghiệm phải có quy định riêng về ghi ký hiệu - mã hiệu của mẫu thử
sao cho có thể nhận dạng được mẫu thử trong suốt quá trình từ khi lấy mẫu đến khi trả phiếu
kết quả phân tích, không để xảy ra nhẩm lẫn do việc sử dụng ký hiệu không rõ ràng hoặc ghi
sai so với nguồn gốc của mẫu, ví dụ: Việc ký hiệu riêng cho từng phân xưởng, ký hiệu riêng
trên bao bì nguyên liệu của khách hàng…
+ Ký mã hiệu này sẽ xuất hiện trên mẫu và trên tất cả các giấy tờ, sổ sách có liên quan
đến mẫu thử như: biên bản lấy mẫu, phiếu giao nhận mẫu, sổ nhận mẫu, báo cáo kết quả thử
nghiệm, phần mẫu lưu (nếu có).
+ Ký mã hiệu ghi trên mẫu phải đảm bảo bền vững với các tác nhân vật lý như không
bị phai mực, được ghi trên nhãn có độ bám dính tốt.
- Bảo quản và vận chuyển mẫu
+ Các mẫu sau khi lấy được bảo quản tách biệt nhau trong các thùng bảo quản mẫu,
làm lạnh bằng bao nước đá. Nước đá phải được bảo quản sao cho không được tan chảy quá
nhanh trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm, mẫu
được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngay trong thời gian có thể được.
+ Nếu không thể phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -20oC cho đến khi phân
tích. Nếu các mẫu không thể bảo quản đông, có thể bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 4oC nhưng
không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay thực
phẩm khó hư hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích.
+ Tốt nhất nên giữ mẫu trong các bao bì ban đầu. Nếu phải vận chuyển mẫu qua bao
bì khác, mẫu phải được chứa trong bao bì vô trùng/sạch và làm bằng vật liệu không ảnh
hưởng đến chất lượng và tình trạng ban đầu của mẫu, làm sai lệch kết quả phân tích.
+ Mẫu phải được bảo quản trong điều kiện thích hợp trước khi vận chuyển về phòng
kiểm nghiệm. Các vật dụng chứa mẫu phải được thiết kế sao cho mẫu không bị nhiễm bẩn và
tránh các hiện tượng thay đổi khác do các yếu tố cơ, lý, hóa học.
+ Chế độ bảo quản mẫu:
+ Đối với mẫu mau hỏng (Sushi các loại, đông IQF, dạng hút chân không, dạng ướt
đá): phải được bảo quản lạnh ngay sau khi lấy mẫu bằng thùng cách nhiệt có đá để duy trì

mẫu ở nhiệt độ thấp (0–4oC). Mẫu cần được để trong bì kín, tránh tiếp xúc trực tiếp với nước
đá.
+ Mẫu không thuộc mẫu mau lỏng: sử dụng các bao túi kín, nhiệt độ bảo quản trong
thời gian vận chuyển không vượt quá 45oC.
+ Mẫu dạng đông block: không được để tan đá một phần hoặc toàn bộ trước khi về
đến phòng kiểm ngiệm.
+ Yêu cầu về mẫu kiểm nghiệm: Mẫu được chấp nhận khi


+ Dụng cụ chứa mẫu không rò rỉ, có nắp đậy kín, không bị nứt, không gây nhiễm bẩn
vào mẫu.
+ Mẫu dạng hút chân không: bao bì kín, không có không khí bên trong.
+ Mẫu dạng block, dạng nguyên con phải nguyên vẹn, không giập nát.
+ Mẫu phải được phân tích trong vòng 24 giờ từ khi ấy. Trong trường hợp xác định
được giời gian sử dụng, yêu cầu về nhiệt độ và thời gian chờ kiểm có thể rộng hơn. Muẫ
kiểm dạng đông phải được bọc để chống mất nước và giữ nhiệt độ tối đa 18oC cho đến khi
phân tích.
+ Thực phẩm đông lạnh: Mẫu kiểm dạng đông phải được rã đông ở 4oC trong vòng 18
giờ. Những mẫu có kích thước nhỏ hoặc dễ tan có thể đặt trong tủ ấm (< 37oC) để rã đông.
Quá trình rã đông phải được thực hiện trong vòng 15 phút.

III. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
A. Xác định dư lượng thuốc kháng sinh nhóm tetracycline bằng phương pháp sắc kí
lỏng hiệu suất cao
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định dư lượng kháng sinh nhóm
tetracycline trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Phương pháp này có thể áp dụng để xác định các hợp chất: tetracyline (TC),
oxytetracyline (OTC) và chlortetracyline (CTC)
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 µg/kg.

2. Nguyên tắc
Các kháng sinh nói trên trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH
4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha
đảo Sep-Pak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định
bằng hệ thống HPLC với detector UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
3. Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất
loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Metanol, loại dùng cho HPLC.
3.2 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol


Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm 2 phân tử nước bằng metanol trong bình định mức 1 000 ml.
Định mức tới vạch.
Dung dịch axit oxalic-metanol không bền, chỉ pha trước khi sử dụng.
3.4 Dung dịch đệm McIlvaine, pH 4,0 ± 0,05, chuẩn bị như sau:
Hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan bằng nước trong bình định mức dung tích 1 000 ml, định mức
tới vạch, thu được dung dịch A.
Hoà tan 21,0 g axit xitric ngậm một phân tử nước bằng nước trong bình định mức, định mức
tới vạch, thu được dung dịch B.
Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1 000 ml dung dịch B. Chỉnh pH tới 4,0 ± 0,05 bằng cách
cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1 M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1 M (sử dụng
máy đo pH).
Dung dịch đệm McIlvaine bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.
3.5 Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA
Hoà tan 60,5 g dinatri etylendinitrilotetraaxetat (EDTA) ngậm 2 phân tử nước vào 1 625 ml
dung dịch đệm Mcllvaine.
Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.
3.6 Pha động cho HPLC

Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm 2 phân tử nước bằng nước trong bình định mức 1 000 ml.
Định mức tới vạch. Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril và 166 ml methanol. Lọc và đuổi
khí.
Dung dịch pha động không bền, chỉ pha trước khi sử dụng.
3.7 Các dung dịch chuẩn gốc tetracycline, 1 000 µg/ml
Cân 108 mg ± 0,1 mg mỗi loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC và CTC) loại có giấy chứng nhận
hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi trong giấy chứng
nhận) vào 3 bình định mức dung tích 100 ml riêng biệt. Hòa tan và định mức tới vạch 100 ml
bằng metanol.
Bảo quản các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc ở nhiệt độ −20oC. Các dung dịch kháng sinh
chuẩn gốc bền trong vòng 3 tháng.
3.8 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp tetracycline, 100 µg/ml
Hút chính xác 10 ml các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml. Định
mức tới vạch bằng methanol.


3.9 Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp tetracycline, 25 µg/ml
Hút chính xác 2,5 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml vào bình định mức 10
ml. Định mức tới vạch bằng methanol.
Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0oC đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1
tuần.
3.10 Dung dịch chuẩn hỗn hợp tetracycline, 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 và 1,00 µg/ml
Hút chính xác 20; 40; 100; 200 và 400 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml vào
các bình định mức 10 ml. Thêm 6 ml dung dịch axit oxalic-metanol) vào mỗi bình. Định mức
tới vạch bằng nước.
Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0oC đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1
tuần.
4. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

4.2 Bình định mức, dung tích 10; 100 và 1 000 ml.
4.3 Pipet, tự động điều chỉnh được từ 2 ml đến10 ml.
4.4 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 50 ml.
4.5 Xơranh thủy tinh, dung tích 100 ml.
4.6 Phễu Buchner, đường kính 5,5 cm.
4.7 Giấy lọc.
4.8 Dụng cụ đo pH.
4.9 Máy ly tâm, tốc độ 5000 r/min, sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml.
4.10 Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min.
4.11 Bể siêu âm.
4.12 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml.
4.13 Cột sắc ký pha đảo C8, dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.
4.14 Cột sắc ký pha đảo C18, dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.
4.15 Hệ thống HPLC, được trang bị detector UV.


5. Cách tiến hành
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Cân 5,00 g ± 0,05 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh thứ
nhất. Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống rồi nghiền trong 30 s bằng máy
nghiền. Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm trong 10 min ở tốc độ 3000 r/min.
5.1.2 Gạn dịch trong của ống thứ nhất vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2. Cho thêm 20 ml dung
dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ nhất. Trộn đều, ly tâm ống trong 10
min ở tốc độ 3000 r/min rồi lại gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2.
5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ nhất.
Trộn đều rồi ly tâm ống trong 10 min ở tốc độ 3000 r/min. Tiếp tục gạn dịch trong vào ống ly
tâm thủy tinh thứ 2.
5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 2 trong 20 min ở tốc độ 3 000 r/min. Sau đó, lọc dịch trong
qua giấy lọc trên phễu Buchner. Rửa ống ly tâm 2 lần, mỗi lần rửa sử dụng 2 ml dung dịch
đệm McIlvaine – EDTA.

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thủy sản đã được xác định không có các kháng sinh thuộc nhóm
tetracycline. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử.
5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
Thêm 100 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml vào 5,00 g mẫu trắng. Đồng
nhất mẫu bằng máy nghiền. Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử.
5.4 Làm sạch dịch chiết
5.4.1 Chuẩn bị cột
Nối cột Sep-Pak C18 vào đầu ra của một xơranh thủy tinh dung tích 100 ml. Thêm lần lượt
20 ml metanol, 20 ml nước vào xơranh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột.
5.4.2 Làm sạch dịch chiết
5.4.2.1 Cho lần lượt các dịch chiết trong ống ly tâm vào các cột Sep-Pak. Tráng rửa bình
chứa bằng 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA. Trong giai đoạn này, các kháng sinh
nhóm tetracycline sẽ được hấp phụ lên bề mặt các hạt rắn chứa trong cột.
Chú ý không được để cho cột Sep-Pak khô ở giữa hai giai đoạn chuẩn bị cột và làm sạch dịch
chiết. Điều chỉnh cho dịch chảy ra khỏi cột từng giọt.
5.4.2.2 Cho 20 ml nước vào xơranh thủy tinh và cho chảy qua cột. Loại bỏ dịch chảy ra khỏi
cột. Làm khô cột bằng dòng không khí sạch trong 2 min.


5.4.2.3 Giải hấp các kháng sinh nhóm tetracycline bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axit
oxalic-metanol chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/min. Thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức
10 ml. Định mức tới vạch (thể tích V) bằng nước. Tiến hành phân tích dịch thu được trên
HPLC.
5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC
5.5.1 Điều kiện phân tích
– cột sắc ký:
– cột pha đảo C8;
– nhiệt độ cột:
– nhiệt độ phòng;

– pha động: hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitril;
– tốc độ dòng: 1,2 ml/min;
– bước sóng cài đặt cho detector UV: 350 nm;
– thể tích tiêm: 60 µl.
5.5.2 Ổn định cột sắc ký trong 30 min bằng pha động.
5.5.3 Tiêm các dung dịch kháng sinh chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến
cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính chiều cao pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối
quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ (µg/ml) từng loại kháng sinh theo quan
hệ tuyến tính (y = ax + b).
Đường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi
tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995.
5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ
thống HPL. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
CHÚ THÍCH: Sau khi phân tích xong, làm sạch hệ thống HPLC (bao gồm cả cột sắc ký)
bằng hỗn hợp: nước - metanol - axetonitril theo tỷ lệ 7:1:2 (thể tích) trong 30 min.
5.5.5 Đối với các mẫu chứa ít hơn 0,5 µg/g kháng sinh nhóm tetracycline, phải kiểm tra xác
nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu và dung dịch kháng sinh chuẩn trên cột C18
chạy cùng chế độ như cột C8 và so sánh thời gian lưu của pic mẫu và pic chuẩn.
6. Tính kết quả
Hàm lượng của từng kháng sinh nhóm tetracycline có trong mẫu thử, C, biểu thị bằng
microgam trên kilogam (µg/kg) được tính theo công thức sau:


trong đó
Y
là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết và chiều cao pic có trong mẫu trắng
tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài;
a, b

là các hệ số của đường chuẩn y = ax + b;

V

là thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (xem 5.4.2.3), tính bằng mililit

m

là khối lượng mẫu đã sử dụng (xem 5.1.1), tính bằng gam (g).

(ml)

7. Độ lặp lại và độ thu hồi
7.1 Độ lặp lại
Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS, tính theo chiều cao pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch
kháng sinh chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
7.2 Độ thu hồi
Độ thu hồi, R, được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn hơn 80 %.
8 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự
chọn và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
B. Xác định dư lượng thuốc kháng sinh nhóm penicillin trong thủy sản bằng phương
pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng các chất kháng sinh nhóm
penicillin trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC).

Phương pháp có thể xác định các hợp chất: penicillin G (benzylpenicillin), penicillin V
(phenoxymethylpenicillin), amoxicillin, ampicillin, oxacillin, nafcillin, cloxacillin và
dicloxacillin.
Giới hạn phát hiện của phương pháp: đối với penicillin G: 3 µg/kg; penicillin V: 3
µg/kg; amoxicillin: 10 µg/kg; ampicillin: 4 µg/kg; oxacillin: 3 µg/kg; nafcillin: 7 µg/kg;
cloxacillin: 5 µg/kg và dicloxacillin: 11 µg/kg.
2. Nguyên tắc
Các chất thuộc nhóm penicillin được chiết ra khỏi mẫu sản phẩm thủy sản bằng dung
dịch đệm phosphat pH = 9, sau đó làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột chiết pha rắn C18.
Tiến hành tạo dẫn xuất của các chất thuộc nhóm penicillin với anhydrit benzoic ở nhiệt độ 50
0C, sau đó với 1,2,4-triazol và thuỷ ngân (II) clorua ở nhiệt độ 65 0C và định lượng bằng
HPLC với detector UV ở bước sóng 325 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
3. Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng
nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Axetonitril.
3.2 Metanol.
3.3 Isooctan.
3.4 Dung dịch NaOH, 5 mol/l
- Hoà tan 20,0 g NaOH trong 100 ml nước.
3.5 Dung dịch NaOH, 2 mol/l
- Hoà tan 4,0 g NaOH trong 50 ml nước.
3.6 Dung dịch NaCl, 2 %
- Hoà tan 20,0 g NaCl trong nước để có 1 l dung dịch.
3.7 Dung dịch đệm phosphat, 0,1 mol/l, pH = 6,0
- Hoà tan 9,938 g Na2HPO4; 20,278 g NaH2PO4.2H2O; 7,788 g Na2S2O3.5H2O; 13,582 g
C16H37NO4S (tetrabutylamoni hydrosulfat) trong 800 ml nước rồi định mức đến vạch để có
2l. Sau đó, lọc dung dịch qua màng lọc Milipore 0,45 µm.
- Dung dịch có thể bảo quản được trong 5 ngày ở nhiệt độ từ +2oC đến +8oC.

3.8 Dung dịch đệm phosphat, 0,1 mol/l, pH = 8


- Dùng dung dịch NaOH 5 mol/l để chỉnh 250 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l pH = 6
tới pH = 8.
- Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tuần.
3.9 Dung dịch đệm phosphat, 0,1 mol/l, pH = 9
- Hòa tan 14,196 g Na2HPO4 khan trong nước rồi định mức để có 1 l dung dịch.
- Chuẩn bị dung dịch chiết để sử dụng trong tuần và giữ ở nhiệt độ trong phòng.
3.10 Dung dịch anhydrit benzoic, 0,2 mol/l
- Hoà tan 2,262 g anhydrit benzoic [(C6H5CO)2O] vào 50 ml axetonitril rồi định mức tới
vạch trong bình thuỷ tinh màu.
- Bảo quản dung dịch trong chai màu nâu, tránh ánh sáng.
3.11 Dung dịch thuỷ ngân (II) clorua, 0,1 mol/l
- Hoà tan 0,2715 g thuỷ ngân (II) clorua (HgCl2) trong 10 ml nước.
CẢNH BÁO: Dung dịch HgCl2 rất độc, tránh để da tiếp xúc trực tiếp với HgCl2.
3.12 Dung dịch cho phản ứng tạo dẫn xuất
- Hoà tan 13,78 g 1,2,4-triazol (C2H3N3) với 60 ml nước trong cốc 100 ml, thêm 10 ml
HgCl2 0,1 mol/l. Dùng NaOH 5 mol/l để chỉnh pH = 9,0 ± 0,5. Sau đó, chuyển toàn bộ sang
bình định mức màu nâu rồi định mức đến 100 ml bằng nước.
- Dung dịch thu được bão hoà HgCl2 và có màu trắng đục, để tối ưu quá trình tạo dẫn xuất
dung dịch phải được điều chế trước khi sử dụng ít nhất 24 h và phải khuấy mạnh trước mỗi
lần sử dụng.
- Bảo quản dung dịch phản ứng tạo dẫn xuất ở nhiệt độ +4oC, nơi tránh ánh sáng. Dung dịch
bền trong 3 tháng.
3.13 Dung dịch rửa giải trên cột C18, tỷ lệ 50:50
- Trộn 50 ml nước và 50 ml axetonitril.
- Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong ngày.
3.14 Dung dịch để hoà tan các chất chuẩn, tỷ lệ 50:50
- Trộn 50 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH = 8 trong 50 ml axetonitril.

Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong ngày.
3.15 Dung dịch pha động, tỷ lệ 65:35


- Trộn 350 ml axetonitril trong 650 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l pH = 6,0.
- Chuẩn bị pha động để sử dụng trong ngày hoặc phối trộn qua bơm HPLC.
3.16 Các chất chuẩn nhóm penicillin
3.16.1 Chất chuẩn penicillin G, dạng axit, 93,4 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương.
3.16.2 Chất chuẩn penicillin V, dạng axit, 89,8 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương.
3.16.3 Chất chuẩn amoxicillin ngậm ba phân tử nước, dạng axit, 86,3 %, SIGMA Chemical
hoặc loại tương đương.
3.16.4 Chất chuẩn natri ampicillin, 92,2 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương.
3.16.5 Chất chuẩn natri oxacillin, 85,5 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương.
3.16.6 Chất chuẩn natri nafcillin, 82,8 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương.
3.16.7 Chất chuẩn natri cloxacillin, 87,8 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương.
3.16.8 Chất chuẩn natri dicloxacillin, 95,3 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương.
3.17 Các dung dịch chuẩn gốc nhóm penicillin
3.17.1 Dung dịch chuẩn gốc penicillin G (SM1), 0,5 g/l
Cân chính xác 0,053 5 g chất chuẩn penicillin G có 93,4 % hoạt tính vào cốc có mỏ, hoà tan
bằng nước. Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml
rồi định mức bằng nước.
3.17.2 Dung dịch chuẩn gốc penicillin V (SM2), 0,5 g/l
Cân chính xác 0,055 7 g chất chuẩn penicillin V có 89,8 % hoạt tính, hoà tan bằng nước. Sau
đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml rồi định mức
bằng nước.
3.17.3 Dung dịch chuẩn gốc amoxicillin (SM3), 0,5 g/l
Cân chính xác 0,057 9 g chất chuẩn amoxicillin ngậm ba phân tử nước (3.16.3) có 86,3 %
hoạt tính vào cốc có mỏ (4.3), hoà tan bằng nước. Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình
định mức màu nâu dung tích 100 ml (4.5) rồi định mức bằng nước.
3.17.4 Dung dịch chuẩn gốc ampicillin (SM4), 0,5 g/l

Cân chính xác 0,054 2 g chất chuẩn natri ampicillin có 92,2 % hoạt tính, hoà tan bằng nước.
Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml rồi định mức
bằng nước.
3.17.5 Dung dịch chuẩn gốc oxacillin (SM5), 0,5 g/l


Cân chính xác 0,058 5 g chất chuẩn natri oxacillin có 85,5 % hoạt tính, hoà tan bằng nước.
Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml rồi định mức
bằng nước.
3.17.6 Dung dịch chuẩn gốc nafcillin (SM6), 0,5 g/l
Cân chính xác 0,060 4 g chất chuẩn natri nafcillin có 82,8 % hoạt tính, hoà tan bằng nước.
Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml rồi định mức
bằng nước.
3.17.7 Dung dịch chuẩn gốc cloxacillin (SM7), 0,5 g/l
Cân chính xác 0,056 9 g chất chuẩn natri cloxacillin có 87,8 % hoạt tính, hoà tan bằng nước.
Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml rồi định mức
bằng nước.
3.17.8 Dung dịch chuẩn gốc dicloxacillin (SM8), 0,5 g/l
Cân chính xác 0,052 5 g chất chuẩn natri dicloxacillin có 95,3 % hoạt tính, hoà tan bằng
nước. Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml rồi
định mức bằng nước.
3.18 Dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất thuộc nhóm penicillin
Hút chính xác 50 µl mỗi dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 và 300 µl mỗi dung dịch
chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 10 ml rồi định mức
bằng nước.
3.19 Các dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của nhóm penicillin
3.19.1 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 1 (ST1)
Hút chính xác 125 µl mỗi dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 và 375 µl mỗi dung dịch
chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 50 ml rồi định mức
bằng nước.

3.19.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 2 (ST2)
Hút chính xác 250 µl mỗi dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 và 750 µl mỗi dung dịch
chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 50 ml rồi định mức
bằng nước.
3.19.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 3 (ST3)
Hút chính xác 500 µl mỗi dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 và 1,5 ml mỗi dung dịch
chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 50 ml rồi định mức
bằng nước.
3.19.4 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 4 (ST4)


Hút chính xác 1 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 và 3 ml mỗi dung dịch chuẩn
gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 50 ml rồi định mức bằng
nước.
CHÚ THÍCH: Các dung dịch từ ST1 đến ST4 được chuẩn bị hàng tháng và phải bảo quản
trong buồng lạnh (nhiệt độ từ 2oC đến 4oC) và tối.
4. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Dụng cụ phân phối dung môi, loại 10 và 20 ml.
4.3 Cốc có mỏ, dung tích 100 ml.
4.4 Pipet tự động, 100; 200 µl, được trang bị đầu hút pipetman.
4.5 Bình nón nút mài.
4.6 Ống nghiệm thuỷ tinh, dung tích 50 ml.
4.7 Ống ly tâm, có nút, dung tích 5 và 50 ml.
4.8 Máy lắc ống nghiệm, Vortex hoặc loại tương đương.
4.9 Máy khuấy từ, NUOVA7 hoặc loại tương đương.
4.10 Máy khuấy quay, Rheax hoặc loại tương đương.
4.11 Máy ly tâm
4.12 Dụng cụ đo pH, Accumet 10 hoặc loại tương đương.

4.13 Máy nghiền, Siemens hoặc loại tương đương.
4.14 Bể siêu âm, Bransonic 220 hoặc loại tương đương.
4.15 Bể điều nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ 50oC và 65oC, Polytest hoặc loại tương đương.
4.16 Bơm chân không, dùng cho hệ chiết pha rắn, N79KN18 hoặc loại tương đương.
4.17 Thiết bị lọc, được trang bị màng lọc HVLP 0,45 µm hoặc loại tương đương.
4.18 Cột chiết pha rắn, Bond Elut C18, dung tích 6 ml, 500 mg hoặc loại tương đương.
4.19 Hệ chiết pha rắn, VAC-ELUT hoặc loại tương đương.
4.20 Hệ thống HPLC, được trang bị như sau:


– bơm HPLC;
– detector UV;
– bộ phận tiêm mẫu tự động;
– cột pha đảo C8, dài 150 mm, đường kính trong 3,9 mm, kích thước hạt 5 µm;
– tiền cột C8, dài 4 mm, đường kính trong 4 mm, kích thước hạt 5 µm;
– hệ thống xử lý số liệu (Thermo Separation Products) gồm giao diện (loại SN4000), máy
tính, phần mềm điều khiển thiết bị và xử lý sắc ký (loại PC1000 phiên bản 3.03) hoặc loại
tương đương.
5. Cách tiến hành
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Nghiền 200 g mẫu sản phẩm thủy sản bằng máy nghiền. Cân 5,0 g mẫu đã được nghiền,
chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly tâm 50 ml.
5.1.2 Dùng thiết bị phân phối dung môi cho 30 ml dung dịch đệm phosphat pH = 9 vào ống
ly tâm 50 ml chứa 5 g mẫu thử đã được nghiền rồi lắc trên máy lắc ống nghiệm trong 1 min.
5.1.3 Thêm 20 ml isooctan vào ống ly tâm, tiếp tục lắc trong 1 min. Sau đó, đồng nhất toàn
bộ trên máy khuấy quay trong 10 min.
5.1.4 Ly tâm dung dịch trong 10 min với gia tốc 2 200 × g, tốc độ 3 500 r/min ở nhiệt độ
10oC rồi hút bỏ phần dịch isooctan phía trên. Sau đó, chuyển toàn bộ pha nước sang ống
nghiệm sạch 50 ml và chỉnh pH về khoảng 8 đến 9 bằng NaOH 5 mol/l.
5.1.5 Tiến hành làm sạch mẫu theo 5.5 và tạo dẫn xuất theo 5.6.

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu sản phẩm thủy sản đã được xác định không có penicillin. Tiến hành chuẩn
bị mẫu trắng, làm sạch và tạo dẫn xuât như đối với mẫu thử theo 5.1, 5.5 và 5.6.
5.3 Chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi, nồng độ 50 µg/kg và 300 µg/kg
Thêm chính xác 100 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất thuộc nhóm penicillin vào 5,0 g
mẫu trắng. Tiến hành chuẩn bị và làm sạch 2 mẫu xác định độ thu hồi (50 µg/kg và 300
µg/kg) làm sạch và tạo dẫn xuất như đối với mẫu thử theo 5.1, 5.5 và 5.6
5.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp các penicillin STD dùng để dựng đường chuẩn
5.4.1 Dung dịch chuẩn được chuẩn bị hàng ngày mỗi khi tiến hành phân tích bằng cách pha
loãng các dung dịch ST1, ST2, ST3, ST4 trong ống nghiệm với 5 ml dung dịch pha loãng.
Tiến hành như sau:


– STD0: 100 µl dung dịch hoà loãng chất chuẩn;
– STD1: 100 µl ST1 và thêm 900 µl dung dịch hoà tan chất chuẩn;
– STD2: 100 µl ST2 và thêm 900 µl dung dịch hoà tan chất chuẩn;
– STD3: 100 µl ST3 và thêm 900 µl dung dịch hoà tan chất chuẩn;
– STD4: 100 µl ST4 và thêm 900 µl dung dịch hòa tan chất chuẩn.
5.4.2 Tiếp tục thực hiện bước tạo dẫn xuất như theo 5.6.
5.5 Làm sạch mẫu
5.5.1 Hoạt hoá cột
Gắn cột chiết pha rắn lên giá đỡ, sau đó gắn bình chứa 50 ml lên cột. Thêm lần lượt 10 ml
metanol, 10 ml nước, 5 ml dung dịch NaCl 2 % và 5 ml dung dịch đệm chiết pH = 9. Cho
ngay dịch chiết thu được lên bình chiết trên cột đã được hoạt hoá.
CHÚ THÍCH: Không để cột bị khô trong quá trình hoạt hoá cột. Thêm dung dịch cần làm
sạch ngay khi hết dung dịch đệm chiết hoặc khi còn một chút dung dịch đệm chiết.
5.5.2 Hút hỗn hợp với lưu lượng 3 ml/min rồi thêm 2 ml dung dịch NaCl 2 % và 2 ml nước.
Tiến hành hút kiệt trong vòng 5 min, ngừng hút chân không.
5.5.3 Đặt ống ly tâm 5 ml dưới cột rồi rót 1 ml dung dịch rửa giải lên cột. Để ngấm pha rắn
khoảng 1 min trước khi hút chân không dịch rửa giải với tốc độ 3 ml/min.

5.5.4 Sau khi rửa giải xong, thể tích dịch rửa giải khoảng 900 µl, chỉnh đến 1 ml bằng dung
dịch rửa giải trong bình nón nút mài.
5.6 Tạo dẫn xuất
5.6.1 Điều chỉnh pH của dịch rửa giải trong khoảng 8 đến 9 bằng dung dịch NaOH 2 mol/l.
Thêm cẩn thận vào dung dịch rửa giải thu được 50 µl dung dịch anhydit benzoic 0,2 mol/l,
lắc trong 10s trên máy lắc ống nghiệm.
5.6.2 Để phản ứng trong 3 min trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 50oC rồi thêm 500 µl dung dịch
cho phản ứng tạo dẫn xuất. Khuấy mạnh bình chứa dung dịch cho phản ứng tạo dẫn xuất
hoặc đặt trong bể siêu âm trong 2 min. Đậy nút và lắc hỗn hợp thu được trên máy lắc ống
nghiệm trong 10s.
5.6.3 Để phản ứng xảy ra trong 10 min trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 65oC. Sau đó, làm lạnh
dưới vòi nước đến nhiệt độ bình thường, tránh ánh sáng rồi ly tâm trong 10 min ở 2000 × g.
5.7 Tiến hành phân tích trên HPLC
5.7.1 Điều kiện phân tích


a) Pha động: dung dịch pha động;
b) Lưu tốc: 1,0 ml/min;
c) Bước sóng phát hiện: 325 nm;
d) Thể tích tiêm mẫu: 200 µl;
e) Nhiệt độ cột: 20oC;
f) Thời gian lưu: theo Bảng 1.
Bảng 1 − Thời gian lưu của các chất thuộc nhóm penicillin
Tên chất

Thời gian lưu, min

Tên chất

Thời gian lưu,

min

Amoxiciin

5,5 ± 0,2

Oxacillin

14,2 ± 0,5

Penicillin G

7,6 ± 0,2

Nafcillin

16,9 ± 0,6

Penicillin V

9,0 ± 0,3

Cloxacillin

17,9 ± 0,7

Ampicillin

11,5 ± 0,4

Dicloxacillin

27,5 ± 1,0

5.7.2 Tiêm các dung dịch đã tạo dẫn xuất
Tiêm các dung dịch đã tạo dẫn xuất theo thứ tự:
− dung dịch chuẩn đã tạo dẫn xuất với 5 mức nồng độ khác nhau. Dựng đường chuẩn
y= ax + b theo quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic các chuẩn penicillin và nồng độ tương
ứng (tính theo microgam trên lit);
− dung dịch mẫu trắng đã tạo dẫn xuất;
− dung dịch 2 mẫu xác định độ thu hồi 50 µg/kg và 300 µg/kg đã tạo dẫn xuất;
− dung dịch mẫu thử đã tạo dẫn xuất.
Quy trình này có thể được lặp lại nếu cần thiết.
CHÚ THÍCH 1: Tiêm 200 µl nước trước mỗi lần phân tích mẫu mới.


CHÚ THÍCH 2: Thay đổi tiền cột sau khoảng 30 mẫu đến 40 mẫu.
CHÚ THÍCH 3: Sau khi phân tích xong, dùng hỗn hợp axetonitril và nước theo tỷ lệ 50:50 để
làm vệ sinh bơm tiêm mẫu. Rửa cột với hỗn hợp trên với tỷ lệ 90:10 trong 60 min. Nếu
ngừng chạy trong thời gian dài, nên rửa cột với hỗn hợp trên, sau đó với metanol trong
khoảng 30 min, tiếp đến với axetonitril trong 30 min. Sau đó, lặp lại với methanol trong 30
min và cuối cùng bằng nước trong 60 min.
6. Tính kết quả
6.1 Tính hàm lượng các chất thuộc nhóm penicillin
Hàm lượng của từng hợp chất nhóm penicillin trong mẫu thử, C, biểu thị bằng microgam trên
kilogam (µg/kg) được tính theo công thức sau:

trong đó
Y

là diện tích pic của các chất thuộc nhóm penicillin có trong mẫu thử;

b

là tung độ góc của đường chuẩn;

a

là hệ số góc của đường chuẩn;

V

là thể tích dịch chiết đã tạo dẫn xuất, tính bằng milinit (ml);

m

là khối lượng mẫu thử đã nghiền được lấy để đem ly tấm, tính bằng gam (g);
là hiệu suất thu hồi trung bình tính từ 2 mẫu xác định độ thu hồi.

6.2 Tính hiệu suất thu hồi
Hiệu suất thu hồi, R, được tính từ kết quả của 2 mẫu xác định độ thu hồi theo công thức sau:

trong đó
Ysup là diện tích pic của mẫu xác định độ thu hồi;
Ystd là diện tích pic của chất chuẩn với nồng độ tương ứng.


Hiệu suất thu hồi trung bình của 2 mẫu xác định độ thu hồi,
sau:

, được tính theo công thức

trong đó
R1 và R2 là hiệu suất thu hồi của 2 mẫu xác định độ thu hồi (nồng độ kháng
sinh tương ứng là 50 µg/kg và 300 µg/kg.
7. Độ thu hồi và độ lặp lại
Độ thu hồi (R) và độ lệch chuẩn lặp lại giữa hai lần tiêm (CV) của một loạt mẫu phân tích
được quy định trong Bảng 2.
Bảng 2 − Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích
Tên chất

Hiệu suất thu hồi %

Độ lệch chuẩn lặp lại
%

Amoxicillin

75 ± 18

8

Penicillin G

74 ± 17

8

Penicillin V

75 ± 30

13

Ampicillin

74 ± 13

6

Mẫu có bổ sung 50 µg/kg

Mẫu có bổ sung 300 µg/kg
Oxacillin

65 ± 18

9

Nafcillin

64 ± 22

12

Cloxacillin

60 ±16

9

Dicloxacillin

48 ± 17

11

8. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự
chọn và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.