Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV và BYMV

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGÂN

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC RNAi KHÁNG ĐỒNG THỜI SMV
VÀ BYMV

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 60.42.01.21

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 4/2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện
dưới sư hướng dẫn cua GS.TS. Chu Hoang Mâu. Mọi trích dẫn trong luận văn
đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 4 năm 2015
Tác giả

Nguyên Thi Phương Ngân

Ban chu nhiêm khoa

Can bô hương dẫn khoa hoc

GS.TS. Chu Hoang Mâu


ii

LỜI CAM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện đê tôi hoàn thành Ban luân văn
thac si này.
Tôi xin chân thanh cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học
hiện đại, cảm ơn Ban chủ nhiêm khoa va cac thầy cô khoa Sinh - KTNN đã
tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài luận văn.
Tôi xin cảm ơn các can bô Phòng ADN ưng dung, Phòng thí nghiệm
Trọng điêm công nghệ gen, Viên Công nghê sinh hoc, Viên Han lâm Khoa
học và Công nghê Viêt Nam đã tao điều kiên va giúp đỡ tôi trong qua trình
tiến hanh thí nghiêm cua đề tài.
Tôi xin cảm ơn Tiến sỹ Lò Thị Mai Thu và Thạc sĩ Lê Thị Hồng đã
giúp đỡ tôi trong quá trình thưc hiên đề tai luận văn.
Đê tai luận văn thuôc chương trinh đào tao nghiên cưu sinh va cao hoc

cua Bô môn Di truyền & Sinh hoc hiên đại, khoa Sinh-Ky thuât nông nghiêp,
trương Đai hoc Sư pham - Đai hoc Thai Nguyên.

Tác giả


iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………….. i
LỜI CẢM ƠN........................................................................................ ii
MUC LUC............................................................................................. iii
DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT..................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................... vii
MỞ ĐẦU……………………………………………………………... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………......... 4
1.1. SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ BEAN YELLOW MOSAIC
VIRUS........................................................................................................

4
1.1.1. Bệnh khảm ở cây đậu tương........................................................ 4
1.1.2. Hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirrus .................................... 8
1.2. ƯNG DUNG KY THUÂT RNAi TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ
CHUYỂN GEN KHANG VIRUS............................................................. 11

1.2.1. Cây thuốc lá va bệnh virus trên cây thuốc lá............................... 11
1.2.2. Cơ chế RNA interference (RNAi)............................................... 14
1.2.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo cây trồng chuyên gen kháng

virus.......................................................................................................
1.3. ƯNG DUNG KY THUÂT PHÂN TƯ TRONG PHÂN TICH CÂY
CHUYÊN GEN ........................................................................................

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

16
18
22

2.1. VÂT LIÊU, HOA CHÂT VÀ THIÊT BI...................................... 22
2.1.1. Vật liệu........................................................................................ 22
2.1.2. Hóa chất...................................................................................... 22


iv

2.1.3. Thiết bị........................................................................................ 22
2.1.4. Địa điêm nghiên cưu..................................................................

23

2.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................

23

2.2.1. Phương pháp chuyên gen vào cây thuốc lá thông qua
Agrobacterium tumefaciens.................................................................. 23
2.2.2. Phân tích sư có mặt của cấu trúc chuyên gen pK7GW/SMVBYMV-CPi bằng phương pháp PCR………………………………… 26
2.2.3. Lây nhiễm nhân tạo SMV và BYMV vao la cây thuốc lá ……. 28

2.2.4. Phân tích số lượng bản sao virus trong cây thuốc lá chuyên
gen chưa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) bằng ky thuât Real time RT- 29
PCR…………………………………………………………………...
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............

30

3.1. KÊT QUA CHUYÊN CÂU TRUC pK7GW/SMV-BYMV-CPi
VAO THUÔC LÁ..................................................................................... 30

3.1.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch A. tumeffaciens và cảm ứng tạo
cum chồi................................................................................................

30

3.1.2. Tạo rễ và phát triên cây chuyên gen hoàn chỉnh ……………... 33
3.2. KÊT QUA PHÂN TICH CÂY THUỐC LA CHUYÊN GEN........... 35

3.2.1. Kết quả kiêm tra cấu truc RNAi trong các dòng thuốc lá
chuyên gen ........................................................................................... 35
3.2.2. Phân tích khả năng kháng virus của cac dong cây chuyên gen
CPi (SMV-BYMV) trong điều kiên lây nhiêm nhân tạo ..................... 36
KÊT LUẬN VA ĐÊ NGHI……………………………………..........

40

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………........

41

4

DANH MỤC CAC TƯ VA CHỮ VIẾT TẮT
AS

Acetosyringone

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

BAP

6-Benzyl Amino Purine

BGMV
BYMV

Bean Golden Mosaic Virus
Bean yellow mosaic virus

bp

Base pair (cặp base)

CP

Coat protein (protein vỏ)

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

cs

Cộng sư

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

GA3

Gibberellic acid

GM

Môi trường tạo chồi

hpRNA
IhpRNA

Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc)
Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron)

IAA

Indoleacetic acid

IBA

Indole-3butyric acid

Kb

Kilo base


v

LB

Luria and Bertani

MS
PCR

Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
Polymerase chain reaction

RM

Môi trường ra rễ RNA

RNAi

interference Short

siRNA

interfering RNA

SMV

Soybean mosaic virus

T0, T6, T12

Các dòng thuốc lá chuyên gen

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Thermus aquaticus

Vir

Virulence Region

WT1, WT2, WT3

Cây thuốc lá không chuyên gen


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro…………..

24

Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số…………….

26

Bảng 2.3. Trinh tư nucleotide cua căp mồi PCR khuếch đai đoan Cpi

28

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen
Cpi ........................................................................................................

28

Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá………………………….

31

Bảng 3.2. Kết quả tạo chồi từ mảnh lá………………………………...

33

Bang 3.3. Kết qua tạo rễ và tái sinh cây thuốc lá ở thí nghiệm và đối
chứng…………………………………………………………………..

34

Bảng 3.4. Kết quả định lượng sư có mặt của virus SMV trong cây
thuốc lá chuyên gen…………………………………………………...

39


vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Lá cây đậu tương bị nhiễm SMV ...............................................................5
Hình 1.2. Sơ đô cấu trúc hệ protein của potyvirus ....................................................9
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyên gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) ............11
Hình 1.4. Cây thuốc lá giống C9-1...........................................................................11
Hình 1.5. Cơ chế hoạt động RNAi ..........................................................................15
Hinh 3.1. Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn
A.tumefaciens tai tô hơp ...........................................................................................31
Hình 3.2. Hinh anh phat sinh cum chôi. ...................................................................32
Hình 3.3. Hình ảnh tạo rễ trên môi trường kháng sinh chọn lọc ..............................34
Hinh 3.4. Cac dong thuốc la chuyển gen ơ thê hê T0 trông trên châu trong nha lươi
...................................................................................................................................35
Hình 3.5. Kêt qua điện di kiêm tra DNA tổng số tách từ các mẫu lá cây thuốc lá

chuyên gen ................................................................................................................35
Hình 3.6. Kêt qua điện di kiêm tra san phâm PCR nhân đoan CPi (SMV-BYMV) tư
21 dong cây thuốc lá chuyên gen ..............................................................................36
Hinh 3.7. Hinh anh môt sô dong thuôc la chuyên gen va đôi chưng .......................37
Hình 3.8. Đồ thị khuếch đại đoan cDNA tư các mẫu thuốc lá trong phân tích Real
time RT-PCR.............................................................................................................38


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một loại cây trồng cạn có
giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao. Hạt đậu tương được dùng làm
thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc. Ngoài ra những sản phẩm như
khô dầu đậu tương còn được dùng làm mực in, sơn, xà phòng, chất dẻo, thuốc
trừ sâu... Hạt đậu tương còn được dùng nhiều trong y học, giúp tránh hiện
tượng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già; hạn chế bệnh loãng xương ở phụ
nữ; bệnh đái tháo đường, thấp khớp... Ngoài ra đậu tương là cây trồng ngắn
ngày, rất thích hợp cho luân canh, xen canh gối vụ với nhiều loại cây khác và
là cây cải tạo đất rất tốt [4]. Việt Nam là một nước nông nghiệp, trong đó đậu
tương cũng là một trong những cây trồng chủ đạo. Mặc dù đã bắt đầu tiến
hành sản xuất trên quy mô công nghiệp từ năm 2011 nhưng Việt Nam vẫn
tiếp tục phải nhập khẩu phần lớn lượng bột đậu tương nhằm bù đắp sư thiếu
hụt về thực phẩm protein trong nước và đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của
ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Năng suất và
sản lượng đậu tương của nước ta còn ở mức khá thấp có thê do các nguyên
nhân như: Nhiều giống hiện trồng mặc dù năng suất khá nhưng do tính ổn
định chưa cao, sức biến động khá lớn giữa các miền, các vùng; Khả năng
kháng virus và sâu bệnh của các giống đậu tương đang trồng rất thấp; Chưa

có những dư báo về thời vụ gieo trồng thích hợp cho từng vùng.
Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus,
ví dụ như bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng ở đậu
tương (Soybean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn lá, bệnh gỉ sắt hại
đậu tương do nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do
nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc


2

Fusarium solani fsp phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số
bệnh hại khác. Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại
trên cây đậu tương. Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại
lớn đến năng suất và chất lượng nông sản. Với đặc điểm khí hậu thời tiết ở
nước ta, đậu tương rất dễ bị nhiễm nhiều loại virus, trong đó Soybean mosaic
virus (SMV) gây bệnh khảm lá và Bean yellow mosaic virus (BYMV) gây
bệnh khảm vàng là hai loại virus co tac đông xấu lơn nhất đến sư sinh trưởng,
phát triển và năng suất cây đậu tương. SMV và BYMV có thê nhiễm đồng
thời trên cùng một cây và triệu chứng biêu hiên rất khó phân biệt. Ảnh hưởng
của việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu
tương có thê bị giảm từ 66% - 80% (Hartman và cs 1999) [34].
Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp
phòng mà chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV gây nên. Một
trong những biện pháp phòng hai loài SMV và BYMV có hiệu quả là sử dụng
các giống đậu tương kháng bệnh. Tuy nhiên nguồn giống đậu tương kháng
bệnh tư nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính vì vậy hướng tiếp
cận tạo cây đậu tương chuyên gen kháng virus được quan tâm nghiên cứu, đó
là chuyên các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh theo nguyên lý
của kỹ thuật RNA interference (RNAi).
Thuốc lá là cây mô hình được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu

chuyên gen ở thực vật. Cây thuốc lá rất dễ nhiễm các loài virus thuộc nhóm
Potyvirus. Hai loài SMV, BYMV gây bệnh khảm ở cây đậu tương cũng thuộc
nhóm virus này. Kết quả thử nghiệm thành công chuyên cấu trúc RNAi vào
cây thuốc lá và đánh giá tính kháng đối với hai loài SMV, BYMV của cây
thuốc lá chuyên gen sẽ là cơ sở đê thực hiện mục tiêu tạo cây đậu tương
chuyên gen kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV theo nguyên lý của kỹ
thuật RNAi. Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành


3

đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi
kháng đồng thời SMV và BYMV”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được dòng cây chuyên gen mang cấu trúc RNAi có khả năng
kháng virus gây bênh kham từ giống thuốc lá C9-1.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cưu tạo cây thuốc lá chuyên gen bằng ky thuât biến nạp cấu trúc
RNAi vào mô lá cây thuốc lá C9-1 thông qua lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ
hợp;
(2) Phân tích sư có mặt của đoạn gen chuyên trong cây chuyên gen bằng kỹ
thuật PCR;
(3) Nghiên cưu lây nhiễm virus va phân tích số lượng bản sao virus SMV
trong cây thuốc lá chuyên gen chưa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) bằng ky
thuât Real time RT-PCR.


4

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. SOYBEAN MOSAIC VIRUS VA BEAN YELLOW MOSAIC VIRUS

1.1.1. Bênh kham ơ cây đâu tương
Đậu tương noi riêng va thưc vât noi chung dễ bị nhiễm cac bênh như
bênh kham, bệnh xoăn lá do virus; bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora
pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm Peronospora manshurica,
bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc Fusarium solani fsp
phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số bệnh hại khác. Đối
vơi cây đâu tương, thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây
hại va phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng sản
phẩm. Cây đậu tương bị nhiễm bệnh nặng, năng suất có thê bị giảm đến 50%
khi trồng ở ngoài đồng, thậm chí mức giảm có thê lên đến 93% - 95% trong
điều kiện lây nhiễm trong phòng thí nghiệm [11]. Một số nước có tỷ lệ thiệt
hại lớn do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ (37%), Australia
và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40-50%)[11], [17],
[33]. Bệnh khảm đậu tương do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra. Bệnh
được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu
tương đã có mặt ở hầu hết các vùng trồng đậu tương trên thế giới. Việt Nam
cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung ở
những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ,
khu vưc Đồng bằng sông Hồng và Tây Nguyên [4], [11]. Các nhà khoa học đã
xác định trong một số loài virus đặc biệt nguy hiêm, gây hại trên cây đậu
tương, có Soybean mosaic virus (SMV) và Bean yellow mosaic virus
(BYMV) [10], [11], [31].


5

SMV là loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tương, thuộc nhóm
Potyvirus, họ Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh
ở đậu tương. Bệnh do SMV gây ra xảy ra trên phạm vi toàn thế giới [10],
[25]. Khi bị bệnh lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ.
Lá non ở ngọn khảm mạnh và biến dạng, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại,
phát triển chậm. Quả ít và thường lép biến dạng, sần sùi, có vị đắng.

Hình 1.1. Lá cây đậu tương bị nhiễm SMV
SMV gây thiệt hại đáng kê về năng suất, thậm chí ở một số trường hợp
tổn thất có thê lên đến 94% tổng sản lượng đậu tương. Những cây đậu tương
bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triên chậm, hình thái thân, lá, quả bị
biến dạng, và khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn sẽ làm giảm sản lượng và chất
lượng hạt [35] [36]. Họ Potyviridae được biết đến là có số lượng loài lớn nhất
trong các họ virus gây bệnh ở thực vật. Nếu nhiễm đồng thời Potyvirus và các
loài virus khác thì thiệt hại về năng suất và chất lượng hạt đậu tương tăng lên
gấp bội [48]. Những cây bị nhiễm Potyvirus cũng dễ bị nhiễm thêm các nấm
gây bệnh hơn [48].


6

SMV sinh ra thê vùi trong tế bào cây bệnh. Thê vùi có dạng hình múi
khế hay hình chong chóng. Thời gian tồn tại của virus trong cây bệnh là 2-5
ngày, nhiệt độ mất hoạt tính Q10 là 55- 700C. Khi bị chiếu tia cực tím virus bị
mất hoạt tính trong hai giờ. Độ pH thích hợp là 6. Nhiệt độ thích hợp đê virus
nhân lên trong tế bào cây bệnh là 21-260C. Tại Hoa Kỳ, SMV đã được phân
thành chín chủng bằng cách sử dụng các phản ứng di truyền trên tám giống
cây.
Ngoài SMV, BYMV cũng gây nên bệnh khảm ở đậu tương. Trước

đây, bệnh khảm vàng lá do BYMV gây ra thường bị nhầm lẫn với bệnh khảm
do SMV và sau này mới được xác nhận là do virus khác gây ra. Bệnh này
tương đối ít nghiêm trọng hơn bệnh khảm, hầu như cây vẫn tăng trưởng và
cho năng suất bình thường. BYMV là một loại virus thuộc chi potyvirus, họ
potyviridae, có vật liệu di truyền là sợi đơn RNA. So với phần lớn các
potyvirus BYMV có phạm vi ký chủ rất rộng trên toàn thế giới, có khả năng
lây nhiễm bệnh vào cả các cây họ đậu và không thuộc họ đậu.
BYMV có dạng sợi mềm, có chiều dài khoảng 750 nm, đường kính
15nm. BYMV không được lan truyền qua hạt giống mà chỉ có thê lan truyền
qua các loài rầy mềm như Aphis tabae Seop và Macrosiphum pisi Kalt. Virus
này có một số dạng chuyên tính khác nhau, gây ra các triệu chứng bệ nh khác
nhau và có thê chịu được độ pha loãng 1:1000 và mất hoạt tính ở 56-600C
[27].
Đối với cây đậu tương, SMV và BYMV có thê nhiễm đồng thời trên
cùng một cây và triệu chứng rất khó phân biệt. Ảnh hưởng của việc nhiễm
cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tương có thê bị
giảm từ 66% - 80% [34]. Bằng các quan sát thực địa nhóm tác giả ở Ukraine


7

đã xác định được triệu chứng nhiễm hai loại SMV và BYMV ở đậu tương
vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev và kết quả đã được xác nhận bằng kính hiên
vi điện tử và kỹ thuật ELISA [41]. Trên cơ sở phân tích gen và thiết lập cây
phát sinh loài một số tác giả cho rằng BYMV phân lập từ các vùng thuộc
Cộng hòa Séc được phân bố ở ba nhóm trên sơ đồ hình cây và không phụ
thuộc vào cây chủ [45]. Phản ứng của cây đậu tương đối với SMV và BYMV
phụ thuộc vào kiểu gen của giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm,
nhiệt độ không khí và các điều kiện môi trường khác [11],[23].
SMV và BYMV có thê xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tương hoặc

có thê xâm nhiễm qua môi giới trung gian là rệp. Virus và cơ thê côn trùng có
mối quan hệ sinh học với nhau. Virus có thê tiềm ẩn một thời gian dài trong
cơ thê côn trùng, qua tuyến nước bọt đê đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua
thành ruột vào máu rồi trở lại tuyến nước bọt. Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus
được nhân lên trong cơ thê côn trùng và ở thời điêm này côn trùng có khả
năng truyền bệnh một cách nhanh chóng. Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của
côn trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thường rất ngắn [8],
[9],[11].
SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do cọ
xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thê truyền bệnh trong trường hợp hạt
phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn của cây. SMV di chuyên trong tế bào chất
và có thê di chuyên sang tế bào khác thông qua các sợi liên bào. Sau 3 ngày
virus mới nhiễm hết một lá đơn, sau 4 ngày thì mới nhiễm hết đoạn gân của lá
kép và một phần đoạn thân sát gốc [11], [47]. Sau 5 ngày virus nhiễm hết dọc
thân chính và các lá ngọn, khoảng sau 25 ngày virus có thê nhiễm trên toàn


8

cây. Khi cây trưởng thành có thê bị nhiễm virus từ 90 - 100% ở các mức độ
biểu hiện bệnh khác nhau [11], [48].
SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là
protein (60 - 95%) và nucleic acid (5 - 40%) [52]. Hệ gen của SMV và
BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)). Đời sống của Potyvirus sau khi
xâm nhập vào các tế bào chủ qua mô tổn thương bao gồm quá trình dịch mã,
xử lý polyprotein, nhân lên của mRNA, quá trình lắp ráp RNA và protein vỏ
thành hạt virus và di chuyên đến các tế bào khác, tới các bộ phận của cây và
các cây khác [48].
SMV lan truyền qua rệp vừng, bọ trĩ và hạt giống bị nhiễm bệnh. Rệp
ăn lá từ cây này sang cây khác và mang theo mầm bệnh. Trên thế giới có

khoảng 30 loài rệp truyền virus SMV. Nghiên cứu gần đây đã khẳng định rệp
vừng ở đậu tương (Aphis Glycine) là môt vector của virus khảm đậu tương.
Rệp càng nhiều thì tỉ lệ nhiễm bệnh càng cao. Vậy cách hiệu quả nhất kiêm
soát bệnh là tạo ra giống đậu tương kháng virus SMV nhằm nâng cao năng
suất và chất lượng đậu tương [8],[9].
1.1.2. Hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirrus
Các Potyvirus có dạng thanh, khúc khuỷu dài khoảng 750 nm và đường
kính là 11-15 nm và bao gồm các protein vỏ được sắp xếp đối xứng, xoắn ốc
xung quanh phân tử RNA sợi đơn dương. Phân tử RNA có khoảng 10.000
ribonucleotide. Hệ gen RNA có đầu 3’gắn đuôi poly A và một protein virion
kết nối gen (VPg) ở đầu 5’. RNA virus được dịch mã tạo ra một polyprotein
được phân cắt bởi protease tạo thành ít nhất 10 phân tử protein [39] (hình
1.2).


9

Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc hệ protein của potyvirus [39]
(UTR) vùng 5 'và 3': vùng chưa dịch mã; CP: protein vỏ của virus; Nib: RNA
polymerase phụ thuộc RNA;P1, P3, Nia: protease; CI: protein hình trụ; VPg:
protein liên kết; HC-Pro: thành phần trợ giúp và protease.

Theo Won-Seok Lim và cs (2003), trình tư nucleotide hoàn chỉnh của
hệ gen SMV chủng G5 (SMV-G5), G7H (SMV-G7H) gồm 9588 nucleotide
(chưa kê đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một
polyprotein mà sau đó được phân cắt thành 10 phân tử protein chức năng. So
sánh trình tư amino acid của 2 chủng G5 và G7 với các chủng SMV khác cho
thấy sư tương đồng lớn giữa chúng. Hệ số tương đồng về trình tư nucleotide
và trình tư amino acid suy diễn giữa chủng SMV-G5 và SMV-G7H là 99%
[38], [54]. Trình tư đầy đủ các nucleotide của các chủng này có thê cung cấp

những cơ sở đê xác định các yếu tố quyết định đến triệu chứng bệnh khảm ở
cây đậu tương, từ đó có các biện pháp hiệu quả đê phòng trừ SMV cho cây
đậu tương.
Gen CP là gen đặc trưng nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein CP được
chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi và vùng đầu C. Chức năng của CP
thê hiện trong sư nhân lên, capsid hóa, di chuyên của virus từ tế bào đến tế
bào và trong sư truyền virus của côn trùng truyền bệnh. Chính vai trò quan
trọng của gen CP đối với hoạt động sống của Potyvirus mà trình tư gen này


10

được sử dụng đê kháng lại chính các loài virus gây bệnh trong kỹ thuật
chuyên gen theo nguyên lý RNAi [18], [19], [42].
Gen CP ở SMV có kích thước là 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804
nucleotide mã hóa 267 amino acid, và từ amino acid thứ 33 đến 264 trong CP
được gọi là vùng poty-coat (CP) [38], [42].
Ở BYMV, gen CP có kích thước 933 nucleotide, vùng mã hóa gồm 822
nucleotide, mã hóa 273 amino acid, trong đó vùng Poty-coat từ amino acid
thứ 37 đến 272 [30], [38], [41]. Các số liệu so sánh cho thấy có sư khác biệt
lớn về kích thước và trình tư amino acid của CP, tuy nhiên lại có sư tương
đồng cao về trình tư ở vùng đầu C của CP [32].
Trên cơ sở đó, nhóm nghiên cứu thuộc đề tài cấp Bộ B2013 đã thiết kế
thành công vector chuyên gen thưc vât pK7GW-CPi (SMV-BYMV) mang
đoan CPi theo nguyên tắc cua kỹ thuât Gateway và biến nap vao vi khuân A.
tumefaciens.
Dựa trên nguyên lý ky thuật RNAi và đăc điêm đoan ma hoa cua gen
CP của SMV và cua BYMV, cấu truc RNAi mang hai đoạn bao thu của gen
mã hoa coat protein cua ca hai loai SMV va BYMV ky hiêu la CPi (SMVBYMV) đươc lưa chon trong vector chuyên gen. Đoan CPi (SMV-BYMV) co
kích thước 573 bp, gồm đoạn nucleotide có nguồn gốc tư gen CP cua SMV,

kích thước là 294 bp và đoan nucleotide co nguồn gốc tư gen CP cua BYMV,
kich thưc 279 bp.


11

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyên gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) [14]
P35S: Promoter CaMV35S; attB1 và attB2: các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng
LR;LB: left T-DNA border; RB: right T-DNA border; T35S: terminator 35S; Kan:
gen kháng kanamycin; CmR: gen kháng chloramphenicol; CPi: vị trí đoạn CPi
(SMV-BYMV) chèn vào; XbaI, EcoRI, HindIII: vị trí cắt của các enzyme giới hạn;
T35R, P35SF2, Fi, Ri: vị trí bám căp mồi đăc hiêu SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri

1.2. ƯNG DUNG KY THUÂT RNAi TRONG TAO CÂY THUỐC LÁ
CHUYỂN GEN KHANG VIRUS
1.2.1. Cây thuốc lá va bệnh virus trên cây thuốc lá
Cây thuốc lá có tên khoa học là Nicotiana tabacum L. Thuộc ngành Hạt
kín, lớp Hai lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có trên dưới 85 chi với
tổng số trên 1800 loài. Một số loài trong họ này được trồng rộng rãi như khoai
tây, cà chua, ớt và các loại cà, trong đó có chi Nicotiana. Đặc trưng của các loài
trong họ này là trong thân và quả thường chứa alkaloid như solanin, atropine,
scoplamin, nicotine…[1],[15].

Hình 1.4. Cây thuốc lá giống C9-1


12

Rễ thuốc lá là một hệ thống gồm rễ cái (rễ trục) và rễ nhánh (rễ bên) và
rễ hấp phụ. Ngoài ra thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, sát mặt đất. Rễ

phụ được hình thành từ trục của rễ cái, thường có độ xiên 30 – 40 độ. Rễ hấp
thu được phát triển trên các rễ nhánh. Có nhiệm vụ cung cấp nước và các chất
dinh dưỡng cho cây. Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát
gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi có độ ẩm không khí cao. Rễ thuốc lá tập
trung dày đặc ở lớp đất 0 – 30 cm, phát triển theo các hướng. Rễ thuốc lá là
cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin được vận chuyên từ rễ và tích tụ trên
thân, lá thuốc lá [15].
Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân tròn, chiều
cao thân cây có thê đạt từ 1 – 3m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá.
Đường kính thân đạt 2 – 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là
chồi nách. Có 2 loại chồi nách: Chồi nách chính và chồi nách phụ [3]. Trên
thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay đổi tùy theo
giống. Lá thuốc lá có các hình dạng như hình trứng, hình tim, hình elip, hình
mũi mác, độ dày, màu sắc lá có thê thay đổi. Lớp ngoài của biêu bì có tầng
cutin trong suốt và có phần sáp khi lá bắt đầu chín kĩ thuật. Lớp tế bào mô
giậu và mô khuyết quyết định độ dày, mỏng, đàn hồi của lá thuốc lá. Ở trên
mặt lá còn có nhiều tuyến lông đa bào, có hình dạng và kích thước khác nhau.
Các tuyến này chứa nhựa, hợp chất thơm tư nhiên và tích lũy nhiều khi lá chín
kĩ thuật. [15].
Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhụy cái ở giữa,
xung quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhụy cái. Hoa thuốc lá thuộc
loại hoa tư hữu hạn, được hình thành do sư phân hóa đỉnh sinh trưởng thân.
Chính giữa chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính
của chùm hoa [15]. Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tư phối (97%-98%),
còn lại có thê do thụ phấn chéo do gió hoặc côn trùng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

13

Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa. Mỗi cây có 100 – 150 quả
trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 – 500 quả trên
chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra. Hạt thuốc lá
rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là 0,07 – 0,10
gam, trong mỗi gam hạt có từ 10000 đến 15000 hạt [15].
Trong sản xuất nông nghiệp thiệt hại bệnh do virus gây ra là rất lớn.
Đối với cây hàng năm, sư thiệt hại thê hiện qua việc giảm năng suất hoặc gây
mất mùa toàn bộ trong vụ. Đối với cây lâu năm, cây thân gỗ, bệnh do virus
gây ra không những làm giảm chất lượng và năng suất ngay đối với cây bị
nhiễm, mà còn có nguy cơ lây lan cho các cây khỏe mạnh những năm sau.
Hiện nay, có khoảng hơn 2000 loại virus thực vật đã được phát hiện và nghiên
cứu, trong số đó khoảng môt nửa là những loài gây hại chính cho cây trồng.
Mức độ thiệt hại của các bệnh do virus gây ra cho cây trồng là rất nghiêm
trọng, có thê lên tới 95 - 100%. Sư thiệt hại không những chỉ dừng ở mức độ
suy giảm về năng suất mà còn ảnh hưởng cả đến chất lượng sản phẩm thu
hoạch [1].
Bệnh khảm lá do virus ở cac loai thưc vât khac cũng có khả năng lây
nhiễm và phát triển bệnh trên cây thuốc lá, gây hại nghiêm trọng đến năng
suất và chất lượng của lá thuốc. Bệnh nặng, phân bố rộng ở nhiều nơi và vào
bất kỳ mua vụ nào trong năm. Bệnh xuất hiện càng sớm thì càng ảnh hưởng
đến năng suất, tỉ lệ phục hồi hoàn toàn khá thấp (2,3- 5,2%). Đặc biệt, phẩm
chất của lá thuốc thường bị hại nghiêm trọng. Lá thuốc bị bệnh sau khi sấy sẽ
bị nâu đen, giòn, dễ bị nát vụn, không có mui vị thơm ngon và hút nặng. Biểu
hiện của bệnh khảm lá đầu tiên là lá nhỏ lại biến thành dạng khảm. Trên bề
mặt của lá có biêu hiện của các vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm, chỗ
nhạt. Ngoài ra còn có các biểu hiện khác như phiến lá nhăn nheo, lồi lõm do

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

14

các gân lá bị kìm hãm sinh trưởng trong khi thịt lá vẫn phát triên, kích thước
lá bị thu nhỏ lại. [1][11].
1.2.2. Cơ chế RNA interference (RNAi)
RNA interference (RNAi) là cơ chế ức chế gen sau phiên mã PTGS
(post-transcriptional gen silencing) qua trung gian là các RNA nhỏ có vai trò
ức chế siRNA (short interfering RNA) được sử dụng phổ biến nhất trong
những nghiên cứu tạo cây chuyên gen kháng virus [16]. Kĩ thuật này do hai
nhà khoa học Mỹ là Andrew Fire và Craig Mello khám phá ra và công bố trên
tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998. Khám phá cũng báo hiệu sư khởi đầu
của một lĩnh vực nghiên cứu mới. Fire và Mello đã vinh dư nhận giải thưởng
Nobel về Y học và Sinh lí học vào năm 2006 cho phát minh quan trọng này.
Cơ chế này được kích hoạt khi các phân tử ARN kép (dsRNA) xuất
hiện trong tế bào. Khi đó chuỗi dsRNA kích hoạt “cỗ máy” sinh hoá, làm suy
biến các phân tử mRNA được sao mã di truyền từ DNA không biểu hiện được
chức năng giải mã, cho ra chuỗi protein tương ứng. Đặc biệt, can thiệp RNA
với chuỗi dsRNA ngắn trực tiếp có thê thực hiện trong các tế bào động vật có
vú mà không gây nên các hiệu ứng không đặc hiệu [26], [29], [53].
Các phần tử quan trọng tham dư vào cơ chế can thiệp RNA này là
Dicer và Argonaute và những RNA kích thước nhỏ (siRNA) được tạo ra từ
RNA sợi đôi (ds RNA). Khi có sư xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tế
bào, Dicer lập tức cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn,
khoảng 21-28 nucleotides, gọi là siRNA. Sau khi bị cắt ngắn bởi Dicer, chuỗi
kép RNA can thiệp được tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn
RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất được chọn đê tiếp

tục liên kết với Argonaute. Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA này xảy ra
trong phức hệ RISC (RNA-induced silencing complex), trong đó có chứa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




15

Argounaute và Helicase. Phức hệ RISC sau đó thu nhận các phân tử phiên mã
mRNA của tế bào có trình tư tương đồng với trình tư của đoạn chuỗi đơn
RNA can thiệp lúc này đang có mặt trong phức hệ RISC. Sau khi nhận dạng
mRNA qua việc bắt cặp các bases tương đồng với trình tư của siRNA, mRNA
bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA. Phức hệ RISC sẽ cắt
mRNA, làm phân cắt phân tử mRNA.

Hình 1.5. Cơ chế hoạt động RNAi [26]
Dựa vào hoạt động của cơ chế RNAi, có thê tiến hành thiết kế các
vector chuyên gen mang cấu trúc RNAi có khả năng ức chế hoạt động của
gen ngoại lai, nhằm tạo giống cây chuyên gen kháng bệnh virus. Vector mang
gen là đoạn cDNA có nguồn gốc từ RNA của virus. Chúng được đưa vào tế
bào vật chủ đê khi virus xâm nhiễm, các đoạn cDNA này sẽ bắt cặp bổ sung
và cắt phân tử mRNA của virus thành những siRNA dẫn tới không tổng hợp
được protein và không biểu hiện bệnh [16].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




16

1.2.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo cây trồng chuyển gen kháng virus
Gần đây, RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại nhằm chống lại các
bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế
hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại
virus ở thực vật [22]. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây
trồng chuyên gen mã hoá protein của virus (gen mã hoá protein vỏ CP,
enzyme phiên mã RdRp...) có khả năng kháng lại chính virus đó đã được
chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại
virus khác nhau như: Potato virus Y PVY [46], [53], cucumber mosaic virus
CMV, Plum pox potyvirus PPV [29] Tobaco mosaic virus TMV và Potato
virus Y PVY [50], ...
Cho đến nay, đã có các loại cây trồng chuyên gen kháng bệnh virus
được công nhận như: Đu đủ chuyên gen kháng bệnh đốm vòng (papaya
ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc,
Philippine; Bí đao chuyên gen kháng ba loại virus Cucumber mosaic virus,
Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận
và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyên gen kháng Cucumber mosaic virus,
được công nhận và trồng ở Trung Quốc… Ngoài ra rất nhiều các loại cây
trồng chuyên gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm đê
được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyên gen kháng
African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyên gen kháng Maize
steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyên gen kháng đồng thời 3 loại virus
Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus
(Polerovirus); Lúa chuyên gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus);
Khoai lang chuyên gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus).
Năm 2007, Bonfim và cs đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyên gen kháng
virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Lim và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN