Xây dựng quy trình TaqMan realtime PCR phát hiện một số nhóm gene blaOXA ở Acinetobacter baumannii

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR
PHÁT HIỆN MỘT SỐ NHÓM GENE blaOXA Ở A. baumannii
NGUYỄN TUẤN ANH
HUỲNH MINH TUẤN

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 05/ 2016


ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU
XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR
PHÁT HIỆN MỘT SỐ NHÓM GENE blaOXA Ở A. baumannii

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

CƠ QUAN QUẢN LÝ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 05/2016


MỤC LỤC
Trang
TÓM TẮT............................................................................................................ 1
ABSTRACT ......................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................... 5
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................... 7
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ............................................................. 8
PHẦN MỞ ĐẦU .................................................................................................. 9
1

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN ................................................................. 11
1.1

Tổng quan vấn đề nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................ 11

1.2

Gene OXA ở A. baumannii................................................................................ 17

1.3

Hiện trạng các công trình nghiên cứu liên quan ................................................. 19

1.4

Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố ..................................... 22

1.5

Lý do thực hiện nghiên cứu ............................................................................... 24

1.6

Dự báo khả năng ảnh hưởng của kết quả nghiên cứu ......................................... 24

1.7

Mục tiêu của đề tài ............................................................................................ 25

2

CHƯƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................. 26
2.1

Vật liệu ............................................................................................................. 26

2.2

Phương pháp ..................................................................................................... 26

2.2.1

Thu nhận các chủng A. baumannii gây bệnh ............................................... 26

2.2.2

Phương pháp xác định tính nhạy cảm với kháng sinh.................................. 26

2.2.3

Thiết kế mồi và mẫu dò .............................................................................. 29

2.2.4

Phương pháp tách chiết nucleic acide ......................................................... 31

2.2.5

Phương pháp real-time PCR ....................................................................... 31

3

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ .................................................................... 35
3.1

Thu thập chủng vi khuẩn ................................................................................... 35

3.2

Thiết kế mồi và mẫu dò ..................................................................................... 36

3.3

Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR .......................................................... 36

3.3.1

Tối ưu điều kiện phản ứng monoplex real-time PCR .................................. 37

3.3.2

Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex real-time PCR ................................... 40

3.4

Đánh giá quy trình multiplex real-time PCR ...................................................... 43

3.4.1

Độ đặc hiệu của quy trình multiplex real-time PCR .................................... 43

3.4.2

Độ nhạy của quy trình multiplex real-time PCR ......................................... 44


3.4.3

Độ ổn định của quy trình multiplex real-time PCR ..................................... 44

3.4.4

Động học của quy trình multiplex real-time PCR ....................................... 46

3.5

Thử nghiệm quy trình multiplex real-time PCR ................................................. 46

4

CHƯƠNG IV – BIỆN LUẬN ................................................................. 51

5

CHƯƠNG V – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................ 56

6

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 57

7

PHỤ LỤC ................................................................................................ 63
7.1

Phụ lục 1: .......................................................................................................... 63

7.2

Phụ lục 2: .......................................................................................................... 65

7.3

Phụ lục 3: .......................................................................................................... 66

7.4

Phụ lục 4: .......................................................................................................... 68

7.5

Phụ lục 5: .......................................................................................................... 69

7.6

Phụ lục 6: .......................................................................................................... 70

7.7

Phụ lục 7: .......................................................................................................... 71

7.8

Phụ lục 8: .......................................................................................................... 72

7.9

Phụ lục 9: .......................................................................................................... 73

7.10

Phụ lục 10:..................................................................................................... 84

7.11

Phụ lục 11:..................................................................................................... 85

7.12

Phụ lục 12:..................................................................................................... 86

7.13

Phụ lục 13:..................................................................................................... 87

7.14

Phụ lục 14:..................................................................................................... 89

7.15

Phụ lục 15:..................................................................................................... 90


TÓM TẮT
Tổng quan:
Việc sử dụng kháng sinh không đúng và lạm dụng kháng sinh đã tạo
nên một áp lực chọn lọc và khiến xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng kháng
sinh gia tăng về số lượng một cách nhanh chóng. Carbapenem là kháng sinh
phổ rộng, mạnh và thường được sử dụng trong trường hợp nhiễm trùng đa
kháng thuốc. Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân gây

nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu hiện nay. Đặc biệt, các chủng A.
baumannii sở hữu một số nhóm gene

bla

OXA, có khả năng biểu hiện tính đa

kháng kháng sinh, nhất là đối với carbapenem.
Mục đích:
Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình multiplex Taq-Man real-time
PCR phát hiện 3 nhóm gene

bla

OXA-23/-51/-58 điển hình ở A. baumannii,

đồng thời với gene 16S rRNA đặc trưng cho Acinetobacter spp.
Phương pháp:
Quy trình sử dụng các mẫu dò Taq-Man được thiết kế đặc trưng cho
từng nhóm gene với các kênh màu khác nhau (Cy5, FAM, Texas Red, HEX)
để phát hiện các nhóm gene blaOXA-23/-51/-58 và gene 16S rRNA tương ứng
trong cùng một phản ứng. Phản ứng multiplex real-time PCR này được tối ưu
để đạt hiệu suất nhân bản tốt nhất cho tất cả các gene đích cần phát hiện.
Kết quả:
Kết quả cho thấy quy trình có khả năng phát hiện chính xác các gene
bla

OXA-23/-51/-58 đặc trưng của A. baumannii với độ nhạy khoảng 4 bản

sao/phản ứng và độ đặc hiệu cao, không cho tín hiệu dương tính với DNA của

nhiều loài vi khuẩn thường thấy trong bệnh viện.
Kết quả khảo sát cho thấy trong các mẫu vi khuẩn thu thập được, có 63
(54,3%) chủng được xác định là Acinetobacter spp. qua sự hiện diện của gene
16S rRNA. Trong đó, có 45 (71,4%), 38 (60,3%) và 4 (6,3%) chủng lần lượt
1


mang các gene

bla

OXA-51,

bla

OXA-23 và

bla

OXA-58. Các chủng mang gene

bla

OXA-51 được cho là các chủng A. baumannii xét trên quan điểm blaOXA-51

là chỉ thỉ sinh học phân tử đặc trưng của vi khuẩn này. Trong 45 chủng A.
baumannii (mang gene

bla

OXA-51), có 84,4% (38/45) mang thêm gene

bla

OXA-23 và 2,2% (1/45) chủng mang thêm gene blaOXA-58. Ba chủng mang

gene

bla

OXA-58 còn lại đều thuộc nhóm không có

bla

OXA-51, được xếp vào

nhóm Acinetobacter spp. Không có chủng nào mang đồng thời 3 gene
bla

OXA-51, blaOXA-23 và blaOXA-58.

Kết luận:
Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình multiplex Taq-Man realtime PCR phát hiện một số nhóm gene

bla

OXA-23/-51/-58 ở A. baumannii.

Quy trình có thể được sử dụng để đồng thời phát hiện nhanh các chủng A.
baumannii và một số nhóm gene kháng kháng sinh

bla

OXA của chúng. Quy

trình có thể được ứng dụng để nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện diện
các nhóm gene blaOXA này ở A. baumannii.

2


ABSTRACT
DEVELOPMENT OF A TAQ-MAN REAL-TIME PCR ASSAY FOR THE
DETECTION OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER
BAUMANNII
Backgrounds:
Misuse and abuse of antibiotics has created selective pressures on
bacteria and consequently antibiotic resistant bacteria quickly increase in
number. Carbapenem is a strong and extended β-lactam antibiotic which
usually used in cases of multidrug resistance. Acinetobacter baumannii
currently is one of the most leading and dangerous factors causing nosocomial
infections. In addition, A. baumannii harbouring several

bla

OXA genes could

express the ability of multidrug resistance, especially with carbapenem.
Objectives:
To set up a multiplex Taq-Man real-time PCR protocol for the

detection of several typical

bla

OXA-23,

bla

OXA-51,

bla

OXA-58 genes in A.

baumannii, together with 16S rRNA gene specific to Acinetobacter spp.
Methods:
The process was created with Taq-Man probes designed specifically to
individual genes with distinguish flourophores (Cy5, FAM, Texas Red, HEX)
to detect

bla

OXA-23,

bla

OXA-51,

bla

OXA-58 and 16S rRNA correspondingly

in one reaction. The multiplex real-time PCR was optimized to get the highest
amplification efficiency for all targeted genes.
Results:
The results showed that the protocol could detect precisely

bla

OXA-23,

bla

OXA-51, blaOXA-58 genes specific to A. baumannii with high sensitivity (4

copies/reaction) and specificity, not reacting with DNA of many common
bacteria in hospital environment.

3


The survey result showed that 63 (54,3%) Acinetobacter spp. isolates
was determined by 16S rRNA gene. In there, 45 (71,4%), 38 (60,3%) and 4
(6,3%) isolates contained

bla

OXA-51,

correspondingly. The isolates with

bla

bla

OXA-23 and

bla

OXA-58 genes

OXA-51 gene was accepted to be so-

called A. baumannii isolates based on the existence of the gene as the specific
molecular marker. In 45 A. baumannii isolates (containing
were 84,4% (38/45) isolates with extra

bla

bla

OXA-51), there

OXA-23 gene and 2,2% (1/45)

isolates with blaOXA-58 gene. The rest of isolates with blaOXA-58 gene was of
the group without

bla

OXA-51 gene. This group was determined as

Acinetobacter spp group. There was not any isolate containing simultaneously
bla

OXA-51, blaOXA-23 and blaOXA-58 genes.

Conclusions:
We built up a multiplex Taq-Man real-time PCR protocol successfully
for the detection of

bla

OXA-23,

bla

OXA-51 and

bla

OXA-58 genes in A.

baumannii. The protocol can be used to identify A. baumannii rapidly and
their antimicrobial resistance

bla

OXA genes. Potentially, the protocol might

become a tool to study molecular epidemiology of several
popularly in A. baumannii.

4

bla

OXA genes


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ak:

Akamicin

AmpC:

Chromosomally encoded cephalosporinase

ARDRA:

Amplified Ribosomal DNA Restriction analysis

ATCC:

American Type Culture Collection

BA:

Blood Agar

BHI:

Brain Heart Infusion

BLAST:

Basic Local Alignment Search Tool

CarO:

Carbapenem Resistance Outer Membrane Protein

Cip:

Ciprofloxacin

CLSI:

Clinical Laboratory Standard Institute

Co:

Colistin

Cs:

Cefoperazon Sulbactam

Ct:

Threshold Cycle

Cx:

Ceftriaxone

Cz:

Ceftazidime

dNTP:

DeoxyriboNucleotide Triphosphate

DNA:

DeoxyriboNucleic Acid

EMB:

Eosin Methylen Blue

ESBL:

Extended Spectrum β-lactamase

GES:

Guiana Extended Spectrum

IDT:

Intergrated DNA Technologies

IMP:

Imipenemase

IND:

Chryseobacterium indologenes
5


IS:

Insertion Sequence

KPC:

Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase

LB:

Luria-Bertani

Lv:

Levofloxacin

Mem:

Meropenem

MHA:

Muller-Hinton Agar

MIC:

Minimum Inhibitory Concentration

NCBI:

National Center for Biotechnology Information

NDM-1:

New-Delhi Metallo-beta-lactamase

Nel:

Neltimicin

OF:

Oxidative Fermentative

OUCRU:

Oxford University Clinical Research Unit

OXA:

Oxacillin hoặc Oxacillinase

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PER:

Pseudomonas Extended Resistance

Pt:

Piperacillin Tazobactam

rRNA:

Ribosomal RiboNucleic Acid

RNA:

RiboNucleic Acid

SME:

Serratia Marcescens Enzyme

SIM:

Sulfite Indole Motility

Tc:

Ticarcillin Clavuclanic Acid

TSI:

Triple Sugar Iron Agar

VIM:

Verona Integron-encoded Metallo-beta-lactamase

6


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân nhóm carbapenemase ............................................................ 17
Bảng 3.1 Trình tự các mồi được thiết kế....................................................... 36
Bảng 3.2 Giá trị Ct hiệu quả nhân bản của các cặp mồi/mẫu dò ................... 38
Bảng 3.3 Giá trị Ct phản ứng monoplex real-time PCR phát hiện gene 16S
rRNA.................................................................................................... 38
Bảng 3.4 Giá trị Ct tối ưu hóa nhiệt độ lai của mồi/mẫu dò .......................... 39
Bảng 3.5 Giá trị Ct hiệu quả phản ứng multiplex real-time PCR .................. 40
Bảng 3.6 Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ mồi/mẫu dò 16S rRNA trong phản ứng

multiplex real-time PCR ....................................................................... 41
Bảng 3.7. Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ MgCl2 trong phản ứng multiplex realtime PCR .............................................................................................. 42
Bảng 3.8. Giá trị Ct độ nhạy của phản ứng multiplex real-time PCR ............ 44
Bảng 3.9. Giá trị Ct độ ổn định của phản ứng multiplex real-time PCR theo
thời gian ............................................................................................... 45
Bảng 3.10. Giá trị Ct độ ổn định của phản ứng multiplex real-time PCR theo
người thực hiện .................................................................................... 45
Bảng 3.11. Giá trị Ct động học của phản ứng multiplex real-time PCR ........ 46
Bảng 3.12. Kết quả phát hiện các gene blaOXA và 16S rRNA của A.
baumannii và Acinetobacter spp. bằng phương pháp multiplex real-time
PCR...................................................................................................... 47
Bảng 3.13. Tương quan giữa sự hiện diện của gene blaOXA-23 và tính nhạy
kháng kháng sinh β-lactam ................................................................... 49

7


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Acinetobacter baumannii (nguồn: Janice Carr, CDC) .................... 11
Hình 3.1 Tỉ lệ nhạy/kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn đã thu thập .. 35
Hình 3.2. Tỉ lệ nhạy/kháng kháng sinh của các chủng Acinetobacter spp. /
A.baumannii ......................................................................................... 48

8


PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tên đề tài/dự án: Xây dựng qui trình Taq-Man real-time PCR phát hiện
một số nhóm gene blaOXA ở Acinetobacter baumannii
Chủ nhiệm đề tài/dự án: Nguyễn Tuấn Anh và Huỳnh Minh Tuấn

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện: 10/2014 – 4/2016
Kinh phí được duyệt: 80 triệu VNĐ
Kinh phí đã cấp: ..... theo Thông báo số ..../TB-SKHCN
2. Mục tiêu: Xây dựng thành công “Qui trình Taq-Man real-time PCR phát
hiện một số nhóm gene blaOXA ở Acinetobacter baumannii”. Qui trình giúp
phát hiện đồng thời một số nhóm gene blaOXA quan trọng đã xuất hiện ở A.
baumannii, có liên quan đến tính kháng carbapenem.
3. Nội dung thực hiện:
Công việc dự kiến

Công việc đã thực hiện

Thu nhận khoảng 72-100 chủng Đã thu thập 116 chủng vi khuẩn gây
A. baumanii gây bệnh kèm theo bệnh kèm theo thông tin kháng sinh
thông tin kháng sinh đồ.

đồ.

Thiết kế các bộ mồi và mẫu dò Đã thiết kế các bộ mồi và mẫu dò đặc
đặc hiệu với blaOXA-23, blaOXA- hiệu
51, blaOXA-58.

bla

với

bla

OXA-23,

bla

OXA-51,

OXA-58 của A. baumannii và 16S

rRNA của Acinetobacter spp.
Tối ưu điều kiện phản ứng real- Đã ưu điều kiện phản ứng real-time
time PCR để phát hiện các nhóm PCR (monoplex và multiplex) để phát
gene
bla

bla

OXA-23,

bla

OXA-51, hiện các nhóm gene

OXA-58.

bla

bla

OXA-23,

OXA-51, blaOXA-58 và 16S rRNA.

Đánh giá qui trình real-time PCR
Độ đặc hiệu: phản ứng đặc hiệu Độ đặc hiệu: Quy trình đặc hiệu với
9


với
bla

bla

OXA-23,

bla

OXA-51,

OXA-58 của A. baumannii

bla

OXA-23,

bla

OXA-51,

bla

OXA-58

của A. Baumannii và 16S rRNA của

Độ nhạy (ngưỡng phát hiện): Acinetobacter spp.
101-102 bản sao/phản ứng.

Độ nhạy: 4 bản sao/phản ứng

Độ ổn định: (1) người thực hiện Độ ổn định: quy trình ổn định với 3
và (2) thời điểm thực hiện khác người thực hiện khác nhau và với 3
nhau.

thời điểm thực hiện khác nhau.

Động học phản ứng: 102-108 bản Động học phản ứng: 4x100-4x108 bản
sao/phản ứng

sao/phản ứng

Thử nghiệm quy trình trên các Qui trình đã được thử nghiệm trên các
chủng A. baumannii đã thu thập chủng vi khuẩn Acinetobacter spp. /
để đánh giá tỉ lệ nhóm gene A. baumannii đã thu thập để đánh giá
bla

OXA hiện diện.

tỉ lệ nhóm gene blaOXA hiện diện.

10

1

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu trong và ngoài nước
Việc sử dụng kháng sinh không đúng và lạm dụng kháng sinh đã tạo
nên một áp lực chọn lọc và khiến xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng kháng
sinh gia tăng về số lượng một cách nhanh chóng. Khi liệu pháp dùng kháng
kháng sinh thất bại, điều đó có nghĩa là bệnh tình sẽ trở nên trầm trọng và kéo
dài, phải sử dụng các loại thuốc mạnh và mắc tiền, tiềm tàng những hiệu ứng
phụ nguy hiểm và tỉ lệ tử vong cao vì nhiễm khuẩn.
Carbapenem hiện là kháng sinh được coi là mạnh nhất hiện nay, được
sử dụng trong trường hợp các đa kháng thuốc ở vi khuẩn. Tuy nhiên, sự xuất
hiện của enzyme carbapenemase ở một số vi khuẩn khiến kháng sinh này dần
mất tác dụng độc tôn của nó. blaOXA gene ở A. baumannii là gene được xem
là có khả năng tạo ra carbapenemase và giúp vi khuẩn kháng lại kháng sinh
này. Đây là một trong những yếu tố khiến A. baumannii trở thành vi khuẩn
gây nhiễm khuẩn bệnh viện hàng đầu nguy hiểm nhất hiện nay.

Hình 1.1 Acinetobacter baumannii (nguồn: Janice Carr, CDC)
Acinetobacter baumannii là loại vi khuẩn siêu kháng thuốc với khả
năng kháng lại hầu hết các loại kháng sinh hiện nay, nổi lên như một trong
những tác nhân hàng đầu gây nhiễm trùng tại các bệnh viện trên thế giới.
Acinetobacter, trước đây có tên là Acinetobacter calcoaceticus, là vi khuẩn
11


Gram (-) cơ hội, không lên men, có nguồn gốc từ đất và nước, và có thể tìm
thấy trên da người khỏe mạnh. Có nhiều loại Acinetobacter và tất cả chúng

đều có khả năng gây bệnh cho người, trong đó Acinetobacter baumannii
chiếm hơn 80% trường hợp bị nhiễm bởi các chủng thuộc Acinetobacter [1].
A.baumannii là tác nhân chủ yếu gây viêm phổi, viêm màng não, nhiễm
khuẩn huyết, nhiễm trùng đường tiết niệu, bệnh về da và mô mềm, nhiễm
trùng hệ thần kinh trung ương. Sự nguy hiểm khi nhiễm Acinetobacter
baumannii ở chỗ nó có khả năng kháng lại tất cả các loại kháng sinh hiện nay
như

β-lactam

(penicillin,

cephalosporin,

carbapenem),

tetracycline,

aminoglycoside, fluoroquinolone [2]; và vì thế đặc biệt nguy hiểm cho những
bệnh nhân nằm viện lâu ngày (nhiều hơn 90 ngày), phải dùng các biện pháp
can thiệp như ống thở hay kim truyền liên tục, dùng quá nhiều kháng sinh phổ
rộng hoặc bị suy giảm miễn dịch, thường tập trung vào các bệnh nhân có độ
tuổi từ 70-90 tuổi. Các loại kháng sinh đặc hiệu phổ biến hiện nay có khả
năng không thể vô hiệu hóa được vi khuẩn này. Acinetobacter baumannii
đang trở thành loại vi khuẩn siêu kháng thuốc. Đây là loại vi khuẩn nguy
hiểm không những cho Việt Nam mà cho cả trên thế giới, đặc biệt là các bệnh
viện có đông bệnh nhân.
Vào những năm 70, vi khuẩn này nhạy cảm với hầu hết các lọai kháng
sinh, nhưng hiện nay đã trở thành tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện
trên toàn thế giới vì đặc tính thu nhận nhanh chóng những nhân tố kháng với

nhiều loại kháng sinh khác nhau. Hiện nay, có một số chủng Acinetobacter
baumannii đã trở nên kháng với tất cả các kháng sinh sẵn có, bằng cách thu
nhận những plasmid, transposon hoặc integron mang cụm gene mã hóa tính
kháng với nhiều họ kháng kháng sinh cùng lúc. Vì Acinetobacter baumannii
đã trở nên khó bị tiêu diệt bắt nguồn từ khả năng kháng thuốc gia tăng, như
đối với carbapenem, beta-lactam và tetracycline, hiểu biết về bộ gene của nó
cũng như các gene kháng thuốc nó sở hữu đặc biệt quan trọng để tiệt trừ hiệu
12


quả và ngăn cản sự tồn tại và lan truyền của Acinetobacter baumannii, đặc
biệt trong môi trường bệnh viện.
Tình trạng kháng kháng sinh ở A.baumannii đang ở mức báo động,
được tổ chức WHO tuyên bố là một trong năm tác nhân đa kháng phổ biến
gồm Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và Enterobacter spp.
được gọi với cái tên nhóm “ESKAPE”. Trong đó, A.baumannii đặc biệt chiếm
tỷ lệ cao (16-32%) và nổi trội, đồng thời có mức đề kháng hơn 80% với hầu
hết các loại kháng sinh trong bệnh viện. Tình trạng đa kháng thuốc ở
A.baumannii tăng trong suốt thập kỉ qua, là hậu quả của việc sử dụng kháng
sinh tràn lan. Nguy hiểm hơn khi carbapenem được coi như là lựa chọn cuối
cùng để điều trị nhiễm trùng do A.baunannii đa kháng cũng không còn hiệu
quả do sự xuất hiện của enzyme carbapenemase (đặc biệt là nhóm D βlactamase/ CHDLs) có khả năng phân hủy carbapenem, tỷ lệ kháng tăng trên
toàn thế giới, và chủng A.baumannii kháng carbapenem đủ tiêu chuẩn để xác
định là đa kháng sinh.
Trên thế giới, tại Hoa Kỳ, tần suất các loại nhiễm khuẩn bệnh viện gây
ra bởi trực khuẩn gram âm, hiếu khí, không lên men được theo dõi và báo cáo
hàng năm qua hệ thống NNIS. Trong giai đoạn 1987-1997, các loại vi khuẩn
này là tác nhân của khoảng 13% các trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện xác
định được, trong đó Acinetobacter là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện

duy nhất hiện diện ít nhất 1 lần ở tất cả các bệnh viện. [3]. Dữ liệu từ hệ thống
quốc gia giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện thu thập trong khoảng thời gian
1986 - 2003 cho thấy sự gia tăng đáng kể của các chủng Acinetobacter kháng
amikacin (5% đến 20%; p = 0,001), ceftazidime (25% đến 68%; p = 0,001) và
imipenem (0% đến 20%; p = 0,001) [4]. Trong một nghiên cứu khác cũng cho
thấy chủng Acinetobacter spp. thu thập từ năm 2004 đến năm 2005 ở 76 trung
tâm trên khắp nước Mỹ, có 60,2% chủng nhạy cảm với imipenem. Số chủng
13


Acinetobacter baumannii không còn nhạy cảm với kháng sinh chiếm tỷ lệ khá
cao: 10% đến 15% đối với carbapenem, 35% đến 40% đối với
ceftazidime/cefepime, 10% đến 30% đối với aminoglycoside và 35% đến
40% đối với ciprofloxacin/levofloxacin [1].
Ở Anh, sự nhiễm khuẩn bệnh viện do A.baumannii kháng carbapenem
đã xảy ra từ năm 2000. Giữa năm 2004 và 2008 tỉ lệ không nhạy cảm với
meropenem đã tăng từ 13 đến 29%. Trong năm 2008 sự không nhạy của
Acinetobacter với các lớp khác của kháng sinh được báo cáo:
aminoglycosides khoảng 20%; ciprofloxacin 30%; ceftazidime 70%;
cefotaxime 89%; piperacillin/ tazobactam 50%.
Ở châu Âu, tỉ lệ kháng cao nhất được báo cáo ở các vùng Địa Trung
Hải bao gồm Hi Lạp, Thổ Nhĩ Kì, Ý và Nhật. Tại 48 bệnh viện ở Châu Âu
giai đoạn 2002-2004, 73,1% các chủng Acinetobacter baumannii là nhạy cảm
với meropenem và 69,8% là nhạy cảm với imipenem.
Mỹ la tinh là một trong những khu vực có tỷ lệ Acinetobacter
baumannii

kháng

với

meropenem,

imipenem,

ceftazidime,

piperacillin/tazobactam, ciprofloxacin, hay gentamicin cao nhất thế giới.
Nghiên cứu giám sát liên quan đến Argentina, Brazil, Chile và Colombia
được thực hiện trong khoảng thời gian 1997 – 2001 cho thấy tỷ lệ kháng cao
nhất ở Argentina và không có quốc gia nào là không xuất hiện các chủng đa
kháng. [1]
Tại châu Phi, khoảng 30% Acinetobacter baumannii phân lập từ máu
có

khả

năng

kháng

carbapenem,

40%

kháng

với

cefepime

và

piperacillin/tazobactam, 30% kháng với ciprofloxacin và levofloxacin [5].
Tại châu Á và Trung Đông, tỷ lệ Acinetobacter baumannii không còn
nhạy

cảm

với imipenem và meropenem

là trên

25%, đối

với

ampicillin/sulbactam, cefepime và ceftazidime là 40%, đối với amikacin là
14


35% và đối với ciprofloxacin là 45% [6]. Nghiên cứu về dịch tễ học lâm sàng
tại các đơn vị chăm sóc sức khỏe mở rộng của Ravi và cộng sự (Ấn Độ, 2013)
cho thấy mô hình kháng thuốc của A. baumannii là kháng đa thuốc với tỉ lệ
92%, vượt xa hai đối tượng còn lại là P. aeruginosa (35%) với cùng mô hình
và E. coli (5%) với mô hình kháng carbapenem [7]. Nghiên cứu về sử dụng
colistin trong điều trị của Karli và cộng sự (Thổ Nhĩ Kỳ, 2013) cho thấy tác
nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện chủ đạo là A. baumannii (48.8%), kế đến là
P. aeruginosa (22%), đồng thời A. baumannii và P. aeruginosa (17.1%) và
những vi khuẩn khác (12.2%) [8]. Báo cáo của hệ thống kiểm soát nhiễm

khuẩn bệnh viện ở Đài Loan (2011) cho thấy A. baumannii là một trong
những tác nhân phổ biến gây nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở các khu vực
chăm sóc đặc biệt, bên cạnh E. coli và Candida spp. Trong đó, tỉ lệ kháng
thuốc carbapenem của A. baumannii lên tới 62.5%, trong khi K. pneumoniae
là 10.7% và P. aeruginosa là 18.1%. [Báo cáo khoa học]
Ở Việt Nam, báo cáo “can thiệp dựa trên bằng chứng bao gồm chương
trình quản lý kháng sinh nhằm giảm gánh nặng về kháng sinh tại cạc bệnh
viện ở Việt Nam” (2013) của Mattias Larsson (OUCRU Hà Nội) và Vũ Đình
Phú (Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương) cho thấy các vi khuẩn thường
gặp gây nhiễm trùng bệnh viện là A. baumannii (22%), P. aeruginosa (13%),
K. pneumonia (11%), K. unspecified (6%) và S. aureus (6%) … (VINARES)
[Báo cáo khoa học]
Báo cáo “viêm phổi liên quan đến thở máy – chiến lượng nghiên cứu
cho Việt Nam” - 2013) của Behzad Nadjm (OUCRU Hà Nội) cho thấy tác
nhân gây viêm khí phế quản phổi liên quan đến thở máy do 80% là vi khuẩn
Gram (-) điển hình là A. baumannii và P. aeruginosa, 20% do vi khuẩn Gram
(+) mà chủ yếu là MRSA. (OUCRU) [Báo cáo khoa học]

15


Báo cáo “tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện và các yếu tố liên quan tại
bệnh viện đa khoa Đồng Nai năm 2011” cho thấy loại vi khuẩn phân lập được
từ các mẫu bệnh phẩm chiếm tỷ lệ cao nhất là Acinetobacter baumanni
(25%), kế tiếp Klebsiella pneumoniae sinh ESBL (21,9%), Escherichia coli
chiếm (18,8 %), S. aureus và Stenotrophomonas maltophilia ( 9,4%), 5 nhóm
vi khuẩn khác mỗi nhóm chiếm (3,1%). [Báo cáo khoa học]
Nghiên cứu “khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh của Acinetobacter
và Pseudomonas phân lập tại bệnh viện nhiệt đới năm 2010” cho thấy
Acinetobacter đa kháng và kháng carbapenem rất cao trong dịch hút khí quản

(75%). Hầu hết các chủng kháng imipenem cũng kháng với meropenem. [9]
Phân tích 476 mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Trưng Vương (2010) cho
thấy A. baumannii là vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện (32.3%).
Trong đó A. baumannii được phân lập chủ yếu từ bệnh phẩm đàm (39.3%) và
cũng là nguyên nhân gây bệnh phổi nhiều nhất. A. baumannii có mức độ đề
kháng cao với hầu hết kháng sinh như: Gentamycin (95.5%), Cefepime
(89.9%), Tobramycin (87%), Ceftazidime (81.5%), imipenem/Cilastatin
(79.3%) và meropenem (77.4%).
Phân tích 195 mẫu bệnh phẩm tại viện Pasteur (2013) cũng cho kết quả
tương tự bệnh viện Trưng Vương. 80% A. baumannii được phân lập từ đờm,
mức độ kháng kháng kháng sinh của vi khuẩn này hầu như trên 90%, vẫn
nhạy hoàn toàn với Colistin.
Một phân tích từ 7 bệnh viện ở Việt Nam (2013) cho thấy có đến 80%
Acinetobacter spp. là A. baumannii, và mức độ đề kháng kháng sinh rất cao:
imipenem 76.5%, meropenem 81.3%; các kháng sinh khác hầu hết đều bị
kháng trên 80%, đáng lo ngại nhất là A. baumannii kháng colistin đến 15.7%.

16


1.2 Gene OXA ở A. baumannii
Carbapenemase là enzyme bất hoạt carbapenem và một số β-lactam
khác. Carbapenemase thuộc lớp A, B và D trong hệ thống phân loại Ambler.
Mỗi lớp có những loại enzyme khác nhau ở cấp độ phân tử.
Bảng 1.1 Phân nhóm carbapenemase
Hệ thống
Ambler

Hệ thống
BushJacoby

Tên thông
thường

Kháng với kháng sinh

A

2f

Serine
carbapenemase

Carbapenem, penicillin,
cephalosporin, aztreonam

B

3a

Metallocarbapenemase

Tất cả β-lactam ngoại trừ
aztreonam

C

1

Serine

cephalosporinase

D

2df

Carbapenemase

Penicillin, cephalosporin, bao
gồm cefoxitin, cefotetan,
cetriaxone, cefotaxime
Carbapenem, penicillin,
cephalosporin, aztreonam

Ví dụ
KPC,
GES,
SME
IMP,
NDM,
VIM, IND
AmpC
OXA

Hai hệ thống phân loại β-lactamase: Ambler và Bush Jacoby. Hệ thống phân loại Ambler gồm 4 lớp, đặt tên
từ A đến D, dựa trên sự tương đồng về trình tự amino acid. Hệ thống phân loại Bush-Jacopy gồm 4 nhóm, đặt
tên từ 1 đến 4, dựa trên cơ chất (imipenem) và chất ức chế (clavulanic acid).

Carbapenemase được tìm thấy ở Enterobacteriaceae, Pseudomonas
spp. và Acinetobacter spp. Phần lớn gene kiểm soát sự sản xuất

carbapenemase có thể được vận chuyển dễ dàng bằng plasmid và hầu hết các
chất ức chế β-lactamase, như clavulanic acid, tazobactam và sulbactam,
không có khả năng kháng lại carbapenemase.
Nhóm carbapenemase lớp D còn được gọi là oxacillinase (OXA).
Chúng có hoạt tính bản thể kháng lại với carbapenem và hoạt tính đó có thể
gia tăng bởi những nhân tố điều hòa biểu hiện gene
nguồn. Các gene

bla

bla

OXA ở vùng thượng

OXA có thể nằm trên bộ nhiễm nhiễm sắc thể vi khuẩn

hoặc plasmid. Tính nguy hiểm của OXA carbapenemase là khả năng đột biến
nhanh chóng và mở rộng phổ kháng.

17


Các gene

bla

OXA được phát hiện tồn tại chủ yếu ở K. pneumoniae ở

Thổ Nhĩ Kỳ và Bỉ. Hiện nay, các gene này còn hiện diện chủ yếu ở P.
aeruginosa, A. baumannii và Enterobacteriaceae. [10, 11]

A. baumannii sản xuất oxacillinase một cách tự nhiên. Bình thường, các
enzyme này có hoạt tính carbapenemase nhưng không đáng kể. Tuy nhiên,
bla

OXA có lẽ khi được biểu hiện vượt mức và dẫn tới tính kháng carbapenem

mạnh ở A. baumannii nhờ có trình tự chèn (IS) ở vùng thượng nguồn, có vai
trò như promotor điều khiển sự biểu hiện gen [12-15]. Bên cạnh đó, tiếp thu
một số gene blaOXA cũng là nguyên nhân dẫn tới tính kháng carbepenem ở A.
baumannii [2]. Oxacillinase có khả năng thủy giải carbepenem (carbapenem
hydrolyzing oxacillinase – CHDL) đã thường được phát hiện ở các chủng
baumannii kháng carbapenem [2].
Nhóm CHDL thứ nhất, đại diện là
hiện ở Scotland nãm 1995 [16].

bla

bla

OXA-23 và blaOXA-27, được phát

OXA-23 là dạng CHDL phổ biến nhất ở A.

baumannii đã được phát hiện trên toàn thế giới (Romania, Brazil, South
Korea, China, Russia, French) [17-20].

bla

OXA-23 đã được xác định là một

phần của cấu trúc transposon Tn2006 và Tn2007 [21].
Nhóm CHDL thứ 2, đại diện là

bla

OXA-24,

bla

OXA-25,

bla

OXA-26 và

bla

OXA-40, đã được phát hiện ở A. baumannii [17, 22-24]. Những CHDL này

cũng được phát hiện trên khắp thế giới và hiện diện ở trên nhiễm sắc thể vi
khuẩn hoặc plasmid của chúng. Sự giảm biểu hiện của ORF mã hóa porin, 43kDa, có cấu trúc tương tự protein biến nhiệt A của Acinetobacter khi kết hợp
với sự hiện diện của blaOXA-24 đóng vai trò trong sự kháng lại carbapenem ở
A. baumannii. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của những porin như thế thì vẫn
chưa được biết [25-28].
Nhóm CHDL thứ 3, đại diện là blaOXA-58 và

bla

OXA-97, đã được phát

hiện đầu tiên ở Pháp và theo kết quả điều tra dịch tễ phân tử cho thấy blaOXA18


58 đã lan rộng trên toàn thế giới [28-30].

bla

OXA-58 được xác định nằm trên

plasmid và liên quan tới trình tự chèn IS (mà không liên quan đến
transposon). Những trình tự này có lẽ đóng vai trò nào đó trong sự biểu hiện ở
mức độ cao của nhóm CHDL này [31].
Đề tài xác định mục tiêu xây dựng qui trình real-time PCR phát hiện 3
nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 vì qua khảo sát sơ bộ của nhóm
nghiên cứu trên 252 chủng A. baumannii,
chủ yếu (theo thứ tự giảm dần) là

bla

bla

OXA carbapenemase ở Việt Nam

OXA-51,

bla

OXA-23 và

bla

OXA-58.

bla

OXA-24 không được phát hiện trong khảo sát sơ bộ này nên nhóm nghiên

cứu không đưa vào quy trình. Hiện nay, chưa có thông tin điều tra dịch tễ
chính thức về các gene blaOXA lưu hành ở Việt Nam.
1.3 Hiện trạng các công trình nghiên cứu liên quan
Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về A. baumannii và tính kháng
thuốc của chúng, liên quan đến gene

bla

OXA gần đây tập trung vào các nội

dung như:
Nghiên cứu tính kháng kháng sinh và sự đa dạng di truyền của các gene
OXA mã hóa cho enzyme carbapenemase ở A. baumannii. Kết qủa cho thấy
cơ chế kháng carbapenem chủ yếu tồn tại ở những chủng A. baumannii phân
lập từ không khí là do gene blaOXA-23 và blaOXA-51. [32]
Nghiên cứu sự phân bố của các chủng A. baumannii mang gene
bla

OXA-23 và tính kháng carbapenem ở nhiều tỉnh của Trung Quốc. Kết quả

cho thấy có sự phân bố rộng rãi của các chủng kháng carbapenem mang gene
bla

OXA-23. [33]
Nghiên cứu tính kháng kháng sinh và cơ chế di truyền liên quan đến

tính đa kháng của A. baumannii ở Istanbul, Thổ Nhĩ Kỳ. Multiplex PCR được
19


ứng dụng để xác định sự hiện diện của các nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-24,
bla

OXA-51 và blaOXA-58 cùng một số gene khác. Kết quả cho thấy có sự hiện

diện phổ biến của các chủng mang gene

bla

OXA-51. Kế đến là các chủng

mang gene blaOXA-23. Các chủng mang gene blaOXA-24 và blaOXA-58 chiếm
tỉ lệ nhỏ. [34]
Nghiên cứu các gene kháng thuốc ở những chủng A. baumannii đã biết
kiểu hình đa kháng cho thấy sự đa dạng di truyền liên quan hiện tượng đa
kháng này, trong đó có sự hiện diện của nhóm gene

bla

OXA-58 và PER. Kết

luận của nghiên cứu cho rằng phát hiện các gene liên quan đến tính đa kháng
là điểm khởi đầu để đưa ra những phương án phù hợp nhằm giới hạn sự lan

truyền của những chủng vi khuẩn nguy hiểm. [35]
Nghiên cứu sử dụng PCR để phát hiện các gene mã hóa carbapenemase
ở A. baumannii. Kết quả cho thấy đã phát hiện được các chủng mang gene
bla

OXA-23. Kết quả được khẳng định bằng giải trình tư gene và hoạt tính của

enzyme cắt giới hạn. [36]
Nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ cơ chế kháng carbepenem của một số
chủng A. baumannii phân lập ở USA và Mexico. Các chủng nghiên cứu đều
cho kết quả âm tính với các gene metallo-β-lactamase và OXA đã biết bằng
PCR. Bằng phương pháp biến nạp, phasmid mang gene mới kháng
carbapenem đã được phát hiện. Giải trình tự gene cho thấy đó là các

bla

OXA-

235, blaOXA-236 và blaOXA-237. [37]
Nghiên cứu chỉ ra cơ chế kháng carbapenem chủ yếu ở các chủng A.
baumannii là do blaOXA-23. Trong khi đó, gene CarO liên quan đến tính thấm
trên màng, đóng vai trò phụ trong cơ chế này. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng
thấy rằng các allele CarO khác nhau và sự biểu hiện của chúng có lẽ liên quan

20


đến tính kháng imipenem. Nghiên cứu nhấn mạnh tính chất phức tạp trong cơ
chế kháng đối với tính kháng carbapenem. [38]
Nghiên cứu sự nhiễm khuẩn bệnh viện ở những cơ sở chăm sóc sức

khỏe mơ rộng tại Ai Cập cho thấy các chủng A. baumannii phân lập được với
tính kháng carbapenem có tỉ lệ cao (74%). Hơn nữa, 100% các chủng này
mang gene blaOXA-23 và blaOXA-51. Nghiên cứu cảnh báo sự lây lan của các
chủng A. baumannii mang gene blaOXA-23 ở Ai Cập. Sự lây lan này rất nguy
hiểm cho cộng đồng và đòi hỏi cần phải có những phương cách kiểm soát
nhiễm khuẩn nghiêm ngặt. [39]
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về A. baumannii và tính kháng
thuốc của chúng, liên quan đến gene

bla

OXA gần đây tập trung vào các nội

dung như:
“Nghiên cứu tính kháng thuốc của A. baumannii phân lập được ở 7
bệnh viện tại Việt Nam” của tác giả Nguyễn Thị Thanh Hà và cộng sự cho
thấy có sự gia tăng tính kháng thuốc của A. baumannii tại 7 bệnh viện ở 3
miền khác nhau của Việt Nam. Tỷ lệ kháng thuốc thay đổi theo vùng, lức
tuổi, khoa điều trị. Nghiên cứu kết luận cần phải có một chính sách kiểm soát
nhiễm khuẩn do A. baumannii và tính kháng thuốc của vi khuẩn này ở mọi
cấp độ bệnh viện, vùng và quốc gia. [40]
“Nhiễm khuẩn bệnh viện do A. baumannii – khó khăn trong trị liệu do
vi khuẩn đa kháng thuốc” của tác giả Trần Quang Bính, bệnh viện Chợ Rẫy
(2010) cho thấy các chủng A. baumannii phân lập được đề kháng hoàn toàn
với các kháng sinh đang dùng như cephalosporin thế hệ thứ 3 và thứ 4,
quinolone,

aminoglycoside,

piperacilline-tazobactam,

ngay

cả

với

carbapenem, chỉ còn nhạy cảm với colistin. Colistin hiện là một kháng sinh
không có sẵn trong bệnh viện. Thuốc trôi nổi trên thị trường không đảm bảo
21