Nghiên cứu phân lập và giám định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus suis gây viêm phổi lợn tại Thái Nguyên

DANH MỤC VIẾT TẮT
S. suis
Cs
CP
VP
HIP
ESC
PYRA
GAL
GUR
GAL
PAL
LAP
ADH
RIB
ARA
MAN
SOR
LAC
TRE
INU
RAF
AMD
GLYG
TT
CPS
Bp
PCR

Streptococus suis
Cộng sự

Cổ phần
Voges Proskauer
Thuỷ phân Hippuric acid
Esculin
Pyrrolidonyl Arylamidase
Galactosidase
Glucuronidase
Galactosidase
Alkaline Phosphatase
Leucine Amino Peptidase
Arginine Dihydrolase
Ribose
Arabinose
Mannitol
Sorbitol
Lactose
Trehalose
Inulin
Raffinose
Amidon
Glycogen
Thể trọng
Capsule polysaccharide
Base pair
Polymerase Chain Reaction
DANH MỤC BẢNG

STT
Tên bảng
1 Bảng 3.1. Trình tự Nucleotide của CPS

2 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR (từ khuẩn lạc)
Bảng 2.5. Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một
3
số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) [29]
4 Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus suis
5 Bảng 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của những chủng phân lập được
6 Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy vi khuẩn S.suis
7 Bảng 4.4. Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học
của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được bằng hệ thống
ii

Trang
21
22
24
27
28
30
32


API 20 Strep
8
9
10
11
12

34

Bảng 4.5. Kết quả PCR

Bảng 4.6. Kết quả xác định được triệu chứng điển hình của lợn
mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra
Bảng 4.7. Kết quả xác định được bệnh tích điển hình của lợn
mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra
Bảng 4.8. Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn
Bảng 4.9. Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị

iii

35
36
38
39


DANH MỤC HÌNH
STT
1
2
3
4

Tên hình
Hình 3.1. Cách tiến hành nhuộm Gram
Hình 3.2 . Hệ thống API 20 Strep
Hình ảnh 4.1. Đĩa nuôi cấy vi khuẩn sau 12 giờ trên môi trường
Hình ảnh 4.2. Hình thái vi khuẩn S. suis

iv

Trang
19
21
29
29


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................ii
DANH MỤC VIẾT TẮT........................................................................................iii
MỤC LỤC............................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG..............................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH.............................................................................................vii
Chương 1: MỞ ĐẦU.............................................................................................1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài.................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.......................................................................................2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn........................................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học.........................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn..........................................................................................2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................3
2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus suis.....................................................3
2.1.1. Đặc điểm hình thái......................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm nuôi cấy.......................................................................................3
2.1.3. Đặc tính sinh hóa........................................................................................4
2.1.4. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn..................................................................5
2.2. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra..........................7
2.2.1. Đặc điểm bệnh.............................................................................................7
2.2.2.Triệu chứng và bệnh tích..............................................................................7

2.2.3. Các biện pháp phòng bệnh..........................................................................9
2.2.4. Điều trị bệnh..............................................................................................11
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước..................................................11
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước..............................................................11
2.3.2. Tài liệu nghiên cứu ngoài nước.................................................................12
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................15
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................15
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................15
v


3.1.2. Phạm vi nghiên cứu...................................................................................15
3.1.2.1. Thời gian nghiên cứu..............................................................................15
3.1.2.2. Địa điểm nghiên cứu..............................................................................15
3.2. Nội dung nghiên cứu....................................................................................15
3.3. Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu..........................................................15
3.4. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................16
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu...............................................................................16
3.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn...............................................................16
3.4.3. Phương pháp nuôi cấy...............................................................................17
3.4.4. Phương pháp giám định đặc tính sinh hóa...............................................20
3.4.5. Phương pháp xác định Streptococcus suis bằng kỹ thuật PCR.................21
3.4.6. Phương pháp xác định triệu chứng, bệnh tích điển hình của lợn mắc bệnh
viêm phổi.............................................................................................................23
3.4.7. Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các
chủng vi khuẩn S.suis phân lập được..................................................................24
3.4.7. Phương pháp thử phác đồ điều trị............................................................25
3.5. Phương pháp phân tích số liệu....................................................................26
Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................................27
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus suis.............................................27

4.2. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn............................................................................28
4.2.1. Kết quả xác định số loại khuẩn lạc từ mẫu bệh phẩm..............................28
4.2.2. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy vi khuẩn Streptococcus suis..............30
4.3. Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn
S. suis phân lập được bằng hệ thống API 20 Strep.............................................31
4.4. Kết quả thử phản ứng PCR..........................................................................33
4.5. Kết quả xác định được triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh viêm phổi
do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra tại thực địa.............................................34
4.6. Kết quả thử kháng sinh đồ............................................................................37
4.7. Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn
Streptococcus suis gây ra....................................................................................39
vi


Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................41
5.1. Kết luận........................................................................................................41
5.2. Đề nghị.........................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................42

vii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngành chăn nuôi 6 tháng đầu năm 2017 gặp khó khăn trong khâu tiêu thụ,
đặc biệt là chăn nuôi lợn, nguyên nhân do những năm trước tình hình chăn nuôi
thuận lợi, giá cả ổn định nên người dân đầu tư mở rộng đàn, dẫn đến tình trạng
cung vượt cầu khiến cho giá lợn giảm sâu, người chăn nuôi chịu thua lỗ nặng.
Tổng số đàn lợn cả nước ước tính đến tháng 1/10/2017 là 24,7 triệu con giảm 5,7%

so với cùng kỳ năm 2016. Sản lượng thịt lợn hơi xuất chuồng 6 tháng ước đạt 2.202
nghìn tấn, tăng 2,7% so với cùng kỳ năm trước theo Thống kê chăn nuôi [17].
Mặt khác khi mức sống của người dân tăng lên thì nhu cầu về sử dụng
thực phẩm sạch đang là vấn đề mà xã hội quan tâm, do đó mà ngành chăn nuôi
nói chung và nhất là chăn nuôi lợn nói riêng phải tạo ra số lượng cũng như phải
đảm về chất lượng sản phẩm. Việc này đòi hỏi công tác thú y phải chú trọng hơn
nữa để chúng ta có những biện pháp hợp lý đáp ứng với nhu cầu của xã hội.
Dù không phải là bệnh truyền nhiễm nhưng Bệnh viêm phổi lợn là một
bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn, bệnh tồn tại rất lâu trong cơ thể lợn cũng như
ngoài môi trường làm công tác phòng bệnh rất khó khăn, khi bị mắc bệnh, chi
phí điều trị lớn, thời gian và liệu trình điều trị kéo dài. Mặt khác một thực tế đặt
ra là: bệnh mang tính chất mãn tính nên người chăn nuôi khó nhận định rõ ràng
về hậu quả như viêm phổi thùy hoặc làm cho dịch tích tụ giữa phổi - màng phổi,
được gọi là tràn dịch màng phổi hoặc viêm phổi cũng có thể tạo ra các khoang
chứ mủ (áp xe) trong phổi là một biến chứng nguy hiểm... làm cho lợn còi cọc,
chậm lớn, tiêu tốn thức ăn cao, giá thành sản phẩm thiếu cạnh tranh. Cho tới nay
ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh viêm phổi lợn, tuy nhiên
mới chỉ tập chung vào tỷ lệ nhiễm, dịch tễ học, và phác đồ phòng trị bệnh, còn
các kết quả phân lập và giám định thì rất ít các tác giả nghiên cứu.
Xuất phát từ thực tiễn sản xuất nhằm mục đích trên hiểu rõ hơn về đặc
tính nuôi cấy và giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus suis từ
đó xây dựng kế hoạch về phòng và trị bệnh một cách có hiệu quả, chúng tôi tiến
1


hành nghiên cứu đề tài :“Nghiên cứu phân lập và giám định một số đặc điểm
sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus suis gây viêm phổi lợn tại Thái
Nguyên”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập và xác định đặc điểm nuôi cấy, đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

S.suis gây bệnh viêm phổi ở lợn tại Thái Nguyên.
- Dựa vào kết quả xác định đặc điểm phân lập và giám định đặc tính sinh
hóa để xây dựng được phác đồ điều trị bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococus
suis.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Xác định được vai trò vi khuẩn Streptococcus suis trong bệnh viêm phổi.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ cho nghiên cứu
tiếp theo về bệnh viêm phổi ở lợn.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Phân lập, xác định vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh viêm phổi ở
lợn. Xây dựng thành công được phương pháp chẩn đoán bệnh viêm phổi do vi
khuẩn Streptococcus suis.
- Điều này phục vụ cho công tác phòng và điều trị bệnh viêm phổi ở lợn.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus suis
2.1.1. Đặc điểm hình thái
Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy vi khuẩn Streptococus suis
thuộc giống Streptococcus, họ Streptococcaceae, bộ Lactobacillales, lớp Bacilli.
Streptococcus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu hoặc hình trứng đường kính
nhỏ hơn 1μm, chúng thường đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hoặc thành từng chuỗi
ngắn như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau. Chiều dài của chuỗi tuỳ
thuộc vào điều kiện môi trường.
Vi khuẩn thuộc nhóm yếm khí tùy tiện, không di động, không sinh nha
bào, nhưng có khả năng hình thành giáp mô. Sự hình thành giáp mô có thể xác

định được khi chúng sinh sống trong các mô hoặc phát triển trong các môi
trường nuôi cấy có chứa huyết thanh.
2.1.2. Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn được nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu là có dạng hình cầu, kích
thước 0,5 - 1μm, đứng thành dạng chuỗi 5 - 10 tế bào. Trong canh trùng già, sau
30 giờ nuôi cấy, vi khuẩn có thể thay đổi tính chất bắt màu, chuỗi cũng thấy dài
hơn. Đặc biệt, khi nuôi cấy trong môi trường dạng lỏng, hình thái các chuỗi
được nhìn thấy rõ nhất. Vi khuẩn Streptococcus suis (S.suis) là những vi khuẩn
hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, gây bệnh thích hợp ở nhiệt độ 37ºC và phát triển
tốt trên nhiều loại môi trường như:
- Môi trường nước thịt: Vi khuẩn Streptococcus suis hình thành hạt hoặc
những bông, rồi lắng xuống đáy ống. Sau 2 giờ nuôi cấy môi trường trong, đáy
ống có cặn.
- Môi trường thạch thường: Vi khuẩn Streptococcus suis hình thành
khuẩn lạc dạng S, khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám
- Trên môi trường đặc: Có thể quan sát thấy khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy
với kích thước khoảng 1 - 2 mm. Sau 72 giờ thì kích thước khuẩn lạc lớn nhất,
có thể đạt tới 3 - 4 mm. Nếu được nuôi trong điều kiện có 5 - 10% CO2 thì khuẩn
3


lạc sẽ phát triển nhanh hơn và rộng hơn. Khuẩn lạc thường tạo chất nhầy mạnh,
độ nhầy càng rõ và tăng nếu như vi khuẩn được nuôi cấy vài giờ vào môi trường
nước thịt có bổ sung huyết thanh trước khi cấy sang môi trường đặc hoặc thạch
máu. Dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch thường nhỏ và khô hơn trên môi
trường có bổ sung dinh dưỡng.
- Trên môi trường thạch máu: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tròn, gọn,
hơi vồng, sáng trắng, mịn, dung huyết sau 24 giờ nuôi cấy.
- Trên môi trường MacConkey: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24 giờ nuôi cấy, hình
thành các khuẩn lạc nhỏ bằng đầu đinh ghim (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [15].

2.1.3. Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn Streptococcus suis có khả năng lên men đường glucose, lactose,
succrose, inulin, trehalose, maltose, fructose; không lên men các loại đường
ribose, arabinose, sorbitol, mannitol, dextrose và xylose. Các phản ứng Oxydase,
Catalase, Indol: Âm tính (Trịnh Phú Ngọc, 2002) [10].
* Cấu trúc kháng nguyên
- Vi khuẩn Streptococcus suis có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp và
có rất nhiều kháng nguyên đã được tìm thấy đó là:
+ Kháng nguyên thân (Somatic antigen): Kháng nguyên thân có ý nghĩa
quan trọng trong việc quyết định độc lực của Streptococcus suis. Kháng nguyên
thân nằm ở thành vi khuẩn (Cell wall) và được cấu tạo bởi các phân tử
peptidoglycan ở lớp trong cùng (N-acetylglucosamine và N-acetylmuramic acid),
tiếp đến là lớp giữa gồm các polysaccharide (N-acetylglucosamine và rhamnose),
lớp ngoài cùng là các protein gồm M protein, lipoteichoic acid, R và T protein.
+ Kháng nguyên bám dính (Fimbriae antigen): Vai trò của kháng nguyên
bám dính của Streptococcus suis còn chưa được biết đến một cách rõ ràng, nhưng có
ý kiến cho rằng chúng đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn bám dính
vào tế bào biểu mô của vật chủ. Vi khuẩn Streptococcus suis là một trong số ít các
loại vi khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này. So với các loại vi khuẩn khác thì
kháng nguyên bám dính của vi khuẩn Streptococcus suis có cấu trúc mỏng, ngắn,
đường kính khoảng 2 m, và dài có khi tới 200 m (Jacques và cs, 1990) [24].
4


+ Kháng nguyên giáp mô (Capsule antigen): Kháng nguyên giáp mô có vai
trò quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn, kháng lại khả năng thực bào của cơ 33
thể vật chủ. Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng các chủng Streptococcus suis có
giáp mô thì có độc lực và có khả năng gây bệnh, còn các chủng không có giáp mô
thì không có khả năng này (Higgins và Gottschalk, 2002) [22].
- Phân loại vi khuẩn Streptococcus suis theo serotype:

Trước đây, Streptococcus suis được phân loại huyết thanh học thành các
nhóm theo ký hiệu S, R, RS và T. Sau đó, các nhóm S, R và RS này lần lượt
được thay thế bằng các serotype ký hiệu lần lượt là serotype1; 2 và 1/2 (Windsor
và Elliot, 1975) [36], còn nhóm T được thay thế bằng serotype 15 (Gottschalk và
cs, 1989) [20]. Các chủng Streptococcus suis được phân thành 35 serotype dựa
trên cấu trúc kháng nguyên polysaccharide của giáp mô (ký hiệu từ 1 đến 34 và
1/2) (Perch và cs, 1983; Higgins và cs, 1995) [27], [23]. Trong đó, đáng chú ý
nhất là các chủng Streptococcus suis thuộc serotype 2 phân lập được thường
xuyên nhất ở lợn và cũng là nguyên nhân gây ra các thể bệnh nguy hiểm khác
nhau ở lợn và người (Higgins và Gottschalk, 2002) [23]. Các chủng thuộc các
serotype gây ra các thể bệnh khác nhau. Thậm chí các chủng vi khuẩn thuộc
cùng một serotype cũng có thể gây ra các thể bệnh khác nhau do vùng địa lý mà
chúng phân bố. Một số serotype không có độc lực và có thể được phân lập từ
lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng lâm sàng như các serotype 17; 18; 19 và
21 (Higgins và Gottschalk, 2002) [23].
Đỗ Ngọc Thúy và cs (2009) [16] khi xác định serotype trong 211 chủng
Streptococcus suis phân lập được từ lợn tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam cho biết số
chủng thuộc serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất 14/211 chủng (6,6%); serotype 9 có
10/211 chủng (4,7%); serotype 9, 31, 32 có 7/211 chủng (3,3%); các serotype 7,
serotype 17 và serotype 21 có tỷ lệ tương đương là 1,4%; serotype 8 chiếm 0,9%.
2.1.4. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn
Những hiểu biết về các yếu tố độc lực của vi khuẩn Streptococcus suis
còn rất hạn chế, phần lớn những nghiên cứu được tiến hành với các chủng thuộc
serotype 2. Các nhà khoa học đều có chung quan điểm là có sự tồn tại của chủng
5


độc và chủng không độc của vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2. Thành phần
polysaccharide của giáp mô (capsular polysaccharide - CPS) được xác định là
yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn này vì các chủng đột biến không có giáp

mô đều thể hiện là không có độc tính và nhanh chóng bị loại bỏ khỏi hệ thống
tuần hoàn của lợn và chuột 34 trong các thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm. Tuy
vậy không phải tất cả các chủng có giáp mô đều là chủng độc (Lun và cs, 2007)
[25]. Các yếu tố độc lực khác ngoài polysaccharide giáp mô của Streptococcus
suis, bao gồm:
- Yếu tố gây dung huyết, hay còn gọi là “suilysin” có trọng lượng phân tử
65 kDa và có độ phóng xạ riêng là 0,7x106 Units/ mg. Suilysin (SLY) thuộc về
nhóm độc tố với những đặc điểm chung là dễ bị oxy hoá và bị hoạt hóa bởi một
số hóa chất khử, dễ bị ức chế bởi cholesterol với nồng độ loãng, ức chế tính hoạt
động của một số lượng ít, gốc N- của chuỗi amino acid của suilysin giống với
perfringolysin O, streptolysin O, listeriolysin O, alveolysin, pneumolysin. Trong
điều kiện invitro trên chuột và lợn đã được chứng minh là có khả năng tạo ra miễn
dịch khi được tiêm vaccine chứa suilysin để kháng lại vi khuẩn Streptococcus
suis serotype 2 gây bệnh. Suilysin là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn S.
suis vì sự trung hoà của yếu tố này đủ để bảo vệ chuột thí nghiệm chống lại các
tác động có hại của vi khuẩn S. suis serotype 2 (Gottschalk và cs, 1998) [21].
- Hai loại protein là protein giải phóng muramidase (Muramidase released protein - MRP) có trọng lượng phân tử 136 kDa và protein giải phóng
yếu tố ngoại bào (Extracellular factor - EF) đã được xác định là các yếu tố độc
lực quan trọng trong sinh bệnh học của Streptococcus suis serotype 2 gây bệnh ở
lợn và người (Vecht và cs, 1991) [33]. Các nghiên cứu về gây bệnh thực nghiệm
trên lợn cũng đã cho thấy các chủng vi khuẩn có mang 2 yếu tố gây bệnh này
(MRP+ và EF+) đã được phân lập từ các phủ tạng của lợn sau khi gây nhiễm với
các triệu chứng điển hình của bệnh, trong khi đó các chủng không mang các yếu
tố gây bệnh này (MRP- và EF-) có thể phân lập được thường xuyên trong
amidan của lợn khỏe và không có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm (Vecht
và cs,(1985), (1991), (1992) [35] [33] [34]; Smith và cs, 1992) [31]). Ở Việt Nam,
6


Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (1994) [13] tiêm 0,2 ml vi khuẩn Streptococcus suis

vào dưới da cho chuột bạch, chuột chết sau 24 - 36 giờ, chỗ tiêm áp xe có mủ và
đã phân lập lại được vi khuẩn từ máu tim .
2.2. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra
2.2.1. Đặc điểm bệnh
Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra ở lợn đã được thông báo là
xảy ra ở hầu khắp các nước trên thế giới đặc biệt là các nước có ngành chăn nuôi
lợn phát triển. Khả năng gây bệnh của S. suis phụ thuộc vào nhiều yếu tố như
sức đề kháng của con vật, điều kiện vệ sinh môi trường, chế độ chăm sóc nuôi
dưỡng, thời tiết khí hậu, tính chất kháng nguyên và độc lực của vi khuẩn sản
sinh. Bệnh có thể bị lây nhiễm từ trại lợn này sang trại khác thông qua vật chủ
trung gian là ruồi. Enright và cs (1987) [19] cho biết ruồi có thể mang S. suis
serotype 2 tới 5 ngày và có thể làm nhiễm mầm bệnh vào thức ăn mà chúng đậu
phải ít nhất là trong vòng 4 ngày .Pijoan (1996) [28] đã xác định hầu hết lợn sau

cai sữa đều 36 có mang các chủng vi khuẩn S. suis nhưng chỉ có một số ít các
chủng này có khả năng gây bệnh cho lợn giai đoạn sau đó.
2.2.2.Triệu chứng và bệnh tích
Clifton-Hadley (1983) [18] nghiên cứu ở lợn gây bệnh thực nghiệm và quan
sát lợn trong các ổ dịch tự nhiên cho thấy lợn từ 1- 3 tuần tuổi thường mắc thể viêm
não và viêm màng não với các triệu chứng như ủ rũ, kém ăn, sưng hầu, khó nuốt, đi
lại khó khăn, lông khô, dựng đứng, sốt, da mẩn đỏ. Lợn hoạt động khó khăn, đi lại
loạng choạng, khi nằm có biểu hiện tư thế như bơi chèo, tê liệt. Lợn mắc bệnh có
hiện tượng viêm một khớp, khớp viêm thường là khớp bẹn, đầu gối hoặc khớp bàn
chân. Các tổn thương đầu tiên bao gồm thủy thũng, sưng khớp, màng khớp sung
huyết, dịch khớp đục. Triệu chứng và các thể bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis
gây ra ở lợn là rất phức tạp, khó nhận biết và khó phân biệt khi bệnh có biểu hiện
bội nhiễm, kế phát bởi một số vi khuẩn khác. Các biến đổi về bệnh tích vi thể không
có sự sai khác giữa các serotype gây bệnh và thường tập trung ở não, phổi, tim và các
khớp. Các tổn thương quan sát thấy như viêm màng não, viêm não, viêm phổi - màng
phổi có mủ hoặc viêm phổi kẽ (Reams và cs, 1994,1996)[29][30].

7


Các thể bệnh và bệnh tích của bệnh do các serotype khác nhau gây ra là
không giống nhau (Vansconcelos và cs, 1994) [32]. Các biến đổi về bệnh tích vi
thể không có sự sai khác giữa các serotype gây bệnh và thường tập trung ở não,
phổi, tim và các khớp. Các tổn thương quan sát thấy như viêm màng não, viêm
não, viêm phổi - màng phổi có mủ hoặc viêm phổi kẽ (Reams và cs, 1994) [31].
Các triệu chứng bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra ở lợn rất đa dạng,
bao gồm như viêm não, nhiễm trùng máu, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, viêm
đa thanh mạc, viêm màng bụng, viêm phổi và thường dẫn đến chết đột ngột
(Higgins và cs, 2002; Lun và cs, 2007) [22], [25]). Lê Văn Tạo (2005) [14] cho
biết để gây bệnh vi khuẩn S. suis sau khi vào cơ thể sẽ nhân lên tại hạch hạch
nhân rồi vào máu gây nhiễm trùng huyết, nên triệu chứng đầu tiên là sốt 40,6 41,7º C, triệu chứng thần kinh như run rẩy, đứng không vững, liệt, dẫn đến chết.
Triệu chứng, bệnh tích và các thể bệnh thường thấy:
- Thể nhiễm trùng huyết:
+ Lợn bệnh sốt rất cao (41 - 42ºC), chảy nước mắt, ly bì, nằm bệt, niêm
mạc đỏ sẫm, da đỏ tím từng mảng. Lợn bệnh chết trong khoảng 1 đến 3 ngày, tỷ
lệ chết lên đến 100%.
+Bệnh tích: da đỏ tím từng mảng, tụ huyết và xuất huyết ở một số phủ
tạng (lách, thận, hạch lâm ba).
- Thể viêm não tuỷ:
+ Lợn bệnh sốt cao, bỏ ăn, đi lại siêu vẹo, run rẩy, co giật, nôn mửa, hôn
mê và chết sau 2-3 ngày. Bệnh thường thấy ở lợn sau cai sữa và lợn từ 2-3 tháng
tuổi, tỷ lệ chết 100%.
+ Bệnh tích: màng não tụ huyết và xuất huyết, dịch não và tủy vẩn đục.
- Thể viêm họng, viêm phế quản, viêm phổi:
+ Lợn bệnh sốt cao, chảy nước mắt, dịch mũi, họng sưng, bỏ ăn, thở khó,
thở nhanh; da tụ huyết từng mảng. Thể này thường gặp ở lợn con và lợn sau cai

sữa, tỷ lệ chết 60 -70%.
+ Bệnh tích: hạch amidan sưng, tụ máu, niêm mạc phế quản tụ huyết,
niêm mạc mũi có màng giả, tiểu phế quản và phế nang viêm có dịch thẩm xuất,
8


có mủ và bọt khí; hạch phổi sưng, tụ huyết. Lợn bị bệnh thể phổi gây ra bệnh
tích ở phổi có các mức độ biểu hiện khác nhau từ viêm phổi - màng phổi dạng
nhục hoá đến viêm phổi dạng fibrin có mủ.
- Thể viêm hạch:
+ Lợn sốt cao, hạch hầu và hạch mang tai sưng thủy thũng, sau thành
apxe mủ, lâu thành bã đậu. Bệnh thấy ở lợn vỗ béo, diễn biến 5-8 ngày, tỷ lệ
chết 20-30%.
+ Bệnh tích: hạch hầu, hạch trước vai, trước đùi sưng tụ huyết ở giai đoạn
đầu, giai đoạn cuối viêm bã đậu.
2.2.3. Các biện pháp phòng bệnh
- Phòng bệnh bằng vệ sinh, chăm sóc, nuôi dưỡng và quản lý trong chăn
nuôi lợn việc chia đàn, phân ô chuồng theo từng loại lợn là rất cần thiết. Với lợn
con sau cai sữa, cần chia thành các ô nhỏ để đạt được tốc độ tăng trưởng tối đa
vì khả năng lây truyền bệnh khi nuôi nhốt với mật độ cao là rất lớn. Để chủ động
phòng bệnh ở lợn do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra cần:
+ Thường xuyên thực hiện phun thuốc diệt ruồi, muỗi để ngăn chặn nguồn
mang mầm bệnh vào chuồng trại. Thu gom rác, phân, chất độn chuồng, nước
thải; phun thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các loại thuốc sát trùng như
NaOH 2%, Benkocid Han-Iodine 10% ... theo đúng qui định.
+ Chú trọng khâu chăm sóc nuôi dưỡng và quản lý đàn; hạn chế sự xâm
nhiễm và lây lan dịch bệnh nên thực hiện chính sách “Cùng vào cùng ra”.
+ Bổ sung kháng sinh vào thức ăn để giảm tỷ lệ lợn khoẻ mang trùng
+ Lợn con sau khi sinh cần được bú đầy đủ sữa đầu của mẹ để có đủ
kháng thể bảo vệ chúng trong giai đoạn đầu - là giai đoạn dễ cảm nhiễm với

bệnh nhất.
+ Loại bỏ những lợn mang trùng và có hướng điều trị kịp thời lợn mắc bệnh.
+ Không được vận chuyển lợn từ vùng có dịch sang vùng khác.
Đối với các vùng chăn nuôi tập trung và các trang trại, biện pháp tốt nhất
là tự sản xuất lấy con giống. Khi nhập lợn về phải nuôi cách ly tại khu vực nuôi

9


cách ly ít nhất 15 ngày. Sau đó kiểm tra thấy lợn khoẻ mạnh bình thường và
không có dấu hiệu gì về bệnh thì mới tiến hành cho nhập đàn.
+ Khi có dịch xảy ra, phải cách ly những con bệnh ra khu vực nuôi cách
ly để tránh lây lan. Theo dõi và điều trị kịp thời những con bị bệnh. Với những
con không có khả năng chữa khỏi thì tiến hành loại thải. Trong quá trình theo
dõi, phải cách ly tuyệt đối không được nhập đàn mới vào, thường xuyên phun
thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các thuốc sát trùng nhằm nhanh chóng
tiêu diệt mầm bệnh Phạm Sỹ Lăng và cs, (2012) [5].
- Phòng bệnh bằng vaccine Hiện nay, các loại vaccine được sử dụng để
phòng bệnh do Streptococcus suis gây ra cho lợn chủ yếu là các vaccine chuồng
và hiệu quả bảo hộ của các loại vaccine này cũng chưa được xác định một cách
rõ ràng. Có thể do một số nguyên nhân của hiện tượng kháng nguyên bị biến
tính mất tính đặc hiệu do quá trình xử lý bằng nhiệt hoặc formalin, do sự sản
sinh kháng thể đối với các kháng nguyên mà không có liên quan đến độc lực của
vi khuẩn và sự thiếu hụt các chủng Streptococcus suis hay serotype liên quan
đến quá trình sinh bệnh học Higgins và cs, (2002) [22]. Các nhà khoa học cũng
đã chế tạo thử nghiệm nhiều loại vaccine khác nhau như vaccine toàn khuẩn,
vaccine sống nhược độc, vaccine tiểu phần (chế từ kháng nguyên giáp mô hoặc
các protein thành tế bào). Tuy nhiên, miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí
nghiệm được tiêm các loại vaccine này cũng rất thất thường và không ổn định.
Trong một số trường hợp khẩn cấp, việc lựa chọn dùng vaccine vẫn là phương

thức tối ưu nhất để bảo vệ đàn lợn. Ở Việt Nam, từ các kết quả nghiên cứu về
bệnh cầu khuẩn ở lợn, Khương Thị Bích Ngọc (1996) [12] đã chế tạo vaccine cầu
khuẩn chết có bổ trợ keo phèn tiêm phòng cho lợn nái, đạt hiệu quả bảo hộ tương
đối cao. Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng vaccine cầu khuẩn để tiêm phòng cho
đàn lợn ở nước ta chưa được phổ biến rộng rãi, bệnh liên cầu khuẩn vẫn thường
xuyên xẩy ra ở lợn gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi.

10


2.2.4. Điều trị bệnh
Trong thực tế, khi sử dụng kháng sinh có độ mẫn cảm cao để điều trị cho
lợn mắc bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra đã mang lại hiệu quả. Tuy
nhiên, sử dụng kháng sinh để điều trị phải dùng sớm và chỉ có hiệu quả tốt khi
con vật chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng hay chưa có biểu hiện quá
ủ rũ, bỏ ăn. Điều trị muộn thì hiệu quả sẽ rất kém hoặc không có hiệu quả. Chẩn
đoán phát hiện sớm bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra và điều trị bằng
kháng sinh thích hợp là biện pháp nhằm tăng khả năng sống sót cho đàn lợn.
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Theo Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [11] cho biết: Các chủng Sreptococcus
phân lập được từ lợn các tỉnh phía bắc Việt Nam đều mang hình thái, tính chất
sinh hóa giống như các chủng chuẩn đã được mô tả trong các tài liệu trước đây.
Kiểm tra tính chất mọc của Streptococcus trên môi trường: Thạch thường: khuẩn
lạc mọc yếu, khuẩn lạc trắng, trong, tròn, gọn. Thạch máu: khuẩn lạc mọc tốt,
màu hơi tím, lồi, tròn, gọn, mịn, dung huyết. Thạch Edward: khuẩn lạc nhỏ mịn,
ướt, tròn gọn, trong, mặt hơi lồi, màu hơi tím. Thạch Shapman: không mọc, màu
đỏ tươi. Nước thịt 5% huyết thanh: mọc tốt, hơi đục.Trên môi trường
MacConkey: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành các khuẩn lạc
nhỏ bằng đầu đinh ghim (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001; Trịnh Phú Ngọc và cs,

1999; Phạm Sỹ Lăng và cs, 2006) [15], [11], [7]. Theo (Lê Văn Tạo, 2005) [14]
cho biết: Streptococcus luôn có mặt trong hạch amidan và xoang mũi của một
số lợn khỏe mà không có triệu chứng lâm sàng. Streptococcus có thể gây bệnh
quanh năm, nhưng các vụ dịch thường xảy ra vào đầu mùa xuân hoặc sau khi
có những thay đổi thời tiết đột ngột. Bệnh có thể lây qua đường tiêu hóa, hô
hấp và qua da.
Gần đây nhất là ở Tứ Xuyên, Trung Quốc ổ dịch liên cầu khuẩn bắt đầu
xuất hiện từ cuối tháng 6 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. Theo thống kê có
6736 lợn bị mắc bệnh vói 641 ổ dịch, số lợn chết là 319 con. Quan trọng hơn
vi khuẩn liên cầu thuộc serotype 2 đã làm cho 214 ngưòi bị nhiễm bệnh và 44
11


ngưòi tử vong (Đăng Văn Kỳ, 2007 [3])
Cũng theo Phạm Sỹ Lăng, 2007 [4] Võ Tiến Thoại, Khương Bích Ngọc
(1981-1983) đã nghiên cứu các ổ dịch viêm đường hô hấp cấp, nhiễm trùng
huyết ở lợn do liên cầu khuẩn ở Hà Nội và Hà Nam.
Nguyễn Thị Nội và Nguyên Ngọc Nhiên, (1993) [9] đã điều tra hệ vi
khuẩn đường hô hấp của 162 lợn bị bệnh ho thở truyền nhiễm thấy rằng tỷ lệ
phân lập được S. suis 74%.
Thời gian gần đây, theo nghiên cứu của Viện thú y Quốc gia đã phân lập
được 35 serotype, trong đó serotype 2 có 8 chủng. Tuy nhiên đầu năm 2007 đến
nay không phát hiện được ổ dịch do vi khuẩn liên cầu hoặc các bệnh trên lợn ở
Việt Nam. Các trường hợp bị bệnh đơn lẻ, các thể chưa được xác định (Đăng
Văn Kỳ, 2007 [3]).
Ở Việt Nam, Trịnh Phú Ngọc (2002) [10] khi kiểm tra khả năng mẫn
cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Streptococcus phân lập được cho
thấy số chủng mẫn cảm với Penicillin G biến động từ 59,09 - 63,63%. Sau đó,
Trương Quang Hải và cs (2012)[1] khi xác định khả năng mẫn cảm với kháng
sinh của vi khuẩn Streptococcus suis phân lập được ở lợn mắc bệnh viêm phổi

cho biết các chủng vi 6 khuẩn Streptococcus suis mẫn cảm cao với các loại
kháng sinh như ceftiofur, florfenicol, amoxicillin, amikacin và có hiện tượng
kháng lại mội số kháng sinh streptomycin, neomycin, tetracycline, penicillin G.
Điều này đã thể hiện theo thời gian vi khuẩn Streptococcus suis đã có hiện tượng
kháng thuốc với một số kháng sinh thông dụng như streptomycin, neomycin,
tetracycline và penicillin G.
2.3.2. Tài liệu nghiên cứu ngoài nước
Các Streptococcus dung huyết alpha mới từ các nhiễm khuẩn huyết ở lợn
lần đầu tiên được Moore xác định về huyết thanh vào giữa năm 1956 - 1963 là
các nhóm Lancefield mới R, S, RS và T. Ở Anh, đã cho thấy rằng nhóm S của
Moore giống như Streptococcus PM và cả hai đều thuộc nhóm D Lancefield; đã
đặt tên là Streptococcus suis serotype1. Năm 1975, Windsor và Elliott đã phân
lập các streptococcus khác của lợn tương ứng với nhóm R của Moore và đặt tên
12


chúng là Streptococcus suis serotype 2. Các vi khuẩn phân lập được phản ứng
với cả kháng huyết thanh đối với serotype 1 và 2 được gọi là serotype V2 (nhóm
RS ban đầu). Phân lập Streptococcus thuộc nhóm T từ các mẫu tăm bông ở hạch
amidan, âm đạo, nếp gấp đầu âm vật đã được Clifton - Hadley báo cáo vào năm
(1983) [18]. Nhóm T Lancefield được gọi là Streptococus suis serotype 15 năm
1989 (Gottschalk và cộng sự, 1989) [20].
Các chủng tham chiếu có nguồn gốc từ lợn bệnh, ngoại trừ typ 14 có giáp
mô, phân lập được từ người, các typ có giáp mô 17, 18, 19 và 21 được phân lập
từ lợn khỏe mạnh về lâm sàng, các typ có giáp mô 20 và 31 từ các bò bị bệnh và
typ 33 từ cừu bị bệnh (Gottschalk và cộng sự, 1989; Higgins và cộng sự, 1995)
[20] [23]. Loài này có sự khác biệt về mặt di truyền và không có mối quan hệ đặc
biệt với các loài Streptococcus khác được khảo sát. Sự đa dạng di truyền giữa các
thành viên của Streptococcus suis rất quan trọng và điều này cần được tính đến
trong chẩn đoán, giám sát và kiểm soát bệnh.

Mặc dù serotype 2 phân lập được chiếm ưu thế ở hầu hết các nước, tình
hình có thể khác nhau tùy thuộc vào vị trí địa lý. Ví dụ, tỷ lệ mắc nhiễm
serotype này từ gia súc bị bệnh ở Canada ở mức tương đối thấp (dưới 25%)
trong 10 năm qua (Higgins và Gottschalk 2002) [25]. Tình hình này rất khác so
với các nước Châu Âu, serotype 2 được phân lập thường xuyên ở Pháp, Ý và
Tây Ban Nha. Về vấn đề này, người ta giả thuyết rằng serotype. 2 ở Châu Âu và
Bắc Mỹ có thể có độc lực khác nhau. Ở Nhật, serotype 2 cũng là serotype phổ
biến nhất (28%) .
Vi khuẩn có thể sống sót trong nước ở 4°C trong 1-2 tuần. Ở trong phân
cấy thí nghiệm,vi khuẩn sống ở nhiệt độ 0°C, 9°C và 22-25°C được 104, 10, và
8 ngày tương ứng. Do đó vào mùa hè hoặc ở nhiệt độ từ 22-25°C, vi khuẩn có
thể tồn tại khoảng 8 ngày trong phân, nhưng < 24 giờ trong bụi. Streptococcus
suis serotype 2 đã thể hiện tồn tại trong xác chết để thối rữa ở các trại. Thời gian
sống sót là 6 tuần ở 4°C và 12 ngày ở 22-25°C, có khả năng tạo ra nguồn nhiễm
khuẩn được lây lan gián tiếp do chim, chuột, hoặc chó (Clifton-Hadley và cộng
sự 1983) [18]. Về vệ sinh các chuồng bị nhiễm, các chất tẩy uế khử trùng sử
13


dụng phổ biến có thể diệt Streptococcus suis serotype 2 trong vòng chưa đầy 1
phút, ngay cả ở các nồng độ trong nước cất thấp hơn so với các sản phẩm được
các nhà sản xuất khuyến cáo. Sự có mặt của chất bẩn và chất hữu cơ bảo vệ một
số vi khuẩn khỏi bị tác động của các chất tẩy uế hóa học, và do đó việc loại bỏ
bụi bẩn trên bề mặt chuồng nuôi là một phần quan trọng của quy trình tẩy uế.
Streptococcus suis typ 2 đã sống sót trong 2 giờ ở 50°C, nhưng chỉ trong 10 phút
ở 60°C. Nước nóng có thể được sử dụng, nhưng nước từ máy giặt áp suất nóng
sẽ nguội đi trên bề mặt chuồng và thường dưới 50°C. Do đó, giá trị của nó là
làm loãng vi sinh vật gây ô nhiễm và rửa sạch bề mặt bẩn chứ không phải là giết
chết bằng nhiệt (Clifton-Hadley và Enright 1983) [18].
Phần lớn nghiên cứu về các yếu tố độc lực của S. suis đã được ttiến hành

với các chủng của serotype 2, các nhà nghiên cứu đồng ý về sự tồn tại của các
chủng vi khuẩn có độc lực và các chủng không có độc lực của serotype này. Hậu
quả là có sự khác biệt tồn tại trong các tài liệu liên quan đến độc lực của cùng
một chủng (Gottschalk et al.1998) [21]. Một trong những ứng dụng thực tiễn
quan trọng nhất của việc xác định các yếu tố độc lực là sử dụng yếu tố đánh dấu
độc lực để phân biệt độc lực với các chủng không có độc lực. Cho đến nay, chưa
có chất đánh dấu độc lực như vậy cho Streptococcus suis. CPS là yếu tố chống
thực bào quan trọng, và những phát hiện này đã làm thay đổi đáng kể các nghiên
cứu về sinh bệnh học của viêm màng não Mặc dù thực tế CPS thể hiện là yếu tố
độc lực quan trọng, nhiều chủng không có giáp mô không có độc lực cho thấy có
các yếu tố độc lực quan trọng khác.

14


Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Vi khuẩn Streptococcus suis gây viêm phổi lợn.
- Bệnh viêm phổi lợn.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
3.1.2.1. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 11 năm 2017 đến tháng 3 năm 2018
3.1.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công ty CP thuốc thú y Đức Hạnh
Marphavet
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, xác định đặc tính nuôi cấy và giám định một số đặc tính sinh
học của vi khuẩn Streptococcus suis trong mẫu bệnh phẩm lợn bị viêm phổi.

- Xác định các triệu chứng, bệnh tích điển hình của lợn mắc bệnh viêm
phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra.
- Xây dựng phương pháp điều trị lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn
Streptococcus suis gây ra.
3.3. Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu.
3.3.1. Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm: phổi và dịch cuống họng của lợn ốm hoặc chết có triệu
chứng, bệnh tích nghi viêm phổi.
Động vật thí nghiệm: Lợn nghi mắc bệnh viêm phổi do Streptococcus suis
3.3.2. Máy móc
- Tủ ấm 37o, tủ sấy, buồng cấy, kính hiển vi có vật kính dầu, vật kính khô
hoặc phản pha, nồi hấp ướt, cân điện, tủ lạnh, lò vi sóng
3.3.3. Dụng cụ
Panh, kéo nhỏ, đèn cồn. Que cấy, đĩa petri để đổ môi trường, lam kính,
kính lúp, lamen (coverslip).
15


3.3.4. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường chọn lọc Streptococcus (Edward medium hoặc thạch máu
có bổ xung polymicin B và crystal violet); Môi trường thạch máu cừu/bò.
- Môi trường đường inulin, mannitol, raffinose, trehalose.
- Môi trường Voges- Proskauer (VP); Môi trường nước thịt có 6,5% NaCl.
- Huyết thanh chuẩn S.suis nhóm D (R,S).
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu bệnh phẩm được lấy theo triệu chứng lâm sàng:
Dùng dao mổ cắt phần phổi có bệnh tích viêm phổi và cuống họng của
những lợn có triệu chứng điển hình mắc viêm phổi được mổ khám; Con vật
dùng để lấy mẫu đều chưa được sử dụng thuốc kháng sinh điều trị. Các mẫu

bệnh phẩm được bảo quản trong túi nylon vô trùng ở điều kiện 4ºC và nhanh
chóng được đưa về phòng thí nghiệm.
3.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
Với mỗi mẫu bệnh phẩm của vi khuẩn Streptococcus suis tiến hành thí
nghiệm như sau:
- Mẫu bệnh phẩm là phổi và dịch họng của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi.
- Số lượng mẫu bệnh phẩm lấy để xét nghiệm là 30 mẫu , những mẫu lấy có
triệu chứng điển hình mắc bệnh viêm phổi và chưa sử dụng thuốc kháng sinh điều
trị thì được sử dụng lấy mẫu để phân lập vi khuẩn.

- Cấy mẫu bệnh phẩm nghi Streptococcus suis lên đĩa thạch máu (5% máu
cừu). Ria cấy phân tách vi khuẩn Streptococcus suis lên 1 đĩa thạch máu cừu, ủ ở
tủ ấm 37oC có bổ sung 5% CO2 trong thời gian 24 giờ.
- Lựa chọn khuẩn lạc mang hình thái đặc trưng để chuẩn bị nhân giống, sử
dụng thạch máu cừu. Chọn khuẩn lạc cấy chuyển 1 đĩa thạch máu ủ qua đêm.
Tiếp tục nhặt khuẩn lạc từ đĩa thạch máu này cấy lên đĩa thạch máu mới, nuôi
cấy ở tủ ấm 37oC có bổ sung 5% CO2 trong thời gian 24 giờ để cấy thuần các
khuẩn lạc, sau đó tiến hành phương pháp nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa,
kháng sinh đồ.
16


* Quy trình phân lập vi khuẩn Streptococcus suis:
Bệnh phẩm
Soi kính hiển
vi

Nuôi cấy trên môi
trường chọn lọc

Thạch máu

Nhuộm Gram
Giám định

Một số đặc tính
sinh hóa

Kết luận:

(+)

(-)

3.4.3. Phương pháp nuôi cấy
3.4.3.1. Phương pháp kiểm tra khả năng mọc trên môi trường thạch máu
- Công thức:
Pepton
10g
NaCl
5g
Cao thịt
4g
Thạch
20g
Nước cất
1000ml
Máu thỏ hoặc máu cừu 50ml (Máu 5%)
Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH
7,4-7,6. Hấp 121oC/15 phút. Để nguội 45-500C, cho 50ml máu vào quay tròn

17


bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Nếu
môi trường màu ngả đen là máu đã chín. Để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.
3.4.3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng mọc trên môi trường thạch MacConkey
Công thức:
Pepton
Muối mật
Đỏ trung tính
pH
Lactose
NaCl
Thạch
Cách chế: Hòa tan 25g

20g
5g
0,075g
7,4
15g
5g
12g
bột trong 1 lít nước cất. Lắc đều, đun cách thủy

cho bột tan ra hết. Hấp vô trùng ở 121°C/30 phút. Rót ra các đĩa lồng, để nguội
và kiểm tra vô trùng ở 37°c trong 24 giờ.
3.4.3.3. Phương pháp kiểm tra khả năng mọc trên môi trường thạch thường
Công thức:
Pepton

10g
NaCl
5g
Cao thịt
4g
Thạch
20g
Nước cất
1000ml
Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH
7,4-7,6. Đóng ống 16mm mỗi ống 6ml. Hấp 121oC/15 phút. Để nghiêng ống
thạch cho thạch đông.
Nếu đổ đĩa: Sau khi hấp, để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.
3.4.3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng mọc trên môi trường nước thịt
Công thức :
Cao thịt
NaCl
Pepton
Nước cất

5g
5g
10g
1000ml

Cách pha chế: Đung sôi hòa tan các thành phần, điều chỉnh pH 7,2. Cho
chỉ thị màu Bromthymol blue 1,5ml tới khi có màu xanh lá mạ. Đóng ống 3ml
cho thêm ống durhar. Hấp 121ºC/15 phút.
18

3.4.3.5. Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn
Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra được tiến hành phiết lên
phiến kính, cố định, rồi nhuộm theo phương pháp nhuộm Gram. Kiểm tra hình
thái vi khuẩn dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần.
- Vi khuẩn S.suis: bắt màu Gram dương, xanh đen hoặc tím. Vi khuẩn có

hình cầu, hình bầu dục hoặc hình trứng, đứng thành từng cặp hoặc xếp thành các
chuỗi ngắn.
3.4.3.6. Phương pháp nhuộm Gram

Hình 3.1: Cách tiến hành nhuộm Gram
- Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn
từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm
khô trong không khí.
- Bước 2: Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 - 2 phút, rửa nước, thấm
khô.
- Bước 3: Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol 10% trong 1 - 2 phút, rửa nước,
thấm khô.
- Bước 4:Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô.
- Bước 5: Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fucsin trong 1 - 2phút, rửa nước, để
19