Nghiên cứu xây dựng qui trình real time PCR phát hiện vi khuẩn rickettsia gây bệnh ở người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------------

Nguyễn Thị Thu Hằng

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL-TIME PCR
PHÁT HIỆN VI KHUẨN RICKETTSIA GÂY BỆNH Ở NGƢỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

Nguyễn Thị Thu Hằng

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL-TIME PCR
PHÁT HIỆN VI KHUẨN RICKETTSIA GÂY BỆNH Ở NGƢỜI

Chuyên ngành
Mã số

: Sinh học thực nghiệm
: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS BÙI TIẾN SỸ
TS. LÊ HỒNG ĐIỆP

Hà Nội - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Thị Thu Hằng, học viên cao học khóa 2015-2017 trường
ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Sinh học thực
nghiệm, xin cam đoan.
Đây là luận văn do tôi trực tiếp thực hiện tại khoa Sinh học phân tử, Bệnh
viện TƯQĐ 108 dưới sự hướng dẫn của thầy TS.BS. Bùi Tiến Sỹ và TS. Lê Hồng
Điệp.
Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được
công bố tại Việt Nam.
Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực
và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Học viên

Nguyễn Thị Thu Hằng


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu
sắc tới TS.BS. Bùi Tiến Sỹ và TS. Lê Hồng Điệp đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận
tình, truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian
tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Hữu Song, PGS.TS. Phan Quốc Hoàn
đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện

Trung ương quân đội 108; cảm ơn các anh chị tại Khoa Sinh học phân tử - Bệnh
viện Trung ương quân đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy , cô giáo trong Khoa Sinh học
cũng như các thầy cô giáo của trường ĐH Khoa học Tự Nhiên đã giảng dạy và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp
đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.
Hà Nội, tháng

năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hằng


MỤC LỤC
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .........................................................................................1
1.1.

Giới thiệu về Rickettsiaceae .............................................................................1

1.1.1.

Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae ........................................1

1.1.2.

Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra .................................................................3

1.1.3.

Các vector lây truyền .....................................................................................3

1.2.

Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae. ..........................................5

1.2.1.

Spotted Fever Group ......................................................................................5

1.2.2.

Typhus Group ................................................................................................6

1.2.3.

Scrub Typhus Group ......................................................................................7

1.3.
1.3.1.

Đặc điểm lâm sàng, cơ chế gây bệnh do Rickettsiaceae ..................................7
Spotted fever Group .......................................................................................8

1.3.2. Typhus Group: ................................................................................................11
1.3.3. Scrub Typhus Group .......................................................................................11
1.4.

Điều trị............................................................................................................12

1.5.

Các phương pháp pháp chẩn đoán Rickettsiaceae .........................................12

1.5.1.

Phương pháp Weil – Felix ...........................................................................12

1.5.2.

Phương pháp nuôi cấy phân lập mầm bệnh .................................................13

1.5.3.

Phương pháp ELISA ....................................................................................14

1.5.4.

Phương pháp kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp ..........................15

1.5.5.

Phương pháp PCR, nested PCR ...................................................................16

1.5.6. Phương pháp real-time PCR ...........................................................................18
1.6.

Tình hình bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam ..............................................20

Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................22
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................22
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................22
2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................................22
2.2.3. Thiết bị, máy móc: ..........................................................................................23
2.2.

Sơ đồ tiến hành thí nghiệm.............................................................................23

2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................24
2.3.1. Phương pháp thiết kế mồi, probe ....................................................................24
2.3.2. Tách chiết ADN ..............................................................................................24
2.3.3. Khuếch đại gen của vi khuẩn bằng phản ứng PCR .........................................26


2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose .............................................................26
2.3.5. Phương pháp giải trình tự xác định loài ..........................................................27
2.3.6. Phương pháp nhân dòng ..................................................................................29
2.3.7. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR ........................................32
2.3.8. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật real-time PCR .................................................33
2.4. Áp dụng hai kĩ thuật real-time PCR để chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ
nhiễm O. tsutsugamushi và Rickettsia ......................................................................33
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ ............................................................................................34
3.1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O. tsutsugamushi và các
loài Rickettsia. ...........................................................................................................34
3.1.1. Thiết kế primer, probe đặc hiệu cho phản ứng PCR, real-time PCR ..............34
3.1.2. Thiết kế plasmid chuẩn dương cho phản ứng real-time PCR .........................36
3.1.3. Đánh giá độ đặc hiệu của kĩ thuật real-time PCR. ..........................................41
3.1.4. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật Real-time PCR. ..............................................43

3.2. Ứng dụng real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae trên các mẫu bệnh phẩm
nghi ngờ ....................................................................................................... 46
3.2.1. Một số đặc điểm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae ...................46
3.2.2. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae bằng kỹ thuật real-time PCR ........................47
3.2.3. Một số đặc điểm của bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae ...................................49
KẾT LUẬN ..............................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................54


DANH MỤC VIẾT TẮT
ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

IFA

Indirect Fluorescent Antibody

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

LPS

Lipopolysaccharide

O. tsutsugamushi Orientia tsutsugamushi
PCR

Polymerase chain reaction

RMSF

Rocky Mountain spotted fever

SCA

Surface cell antigen

SFG

Spotted fever group

STG

Scrub typhus group

TG

Typhus group

TSA

Type-specific antigen


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Phân loại Rickettsiaceae..............................................................................1
Hình 1.2: Hình ảnh Rickettsia trong tế bào vật chủ ...................................................2
Hình 1.3: Các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia ...................................4

Hình 1.4: Chu kỳ nhiễm bệnh Sốt Mò ........................................................................5
Hình 1.5: Phân bố các loài Rickettsiaceae gây bệnh...................................................5
Hình 1.6: Phân bố các loài Rickettsia .........................................................................6
Hình 1.7: Tình hình dịch tễ STG 2000-2014 ..............................................................7
Hình 1.8: Sự lây nhiễm của các vi khuẩn nhóm SFG trong các tế bào nội mô ..........8
Hình 1.9: Rickettsia rickettsii trong nhiễm trùng các tế bào nội mạch ......................9
Hình 1.10: Bệnh nhân nhiễm RMSF .........................................................................10
Hình 1.11: Đặc điểm bệnh STG ................................................................................11
Hình 1.12: Nguyên lý phương pháp ELISA .............................................................14
Hình 1.13: Biểu đồ đường biểu diễn tín hiệu cường độ huỳnh quang khuếch đại ...18
Hình 2.1: Sơ đồ của vector cloning pTZ57R/T ........................................................29
Hình 3.1: Trình tự vùng bảo thủ trên gen gltA .........................................................35
Hình 3.2: Trình tự vùng bảo thủ trên gen 56 kDa .....................................................35
Hình 3.3: Sơ đồ phản ứng nested PCR, semi nested PCR, real-time PCR ...............37
Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng PCR vòng trong.............................38
Hình 3.5: Độ tương đồng của trình tự PCR O2 từ mẫu SM1604 với dữ liệu trên
Genbank của O. tsutsugamushi .................................................................................39
Hình 3.6: Độ tương đồng của trình tự PCR R2 từ mẫu SM1608 với dữ liệu trên
Genbank của Rickettsia .............................................................................................39
Hình 3.7: Kết quả kiểm tra plasmid pOri và pRick bằng PCR với cặp mồi M13.. ..41
Hình 3.8: Độ đặc hiệu của kỹ thuật real-time PCR. ..................................................42
Hình 3.9: Đường chuẩn tuyến tính, tín hiệu khuếch đại thu được của pOri .............44
Hình 3.10: Đường chuẩn tuyến tính, tín hiệu khuếch đại thu được của pRick .........44
Hình 3.11: Biểu đồ tỷ lệ dương tính với 50 phản ứng real-time PCR lặp lại ...........45
Hình 3.12: Đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại phản ứng real-time PCR. .............45
Hình 3.13: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo giới tính ....................................................47
Hình 3.14: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo độ tuổi ......................................................47


Hình 3.15: Tín hiệu khuếch đại real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi. ..........48

Hình 3.16: Kết quả real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi và Rickettsia trên
bệnh phẩm nghi ngờ. .................................................................................................48
Hình 3.17: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo giới tính .................50
Hình 3.18: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo nhóm tuổi ..............50
Hình 3.19: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo địa lý .....................51
Hình 3.20: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo các tháng trong năm...... 51


DANH MỤC BẢNG, BIỂU
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR .......................................................................26
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR giải trình tự ...................................................27
Bảng 2.3: Thành phần tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự ...................................28
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng ligation ..................................................................30
Bảng 2.5: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng ....................................32
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng real-time PCR .......................................................32
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng real-time PCR phát hiện vi khuẩn ........................33
Bảng 3.1: Danh mục các cặp mồi, probe được thiết kế ............................................36
Bảng 3.2: Kết quả tạo plasmid chuẩn dương real-time PCR cho vi khuẩn ..............41
Bảng 3.3: Độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR ................................................43


MỞ ĐẦU
Bệnh truyền nhiễm luôn nhận được sự quan tâm của nền y tế toàn cầu. Những
mầm bệnh trước đây đã được kiểm soát nhưng nay thường xuyên biến đổi kết hợp
với các căn nguyên mới xuất hiện gây khó khăn cho kiểm soát dịch bệnh cũng như
điều trị bệnh truyền nhiễm. Theo CDC 4470 ca bệnh Spotted fever group được báo
cáo ở Mỹ năm 2012, 18000 trường hợp Scrub typhus group (sốt mò) được báo cáo
trong chiến tranh thế giới thứ II. Trong thời gian gần đây, ước tính mỗi năm có
khoảng 1 triệu trường hợp sốt mò và có tới 1 tỷ người sống trong các vùng lưu hành
bệnh có nguy cơ lây nhiễm thì Rickettsia là căn nguyên gây bệnh đáng được chú ý.

Rickettsia được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn nội bào bắt
buộc không thể nhận dạng bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Dựa trên
đặc điểm hình thái, kháng nguyên, và chuyển hóa, Rickettsia được phân loại thành
các nhóm sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus
Group (STG).
Dựa vào các tác nhân gây bệnh khác nhau cùng với các cơ chế lan truyền,
phân bố địa lý, sự hạn chế trong việc chẩn đoán, tình hình dịch tễ học và đánh giá
về mức độ nghiêm trọng của bệnh do Rickettsiaceae gây ra trong khu vực Đông
Nam Á được xem là một thách thức khó khăn. Hàng trăm trường hợp tử vong và
hàng ngàn trường hợp nhiễm bệnh đã không được chẩn đoán. Việc chẩn đoán bệnh
do Rickettsiaceae ở Việt Nam vẫn chủ yếu dựa vào lâm sàng và yếu tố dịch tễ. Bệnh
do Rickettsiaceae có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng dễ nhầm lẫn với nhiều bệnh
truyền nhiễm khác. Thêm vào đó, bệnh có thể để lại những biến chứng thần kinh
nặng nề và có thể gây tử vong cho bệnh nhân. Do vậy, chẩn đoán xác định căn
nguyên gây bệnh sớm và chính xác để điều trị sớm có ý nghĩa rất lớn.
Các xét nghiệm chẩn đoán mầm bệnh đã được áp dụng như phương pháp
huyết thanh học (phản ứng Weil – Felix), nhưng phương pháp này còn nhiều hạn
chế, chỉ chẩn đoán được một vài loài nhất định và dễ xảy ra các phản ứng chéo gây
sai lệch kết quả. Phương pháp phân lập mầm bệnh bằng tiêm truyền mầm bệnh,
phương pháp này nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn trong tế bào động vật rất khó và nguy


hiểm cho người thực hiện thí nghiệm. Các phương pháp gần đây như ELISA, IFA
thao tác dễ, tiết kiệm chi phí, tuy nhiên các phương pháp này chẩn đoán được khi
thời gian nhiễm vi khuẩn từ 15-26 ngày, hạn chế trong việc chẩn đoán sớm. Từ đó
đặt ra nhu cầu cần những phương pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao,
thời gian trả lời kết quả sớm. Phương pháp real-time PCR trong chẩn đoán
Rickettsiaceae gây bệnh ở người đã cho những kết quả khả quan. Phương pháp này
sẽ giúp xác định sớm, chính xác mầm bệnh, định hướng thầy thuốc lâm sàng điều trị
đặc hiệu kịp thời, làm giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong của bệnh do Rickettsiaceae.

Chính vì những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
xây dựng qui trình real-time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở
người.”
Với hai mục tiêu chính:
1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O. tsutsugamushi và các
loài Rickettsia.
2. Áp dụng kĩ thuật real-time PCR xác định các mầm bệnh gây sốt Rickettsiaceae
trên mẫu bệnh phẩm thu thập được tại Bệnh viện Trung ương quân đội 108 từ
tháng 6/2016 - tháng 9/2017.


Chƣơng 1. TỔNG

QUAN

1.1. Giới thiệu về Rickettsiaceae
1.1.1. Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae
Rickettsia được biết đến như là các căn nguyên gây bệnh ở động vật có xương
sống với các vectơ truyền bệnh thuộc nhóm động vật chân đốt. Trước đây Rickettsia
được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn không thể nhận dạng
bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Rickettsia được đặt tên sau khi nhà
bệnh học Howard Taylor Ricketts phát hiện ra mầm bệnh sốt phát ban (1906) và
ông bị chết vì nhiễm bệnh này trong thời gian nghiên cứu [20]. Bằng sự phát triển
của các kỹ thuật phân tử gần đây, sự phân loại các loài Rickettsia có sự thay đổi lớn.
Rickettsia tsutsugamushi đã được chứng minh đủ điều kiện để phân loại thành một
chi mới là Orientia [65]. Dựa trên đặc điểm hình thái, kháng nguyên và chuyển hóa,
Rickettsia được phân loại thành hai nhóm bệnh: Spotted Fever Group (SFG) và
Typhus Group (TG); Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là
bệnh sốt mò ở Việt Nam. Theo nghiên cứu của Bechah và cộng sự (2008), chi
Rickettsia có 24 loài gây bệnh và Orientia chỉ có một loài duy nhất là Orientia

tsutsugamushi (Rickettsia tsutsugamushi). Phân loại các loài Rickettsiaceae được
thể hiện như hình 1.1 [7].

Hình 1.1: Phân loại Rickettsiaceae
1


Hình 1.2: Hình ảnh Rickettsia trong tế bào vật chủ [71]
Các vi khuẩn trong chi Rickettsia là các loài sống nội bào bắt buộc có chiều
dài khoảng 0,8 - 2,0 µm, chiều rộng khoảng 0,3 - 0,5 µm, đa hình thái, hình dạng
thay đổi qua các giai đoạn phát triển: cầu khuẩn đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi
có khi xếp thành chuỗi ngắn hoặc từng đám trong hoặc ngoài tế bào. Tế bào chất
của các vi khuẩn này chứa ribosome, các sợi ADN và được bao bọc bởi cấu trúc của
tế bào Gram âm điển hình với một lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide ở
màng ngoài, nhưng không có tiên mao [53]. Bộ gene của các loài thuộc
Rickettsia là một ADN đơn dạng vòng, có kích thước lên đến 1-1,4Mbp. Có
khoảng 900 - 1500 gene tùy loài, trong đó có 704 protein và 39 RNA chung cho
tất cả các loài [4, 45]. Gen đầu tiên được sử dụng cho mục đích phát sinh loài
là 16S rDNA [55]. Sau đó, nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các trình tự gen
khác bao gồm gltA (gen mã hóa tổng hợp citrate) [57], gen mã hóa protein
17kDa [3] và nhóm gen kháng nguyên bề mặt tế bào (SCA): ompA, ompB,
sca4, sca1 và sca2 [18, 44, 56, 43]. Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự
gen mã hóa protein 17kDa không cho nhiều giá trị ý nghĩa. Ngược lại, dựa trên
trình tự gen gltA có thể xây dựng mối quan hệ phát sinh loài.
O. tsutsugamushi là vi khuẩn có chiều rộng khoảng 0,5 µm và chiều dài từ 1,2
đến 3,0µm, lớn hơn so với các vi khuẩn nhóm SFG và TG [24]. Hơn nữa cấu tạo tế
bào của O. tsutsugamushi bị thiếu lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide khác với
các loài Rickettsia khác [2]. O. tsutsugamushi có kích thước hệ gen dao động từ 2,0
đến 2,7 Mb bao gồm 1967 trình tự mã hóa protein và khoảng 46,7% là các trình tự
lặp lại [41]. O. tsutsugamushi chứa nhiều biến thể kháng nguyên, bao gồm Gilliam,

2


Kato, Karp, Kawasaki, Kuroki và các loại khác. Sự thay đổi kháng nguyên này phụ
thuộc phần lớn vào sự đa dạng của kháng nguyên đặc hiệu loài 56kDa (TSA) nằm
trên bề mặt của màng vi khuẩn [52]. Với một khung đọc mở (ORF) là 1600 bp,
TSA 56kDa gồm có 516-541 amino axit và tham gia vào việc xâm nhập vào tế bào
chủ thông qua sự kết hợp của fibronektyin. Có bốn domain biến thể trong vùng này,
các domain biến thể (VD) I-IV, chịu trách nhiệm về mức độ biến đổi kháng nguyên
lớn ở gen [37].
Họ vi khuẩn Rickettsiaceae sinh sản bằng hình thức chia đôi giống như vi
khuẩn. Tuy nhiên tốc độ sinh sản chậm so với vi khuẩn và virut khác. Trong nuôi
cấy tế bào, thời gian 1 thế hệ là 8-10 giờ ở nhiệt độ 32-35oC [53]. Dịch tễ học của
các bệnh ở người do Rickettsiaceae gây ra liên quan đến đặc điểm sinh học của
vectơ truyền bệnh. Bệnh do Rickettsiaceae rất khác nhau ở mức độ nghiêm trọng từ
bệnh nhẹ không cần điều trị đến việc nhiễm trùng đe dọa tính mạng.
1.1.2. Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra
Các bệnh gây ra bởi các sinh vật trong nhóm Rickettsiaceae được công nhận
và có thể được chia thành 3 nhóm bệnh sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus
Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG) [73].
-

Nhóm bệnh SFG được chia theo từng bệnh như sau: Rocky Mountain spotted

fever (RMSF) do Rickettsia rickettsii gây bệnh; Rickettsialpox do Rickettsia akari
gây ra; Boutonneuse fever,…
-

Nhóm bệnh TG có đặc điểm dịch tễ học giống nhau, do các loài vi khuẩn

Rickettsia prowazekii và Rickettsia typhi là căn nguyên gây bệnh chính: Louseborne typhus, Brill-Zinsser disease, Murine typhus,…
-

Tác nhân gây bệnh sốt mò (STG) chỉ có một loài duy nhất là

O. tsutsugamushi, có ba kiểu huyết thanh học chủ yếu là Karp, Gilliam, Kato.
1.1.3. Các vector lây truyền
Vật chủ mà Rickettsiaceae kí sinh rất đa dạng, tất cả các loài đều có liên
quan đến động vật chân đốt. Một số loài Rickettsiaceae có thể lan truyền trong động
vật có xương sống, một số loài gây bệnh ở người và động vật, do chúng lây truyền

3


bởi các động vật chân đốt như bọ chét, chấy, chấy hoặc ve và hiện nay các loài
Rickettsiaceae đã được công bố gần như trên toàn thế giới [49]. Cho đến nay ve, rận
và bọ chét trong giới Ixodidea, Phtiraptera, và Siphonaptera tương ứng được biết
đến như là các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia. Năm 2012,
Socolovschi và cộng sự cho rằng muỗi cũng là một trong số các vector lây truyền R.
felis đáng chú ý [62]. Mò Leptotrombidium là vector truyền bệnh của vi khuẩn
thuộc chi Orientia [25]. Động vật chân đốt đồng thời cũng là ổ chứa và nơi nhân
lên của vi khuẩn chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc lây lan. Tuy nhiên
cách thức lây truyền từ động vật chân đốt sang người là khác nhau. Vi khuẩn lây
nhiễm vào vật chủ qua nước bọt, vết đốt của côn trùng như ve, bét, chấy rận hoặc
mò mạt. Ngoài ra chúng còn được truyền qua phân qua vết xước ở da vật chủ [50].
Rickettsia và Orientia lây nhiễm sang các tế bào da như lớp nội mạc mạch máu (tế
bào bị nhiễm chính), nguyên bào sợi, tế bào nội mô bạch huyết và đại thực bào.

Hình 1.3: Các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia [38]

Các loài Rickettsiaceae được duy trì trong tự nhiên bằng cách truyền trực tiếp
hay gián tiếp tới những con bọ không nhiễm bệnh thông qua đường ruột những con
bọ này khi đốt nhưng loài gặm nhấm hay động vật khác bị nhiễm Rickettsiaceae
(hình 1.4).

4


Hình 1.4: Chu kỳ nhiễm bệnh Sốt Mò
1.2. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae.
Bệnh sốt do Rickettsiaceae được tìm thấy ở mọi châu lục trừ Nam Cực [17]

Hình 1.5: Phân bố các loài Rickettsiaceae gây bệnh.[71]
1.2.1. Spotted Fever Group
Rocky Mountain spotted fever (RMSF) chủ yếu xảy ra ở lục địa Hoa Kỳ và
cũng xuất hiện ở một số nơi miền nam Canada, Trung Mỹ, Mexico, và một phần
của Nam Mỹ. Nó hiếm khi được xuất hiện ở nơi khác [14]. RMSF lần đầu tiên được
ghi nhận và giới hạn ở khu vực núi Rocky. Báo cáo gần đây của CDC, tại Mỹ số ca
nhiễm SFG tăng từ 424 trường hợp năm 1993 lên đến 4470 trường hợp vào năm
5


2012, và năm 2014 số ca nhiễm bệnh khoảng hơn 3500 trường hợp [76]. Hơn 90%
bệnh nhân bị nhiễm RMSF trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 9. Những
người thường xuyên tiếp xúc với chó và những người cư trú gần các khu rừng hoặc
những khu vực có cỏ sẽ có nguy cơ lây nhiễm cao. Rickettsialpox có thể phân bố
rộng rãi hơn so với báo cáo trước đây. Bệnh này đã được xác định tại các thành phố
lớn ở Nga, Nam Phi và Hàn Quốc. Tại Hoa Kỳ, thường gặp nhất ở vùng Đông Bắc,
đặc biệt là ở thành phố New York. Mặc dù dịch bệnh xảy ra định kỳ thường xuyên
nhưng tỷ lệ xuất hiện bệnh đang giảm. Các báo cáo gần đây cho thấy tỷ lệ mắc bệnh

Boutonneuse fever tăng ở các nước Địa Trung Hải như Tây Ban Nha, Ý và Israel.
Cùng với African tick–bite fever của châu Phi, những ca mắc bệnh này đã được xác
định tại Algeria, Malta, Síp, Slovenia, Croatia, Kenya, Somalia, Nam Phi, Ethiopia,
Ấn Độ và Pakistan, cũng như vùng cận Sahara thuộc Châu Phi, phía Đông Caribê ,
và xung quanh Biển Đen [15, 58].
1.2.2. Typhus Group
Louse-borne typhus, Brill-Zinsser disease xảy ra ở Châu Âu, Châu Á và
Châu Phi. Các nước châu Phi, đặc biệt là Ethiopia và Nigeria là những nơi xảy ra
hầu hết các trường hợp trong 2 thập kỷ qua. Endemic murine typhus phổ biến ở các
thành phố lớn trên thế giới, nơi có nhiều chuột. Đã có tường hợp mắc bệnh là những
khách du lịch trở về từ các cảng và các khu nghỉ mát biển ở châu Á, châu Phi và
châu Âu [5, 17].

Hình 1.6: Phân bố các loài Rickettsia [38]

6


1.2.3. Scrub Typhus Group
Các ca bệnh thường thấy ở vùng nông thôn khu vực Nam Á và Đông Nam Á,
giới hạn ở khu vực địa lý bị ràng buộc bởi Nhật Bản, quần đảo Solomon và
Pakistan. Bệnh này chủ yếu ở các nước châu Á, bao gồm Nhật Bản, Hàn Quốc,
Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan và Đài Loan,… Trong chiến tranh thế giới thứ II, y
học Phương Tây đặc biệt quan tâm đến bệnh này bởi vì có khoảng 18000 ca nhiễm
bệnh trong quân Đồng Minh đóng quân tại vùng nông thôn hoặc rừng rậm khu vực
Thái Bình Dương. Sốt mò cũng được báo cáo là bệnh nhiễm trùng đứng thứ hai hay
thứ ba trong quân đội Hoa Kỳ khi đóng quân ở Việt Nam. Trong thời gian gần đây,
ước tính mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp sốt mò và có tới 1 tỷ người sống
trong các vùng lưu hành bệnh có thể bị nhiễm O. tsutsugamushi [5, 8, 61].

Hình 1.7: Tình hình dịch tễ STG 2000-2014 [28]
1.3. Đặc điểm lâm sàng, cơ chế gây bệnh do Rickettsiaceae
Các dấu hiệu và triệu chứng sớm của những bệnh nhiễm trùng này thường
không đặc hiệu và có thể giống với các bệnh do virut lành tính khác gây ra, khiến
việc chẩn đoán trở nên khó khăn hơn. Một số tiêu chí hỗ trợ chẩn đoán sớm các
bệnh về Rickettsiaceae bao gồm (1) tiền sử bị cắn hoặc tiếp xúc với vết cắn, (2) đi

7


du lịch gần đây đến các vùng lưu hành bệnh, và (3) các bệnh tương tự trong thành
viên gia đình, đồng nghiệp, hoặc vật nuôi trong gia đình.
Các loài vi sinh vật này gây bệnh bằng cách gắn vào và xâm nhập vào lớp
niêm mạc nội mô của mạch máu trong các cơ quan khác nhau bị lây nhiễm. Các yếu
tố bám dính (adhesins) giống như các protein màng ngoài cho phép vi khuẩn có thể
thâm nhập vào trong tế bào vật chủ. Khi vào bên trong, Rickettsiaceae nhân lên với
số lượng lớn trước khi phá vỡ tế bào vật chủ (đối với TG) hoặc chúng thoát ra khỏi
tế bào và phá vỡ tế bào bằng cách làm hỏng màng tế bào, tạo chiều nước đi vào (đối
với SFG) [15].
Rickettsiaceae dựa vào tế bào chất của tế bào vật chủ để sinh trưởng. Để tránh
việc bị thực bào trong tế bào vật chủ, chúng tiết ra phospholipase D và hemolysin
C, phá vỡ màng phagosomal cho phép nhanh chóng thoát khỏi tế bào đó. Ảnh
hưởng nghiêm trọng nhất là làm tăng tính thấm thành mạch, gây hậu quả là phù nề,
giảm lượng máu, giảm albumin máu, giảm áp suất thẩm thấu và hạ huyết áp.

Hình 1.8: Sự lây nhiễm của các vi khuẩn nhóm SFG trong các tế bào nội mô [71]
1.3.1. Spotted fever Group
RMSF: Trong RMSF, các vi khuẩn nhân lên trong tế bào nội mô mạch máu
và sau đó chúng đi vào mạch máu sau khi lây nhiễm qua da. Những tổn thương
mạch máu có thể xảy ra và gây ảnh hưởng ở tất cả các cơ quan, tuy nhiên nhưng tổn

thương này thường tìm thấy ở trên da và tuyến thượng thận. Trong hệ thống thần
kinh trung ương và tim, có hiện tượng đáp ứng gây tổn thương tế bào vật chủ kèm

8


thèo hiện tượng viêm mạch. Sự hoại tử thành mạch dẫn đến việc sử dụng nhiều tiểu
cầu, và đây là nguyên nhân gây giảm tiểu cầu. Nhiều yếu tố dẫn đến việc đến giảm
Albumin (ví dụ: suy thận, giảm sự hấp thu nước) và hạ Natri máu (ví dụ suy thận,
thay đổi nồng độ dịch ngoại bào, sự trao đổi ion Na+, K+ qua thành tế bào).

Hình 1.9: Rickettsia rickettsii trong nhiễm trùng các tế bào nội mạch [67]
Sốt, nhức đầu, phát ban, không tỉnh táo và đau cơ là những triệu chứng điển
hình. Sự khởi phát bệnh có thể là dần dần hoặc đột ngột, bắt đầu từ khoảng 1 tuần
(khoảng, 2-14 ngày) sau khi vết cắn từ bọ ve bị nhiễm bệnh. Thường những cơn
sốt kéo dài liên tục ở nhiệt độ 40-41oC [15]. Hiện tượng phát ban xuất hiện vào
ngày thứ 2 hoặc thứ 3 của bệnh, đầu tiên xuất hiện ở xung quanh cổ chân, hoặc
cổ tay, sau đó lan ra khắp các chi và toàn cơ thể. Hiếm khi, những vết ban có thể
mờ đi hoặc chỉ tập trung ở một phần của cơ thể. Điển hình, vết ban nhỏ (1-5mm),
lan rộng, các vết ban có thể phát triển thành vết rát đỏ và ban đốm xuất huyết.
Tuy nhiên khoảng 20% trường hợp, bệnh nhân có thể không phát ban (không
xuất hiện nốt đốm). Các triệu chứng có thể xuất hiện như viêm màng não và hôn
mê có thể kèm theo mê sảng, hay tìm thấy điểm mù ở vỏ não, bệnh động kinh,
điếc trung tâm, mất điều hoà vận động,… Các bệnh liên quan đến tim mạch cũng
thường xuyên xảy ra. Hay biểu hiện liên quan đến phổi như áp xe phổi cho đến
tràn dịch màng phổi hoặc phù phổi. Ngoài ra đau cơ là biểu hiện đặc trưng
thường xuất hiện ở bắp đùi hoặc bắp chân.

9

Hình 1.10: Bệnh nhân nhiễm RMSF [75]
Rickettsialpox: Các vi khuẩn gây bệnh này cũng gây ra triệu chứng viêm
mạch như các loài Rickettsiaceae khác. Sinh thiết cho thấy các dấu hiệu của xuất
huyết, hoại tử mao mạch, cũng như sự xâm nhập của các tế bào đơn nhân quanh
mạch. Sau giai đoạn ủ bệnh 9-14 ngày, một đốm đỏ phát triển tại chỗ bị đốt. Các nốt
sưng sau đó phát triển thành vết loét.Vết loét thường phân bố ở mặt, cổ, thân, và rất
dễ nhầm lẫn với vết ban của thuỷ đậu đặc biệt ở người lớn. Sốt không thường xuyên
(38-41°C) xảy ra và kéo dài chưa đầy một tuần. Sốt kèm theo đau đầu, ớn lạnh, đổ
mồ hôi, đau cơ, chảy nước mũi, ho, đau họng, buồn nôn, nôn mửa, đau bụng. Các
vùng xung quanh vết loét có sự nổi hạch [15].
Boutonneuse fever: Đặc điểm của bệnh này liên quan đến cấu trúc thành
mạch của lớp hạ bì tương tự như cách thức nhận biết RMSF. Tế bào nội mô của các
mao mạch, tĩnh mạch và động mạch nhỏ trong các cơ quan khác nhau cũng có thể bị
tổn thương khi bị lây nhiễm bệnh. Thời kỳ ủ bệnh thường là 6 ngày (khoảng từ 1-16
ngày). Hoại tử da do viêm mạch tại vết cắn là triệu chứng đặc trưng. Vết ban xuất
hiện vào ngày thứ 3-5 của cơn sốt. Nó lan rộng ra các chi, thân, cổ, bàn tay và gan
bàn chân trong vòng 36 tiếng, thường không có ở mặt. Tuy nhiên, 14-40% trong các
trường hợp không tìm thấy vết ban. Tổn thương này lành lại từ 10-20 ngày mà
không để lại sẹo. Khởi phát cấp tính của bệnh với sốt cao (trên 39°C), nhức đầu,
khó chịu [59].

10


1.3.2. Typhus Group:
Các đặc điểm bệnh lý của loại bệnh này cũng tương tự như ở nhóm bệnh SFG.
Tuy nhiên nhóm bệnh TG này vi khuẩn nhân lên, lan rộng và tích lũy nhiều trong tế
bào các cơ quan nội tạng cho đến khi đạt số lượng, chúng phá vỡ tế bào nội mô và
lan truyền vào trong máu. Bệnh đột ngột xảy ra 1-2 tuần sau khi bị rận nhiễm bệnh

cắn. Bệnh nhân bị sốt, nhức đầu và phát ban. Vết phát ban xuất hiện vào ngày thứ 47 của cơn sốt và lan rộng ra thân đến tay, chân, ít khi xuất hiện ở mặt, bàn tay và
bàn chân. Đầu tiên vết ban thường tập trung ở nách [11].
1.3.3. Scrub Typhus Group
Các vi khuẩn O. tsutsugamushi sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ và nhân
lên trong tế bào chất. Chúng thoát ra bằng cách nảy chồi từ màng tế bào vật chủ khi
nó xâm nhập vào tế bào liền kề. Hiện tượng viêm quanh mạch ở các mạch máu nhỏ
cũng xảy ra như bệnh do các loài Rickettsia khác gây ra. Thông thường có xuất hiện
hoại tử vùng da tổn thương ngay tại vết đốt, và nổi hạch ở các vùng xung quanh.
Thời kỳ ủ bệnh khoảng 1-2 tuần.Vết loét thường xuất hiện 1-3 tuần sau khi
tiếp xúc với sinh vật lây nhiễm. Dưới 50% số bệnh nhân, vị trí của vết cắn phát triển
thành vết hoại tử với sự gia tăng các hạch quanh như bệnh Rickettsialpox. Đây cũng
là những triệu chứng đặc trưng [11].

Hình 1.11: Đặc điểm bệnh STG [75]
A, B: Hình ảnh vết loét do O. tsutsugamushi gây bệnh;
C: Hình ảnh O. tsutsugamushi nằm rải rác trong tế bào chất của đại thực bào nhiễm
bệnh ở chuột

11


1.4. Điều trị
Doxycycline được lựa chọn để điều trị cho tất cả các nhóm bệnh do
Rickettsiaceae. Mặc dù các thuốc trong nhóm tetracycline thường không được dùng
cho phụ nữ mang thai và trẻ em, nhưng loại kháng sinh này được khuyến cáo dùng
cho các bệnh nhân khi có triệu chứng nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae bởi vì đây là
loại thuốc được cho là hiệu quả nhất. Thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hoá, có thời
gian bán thải kéo dài, và ít tác dụng phụ. Liều thường dùng là viên 100mg uống hai
lần trong một ngày, kéo dài từ 5 - 7 ngày. Chloramphenicol cũng là một loại kháng
sinh có hoạt tính điều trị bệnh này, được sử dụng bằng đường uống hoặc đường

tiêm, liều khuyến cáo là 250-500mg, 6 tiếng một lần, cho đến khi hết sốt 2-3 ngày.
Tuy nhiên việc sử dụng chloramphenicol cho thấy có nguy cơ tái phát cao hơn.
Những vùng có sự giảm đáp ứng với tetracyclines, thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên
cho thấy một liều duy nhất của azithromycin (500 mg) có thể có hiệu quả như trong
7 ngày điều trị doxycycline, kháng sinh này được xem là an toàn ở phụ nữ mang
thai. Mặc dù vậy, nghiên cứu cũng chỉ ra điều trị bằng azithromycin có nhiều tác
dụng phụ hơn [10, 29, 46].
Việc chẩn đoán nhanh và đưa ra các giải pháp điều trị thích hợp sẽ giúp bệnh
nhân tiên lượng tốt. Nhưng trong nhiều trường hợp không có các triệu chứng lâm
sàng điển hình để nhận biết như phát ban,… Bên cạnh đó, phương pháp huyết thanh
học thường chỉ chẩn đoán được khi nhiễm bệnh một vài tuần. Để không làm chậm
thời gian điều trị và có thể dẫn tới tiên lượng xấu, doxycycline được sử dụng điều trị
ngay khi nghi ngờ.
1.5. Các phƣơng pháp pháp chẩn đoán Rickettsiaceae
Qua các nghiên cứu trước đây chẩn đoán Rickettsiaceae có các phương pháp
như: phương pháp Weil – Felix, phương pháp nuôi cấy tế bào trực tiếp, ELISA,
IFA, PCR, real-time PCR.
1.5.1. Phương pháp Weil – Felix
Phương pháp Weil – Felix được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1916 bởi
Edmund Weil và Arthur Felix áp dụng để chẩn đoán Rickettsiaceae trong một
khoảng thời gian dài trên toàn thế giới [12]. Phương pháp này đơn giản dựa trên sự
12


phản ứng chéo xảy ra giữa các kháng thể được tạo ra trong giai đoạn nhiễm
Rickettsiaceae cấp tính với các kháng nguyên dòng OX (OX19, OX2, OXK) của
các loài Proteus. Nhóm Typhus Rickettsia (Rickettsia prowazekii, R.typhi) phản ứng
với P. vulgaris OX19 và STG, O. tsutsugamushi phản ứng với P. mirabilis OXK.
Nhóm SFG (R. rickettsii, R. africae, R. japonica,...) phản ứng với P. vulgaris OX2
và OX19 ở các mức độ khác nhau tùy theo loài [72]. Có 2 cách để thực hiện phương

pháp này.
Cách thứ nhất: Chuẩn bị một lam kính, nhỏ một giọt (50-100 μl) huyết thanh
bệnh nhân lên bề mặt lam kính. Bổ sung 1 giọt kháng nguyên muốn kiểm tra, trộn
lẫn hỗn hợp trong 1 phút. Kết quả dương tính khi có xuất hiện sự kết dính, tương
ứng ngưỡng khảng 1:20.
Cách thứ hai: Sử dụng 0,25% phenol làm chất pha loãng, pha loãng một dãy
các ống 1ml có nồng độ huyết thanh bệnh nhân hơn kém nhau hai lần. Một giọt
dung dịch kháng nguyên được thêm vào mỗi ống, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 50-55oC
trong 4-6 giờ. Các ống xuất hiện sựa kết tủa hay tạo hạt được cho là dương tính, với
nồng độ ngưỡng phát hiện khoảng 1:320.
Tuy nhiên hạn chế phương pháp này là độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, một vài
nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng độ nhạy vào khoảng 33% và độ đặc hiệu 46%[32].
Chính vì thế phương pháp này bị thay thế bằng các phương pháp huyết thanh học
khác, bao gồm xét nghiệm miễn dịch miễn dịch huỳnh quang (IFA), đó là tiêu
chuẩn vàng. Tuy nhiên, ở các cơ sở nhỏ hạn chế về mặt kĩ thuật thì đây vẫn là một
công cụ trong chẩn đoán và xác định các mầm bệnh gây sốt do Rickettsiaceae.
1.5.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập mầm bệnh
Rickettsiaceae là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, sự phát triển của
Rickettsiaceae phụ thuộc vào sự xâm nhập, tăng trưởng, và nhân bản trong tế bào
chất của tế bào chủ [73]. Rickettsiaceae không thể nuôi cấy trong môi trường dinh
dưỡng nhân tạo và được nuôi cấy trong mô hoặc nuôi cấy phôi. Phôi gà là môi
trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn này, sau đó nhuộm Giemsa hoặc
Macchiavello để tìm mầm bệnh được bằng các phản ứng kháng nguyên – kháng thể
với huyết thanh đặc hiệu. Đây là một phương pháp được phát triển bởi Ernest

13