Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống cây củ mài (dioscorea persimilis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

-------*****-------

PHẠM THỊ QUY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI
( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƢƠNG
PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật

HÀ NỘI, 2017


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

-------*****-------

PHẠM THỊ QUY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI
( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƢƠNG
PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. La Việt Hồng – Khoa Sinh
KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban
Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện
để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật đã giúp đỡ,
đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi
lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh
lí học thực vật trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị,
phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

PHẠM THỊ QUY


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

PHẠM THỊ QUY


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 2
4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 3
1.1. Đặc điểm và phân loại cây Củ mài ......................................................... 3
1.1.1. Phân loại thực vật cây Củ mài ............................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Củ mài ............................................... 4
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ................................................................ 5
1.1.4. Đặc điểm của dƣợc liệu và hạt tinh bột Củ mài sau khi chế biến .... 5
1.1.5. Thành phần hóa học ............................................................................. 5
1.1.6. Công dụng .............................................................................................. 6
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................. 7
1.2.1. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ....... 7
1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật .................................................. 7
1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ............................................. 7
1.2.1.3. Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào ................................. 9
1.2.2. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .................... 9
1.2.2.1. Khử trùng mẫu và cấy khởi động ..................................................... 9
1.2.2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy ........................................................................ 9

1.2.2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi ............................................................... 9
1.2.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh .......................................................................... 10
1.2.2.5. Giai đoạn đƣa cây ra đất ................................................................. 10
1.2.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật . 10
1.2.3.1. Các muối khoáng đa lƣợng và vi lƣợng ......................................... 11
1.2.3.2. Nguồn cacbon ................................................................................... 12
1.2.3.3. Các vitamin và acid amin ................................................................ 12


1.2.3.4. Các chất điều hòa sinh trƣởng ........................................................ 13
1.2.3.5. Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trƣờng ................ 14
1.2.3.6. pH môi trƣờng .................................................................................. 15
1.2.4. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật ......15
1.2.4.1. Điều kiện vô trùng ............................................................................ 15
1.2.4.2.Môi trƣờng vật lý .............................................................................. 15
1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mài ở Việt Nam và thế giới. .....16
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mái ở Việt Nam. ............ 16
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 18
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................ 18
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm .............................................................. 18
2.3.1. Thiết bị ................................................................................................. 18
2.3.2. Dụng cụ................................................................................................. 18
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy............................................................................... 18
2.5. Điều kiện nuôi cấy .................................................................................. 18
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 19
2.6.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm .......................................................... 19
2.6.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................... 19
2.6.2.1. Tạo vật liệu khởi đầu ....................................................................... 19
2.6.2.2. Tái sinh chồi: Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất điều tiết

sinh trƣởng đến khả năng tái sinh của chồi cây Củ mài. .......................... 20
2.6.2.3. Ra rễ tạo cây Củ mài in vitro hoàn chỉnh. ..................................... 21
2.6.2.4. Huấn luyện cây Củ màiin vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên........22
2.7. Phƣơng pháp thống kê. .......................................................................... 23
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 24
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu ............................................................................. 24
3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây củ mài. ............................... 25
3.2.1. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi ................................. 27


3.2.2. Ảnh hƣởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi........... 28
3.3. Ảnh hƣởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Củ mài in vitro......29
3.4. Huấn luyện cây Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên. .. 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 39


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Củ mài ......... 28
Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của BAP đến nhân nhanh chồi Củ mài
in tro ................................................................................................................ 29
Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng của BAP kết hượp NAA đến khả năng
nhân chồi Củ mài in tro .................................................................................. 29
Bảng 2.4: Công thức ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ Củ mài in
vitro ............................................................................................................... 30
Bảng 2.5: Công thức ảnh hưởng của giá thể tới sự thích nghi của cây Củ
mài ................................................................................................................. 30
Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu đốt thân cây Củ mài................ 33
Bảng3.2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6

tuần nuôi cấy ................................................................................................. 36
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi của
Củ mài nuôi cấy ................................................................................................................ 38
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA lên khả năng nhân chồi của củ mài sau 6
tuần nuôi cấy ................................................................................................... 39
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần hoá cây Củ mài in vitro
......................................................................................................................... 40


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây Củ mài ........................................................................... 11
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ......... ........................................................ 27
Hình 3.1: Vật liệu khởi đầu ............................................................. 34
Hình 3.2: Tái sinh và nhân nhanh chồi Củ mài in vitro ................... 35
Hình 3.3: Rễ cây Củ mài in vitro ..................................................... 39
Hình 3.4: Rèn luyện cây con ngoài tự nhiên .................................... 41


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

α- Napthlacetic acid

KI:

Kinetin

IBA:

Indol 3- butyric acid

IAA:

- Indole - acetic acid

BAP:

6- Benzyl amino purin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây củ mài (Dioscorea persimilis Prain et Burkill), thuộc họ Củ nâu
(Dioscoreaceae) là một trong những loài thực vật thân leo nằm trong danh
mục nhóm lâm sản ngoài gỗ [9]. Ngoài ra trong dân gian cây củ mài còn được
biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: hoài sơn, sơn dược, khoai mài, mằn
chèn, mán dịn, co mằn kép (tiếng dân tộc Thái), mằn ôn (tiếng dân tộc Nùng),
hìa dòi (tiếng dân tộc Dao), gờ lờn (tiếng dân tộc K'dong).... Cây Củ mài là
loài cây có rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, ngoài ra các lá non và
thân non cây củ mài cũng được sử dụng như một loại rau rừng [18]. Do có vị
ngọt và tính mát, mùi vị đặc trưng nên từ nhiều năm nay củ mài được chế biến

thành những mặt hàng thực phẩm đặc sản (bánh củ mài, chè củ mài,...) tại một
số vùng miền núi như Chùa Hương, Đền Hùng.
Cây củ mài ngoài vai trò chính là nguồn cung cấp lương thực, trong dân
gian còn được con người nghiên cứu và biết đến với vai trò là một vị thuốc
nằm trong danh mục Dược điển Việt Nam [1].
Trong thực tế, nhân giống in vitro các loài thuộc chi Dioscorea đã được
các tác giả tiến hành nghiên cứu cách đây khoảng 30 năm và sau đó tăng lên
khá nhanh. Các tác giả sử dụng các bộ phận nuôi cấy khác nhau cho đối tượng
nghiên cứu của họ. Kohmura và cs (1995) sử dụng là non làm mẫu nuôi cấy ở
loài Dioscorea oppositaThumb [29]. Alizadeh và cs (1998) nghiên cứu về
Dioscorea composite Hemsl [22]. Twyford và Mantell, (1996) sử dụng mẫu
cấy là rễ ở loài Dioscorea alata [35]. Tor và cs (1998) dùng tế bào và
protoplast trên loài Dioscorea Yams [34]. Nhiều tác giả như Matell và Hugo
(1989), Jasik và Mantell (2000), Fotso và cs (2013), Borges và cs (2004) đã
thực hiện nghiên cứu trên đối tượng cây Khoai Mỡ với mẫu là củ bi [25],
[26], [27], [30].
Trong tự nhiên, Củ mài tái sinh thông qua hạt hay đoạn thân tươi hay củ.
Nhưng năng suất củ giảm do nhiễm virus và các loài tuyến trùng, củ bị nhiễm
1


truyền cho thế hệ sau làm giảm chất lượng củ [34].Hơn nữa, nhân giống theo
phương pháp truyền thống không đảm bảo được cây sạch bệnh. Phương pháp
nuôi cấy mô giúp sản xuất cây Củ mài với số lượng lớn có chất lượng cao
(sạch bệnh). Điều quan trọng, phương pháp này là sản xuất ra cây giống ở quy
mô công nghiệp trong thời gian ngắn, cây sạch bệnh và trồng được quanh
năm. Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên
cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Củ mài(Dioscorea persimilis) bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”.
2. Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Củ mài bằng kĩ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
-Ý nghĩa khoa học:
+ Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được quy trình nhân giống cây củ mài
bằng kỹ thuật in vitro.
+ Góp phần bảo tồn nguồn gen loại cây dược liệu, cây lương thực này.
-Ý nghĩa thực tiễn: Đề xuất quy trình hoàn chỉnh nhân giống cây củ mài
bằng kỹ thuật in vitro, từ đó đảm bảo chủ động trong sản xuất cây giống với
số lượng lớn, sạch bệnh, chất lượng đồng đều, đáp ứng nhu cầu cây giống cho
sản xuất, nâng cao hiệu quả sản xuất, phục vụ nhu cầu lương thực, thực phẩm
và dược liệu.
4. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro.
- Tái sinh và nhân nhanh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất
điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi của cây Củ mài.
- Ra rễ, tạo cây in vitrohoàn chỉnh.
- Huấn luyện cây Củ mài cấy mô thích nghi với điều kiện tự nhiên.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm và phân loại cây Củ mài
1.1.1. Phân loại thực vật cây Củ mài
Theo hệ thống thực vật [19] cây Củ mài được phân loại như sau:
Giới (regum) : Thực vật (Plantae)
Ngành

(Phylum)

:

Ngọc

lan

(Magnoliophyta)
Lớp (Class) : Hành (Liliospida)
Phân lớp : Hành (Lilianae)
Liên bộ: Hành (Liliales)
Bộ (Ordo) : Củ nâu (Dioscoreales)
Họ (family) : Củ nâu (Dioscoreaceae)
Chi (genus) : Củ nâu (Dioscorea L.)
Loài (species) : Dioscorea persimilis

Hình 1.1: Cây Củ mài

Chi Dioscorea được đặt theo tên bác sĩ
Hy Lạp cổ đại và nhà thực vật học Dioscorides. Theo Ayensu ES. và cs
(1972) chi này bao gồm hơn 600 loài, thuộc nhóm cây một lá mầm chủ yếu
được trồng ở Nam Mỹ, Châu Á và Tây Phi [23]. Theo Jean M. và cs (1992)
bộ Dioscoreales được xác định có niên đại khoảng 124 triệu năm trước [28].
Hầu hết các loài thuộc chi Dioscorea đều có nguồn gốc ở Châu Á, Châu Phi,
Châu Mỹ và Châu Đai Dương, xuất hiện cách ngày nay khoảng 10.000 năm
(Khoai mỡ) và du nhập sang các vùng khác nhau trên thế giới, nhất là các
quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [36].
Ở nước ta hiện nay có 4 loài phổ biến thuộc chi Dioscorea phân bố tập
trung nhiều ở các vùng trung du, bán sơn địa và các vùng mới khai hoang: củ
nâu(Dioscorea cirrhosa), khoai mỡ(Dioscorea alata), củ mài(hay hoài

sơn: Dioscorea persimilis) và củ từ(Dioscorea esculenta).

3


1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Củ mài
Cây Củ mài thuộc loài cây thân thảo, leo quấn trên các giá thể khác nhau
trong tự nhiên, cây sống nhiều năm, dài 5-10 m, cây có củ mọc sâu trong lòng
đất từ 1,5 – 2 m. Cây thường mọc rải rác ven rừng, rừng tre nứa, khe núi đá,
trên đất đồi, những địa điểm ẩm quanh năm, đất xốp và giàu chất dinh dưỡng.
Cây củ mài (Dioscorea persimilis) thường có một củ chính to được hình
thành từ rễ chính, củ dài hình chiếc dùi cui, mọc sâu vào trong đất độ sâu có
thể từ 1-2 m. Trên rễ củ có rất nhiều rễ dinh dưỡng mọc dài có tác dụng hấp
thụ nước và ion khoáng trong đất. Cây trồng một năm đã cho củ với năng suất
trung bình đạt từ 1-1,2 kg/gốc [17].
Cây củ mài dạng thân leo (thân tự leo) dài trên 10 m, đường kính thân
trung bình từ 0,2-0,5 cm thân quấn vào các giá thể khác theo chiều từ trái qua
phải. Thân cây nhẵn, không có lông, màu nâu đỏ và có góc cạnh, trên thân
không có tua. Chồi bên hình thành từ các nách lá hình thành lên các cành cấp
1 nhưng số lượng cành ít tập trung chủ yếu ở giữa thân. Thân cây chia đốt
mỗi đốt thân dài khoảng 15-20 cm toàn thân cây có từ 50-100 đốt tùy mức độ
sinh trưởng và phát triển của cây. Trên mỗi đốt thân có 4 lá. Do đặc điểm cấu
tạo thân cây nhỏ, mềm dẻo nên cây Củ mài không tự đứng trong không gian
mà phải leo lên các giá thể khác để lấy ánh sáng mặt khác khi leo lên cá giá
thể khác sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát tán của hạt trong không gian
[17].
Lá cây Củ mài là lá đơn, lá có dạng bản nhỏ, mọc so le hay mọc đối,
hình tim đôi khi hình mũi tên, trên lá không lông, số lượng gân lá nhiều,
gân lá có hình chân vit, dài khoảng 10-12 cm, rộng 6-8 cm, nhẵn, chóp lá
nhọn [17].

Hoa nhỏ, đều, mọc thành bông, trục bông khúc khuỷu, hoa đơn tính. Hoa
đực và hoa cái khác gốc, thích nghi với lối thụ phấn nhờ gió. Hoa đực có 6
nhị. Hoa cái mọc thành cụm dạng bông cong dài tới 20 cm. Cây ra hoa vào
khoảng tháng 10 đến tháng 11 dương lịch hàng năm trước khi bước vào thời
4


kỳ tích lũy tinh bột. Cụm hoa đực dài không 40 cm, mang từ 20-40 hoa nhỏ,
màu vàng [17].
Quả nang, quả có 3 cạnh rộng 2-3 cm, mang 6 hạt. Khi còn non quả có
màu xanh, đến cuối tháng 12 quả chuyển sang màu vàng xanh. Đối với cây
trồng 1 năm sẽ ra hoa và quả, quả được hình thành vào tháng 11 dương lịch
hằng năm trước khi cây chuẩn bị bước vào thời kì ngủ nghỉ [17].
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến
Cây mọc hoang khắp nơi tại các vùng rừng núi nước ta, nhiều nhất ở các
tỉnh Hà Bắc, Hoàng Liên Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Bình,
đặc biệt là các vùng dọc dãy Trường Sơn và vùng núi đá vôi của tỉnh Quảng
Bình, hiện nay đã được trồng phổ biến để chế biến thuốc.
Mùa thu hoạch tốt nhất vào thu đông cho đến đầu xuân (từ tháng 10 đến
tháng 4 năm sau).
Chế biến: củ mài đào về cần chế biến ngay.
1.1.4. Đặc điểm của dƣợc liệu và hạt tinh bột Củ mài sau khi chế
biến
Hạt tinh bột Củ mài có hình trứng hay hình chuông, dài 10-60 m, rộng
khoảng 15-50 m, có vân đồng tâm, rốn lệch tâm, hình chấm hay hình vạch.
Tinh thể calci oxalat hình kim dài 35-50 m. Mảnh mô mềm gồm các tế bào
màng mỏng, chứa tinh bột, mảnh mạch mạng.
1.1.5. Thành phần hóa học
Thành phần chính của củ mài là tinh bột, chiếm 63,3%, ngoài ra còn có
0,5% chất béo và 6,8% protid.

Theo phân tích của Viện Dược liệu Việt Nam (2011) [40] trong rễ củ của
cây củ mài khô có chứa một số thành phần dinh dưỡng như: gluxit 63,25%,
protit 6,75%, lipit 0,45%, chất nhầy 2,0 – 2,8%, dioscin sapotoxin, allantoin,
dioscorin và các axit amin, mucin là một loại protein nhớt và một số chất
khác như allantion, cholin, arginin, men maltose, saponin có nhân sterol. Viên
đã có một số nghiên cứu tác dụng dược lý của củ mài trên cơ thể sống
5


(chuột) thông qua các chỉ tiêu như tăng thân trọng, tăng sự đồng hóa và tác
dụng nội tiết hướng sinh dục…. Theo danh y Đỗ Tất Lợi (2004) [4] chất
mucin trong củ mài hòa tan trong nước ở điều kiện axit và nhiệt độ thích hợp
sẽ phân giải thành chất protid và hydrat carbon. Ở nhiệt độ 45 – 55 độ C, khả
năng thủy phân chất đường của men trong củ mài rất cao, trong axit loãng
trong 3 giờ có thể tiêu hóa 5 lần lượng đường có vai trò rất quan trọng trong
việc chữa bệnh tiểu đường ở con người.
1.1.6. Công dụng
Ngoài việc dùng để ăn chống đói, củ mài (hoài sơn) còn là vị thuốc. Củ
mài với công năng kiện tỳ, chỉ tả, bổ phế khí, ích thận, cố tinh, giải độc, được
dùng trong các trường hợp tỳ vị hư nhược, ăn uống kém tiêu, tiêu chảy hoặc
trẻ em bị vàng da, bụng ỏng, mắt mũi nhoèn gỉ mà y học cổ truyền gọi là bệnh
cam, có thể phối hợp với các vị thuốc kiện tỳ: bạch truật, hoàng kỳ, bạch biển
đậu… hoặc trong trường hợp khí phế hư nhược, đoản hơi, mệt mỏi, ho khan,
phối hợp với đảng sâm, cát cánh, bách bộ.. Còn dùng khi thận hư, mộng tinh,
di tinh, tiểu tiện không cầm, phụ nữ bạch đới, phối hợp với ba kích, kim anh,
khiếm thực…, đái tháo đường, phối hợp với mạch môn, thiên hoa phấn, sinh
địa… Dùng ngoài, trị viêm tuyến vú gây đau đớn: củ mài tươi, rửa sạch, giã
nát, đắp vào chỗ sưng đau, cách dùng vị hoài sơn là rất phong phú và đa dạng.
Đề tài : Chế biến tinh bột củ mài hỗ trợ điều trị bệnh nhân đái tháo đường týp
2[38] do Trần Hữu Dũng Trường Đại học Y Dược Huế cùng cộng sự được

thực hiện từ tháng 3- 2011 đến tháng 9- 2012 nhằm nghiên cứu về các đặc
tính lý hóa, cấu trúc và thành phần của tinh bột củ mài. Theo Trần Hữu Dũng
thông qua nghiên cứu lâm sàng trên 60 người tình nguyện bị đái tháo đường
type 2 (được cho ăn các khẩu phần bánh chế biến từ nguyên liệu tinh bột củ
mài theo một cách xác định), bước đầu đã chứng minh được rằng, khẩu phần
bánh tạo ra có thể sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường một cách
hiệu quả.

6


1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên học
thuyết về tính toàn năng của tế bào.
Cuối thế 19 đầu thế kỉ 20 nhà sinh vật học ngưới Đức Haberlandt (1902)
đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: mỗi tế bào bất kì của một cơ
thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể
hoàn chỉnh [3].
Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thựcvật đều mang toàn bộ lượng thông tin di
truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome) của thực vật đó. Do đó, khi
gặp điều kiện thuận lợi, cơ quan, mô, tế bào đều có thể phát triển thành một
cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [20].
Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua
sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.
1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Cơ thể thực vật là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức
năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên
tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử).

Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi
sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Từ các tế bào phôi sinh
này chúng tiếp tục biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô,
cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể.
Tuy nhiên, khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng
chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong
trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế
bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái
7


sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược
lại với sự phân hóa tế bào.
Sự giãn tế bào: tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng
kích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung. Sau hai
giai đoạn này cùng với quá trình cùng với quá trình biệt hóa tế bào phân hóa
thành các mô chức năng chuyên hóa chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác
nhau trong cùng một cơ thể sống [6].

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực
vật
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt
hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá
thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính
trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra
theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của
mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn
được hài hòa. Mặt khác, khi tế bàonằm trong một khối mô của cơ thể thường

bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm
kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào
[11].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực
chất là kết của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào.

8


1.2.1.3. Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào
Theo quan niệm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa
đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh. Cho đến nay các tác giả đã chứng minh được khả năng tái sinh
một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6].
1.2.2. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.2.1. Khử trùng mẫu và cấy khởi động
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống
invitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng
để đưa vào nuôi cấy.
Mẫu sau khi được

vô trùng đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ lệ nhiễm thấp,

tỷ lệsống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời
gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: đỉnh
sinh trưởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ [7]. Chọn đúng phương
pháp khử trùng sẽ đưa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc
độ nhân nhanh cao [7].

1.2.2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Đây là giai đoạn tái sinh một cách có định hướng sự phát triển của mô
nuôi cấy. Quá trình được điều khiển bằng các chất kích thích sinh trưởng
(auxin/cytokinin), các chất bổ sung khác như là nước dừa, dịch chiết nấm
men.. .vào môi trường kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp
nhằm tạo ra tỷ lệ tái sinh cao nhất. Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần được chú
ý, thường các mô non chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô
đã chuyển hóa [7].
1.2.2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi
Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân nhanh cao nhất, được coi là
then chốt của quá trình. Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi
9


trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung khác như:
nước dừa, dịch chiết nấm men,.. kết hợp với yếu tố nhiệt độ và ánh sáng [ 7].
Tùy thuộc vào vào đối tượng nuôi cấy, có thể tiến hành nhân nhanh bằng cách
kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát
triển cuả các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính.
1.2.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Khi các chồi đạt được kích thước nhất định sẽ được chuyển sang môi
trường ra rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành
cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta bổ sung các vào môi trường nuôi
cấy các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin là nhóm hoocmon thực
vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các
chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D thường sử dụng để tạo rễ cho chồi.
1.2.2.5. Giai đoạn đưa cây ra đất
Đây là giai đoạn cuối cùng quyết định khả năng ứng dụng của quá trình
nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Trong giai đoạn này cây con
được chuyển từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên, do đó cần đảm

bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp (nhiệt độ và độ ẩm) để cây có thể đạt
tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất.
1.2.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào
thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho
sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự
thành công của nuôi cấy mô thế bào thực vật. Thành phần của môi trường
nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan
được nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy
không giống nhau, môi trường nuôi cấy sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản.
Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của
mẫu nuôi cấy [21].
10


1.2.3.1. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng (cả đa lượng và vi lượng)
được đưa vào nuôi cấy. Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô thực vật
tách rời là không khác nhiều

so với nhu cầu của cây trong điều kiện tự

nhiên. Trong thành phần muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung
cấp là nitơ, phospho, kali và sắt [21].
Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng: Nitrat (NO 3) và amon
(NH4). Đa số các môi trường có chứa dạng nitrat nhiều hơn dạng amon. Hàm
lượng nitrat trong môi trường khoảng 25 mM, còn của amon khoảng từ 2-20
mM. Trong môi trường MS, amon được cung cấp ở dạng muối NH4NO3, còn
môi trường B5 của Gamborg có amon dạng muối (NH4)2SO4. Các gốc nitrat

được đưa vào môi trường dưới dạng muối nitrat canxi, nitrat kali, nitrat natri
hoặc nitrat amon. Trong số các nguyên tố của môi trường, nitơ có hàm lượng
lớn nhất [21].
Hai dạng phospho thường được dùng là: NaHPO4.7H2O và KH2PO4 [21].
Kali được cung cấp cho môi trường dưới dạng kali nitrat (KNO 3); Kali
Clorua (KCl); Kali phosphate (KH2PO4). Nồng độ kali trong môi trường nuôi
cấy thay đổi từ 2-25 mM [19].
Nguồn Canxi trong môi trường cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat
Ca(NO3)2.4H2O; canxi clorua CaCl2.6H2O. Nồng độ Ca2+ trong môi trường
nuôi cấy thay đổi từ 1-3,5 ụM [21].
Nguồn magiê: Magiê được cung cấp dưới dạng magiê sunphat MgSO 4.
7H2O. Với nồng độ trong môi trường từ 0,5-3 ụM [21]. Nguồn Mg và S được
cung cấp dưới dạng MgSO4.H2O hoặc (NH4)2SO4 [22].
Sắt: thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu sắt làm giảm hàm
lượng ARN và sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng tổng hợp ADN và axit
tự do dẫn đến giảm phân bào. Các môi trường cổ điển dùng sắt dưới dạng
clorua sắt FeCl2, FeCl3.6H2O, sunfat sắt FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3[21].

11


Các ion Na+và Cl- cần ở hàm lượng thấp được đưa vào môi trường cùng
với các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường.
Các loại muối khoáng vi lượng: là những nguyên tố thường được sử
dụng với hàm lượng thấp hơn 30 mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi
lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe,
Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong
hoạt động của các enzyme [3].
1.2.3.2. Nguồn cacbon
Khi nuôi cấy in vitro,các tế bào thực vật thường không có khả năng

quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh
dưỡng của tế bào.
Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường
saccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho
saccharose nhưng chúng thường nghèo cacbon hydrate so với nhu cầu của
thực vật.
Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời
gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển
sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [3].
1.2.3.3. Các vitamin và acid amin
Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầu
hết các vitamin nhưng không đủ về số lượng, do đó để mô có thể sinh trưởng,
tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và
amino acid, đặc biệt là vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6,...Các
vitamin đặc biệt quan trọng như Myo-inositol đóng vai trò sinh tổng hợp
thành tế bào và được sử dụng với lượng lớn từ 50-100 mg/l [3].
Các vitamin được

pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500

đến 1000 lần dung dịch làm việc. Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm,
khuẩn nhiễm tạp và dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong
điều kiện lạnh dưới 0oC hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng [3].
12


1.2.3.4. Các chất điều hòa sinh trưởng
Thông thường trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phổ biến 3
nhóm chất sinh trưởng sau: auxin, cytokinin và gibberelin. Các chất sinh
trưởng tương tác với nhau và tương tác với các chất ức chế sinh trưởng (axit

abscisis, ethylen) quyết định sự hình thành, phát triển, phát sinh hình thái của
thực vật nuôi cấy [16].
*Auxin: Auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
và thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ đầu. Auxin cùng với
cytokinin có tác dụng thúc đẩy sự phát sinh và phát triển chồi, huyền phù tế
bào và cơ quan. Đồng thời điều hòa quá trình phát sinh hình thái. Ở mức độ tế
bào, auxin điều khiển các quá trình cơ bản của tế bào như phân chia và kéo
dài tế bào [3].
Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid
(IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự
hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid
(NAA) và 2,4- dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D). Các chất này cũng đóng
vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ
[3].
Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát
triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các
phần phía dưới của cây [7].
*Cytokinin: Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích
thích sử dụng protein, điều khiển chu trình tế bào và tăng sự phân chia tế bào.
Các cytokinin thường được sử dụng rộng rãi là kinetine, benzyadenin
(BA), 6- benzyl aminopurin (BAP) và thidiazuzon (TDZ). Đây là các
cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều các cytokinin
tự nhiên như zeatin hay iP. Các cytokinin có tác dụng kích thích phân chia tế
bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già
hóa của tế bào [3].
13


*Gibberellin: Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu
người nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella

Fujikuroi gây ra. Năm 1939, ông đã tách chiết được gibberellin từ nấm G.
Fujikuroi và được gọi là gibberellin A. Vào thời điểm năm 2003, đã có 126
chất được biết đến thuộc nhóm Gibberellic acid, thông dụng nhất trong nuôi
cấy mô là GA3. Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào theo chiều
dọc, giúp kéo dài lóng đốt thân cây, phá ngủ của phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng
như tạo chồi phụ. Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực
vật và rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây. Tuy nhiên GA3 rất mẫn cảm
với nhiệt độ, nó bị mất hoạt tính sinh lý tới 90% sau khi hấp vô trùng. Vì vậy
sử dụng GA3 thường phải đem lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào
môi trường nuôi cấy [3].
1.2.3.5. Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trường
*Nước dừa: Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ,
chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng [14]. Nước dừa đã được sử dụng
để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường
được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa thường sử
dụng với hàm lượng 5-20% thể tích môi trường, kích thích phân hoá và nhân
nhanh chồi [21].
*Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát
triển của mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong
nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với hàm lượng thích hợp.
Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thuỷ phân casein hydrolyase (0,1-1%)
hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100 g/l (xanh) nhằm tăng
cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy [21].
*Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để
làm rắn hoá môi trường. Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6-1% đây là
loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi
trường hoặc bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [14].
14

1.2.3.6. pH môi trường
Mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH của
môi trường thường là 5,6-6,0 [2].
Môi trường thấp có pH hơn 5 hay cao hơn 6 đều có ảnh hưởng đến trạng
thái của môi trường nuôi cấy và sự hòa tan các chất dinh dưỡng [12].
1.2.4. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực
vật
1.2.4.1. Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm
bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị
nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến cả quy trình nuôi cấy mô
in vitro [2].
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hoá học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Đây là một thao tác khó
và là khâu đầu tiên có ý nghĩa tiên quyết. Song nếu tìm được nồng độ và thời
gian xử lí thích hợp sẽ cho mẫu tỉ lệ sống cao và tỉ lệ nhiễm thấp. Các hóa
chất thường dùng để khử trùng như: HgCl2 0,1%, nước Clolox, cồn 700,
Ca(ClO)2...
1.2.4.2.Môi trường vật lý
*Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và
các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn
định ở 25-270C; nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của auxin [21]. Nhìn
chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là
25±20C [3].
*Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát
sinh hình thái mẫu nuôi cấy. Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng
của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Và các
loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độ ánh
sáng khác nhau. Thời gian chiếu sáng với đa số các loài cây thích hợp là 1215