Xây dựng quy trình real time rtpcr phát hiện và phân type tác nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo (prrsv)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
… oOo……


LÊ THÙY DUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR
PHÁT HIỆN VÀ PHÂN TYPE TÁC NHÂN GÂY HỘI
CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN TRÊN
HEO (PRRSV)


CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN
Mã số chuyên ngành: 60 42 70


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS.HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG


TP.HỒ CHÍ MINH - NĂM 2011

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này đạt được những kết quả như ngày hôm nay là nhờ sự quan
tâm, tận tình hư ớng dẫn của rất nhiều thầy cô và bạn bè thuộc Khoa Sinh học-
Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ
Huỳnh Thùy Dương. Cô đã tạo điều kiện về mọi mặt giúp tôi hoàn thành tốt luận

văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Tuấn Anh, cùng các anh chị thuộc
công ty TNHH Công Nghệ Sinh Học Khoa Thương đã luôn luôn tận tình giúp đỡ,
gợi ý hướng tiếp cận đề tài cho tôi.
Xin cảm ơn các anh chị công tác ở Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh
học-Sở Khoa học công nghệ Đồng Nai và Công ty Thuốc Thú y Trung Ương -
Navetco đã nhiệt tình giúp đ ỡ trong việc cung cấp mẫu cho tôi hoàn thành luận
văn này
Tôi xin cảm ơn các bạn của tôi đã cùng tôi chia sẻ những khó khăn, quan
tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Và cuối cùng con xin cảm ơn ba, mẹ, những người thân yêu và anh. Mọi
người luôn là chỗ dựa tinh thần, là nguồn động viên to lớn cho tôi vượt qua mọi
khó khăn.
Tp. HCM, tháng 11 năm 2011
Lê Thùy Duyên


Luận văn Thạc sĩ Lời mở đầu

Lê Thùy Duyên 1
LỜI MỞ ĐẦU
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo (Porcine reproductive and
respiratory syndrome- PRRS) xuất hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987. Đến
nay PRRS đã lây lan trên khắp thế giới, trở thành dịch địa phương ở nhiều nước
có ngành chăn nuôi phát triển, trong đó có Việt Nam [21]. Đây là hội chứng các
bệnh liên quan đến heo, do PRRSV (Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus) gây ra, có khả năng lây nhiễm cao. Heo bị nhiễm PRRSV dễ bị
sảy thai, giảm tỉ lệ sinh sản, sinh non hoặc thai chết lưu. Ngoài ra heo bị bệnh
PRRS dễ mắc các bệnh kế phát như viêm phổi, tiêu chảy, thương hàn…dẫn đến
tử vong [20].

Dịch heo tai xanh lần đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam vào tháng 3 năm
2007. Và cho đến năm 2011, năm nào cũng có dịch bệnh xảy ra, gây tâm lý
hoang mang cho người dân. Theo cục Thú y, trong năm 2010, qua hai đợt dịch
bệnh trên cả nước có 1.114.166 con heo mắc bệnh, trong đó số con heo tiêu hủy
là 438.699 con [7]. Bên cạnh đó, thịt heo vốn là sản phẩm chăn nuôi quan trọng ở
nước ta, chiếm 58% tổng GDP nông nghiệp [21]. Do đó, kiểm soát dịch bệnh heo
tai xanh trở thành một trong những nhiệm vụ quan trọng của ngành chăn nuôi
nước ta.
Một trong những nhiệm vụ quan trọng của việc kiểm soát dịch PRRS là xây
dựng các công cụ phát hiện và phân type PRRSV chính xác và nhanh chóng. Do
đó, mục tiêu của luận văn đề ra là xây dựng quy trình Real time RT- PCR có khả
năng đồng thời phát hiện và phân type virus PRRSV với các nội dung chính sau:
1). Thiết kế mồi và mẫu dò bắt cặp đặt hiệu, có khả năng đồng thời phát
hiện và phân type PRRSV.
2). Tối ưu hóa phản ứng Real time RT-PCR.
3). Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình.
Luận văn Thạc sĩ Lời mở đầu

Lê Thùy Duyên 2
4). So sánh hiệu quả của quy trình phát hiện PRRSV với bộ kit thương
mại trên mẫu heo nuôi.
Sự thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho sự phát triển một bộ kit chẩn
đoán Real time RT-PCR có khả năng đồng thời phát hiện và phân type heo mang
mầm bệnh PRRSV, cho kết quả nhanh, chính xác, góp phần phát hiện kịp thời
đàn heo bị nhiễm bệnh, giảm thiệt hại đàn heo, giảm chi phí xét nghiệm. Ngoài ra
ứng dụng phân type PRRSV sẽ là tiền đề phục vụ cho các nghiên cứu về đặc tính
gây đáp ứng miễn dịch khác nhau của các type PRRSV, góp phần theo dõi sự lưu
hành của các type PRRSV, lựa chọn vaccine phòng ngừa thích hợp cho dịch bệnh
PRRS ở nước ta.

Luận văn Thạc sĩ Mục lục

Lê Thùy Duyên i

MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH viii
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Một số thông tin về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo
(PRRS) 4
1.2. Triệu chứng bệnh 6
1.3. Tác nhân gây bệnh 8
1.4. Cấu trúc bộ gene PRRSV 8
1.5. Cơ chế gây bệnh của PRRSV 10
1.6. Một số đặc tính của PRRSV 11
1.7. Vaccine phòng ngừa 12
1.8. Các phương pháp phát hiện PRRSV 13
1.8.1. Dựa trên biểu hiện lâm sàng : 13
1.8.2. Phân lập virus (VI): 14
1.8.3. Huyết thanh học: 14
1.8.4. RT-PCR ( Reverse transcription- polymerase chain reaction ): 15
Luận văn Thạc sĩ Mục lục

Lê Thùy Duyên ii

1.8.5. Real-time RT-PCR: 15

1.9. Phương pháp Real-time RT-PCR 16
1.10. Tình hình nghiên cứu và các phương pháp phát hiện PRRSV ở Việt
Nam 20
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 22
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23
2.2. Vật liệu 23
2.2.1. Mẫu sử dụng trong nghiên cứu 23
2.2.2. Các cặp mồi và mẫu dò sử dụng trong đề tài 23
2.2.3. Hóa chất 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu 29
2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA bằng Phenol-Chloroform 29
2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA theo Boom [10], [18],[26] 30
2.3.3. Phương pháp reverse transcriptase (RT) 31
2.3.4. Phương pháp thiết kế cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho PRRSV 32
2.3.4.1. Đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi và mẫu dò phát hiện và phân
type PRRSV 34
2.3.4.2. Đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi và mẫu dò chứng nội 35
2.3.5. Phản ứng multiplex Real time RT-PCR: 35
2.3.6. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR 35
2.3.7. Xác định ngưỡng phát hiện và sự đặc hiệu của phản ứng 36

2.3.8. So sánh hiệu quả phát hiện và phân type với kit thương mại 37
2.3.9. Các bước chuẩn bị cho việc tạo kit chẩn đoán hoàn chỉnh 37
Luận văn Thạc sĩ Mục lục

Lê Thùy Duyên iii

2.3.9.1. So sánh hiệu quả tách chiết RNA bằng phương pháp Phenol-
Chlorofom 37
2.3.9.2. Phương pháp tạo dòng gene làm chứng dương 38

2.1.2. Phương pháp phân tích kết quả giải trình tự bằng Blast (Basic local
alignment search tool): 42
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 44
3.1. Thiết kế mồi và mẫu dò đặc hiệu cho phát hiện và phân type PRRSV 45
3.1.1. Thiết kế mồi và mẫu dò Taqman 45
3.1.2. Đánh giá khả năng hoạt động của bộ mồi PR4 và bộ mồi PR6 46
3.1.3. Đánh giá hiệu quả hoạt động của ba bộ mồi/mẫu dò chứng nội 51
3.2. Phản ứng Multiplex Real time RT-PCR 53
3.3. Tối ưu hóa phản ứng Multiplex Real time RT-PCR 54
3.3.1. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nhiệt độ lai 55
3.3.2. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ MgCl
2
56
3.3.3. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ mồi PR6 57
3.3.4. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: mẫu dò PR6-P1. 58
3.3.5. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: Taq DNA
polymerase 59
3.4. Xác định ngưỡng phát hiện và sự đặc hiệu của quy trình 60

3.4.1. Ngưỡng phát hiện của quy trình 60
3.4.2. Sự đặc hiệu của phản ứng trên các vi sinh vật khác 61
3.4.3. Đánh giá khả năng phát hiện và phân type của phản ứng multiplex
Real Time RT-PCR trên mẫu có sự hiện diện đồng thời PRRSV type NA và
PRRSV type EU 63
Luận văn Thạc sĩ Mục lục

Lê Thùy Duyên iv

3.5. So sánh hiệu quả phát hiện và phân type PRRSV với kit thương mại 65
3.6. Các bước chuẩn bị khởi đầu cho việc tạo kit chẩn đoán hoàn chỉnh 66

3.6.1. So sánh hiệu quả tách chiết RNA của phương pháp tủa Phenol-
Chloroform và phương pháp Boom 66
3.6.2. Tạo dòng gene làm chứng dương 68
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 73
4.1. KẾT LUẬN 74
4.2. ĐỀ NGHỊ 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
PHỤ LỤC 84
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 3









CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU








Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 4
1.1. Một số thông tin về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo
(PRRS)
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (Porcine reproductive and
respiratory syndrome-PRRS) được mô tả lần đầu tiên ở Mỹ tại vùng bắc của bang
California, bang Iowa và Minnesota vào năm 1987. Rất nhanh sau đó, năm 1988
bệnh lây sang Canada. Ở Châu Âu nhiều vùng cũng ghi nh ận dịch bệnh này như
Đức (năm 1990), Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992). Năm
1998, bệnh được phát hiện ở các nước châu Á như: Hàn Quốc, Nhật Bản [39]. Từ
năm 2006 đến năm 2010, khu vực các nước Châu Á như Trung Quốc, Việt Nam,
Philippines và Thái Lan, Lào, Campuchia liên tiếp bị các đợt dịch PRRS hoành
hành với chủng PRRSV độc lực cao [22]. Cho đến nay PRRS đã tr ở thành dịch
bệnh lưu hành ở nhiều châu lục trên thế giới, là một trong những bệnh gây tổn
thất nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi ở nhiều quốc gia. Hình 1.1 cho thấy
tình hình dịch bệnh PRRS ở khu vực Châu Á được báo cáo ở Tồ chức Thú y Thế
giới (OIE) vào năm 2007.
Thời gian đầu, do chưa xác định được nguyên nhân gây bệnh nên bệnh
PRRS có nhiều tên gọi như bệnh bí ẩn ở heo (Mistery Disease of Swine-MDS),
hội chứng hô hấp và sẩy thai ở heo (Porcine endemic abortion and respiratory
syndrome – PEARS), và ở Việt Nam PRRS thường được gọi là bệnh heo tai xanh
(Blue Ear Disease-BED) [16]. Năm 1992, Hội nghị quốc tế về hội chứng này
được tổ chức ở Minnesota (Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên
gọi là Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo.




Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 5











Hình 1. 1: Các đỉnh dịch PRRS bùng phát ở Châu Á được báo cáo ở OIE năm
2007 (OIE, 2007)
Hàng năm bệnh PRRS gây tổn thất gần 560 triệu USD ở Mỹ. Từ tháng 1
đến tháng 7 năm 2007, có 39.455 heo chết trong tổng số 143.221 heo nhiễm bệnh
ở Trung Quốc [49]. Ở Việt Nam, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ
vào các tỉnh phía Nam vào năm 1997. Kết quả kiểm tra huyết thanh học cho thấy
10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS [5]. Theo báo
cáo của cục Thú y (2007) cho thấy virus PRRS đã xu ất hiện và lưu hành ở Việt
Nam từ năm 1997. Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch và gây thiệt hại lớn cho
ngành chăn nuôi nước ta bắt đầu lần đầu tiên vào tháng 3 năm 2007. Kể từ đó
dịch bệnh liên tục hoành hành và cho đến nay chưa có một loại vaccine nào sử
dụng ở Việt Nam có thể ngăn ngừa hiệu quả bệnh tai xanh. Năm 2010 là năm
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 6
dịch tai xanh diễn biến phức tạp nhất. Không kể đợt dịch thứ nhất với 16 tỉnh
thành phía Bắc, thì đợt dịch thứ 2 năm 2010 diễn ra trên 36 tỉnh, thành phố miền
Trung và Nam gồm: Nghệ An, Sóc Trăng, Quảng Trị, Tiền Giang, Lào Cai, Long

An, Bình Dưng, Bạc Liêu, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Phư ớc, Đà Nẵng, Vĩnh
Long, Khánh Hòa, Đăklăk và H ậu Giang Theo báo cáo tổng kết từ cục Thú ý,
có 717.830 con heo mắc bệnh, trong đó số chết, tiêu hủy là 413.540 con [54].
Dịch heo tai xanh không chỉ gây ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi heo trong
nước mà còn kéo theo nhiều hệ lụy khác như ô nhiễm môi trường, khan hiếm
nguồn heo giống, mất thời gian phục hồi ngành chăn nuôi, giá thịt tăng trong khi
nguồn cung không cung ứng đủ nhu cầu thị trường dẫn đến nhập siêu các sản
phẩm thịt. Theo thống kê của cơ quan Thú y vùng 6, trong 6 tháng đầu năm
2011, lượng thịt heo nhập về Việt Nam là 39.180 tấn, trong đó, chỉ riêng tháng 7
năm 2011 lượng heo nhập khẩu đạt 1.300 tấn, gần 50% tổng lượng nhập khẩu
trong 6 tháng đầu năm. Dự đoán trong sáu tháng cuối năm lượng thịt heo nhập
khẩu vẫn tiếp tục gia tăng [56].
1.2. Triệu chứng bệnh
Triệu chứng bệnh của heo bị nhiễm PRRSV thường khác nhau tùy theo
chủng virus, đặc điểm giống heo, lứa tuổi, trạng thái miễn dịch của heo và các
nhân tố kiểm soát khác. Thời kì ủ bệnh có thể từ 3-37 ngày [21]. Các triệu chứng
của bệnh PRRS gồm:
- Các triệu chứng về da: da thường có sự đổi màu từ ửng đỏ tới xanh,
đặc biệt là vùng da tai và vùng âm hộ (hình 1.1). Có dấu hiệu phù nề
ở dưới da, mí mắt, chi sau, mõm…
- Các triệu chứng về sinh sản ở heo nái: hôn mê, lờ đờ, giảm ham muốn
tình dục, sẩy thai, sinh non hoặc thai chết lưu. Heo con mới sinh
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 7
thường yếu. Các bệnh về hô hấp cũng thường xảy ra đối với heo nái
bị nhiễm bệnh.
- Các triệu chứng về hô hấp ở heo con và heo trưởng thành như khó
thở, suy hô hấp. Các triệu chứng về hô hấp thường trở nên nghiêm
trọng hơn khi nhiễm các bệnh kế phát do các vi sinh vật khác gây ra

như Pasteurella multocida, Porcine Circovirus Type 2 (PCV2),
Mycoplasma hyopneumonia, Streptococcus suis, Salmonella
cholerasuis, Haemophilus parasuis, swine influenza virus… Tỉ lệ heo
chết thường cao ở heo con (30-50 %) và thấp hơn ở heo trưởng thành
(4-20%) [40].
- Đối với heo cai sữa và heo trưởng thành, các triệu chứng của bệnh
bao gồm: biếng ăn, hôn mê, lờ đờ, sung huyết, lông thô ráp, sụt cân,
sốt cao…




Hình 1. 2: Dấu hiệu lâm sàng nhận biết bệnh PRRS. A: Heo có biểu hiện tai màu
tím xanh; B: Heo bệnh có biểu hiện sốt đỏ toàn thân
Tuy nhiên các dấu hiệu lâm sàng nêu trên không hoàn toàn là đặc trưng
cho bệnh PRRS, mà còn xuất hiện ở các bệnh lây nhiễm do các tác nhân khác
gây nên. Điều này dễ gây nhầm lẫn trong chẩn đoán bệnh nếu chỉ dựa vào biểu
hiện lâm sàng. Các bệnh có dấu hiệu lâm sàng tương tự với PRRS được liệt kê
trong bảng 1.2 [39].
A
B
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 8
Bảng 1. 1: Bảng liệt kê các bệnh có dấu hiệu lâm sàng tương tự với PRRSV
Bệnh liên quan đến sinh sản
Bệnh liên quan đến hô hấp
Sốt heo cổ điển
Cúm heo
Sốt heo Châu Phi

Viêm phổi
Bệnh trùng xoắn móc câu
Nhiễm Haemophilus parasuis
Porcine parvovirus
Haemagglutinating encephalomyelitis virus
Porcine enterovirus
Porcine respiratory coronavirus
Haemagglutinating
encephalomyelitis virus
Syncitial pneumonia and myocarditis
Bệnh Aujeszky
Porcine circovirus-associated disease
1.3. Tác nhân gây bệnh
Virus gây bệnh PRRS (gọi tắt là PRRSV) được xác định và phân lập vào
năm 1991 ở viện Thú y Lelystad (Hà Lan) và được phân lớp vào họ
Arteriviridae, giống Arterivirus, bộ Nidovirales. PRRSV là một loại virus RNA
mạch đơn, không màng bao. Kích thước bộ gene khoảng 15 kb, bao gồm 8 khung
đọc mã (ORF). Hai chủng chính được xác định gồm: (1) geneotype 1 với
prototype Lelystad (thường được gọi là chủng Châu Âu-EU) và geneotype 2 với
prototype VR2332 (chủng Bắc Mỹ-NA). Gần đây, một biến thể của geneotype 2
có độc lực cao hơn đã gây nhi ều tổn thất ở châu Á [31], [46]. Mặc dù đôi khi
triệu chứng gây bệnh trên hai type PRRSV có nhiều nét chung, nhưng theo các
nghiên cứu cho thấy hai type có sự khác biệt lớn về bộ gene (55-80% mức độ
tương đồng), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng như độc lực virus [41]. Điều
này có nghĩa là vaccine đư ợc làm từ một chủng PRRSV sẽ không thể bảo vệ
hoàn toàn cho đàn heo.
1.4. Cấu trúc bộ gene PRRSV
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 9

PRRSV là một loại virus RNA mạch đơn, gồm có 8 khung đọc mở (ORF).
Trong đó ORF1a và ORF1b mã hóa cho các protein có hoạt tính polymerase và
replicase. Các ORF2 đến ORF7 mã hóa cho các protein cấu trúc của virus [43].
Sơ đồ cấu trúc bộ gene PRRSV được thể hiện trong hình 1.3.

Hình 1. 3: Cấu trúc bộ gene PRRSV
Chức năng cụ thể của từng ORF của PRRSV được thể hiện trong bảng 1.3.
Bảng 1. 2: Chức năng của các ORF của PRRSV [15]
Khung đọc mã
ORF
Protein được mã hóa
Chức năng protein

ORF1a và ORF1b
Các enzyme sao chép RNA
polymerase
Các protein không cấu
trúc
ORF2
Glycoprotein màng nhỏ GP2a
và GP2b
Protein cấu trúc
ORF2-7
Nucleocapsid protein N
ORF3
Glycoprotein màng GP3
ORF4
Glycoprotein màng GP4
ORF5
Glycoprotein màng chính GP5

ORF6
Protein kết màng-M
ORF7
Nucleocapsid protein -N
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 10
Thông qua phân tích các trình tự PRRSV từ các vùng phân lập khác nhau,
người ta thấy rằng chỉ có khoảng 55-80% sự tương đồng về trình tự gene giữa hai
PRRSV type NA và type EU. Cụ thể là sự tương đồng trình tự giữa các ORF như
sau: 57-59 % (ORF7), 70-81 % (ORF6), 51-59% (ORF5), 68% (ORF4), 58%
(ORF3), 63% (ORF3). Thậm chí, ngay trong cùng một type, sự biến dị di truyền
cao đã được báo cáo ở nhiều công trình trên thế giới, đặc biệt là chủng NA [29].
Chính sự biến động di truyền khá lớn là một trong những nguyên nhân dẫn đến
sự khác biệt và đa dạng về tính gây đáp ứng miễn dịch của PRRSV. Điều này
càng gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine phòng bệnh.
1.5. Cơ chế gây bệnh của PRRSV
Đến nay cơ chế gây bệnh của PRRSV vẫn chưa được hiểu rõ ràng. Các
nghiên cứu chỉ thấy rằng virus PRRSV có ái lực đặc biệt với đại thực bào, đặc
biệt là đại thực bào phổi, gây tổn thương đáp ứng miễn dịch tế bào, phá hủy các
bề mặt màng nhày [13],[40]… Những virus này sẽ sao chép bên trong đại thực
bào phổi và các mô lympho để tạo ra nhiều virus mới, đồng thời phá vỡ các tế
bào đóng vai trò gây đáp ứng miễn dịch này. Các virus mới này tồn tại lâu dài ở
đại thực bào phổi và đại thực bào amiđan. Kháng nguyên PRRSV có thể được
phát hiện ở các đại thực bào của các mô khác nhau, cũng như các tế bào khác bao
gồm mô cơ. Hình 1.4 cho thấy sự thay đổi hình thái của đại thực bào trước và sau
khi nhiễm PRRSV.
Một khi hơn 40% đại thực bào của cơ thể bị phá hủy, PRRSV hầu như đã
loại bỏ hệ thống bảo vệ của cơ thể. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho những
vi khuẩn và virus gây hại khác gây bệnh. Điển hình của trường hợp này là sự gia

tăng nghiêm trọng viêm phổi khi bị nhiễm virus PRRSV. Ngoài ra heo mắc bệnh
PRRS thường bị bội nhiễm với các bệnh như dịch tả heo, tụ huyết trùng, phó
thương hàn, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira spp, bệnh do Steptococcus spp,
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 11
Mycoplasma spp, E.coli Các bệnh kế phát này mới là nguyên nhân chính gây
chết nhiều ở heo mắc bệnh PRRS [46].





Hình 1. 4 : Hình thái của đại thực bào khi bị nhiễm PRRSV. A: đại thực bào bình
thường; B: đại thực bào bị phá hủy
1.6. Một số đặc tính của PRRSV
Virus PRRSV có trong nước bọt, nước tiểu, tinh dịch, qua sữa tiết ra từ
tuyến vú. Do đó PRRSV có thể lây nhiễm qua đường hô hấp, tiêu hóa, giao hợp,
giữa các chuồng trại, thụ tinh nhân tạo, các dụng cụ thiết bị y tế cho heo (như
kim tiêm, quần áo) hoặc qua cơ chất như nước, thức ăn [39], [40].
PRRSV không bền ở bên ngoài với dãy pH từ 5,5 – 6,5. Trong các môi
trường chất tẩy và dung môi có động độ thấp, PRRSV dễ dàng bị bất hoạt nhanh
chóng. PRRSV tồn tại trong nước trên 11 ngày, tuy nhiên ở trạng thái khô nó
cũng dễ dàng bị bất hoạt. Do đó, virus này không tồn tại trong môi trường hay
các điều kiện khô ráo [20].
Vì vậy yếu tố then chốt để kiểm soát và ngăn chặn dịch tai xanh đó là
phát hiện sớm đàn heo bệnh, các trại heo nhiễm bệnh để có biện pháp ngăn chặn,
cách ly và tiêu hủy kịp thời, tránh bùng phát thành dịch bệnh.
A
B

Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 12
1.7. Vaccine phòng ngừa
Mặc dù các hiểu biết về đáp ứng miễn dịch đối với PRRSV vẫn còn chưa
rõ ràng, nhưng một vài vaccine nhược độc và vaccine chết được làm từ chủng
EU và NA đã được thương mại hóa ở nhiều nước. Ở nước ta, hiện nay có 5 loại
vaccine được cấp phép lưu hành [57]:
- Vaccine nhược độc BSL-PS100 (Bestar, Singapore) và Amervac® PRRS
(Hipra, Tây Ban Nha) được đăng kí vào năm 2000 sau khi đàn heo trong nước
phát hiện dương tính với virus gây tai xanh vào cuối năm 1997.
- Vaccine vô hoạt chủng NVDC-JXA1 (Trung Quốc) và vaccine nhược độc
Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim VET, Đức) được đăng kí vào năm
2007 và 2008 khi dịch tai xanh bùng lên dữ dội.
- Vaccine nhược độc JXA1-R (Trung Quốc) đượ c cấp phép lưu hành vào
tháng 9 năm 2010 khi đỉnh dịch heo tai xanh bùng phát trên cả nước.
Hiệu quả của các loại vaccine nêu trên chưa thật sự tốt. Sau khi tiêm heo
vẫn có thể mắc bệnh tai xanh, nên Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
không chính thức khuyến cáo nông dân sử dụng.
Do có sự khác biệt lớn trong cấu trúc kháng nguyên của hai type PRRSV,
các nghiên cứu sâu hơn cho thấy dường như vaccine type NA chỉ cho hiệu quả
tốt trên vùng thực địa nhiễm type NA và ít hiệu quả hơn trên vùng thực địa
nhiễm type EU [43]. Hơn nữa, việc sử dụng các vaccine nhược độc tiềm ẩn nguy
cơ lan truyền virus PRRSV từ heo được tiêm vaccine (do sự tái hoạt hóa của
virus) sang heo chưa được tiêm phòng thông qua tinh dịch và nước dãi. Lúc này
sẽ không thể phân biệt kháng thể có nguồn gốc vaccine với kháng thể có nguồn
gốc từ virus thực địa [39].
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 13

1.8. Các phương pháp phát hiện PRRSV
1.8.1. Dựa trên biểu hiện lâm sàng :
Chủ yếu phát hiện heo bị bệnh dựa vào các biểu hiện lâm sàng như: các
vấn đề về sinh sản ở heo nái (tỉ lệ thụ thai thấp, sảy thai ở giai đoạn cuối, tỉ lệ heo
sinh non cao, thai chết lưu, heo con yếu hoặc chết (hình 1.5)….), các bệnh về hô
hấp (khó thở, ho…), các dấu hiệu lâm sàng như sốt cao, bỏ ăn, da mẩn đỏ, xảy ra
ở bất kì lứa tuổi heo [32]. Theo hướng dẫn của Cục Thú Y nước ta, để phát hiện
heo bệnh tai xanh, phải thường xuyên kiểm tra sức khỏe đàn heo nuôi và sử dụng
định nghĩa ca bệnh lâm sàng như sau: Heo sốt cao trên 40
0
C, khó thở, có những
vết bầm, thâm tím trên da, tai tím xanh, heo ở các lứa tuổi khác nhau đều có thể
mắc bệnh [57].
Trong thực tế chăn nuôi, khi người nuôi thấy các dấu hiệu như: Heo chích
kháng sinh nhiều ngày không giảm, có nhiều heo nái sẩy thai, hoặc sốt nằm đờ
đẫn, hôn mê; heo con, heo cai sữa cả đàn có biểu hiện ửng đỏ toàn thân hoặc tai
tím bầm thì có thể chẩn đoán là heo đã mắc bệnh tai xanh.

Hình 1. 5: Sảy thai, thai chết lưu ở các giai đoạn thai kì khác nhau của bệnh
PRRS
Tuy nhiên, phương pháp này nhận diện bệnh không rõ ràng vì các biểu
hiện bệnh biến động tùy thuộc chủng virus, tình trạng đàn heo, các yếu tố môi
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 14
trường, cũng như việc dễ nhầm lẫn với các bệnh do các tác nhân virus và vi
khuẩn khác gây ra. Bên cạnh đó, thời gian để phát hiện heo nhiễm bệnh lâu, chỉ
phát hiện khi heo đã phát bệnh nên gây khó khăn cho các biện pháp cách ly và
phòng ngừa. Tuy nhiên hiện nay, đây lại là phương pháp phát hiện phổ biến nhất
ở các trại chăn nuôi cũng như các trung tâm thú y ở nước ta.

1.8.2. Phân lập virus (VI):
Phân lập virus được xem như là tiêu chuẩn vàng cho việc phát hiện
PRRSV. PRRSV có thể được phân lập từ mẫu huyết thanh, mô cơ quan như phổi,
lách, tim, hạch bạch huyết Đại thực bào phổi hay dòng tế bào MARC-145 rất
thích hợp làm hệ thống nuôi cấy virus. Việc phân lập thành công virus PRRSV
phụ thuộc rất nhiều vào tuổi heo bị nhiễm, điều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy
mẫu,… Nhược điểm của phương pháp này là tiến hành khó khăn, tốn thời gian
[39], rất khó để phân lập được PRRSV type EU vì type này thư ờng không sao
chép trong tế bào dòng mà chỉ sao chép trên đại thực bào phổi heo (PAM-porcine
alveolar macrophages).
1.8.3. Huyết thanh học:
Huyết thanh học là phương pháp được ưa chuộng vì dễ thực hiện, có độ
nhạy và độ đặc hiệu tốt. Kháng thể IgM có thể phát hiện trong 7 ngày sau khi lây
nhiễm và kháng thể IgG có thể được phát hiện 14 ngày sau khi heo bị nhiễm.
Nhiều phương pháp huyết thanh dựa trên phương pháp IPMA
(ImmunoPeroxidase Monolayer Assay), IFA ( Indirect Fluorescent Antibody)
hay ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)….đã đư ợc công bố và
thương mại hóa như kit HerdCheck-PRRS (IDEXX Laboratories Inc, USA),
Lsivet suis PRRS A/S (Laboratoire Service International, Pháp). Bất lợi của
phương pháp huyết thanh là có thể cho kết quả dương tính giả. Các nghiên cứu
trước đó cho thấy kháng thể đặc hiệu cho PRRSV từ heo mẹ có thể được phát
hiện ở heo con trong 4 ngày sau khi sinh và biến mất trước 3 tuần tuổi (Albina et
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 15
al,1994). Mức độ kháng thể có thể giảm rất nhanh khi thiếu sự tuần hoàn virus.
Ngoài ra đáp ứng vaccine có thể ảnh hưởng đến kết quả cũng như khả năng phân
biệt heo bị nhiễm PRRSV với heo được tiêm ngừa vaccine.
1.8.4. RT-PCR ( Reverse transcription- polymerase chain reaction ):

RT-PCR là phương pháp cải tiến của phương pháp PCR truyền thống cho
phép phát hiện các RNA từ người, động vật và virus. Các RNA này sẽ được
phiên mã ngược thành các cDNA và được nhân bản bằng các cặp mồi đặc hiệu.
Sản phẩm nhân bản sẽ được phát hiện bằng điện di trên agarose.
Theo khuyến cáo của Tổ chức Sức Khỏe Động vật (World Organisation
for Animal Health) năm 2011, phương pháp RT-PCR cần được sử dụng trong
việc kiểm soát tính sạch bệnh ở tinh dịch sử dụng trong thụ tinh nhân tạo và theo
dõi các đàn heo nhi ễm khi cần tái lập tình trạng sạch bệnh [40]. Phương pháp
RT-PCR đơn giản, ít tốn kém. Kỹ thuật RT-PCR nhạy hơn phân lập virus, có thể
phát hiện 10 phần tử virus/ml tinh dịch và hoàn toàn đặc hiệu. Tuy nhiên phương
pháp này cũng có các m ặt hạn chế như có thể cho kết quả dương tính giả, tốn
thời gian do các bước sau PCR, dễ gây nhiễm chéo. Ngoài ra do đặc tính khác
biệt lớn về trình tự gene giữa hai type PRRSV cũng gây khó khăn cho việc thiết
kế cặp mồi đặc hiệu phát hiện PRRSV.
1.8.5. Real-time RT-PCR:
Real-time RT-PCR được xem là phương pháp khắc phục nhược điểm của
phương pháp RT-PCR do ưu điểm nhanh, nhạy, đặc hiệu, giảm các bước sau
PCR, từ đó giảm nguy cơ nhiễm. Hiện nay kĩ thuật Real-time RT-PCR ngày càng
được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh trên người, động vật
và thực vật. Nhiều công trình đã xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện
PRRSV sử dụng mẫu dò Taqman hoặc SYBR đã đư ợc công bố
[9],[16],[45].
Ngoài ra, nhiều nước cũng đã thương mại hóa các bộ kit chẩn đoán PRRSV bằng
kĩ thuật Real-time RT-PCR như PRRSV Real Time RT-PCR kit (Shanghai ZJ
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 16
Bio-Tech Co., Ltd), Real-Time PCR PRRSV Specific Reagents (Tetracore, Inc),
ADIAVET® PRRS EU/NA (Adiagene, France) [53]…
1.9. Phương pháp Real-time RT-PCR

Real time RT-PCR là phương pháp cải tiến của phương pháp RT-PCR
truyền thống cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm nhân bản ngay khi phản
ứng đang xảy ra mà không cần qua bước điện di gel agarose. Khả năng này được
thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu
sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng lượng dấu hiệu huỳnh quang [8],
[33]. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA
(Evagreen, SYBR I, SYBR II) và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc
hiệu với mồi gọi là mẫu dò (mẫu dò Taqman, molecular beacon, mẫu dò Eclipse,
Amplifluor, Scorpions, LUX….). Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ
phận phát hiện huỳnh quang được sử dụng để kiểm soát dấu hiệu huỳnh quang
khi quá trình nhân bản xảy ra. Dấu hiệu huỳnh quang được đo lường phản ánh
lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Hiện nay, mẫu dò Taqman và thuốc nhuộm liên kết Evagreen, SYBR được
sử dụng phổ biến nhất. Mỗi loại đều có những ưu điểm và mặt hạn chế của nó.
a. Thuốc nhuộm liên kết DNA:
Thuốc nhuộm liên kết DNA được sử dụng chủ yếu là SYBR và Evagreen
cho phép liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi (hình 1.6). Các chất này chỉ
phóng thích một lượng nhỏ dấu hiệu huỳnh quang khi nó ở dạng tự do trong dung
dịch, nhưng dấu hiệu huỳnh quang sẽ tăng đến 1000 lần khi nó liên kết DNA
mạch đôi. Như vậy, dấu hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng sẽ tỷ lệ với lượng
DNA mạch đôi hiện diện, và gia tăng khi trình tự mục tiêu được khuếch đại.




Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 17

Hình 1. 6: Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng Real-Time PCR.
Ưu điểm của việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA là thiết kế phản ứng
đơn giản (chỉ cần 2 mồi, không cần thiết kế mẫu dò), kiểm tra được nhiều gene
nhanh chóng mà không cần phải thiết kế các mẫu dò khác nhau (ví dụ, xem xét
hiệu quả biểu hiện gene từ nhiều gene trong một thí nghiệm microarray), chi phí
ban đầu thấp (mẫu dò tốn kém hơn), và có khả năng thực hiện một phân tích
melt-curve (đường cong nóng chảy) để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng
khuếch đại. Tuy nhiên trở ngại lớn nhất của thuốc nhuộm liên kết DNA là chúng
không đặc hiệu, nghĩa là chúng liên kết với bất kỳ DNA mạch đôi nào. Kết quả
là, sự hiện diện của các sản phẩm không đặc hiệu trong phản ứng Real-Time
PCR có thể làm tăng lượng dấu hiệu huỳnh quang tổng và ảnh hưởng đến tính
chính xác của kết quả định lượng. Một bất lợi khác là không thể sử dụng thuốc
nhuộm liên kết DNA cho phản ứng multiplex bởi vì ta không thể phân biệt được
dấu hiệu huỳnh quang từ các sản phẩm khuếch đại khác nhau.
b. Hoá chất phát huỳnh quang dựa trên mồi và mẫu dò:
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 18
Hoá chất phát huỳnh quang dựa trên mồi và mẫu dò được sử dụng phổ
biến hiện nay là mẫu dò Taqman. Đó là một trình tự oligonucleotide đặc hiệu có
gắn chất huỳnh quang. Cũng được biết đến như là phản ứng 5’exonuclease, phản
ứng Taqman sử dụng khả năng 5’-exonulease của các DNA polymerase chịu
nhiệt hiện nay. Mẫu dò Taqman đư ợc gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’

và một chất hấp thụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, dấu hiệu của
chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do chúng nằm gần chất hấp thụ. Trong giai
đoạn kết hợp bắt cặp và kéo dài DNA trong phản ứng nhân bản, mẫu dò liên kết
với trình tự đích và hoạt động 5’-3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi
của DNA polymerase sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả là, chất phát
huỳnh quang bị tách rời khỏi chất hấp thụ, và dấu hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ
với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu (hình 1.7).


Hình 1.7: Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lê Thùy Duyên 19
Ưu điểm chính của mẫu dò Taqman là độ đặc hiệu cao, tỷ lệ huỳnh quang
phát cao, và khả năng thực hiện các phản ứng multiplex. Tuy nhiên giá thành của
nó có thể đắt và việc thiết kế phản ứng khó khăn.
Một phản ứng Real-Time PCR thành công đòi h ỏi sản phẩm phải được
khuếch đại đặc hiệu và hiệu quả. Do đó, cần phải cẩn thận khi lựa chọn trình tự
đích và thiết kế mồi và mẫu dò phù hợp với nó.
Một khía cạnh quan trọng trong việc thiết kế mẫu dò là việc lựa chọn chất
phát và hấp thụ huỳnh quang. Mẫu dò gắn chất phát huỳnh quang màu FAM
thường được sử dụng vì không đắt tiền và có sẵn, hiệu quả tốt và dấu hiệu có thể
được phát hiện bởi bất kỳ thiết bị nào hiện có trên thị trường. Ngoài ra, cần lưu ý
là một số chất hấp thụ chỉ thích hợp cho mẫu dò molecular beacon như
DABCYL. Bên cạnh đó, TAMRA không nên sử dụng như là một chất hấp thụ,
nhưng nó có thể được sử dụng cho các thí nghiệm một màu FAM. TAMRA
không phải là một chất hấp thụ tốt trong mẫu dò molecular beacon. Bảng 1.3 liệt
kê một số cặp chất phát và hấp thụ huỳnh quang thường được sử dụng.
Bảng 1. 3: Các cặp chất phát và hấp thụ huỳnh quang thường được sử dụng
Chất phát huỳnh quang

Chất hấp thụ huỳnh quang thích hợp
FAM
BHQ1, DABCYL, TAMRA
TET
BHQ1, DABCYL
HEX
BHQ1, BHQ2, DABCYL
TAMRA
BHQ2, DABCYL
Texas Red
BHQ2, BHQ3, DABCYL
ROX
BHQ2, BHQ3, DABCYL
Cy5
BHQ2, BHQ3