đã chỉnh sửa 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1/ PROTEIN NGỌT VÀ PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT
2/ MIRACULIN

1. PROTEIN NGỌT VÀ PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT
Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới đã xác định được 7 loại protein ngọt
và protein tạo cảm giác ngọt từ tự nhiên. Theo đặc tính có thể chia thành 3 nhóm:
Nhóm 1: các protein ngọt (thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin và brazzein),
nhóm 2: protein cảm ứng độ ngọt (miraculin) và nhóm 3: protein có đủ đặc tính
của hai nhóm trên (neoculin). Các thuộc tính và tính chất chất của các protein này
được trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số đặc tính của protein ngọt và tạo cảm giác ngọt (Kant 2005)
Đặc
tính

Thaumatin

Monellin

Mabilin

Pentadin

Brazzein

Curculin

Miraculin

Nguồn
gốc

T. danielli
Benth

D. cumminsii
Diels

C. masaikai

P. Baillon

P. Baillon

C.
latifolia

R. dulcifica

Phân bố

Tây Phi

Tây Phi

Trung Quốc

Tây Phi

Tây Phi

Malaysia

Tây Phi

Biến thể

I, II, a, b, c

-

I, II-a, III,
IV

-

-

-

-

Độ ngọt
(*)

3000

3000

100

500

2000

550

-

KLPT
(kDa)

22,2

10,7

12,4

12,0

6,5

24,9

24,6

Acid
amin

207

45 (chuỗi A)
50 (Chuỗi B)

33 (chuỗi
A)
72 (Chuỗi
B)

-

54

114

191

Dạng
hoạt
tính

Monomer

(A+B)

(A+B)(1)

-

Monomer

(A+A) (2)

(A+A),
(A+A+A+A) (3)

(*) độ ngọt được tính dựa theo khối lượng phân tử, (1) : heterodimer, (2): homodimer, (3): tetramer.


Trong số các protein kể trên, monellin có độ ngọt là 100.000 lần, sau đó là
brazzein và thaumatin lần lượt là khoảng 500 lần và 3000 lần so với sucrose (dựa
theo nồng độ mol/lít). Tất cả các protein này đều được phân lập từ cây sống trong
rừng mưa nhiệt đới. Các protein này có tiềm năng ứng dụng trong cơng nghiệp để
thay thế chất làm ngọt nhân tạo mà ít sinh năng lượng và an toàn cho người sử
dụng.
Brazzein
Brazzein là protein nhỏ nhất thuộc nhóm protein tạo vị ngọt, protein này
chứa 54 acid amin. Brazzein rất bền với nhiệt độ và độ pH, có độ ngọt vào khoảng
500-2000 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng phân tử) và rất có tiềm năng sử
dụng như chất làm ngọt với năng lượng thấp. Brazzein được phân lập từ quả
Pentadiplandra brazzeana Baillon, một loại cây sống ở Châu Phi. Với đặc tính
bền nhiệt và bền với pH của brazzein giúp các nhà khoa học có thể sử dụng
brazzein để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ pH đến hoạt tính tạo cảm
giác ngọt của các protein ngọt nói chung (Izawa et al., 1996).
Thaumatim
Thaumatin thuộc nhóm protein tạo vị ngọt được phân lập từ cây vùng nhiệt
đới Thaumatococcus danielli. Thaumatin có 207 acid amin với 8 cầu liên kết
disulfide và không chứa cystein tự do. Khi nhiệt độ trên 70oC và pH 7,0 thì
thaumatin có xu hướng kết dính lại và mất hoạt tính tạo vị ngọt (Kaneko,
Kitabatake 1999). Thaumatin có độ ngọt khoảng 10.000 lần so với sucrose (dựa
theo nồng độ mol/lít), protein này được sử dụng ở nhiều quốc gia theo hướng tạo

cảm giác ngọt hoặc tăng cường độ ngọt (Zemanek, Wasserman 1995).
Monellin
Monellin là một protein ngọt chứa 2 chuỗi peptide, chuỗi A có 44 acid amin
và chuỗi B chứa 50 acid amin (Ota et al., 1999). Protein này được tinh sạch từ quả
cây Dioscoreophyllum cumminsii sống ở Tây Phi. Độ ngọt của monellin là
khoảng 100.000 lần so với đường sucrose và khoảng vài trăm lần dựa theo nồng
độ mol/lít và khối lượng. Chuỗi đơn của monellin có 94 acid amin đã được chứng
minh là có độ ngọt tương tự như hai chuỗi monellin trong tự nhiên, dạng chuỗi


đơn cũng bền với nhiệt độ và độ acid so với monellin tự nhiên (Lee et al., 1999).
Các nghiên cứu gần đây cũng xác định các vị trí liên kết của monellin với thụ thể
vị giác của người, các vị trí đó gồm AsnA16, AsnA22, GlnA25 và AsnA26 có hoạt tính
tạo cảm giác ngọt lần lượt là 7500, 750, 2500 và 5500 lần so với sucrose (dựa theo
khối lượng phân tử) (Kohmura et al., 1992).
Curculin
Curculin được thu nhận từ cây Curculigo latifolia, curculin có hoạt tính như
chất làm ngọt ít sinh năng lượng. Độ ngọt tối đa của curculin tương đương với
dung dịch sucrose 0,35 M. Nó có khả năng tạo ra vị ngọt đối với nước và các chất
chua sau khi sử dụng curculin. Hoạt tính tạo vị ngọt của curculin không thay đổi
sau khi được xử lý ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ với pH từ 3-9.
Mabinlin
Mabinlin là một protein ngọt rất bền với nhiệt độ, được bắt nguồn từ cây
Capparis masaikai, có độ ngọt khoảng 400 lần so với sucrose (dựa theo khối
lượng phân tử). Protein này có chứa hai chuỗi, chuỗi A có 33 acid amin và chuỗi
B có 72 acid amin, trong chuỗi B có chứa hai liên kết disulfide và chuỗi B liên kết
với chuỗi A thông qua ba liên kết disulfide (Kohmura et al., 1992). Độ ngọt của
mabinlin-2 không thay đổi sau xử lý 48 giờ ở điểm sôi, đối với mabinlin-3 và
mabinlin-4 vẫn giữ được hoạt tính sau khi xử lý ở 80oC trong 1 giờ (Nirasawa et
al.,1994).

Pentadin
Pentadin là một loại protein ngọt được tách chiết từ cây Pentadiplandra
brazzeana, đây là một loại cây bụi được phát hiện ở rừng nhiệt đới của một số
quốc gia Châu Phi. Độ ngọt của nó bằng khoảng 500 lần so với sucrose (dựa theo
khối lượng phân tử), trong phân tử cũng chứa hai tiểu phần liên kết với nhau qua
cầu disulfide. Đến nay cũng chưa có nhiều thơng tin về protein này (van der Wel
et al., 1989).
2. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin
2.1 Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ


Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) thuộc họ Hồng xiêm (Sapotaceae)
(Matsuyama et al., 2009). Đây là loại cây bụi sống ở vùng nhiệt đới Tây Phi.
Trong điều kiện tự nhiên, cây cao khoảng 6 m còn trong điều kiện nhân tạo thì
chiều cao khoảng 3 m. Loại cây này sinh trưởng tốt ở đất có pH từ 4,5-5,8, trong
điều kiện lạnh, chịu bóng và ở nơi có độ ẩm tương đối cao.
Cây thần kỳ có quả màu đỏ, kích thước quả nhỏ (hình 1.1), khi nhai phần
thịt quả thần kỳ sau đó ăn vị chua chẳng hạn như chanh, lúc đó chanh sẽ có cảm
giác ngọt mà khơng cịn vị chua. Do vậy, cây này được gọi tên “thần kỳ”, có quả
được người dân Châu Phi dùng cách đây hàng trăm năm (Kurihara, Beidler 1968).

Hình 1.1. Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) và quả cắt dọc
Tính chất tạo cảm giác ngọt khi sử dụng quả thần kỳ là do miraculin chứa
trong quả tạo ra mà bản thân miraculin là không ngọt. Ưu điểm của việc sử dụng
miraculin là vừa tạo ra cảm giác ngọt vừa có năng lượng hấp thụ thấp, do đó rất tốt
cho cải thiện bữa ăn của bệnh nhân tiểu đường và béo phì (Sun et al., 2006a)
Trong tự nhiên, miraculin được tích lũy ở quả của cây thần kỳ 6 tuần tuổi
khi quả chuyển từ màu xanh lá cây sang màu cam và miraculin được tích lũy nhiều
nhất khi quả ở trạng thái đỏ hoàn toàn, miraculin được tiết ra và tích lũy trong lớp
gian bào của quả thần kỳ (Hirai et al., 2010b) (hình 1.2).

Hình 1.2. Miraculin tự nhiên được tích lũy trong phần thịt quả cây thần kỳ.
(A). Hàm lượng miraculin được tích lũy trong thịt quả; (B). Miraculin trong thịt
quả được phân tích bằng Western blot; (C). Các giai đoạn phát triển của quả thần
kỳ (Hirai et al., 2010a, Hiraiet al., 2011a, Kim et al., 2010b).
Tại Việt Nam, Trần Danh Thế et al (2009) đã bước đầu trồng thử nghiệm
cây thần kỳ tại Thành phố Hồ Chí Minh, theo dõi đặc điểm sinh học cũng như
phân tích thành phần từ thịt quả cây thần kỳ ở giai đoạn chín đỏ, kết quả phân tích
cho thấy ,dịch chiết quả gồm: nước (68,9%), đường tan tổng số (2,38%), đường
khử (0,40%), protein (0,10%), đạm tổng số (1,91%) và khống tổng số (0,99%).
Ngồi ra cũng đã định tính được một số thành phần cơ bản trong dịch chiết thịt quả
gồm tinh dầu, carotenoid, phytosterol, acid béo, flavonoid, polyphenol, acid hữu
cơ, saponin steroid, đường khử, hợp chất uronic (Trần Danh Thế et al., 2009).
2.2. Cấu trúc của miraculin
Miraculin là một glycoprotein, chuỗi polypeptide chứa 220 acid amin trong
đó có 29 acid amin là trình tự tín hiệu (Masuda et al., 1995). Khối lượng phân tử


của chuỗi đơn peptide được tính tốn dựa trên trình tự acid amin là khoảng 24,6
kDa, trong đó hàm lượng hydrocacbon chiếm khoảng 13,9% (Theerasilp et al.,
1989).
Miraculin tự nhiên tinh khiết là tetramer, dịch chiết thô chưa khử và chưa
biến tính của miraculin là dimer. Cả hai dạng tetramer và dimer tự nhiên của
miraculin đều có tác dụng tạo cảm giác ngọt (Igeta et al., 1991), trong khi đó dạng
monomer lại khơng có tính chất này (Ito et al., 2007). Vì vậy, q trình dimer hóa
từ hai monomer của miraculin thơng qua việc tạo một liên kết cộng hóa trị ở vị trí
Cys138-Cys138 (Cysteine) cần thiết để tạo ra miraculin dimer có hoạt tính (hình
1.3).

Hình 1.3. Mơ hình cấu trúc 3D của protein miraculin dạng homodimer. Mũi tên màu
xanh: liên kết disulfide (Cys138-Cys138) giữa hai monomer.
Phân tử miraculin có hai vị trí glycosyl hố là Asn42 và Asn186 tạo thành
các ,oligosarcharide (Hiwasa-Tanase et al., 2011). Miraculin có bảy phân tử Cys,
hình thành ba chuỗi tương tác qua cầu disulfide ở Cys47-Cys92, Cys148-Cys159
và Cys152- Cys155 và một chuỗi tương tác qua cầu disulfide ở Cys138 (Igeta et
al., 1991).
2.3. Cơ chế tạo cảm giác ngọt của miraculin
Miraculin có bản chất khơng ngọt, sau khi sử dụng miraculin từ quả thần
kỳ thì vị chua của quả chanh có vị ngọt của cam. Miraculin có khả năng tạo ra cảm
giác ngọt từ các loại acid khác nhau như HCl, acid oxalic, acid lactic, acid formic,


acid axetic và acid citric. Tác dụng tạo cảm giác ngọt của miraculin phụ thuộc vào
độ chua và độ pH của acid (Kurihara, Beidler 1969). Hoạt tính tạo cảm giác ngọt
của dung dịch miraculin đạt mức tối đa sau khi ngậm dung dịch trong miệng
khoảng 3 phút (Kurihara, Beidler 1969). Để có thể tạo ra cảm giác ngọt tối đa,
nồng độ của miraculin là từ 4.10-7 M và độ ngọt đạt được tương đương với độ
ngọt của dung dịch sucrose 0,4 M. Tác dụng tạo cảm giác ngọt kéo dài khoảng 1
giờ sau khi sử dụng, tùy thuộc vào nồng độ của dung dịch miraculin.
Ở người, vị được cảm nhận nhờ vào các tế bào thụ thể trong chồi vị giác.
Có 5 loại vị giác cơ bản: mặn, chua, ngọt, đắng và umami, trong đó cảm giác ngọt
và vị umami là các vị ngon chính của con người. Thụ thể vị giác ở động vật có vú
có bản chất là phức hệ G protein, trong đó phức hệ thụ thể cảm giác ngọt là
T1R2+T1R3 (Zhao et al., 2003).

Hình 1.4. Mơ hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác ngọt. (A).
Mơ hình mơ phỏng tương tác giữa protein ngọt với thụ thể; (B). Mơ hình phân tử
thể hiện tương tác giữa miraculin với thụ thể T1R2+T1R3 (Kant 2005, Koizumi et
al., 2011).

Miraculin có thể làm thay đổi cấu hình của các chồi vị giác trên lưỡi sau
khi sử dụng. Điều này có thể là kết quả của sự hoạt hố các thụ quan cảm giác ngọt
trên lưỡi bởi miraculin: đầu tiên protein cảm giác ngọt (ký hiệu màu đỏ, hình
1.4A) sẽ liên kết với thụ thể T1R2+T1R3 ở dạng I, liên kết này làm thay đổi cấu
hình của thụ thể, trở thành dạng II ổn định hơn (Kant 2005, Koizumi et al., 2011).
Cơ chế chi tiết về hoạt động và thuộc tính cảm ứng lưỡi của miraculin đến nay vẫn
chưa rõ ràng, có quan niệm cho rằng các chồi vị giác khác nhau cho cảm giác vị


khác nhau chẳng hạn như các chồi vị giác nhận ra vị mặn và truyền tín hiệu này
lên não để hoạt hóa các thụ quan vị mặn và cho chúng ta có cảm giác vị mặn này.
Trong trường hợp của miraculin, các tế bào thụ quan cảm giác ngọt trên chồi vị
giác khơng nhận ra vị của miraculin mà nó hoạt hố các thụ quan cảm giác ngọt
trên não. Vì thế miraculin đã“đánh lừa” não bộ.
2.4. Tình hình nghiên cứu miraculin tái tổ hợp
Cây thần kỳ là loại cây sống ở vùng nhiệt đới, cây không thể sống được
nếu nhiệt độ mơi trường thấp hơn 70C, thêm vào đó, cây cần đến 3-4 năm tuổi để
có thể ra hoa và chỉ một phần nhỏ số hoa đó mới được thụ phấn. Ngoài ra, hoạt
động tạo cảm giác ngọt của miraculin trong quả thần kỳ sẽ bị mất hoạt tính sau
khoảng 2-3 giờ thu hoạch khi quả được bảo quản ở nhiệt độ phịng (Kurihara,
Nirasawa 1997). Vì vậy, nguồn miraculin tự nhiên bị hạn chế. Từ các tính chất ưu
việt của miraculin nên việc sản xuất sinh khối miraculin là cần thiết.
Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là
công nghệ gen đã giúp nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm miraculin tái tổ hợp trên
nhiều đối tượng biểu hiện khác nhau như E.coli, nấm men, nấm mốc (Aspergillus
oryzae) và thực vật. Miraculin tái tổ hợp được tạo ra trong E.coli khơng có hoạt
tính tạo cảm giác ngọt mặc dù có biểu hiện protein này (Kurihara 1992). Gần đây,
miraculin tái tổ hợp được biểu hiện lại trong E.coli với một số cải tiến bởi nhóm
nghiên cứu Matsuyama et al (2009), nhóm đã thành cơng trong việc sản xuất
miraculin dimer có hoạt tính. Tuy nhiên, hoạt tính của nó chỉ bằng khoảng 1/6 so

với miraculin tự nhiên. Kết quả này cho thấy quá trình glycosyl hóa là cần thiết
cho q trình cuộn gấp và ổn định của protein này (Matsuyama et al., 2009).
Miraculin tái tổ hợp có hoạt tính cũng được sản xuất trong nấm mốc (có q trình
glycosyl hóa) (Ito et al., 2007). Một hệ thống vi sinh vật khác được sử dụng để
biểu hiện miraculin tái tổ hợp là tế bào nấm men có mã di truyền đã tối ưu và bổ
sung them trình tự tín hiệu, kết quả là miraculin tái tổ hợp được tạo ra có hoạt tính
(Ito et al., 2010). Hoạt tính của miraculin tái tổ hợp ở cả hệ thống nấm mốc và nấm
men được đánh giá là khoảng 1/5 so với hoạt tính của miraculin tự nhiên, kết quả
này cũng có thể giải thích rằng khơng chỉ q trình glycosyl hóa quan trọng mà


còn phụ thuộc vào bản chất của chuỗi đường liên kết, sự sự ổn định của miraculin
được tổng hợp.
Các nghiên cứu gần đây xác định thực vật là hệ thống thích hợp nhất để
sản xuất miraculin có hoạt tính sinh học, có thể ở thực vật nói chung có quá trình
glycosyl hóa tương tự như ở cây thần kỳ. Cây xà lách (Lactuca sativa) là thực vật
đầu tiên được sử dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp, hoạt động của gen này
được điều khiển bởi promoter 35S và NOS terminator, kết quả là miraculin tái tổ
hợp được tạo ra có đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác ngọt với độ ngọt tương đương
với miraculin tự nhiên (Sun et al., 2006a). Tuy nhiên, sự “câm lặng” của gen
chuyển xảy ra ở các dòng chuyển gen thế hệ con cháu (Sun et al., 2007). Tiếp theo,
miraculin được biểu hiện trong cây dâu tây chuyển gen, đây là loại cây có ưu thế
sinh sản vơ tính, tuy nhiên miraculin tái tổ hợp được tích lũy có hàm lượng rất
thấp, chỉ khoảng 2,0 µg/g khối lượng tươi, mặc dù mức độ tích lũy ổn định qua các
thế hệ nhờ sinh sản vơ tính (Sugaya et al., 2008). Miraculin tái tổ hợp cũng đã
được biểu hiện trong cây cà chua, đây được xem là loại cây thích hợp nhất trong số
các lồi thực vật được sử dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp (Kurokawa et al.,
2013). Cây cà chua cũng có nhiều ưu điểm khác như chuyển gen dễ dàng thông
qua Agrobacterium, hiệu suất biến nạp có thể lên đến 40% (Sun et al., 2006b). Các
thể biến nạp có thể thu được trong khoảng 3 tháng sau khi hạt nảy mầm. Hơn nữa,

cây cà chua chuyển gen tạo ra miraculin tái tổ hợp có hàm lượng khoảng 90,7 µg/g
khối lượng tươi của quả, có đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác ngọt, tương đương với
miraculin tự nhiên (Sun et al., 2007). Ngoài ra, mức độ tích lũy và biểu hiện của
gen chuyển là ổn định từ thế hệ T1 đến T5 (Yano et al., 2010). Tuy nhiên, sự tích
lũy của miraculin tái tổ hợp cũng phụ thuộc vào bản chất giống cà chua, số lượng
bản copy của gen chuyển và thời điểm chín của quả cà chua (Hirai et al., 2011a,
Hiwasa-Tanase et al., 2011, Sun et al., 2007). Một hệ thống gần đầy cũng được sử
dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp là cây cam quýt, đây cũng hệ thống này rất
tiềm năng để sản xuất miraculin trong tương lai (Jin et al., 2013).
Trong quá trình nghiên cứu sản xuất miraculin tái tổ hợp cũng như
miraculin được phân lập từ tự nhiên, việc xác định chính xác khối lượng phân tử


cũng như tinh sạch được sản phẩm này rất quan trọng, phục vụ các nghiên cứu chi
tiết. Trước đây các mẫu phân lập được chưa hoàn toàn tinh sạch và do đó việc xác
định cấu trúc chủ yếu của miraclin chưa được thực hiện. Kỹ thuật tinh sạch
miraculin từ quả cây thần kỳ được phát triển từ những năm 1968 (Kurihara,
Beidler 1968). Tuy nhiên, các phương pháp này không thể loại bỏ của chất tạo
màu polyphenolic và giảm hoạt tính tạo cảm giác ngọt. Năm 1988, Theerasilp và
Kurihara đã sử dụng dung dịch NaCl để tách chiết dịch thô từ quả thần kỳ, sau đó
tiến hành sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực để tinh sạch miraculin thu được
(Theerasilp, Kurihara 1988), khối lượng phân tử được xác định bằng SDS-PAGE
là khoảng 28 kDa trong khi các thông báo trước đó đã cho rằng khối lượng của
miraculin dao động 40 kDa tới 48 kDa. Miraculin là một glycoprotein có chứa
khoảng 13,9% carbohydrate (Theerasilp, Kurihara 1988). Gần đây, hệ thống tinh
sạch một bước sử dụng sắc ký ái lực kim loại nikel cố định đã được phát triển
(Duhita et al., 2009). Phương pháp này sử dụng chuỗi histidine tiếp xúc trên bề
mặt của dimer miraculin. Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp
trước đây và làm giảm được bước sử dụng cột lọc nên tiết kiệm về thời gian, giảm
chi phí cho q trình tinh sạch. Thêm vào đó, phương pháp này cũng cho phép tinh

sạch dạng miraculin hoạt tính bởi vì cột IMAC liên kết chỉ với miraculin có cấu
trúc khơng gian 3 chiều ở dạng dimer (cấu trúc khơng gian này có liên quan đến
hoạt động tạo cảm giác ngọt) và không liên kết với miraculin dạng monomer (dạng
khơng có hoạt tính). Mặc dù phương pháp tinh sạch sử dụng IMAC là hiệu quả
hơn so với các phương pháp khác, trong tương lai cần thiết phải phát triển các
phương pháp khác để ứng dụng trên quy mô công nghiệp.
Đối với miraculin tái tổ hợp, q trình tinh sạch có thể được thực hiện theo
phương pháp của Theerasilp và Kurihara (1988) bằng cách thêm sắc ký cột khối
lượng phân tử (Sephacryl S-200 HR) nhưng phương pháp này mất thời gian và có
mức độ thu hồi thấp vì liên quan đến nhiều bước tinh sạch (Sun et al., 2007).