Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen cystatin 2 vào một số giống ngô thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ ĐỨC HUẤN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC GEN
CYSTATIN2 VÀO MỘT SỐ GIỐNG NGÔ THÔNG
QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

i
ĐẠI HỌC THÁ I NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ ĐỨC HUẤN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC GEN
CYSTATIN2 VÀO MỘT SỐ GIỐNG NGÔ THÔNG
QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

THÁI NGUYÊN - 2015


ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi
dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của
các cán bộ Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học
Thái Nguyên; Khoa Sinh – Đại học Sư Phạm Thái Nguyên; Viện Công
nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số
liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 01 tháng 05 năm 2015
Tác giả luận văn

LÊ ĐỨC HUẤN


3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh
Thanh, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, anh chị em Khoa Khoa học
sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập và thực
hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, anh chị em Khoa Sinh họcĐại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ
sở vật chất giúp tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật viên
phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có
thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình,
đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn
cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày 1 tháng 05 năm 2015
Tác giả luận văn

Lê Đức Huấn


4

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. iii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
.................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY NGÔ (ZEA MAYS L.) ................................... 3
1.2. ĐẶC ĐIỂM MỌT HẠI NGÔ Sitophyllus zeamais ............................. 10
1.2.1. Sơ lược về mọt hại ngô.................................................................. 10
1.2.2. Đặc điểm hình thái của mọt ngô ................................................... 11
1.3. PROTEINASE VÀ CYSTATIN............................................................ 13
1.3.1. Proteinase và các loại proteinase ................................................. 13
1.3.2. Proteinase inhibitor và Cystatin ................................................... 15
1.4. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT........................................................... 18
1.4.1. Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens .................................................................... 18
................................................ 22
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 25
2.1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ ................................................................... 25
2.1.1. Vật liệu .......................................................................................... 25
2.1.2. Hóa chất, thiết bị sử dụng ............................................................. 26
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................. 27
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 27
2.2.1.

................................................................................ 29

2.2.2.

.............................................................................. 29

2.2.3. Tạo dịch huyền phù ....................................................................... 30


5

2.2.4. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy ..................................................... 30
2.2.5. Diệt khuẩn, nuôi cấy và chọn lọc mô sẹo chuyển gen .................. 30
2.2.6. Phương pháp tái sinh cây từ mô sẹo, tạo rễ và cho cây ra đất .... 31
2.2.7. Phương pháp bố trí thí nghiệm thử các yếu tố ảnh hưởng tới khả
năng chuyển gen của ngô ........................................................................ 32
2.2.8. Đánh giá, phân tích kết quả chuyển gen ....................................... 34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 37
3.1 Chuyển vector mang gen Cystatin2 vào 2 giống ngô nghiên cứu ........ 37
3.2. Kết quả kiểm tra cây ngô mang gen Cys2 sau khi chuyển gen............ 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 47
4. 1. Kết luận ............................................................................................... 47
4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 48
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 55


6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Anh

1

BAP

6- benzyl amino purine

2

bp

Base pair

3

cDNA

Complementary DNA

5

CS

6

Cys2

Cystatin2

7

DNA

Deoxyribose nucleic acid

8

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

9

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic
acid

10

Nghĩa tiếng Việt

Cặp bazơ

Cộng sự

IPTG

Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside

12

kb

kilo base

13

LB

Luria Bertani

14
MS

Môi trường nuôi cấy mô
cơ bản theo Murashige
và Skoog

15

NXB

Nhà xuất bản

16

mRNA

messenger ribonucleic acid

17

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

20

RNA

Ribonucleic acid

21

TAE

Tris – acetate- EDTA

22

Taq

Thermus aquaticus

19

Phản ứng chuỗi trùng
hợp


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1. Sản xuất ngô trên thế giới giai đoạn 1961 – 2012…………………8
Bảng 1.2. Thống kê diện tích, năng suất, sản lượng ngô của Việt Nam từ năm
2007 - 2013........................................................................................................ 9
Bảng 2.1. Đặc điểm 2 giống ngô nghiên cứu .................................................. 25
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................... 26
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA .................................. 34
Bảng 2.4. Thành phần chạy phản ứng PCR nhân gen Cys2 t
......................................................................................... 35
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân gen Cys2 ........................ 35
Bảng 3.1. Ảnh hưởng thời gian gây nhiễm A.tumefaciens đến khả năng tạo mô
sẹo từ phôi non của 2 dòng ngô LVN99 và LVN885 ..................................... 38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất kháng sinh kanamycin đến khả năng
tạo mô sẹo từ phôi non của 2 giống ngô LVN99 và LVN885 ........................ 40
Bảng 3.3. Kết quả tạo cây ngô chuyển gen Cys2 ............................................ 42


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Hình 2.1. Cây ngô mẹ được trồng ngoài đồng ruộng ..................................... 29
Hình 2.2. Phôi ngô được tách ra khỏi hạt ....................................................... 29
Hình 3.1. Ảnh hưởng thời gian gây nhiễm đến khả năng tạo mô sẹo của 2
giống ngô LVN 99 và LVN885 ...................................................................... 38
Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất kháng sinh kanamycin đến khả năng tạo mô
sẹo của 2 giống ngô LVN99 và LVN885 ....................................................... 41
Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất kháng sinh kanamycin đến khả năng tạo mô
sẹo từ phôi non của 2 giống ngô LVN99 và LVN885 .................................... 41

Hình 3.4. Dòng cây ngô chuyển gen được tái sinh từ phôi non (A) và dòng
cây chuyển gen được đưa ra môi trường đất pha cát (B) từ giống ngô LVN9943
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây ngô.................... 44
Hình 3.6. Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Cys2....................... 45


1

MỞ ĐẦU

Cây ngô (Zea mays L.) là cây lương thực giàu dinh dưỡng có vai trò
.
nhất cung cấp lương thực cho loài
người, được
-

-

hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Cây ngô được gieo

. Theo thống kê của FAO, năm 2012 cây ngô được
với diện tích 177,38 triệu ha,

[57

t Nam,

ngô là cây lương thực được

.

Ở nước ta hiện nay, ngô là một trong những cây trồng đang được coi
trọng để phát triển cả diện tích cũng như năng suất và chất lượng. Tuy
nhiên, do điều kiện khí hậu, thời tiết nước ta rất phức tạp, vấn đề bảo quản
ngô sau thu hoạ

để
đưa vào sản xuất. Hiện nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng
kháng mọt của ngô như: nghiên cứu về thành phần sâu mọt hại ngô trong
quá trình bảo quản, đặc điểm sinh thái học của loài mọt ngô, đánh giá
giống ngô nhiệt đới kháng mọt Sitophilus zeamais [42], [45], nghiên cứu
đánh giá cải thiện giống ngô lai với mức độ kháng khác nhau với mọt ngô
[49], đánh giá biểu hiện của gen Cystatin lúa mạch trong ngô tăng cường


2

sức đề kháng [25]. Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng đặc tính kháng mọt của
cây ngô do nhiều gen quyết định, trong đó có gen Cystatin [19]. Xuất phát
từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống ngô theo hướng nâng cao khả
năng kháng mọt, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu chuyển cấu
trúc gen Cystatin2 vào một số giống ngô thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Chuyển cấu trúc gen Cystatin2 liên quan đến khả năng kháng mọt vào
giống ngô LVN99 và LVN885.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm A.tumefaciens đến khả năng
tạo mô sẹo từ phôi non của hai giống ngô LVN99 và LVN885.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh đến khả năng tạo mô sẹo từ
phôi non của hai giống ngô LVN99 và LVN885.

- Chuyển cấu trúc gen Cystatin2 vào giống ngô LVN99 và LVN885.
- Đánh giá kết quả chuyển gen bằng phương pháp PCR.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY NGÔ (ZEA MAYS L.)
1.1.1. Sơ lược về cây ngô
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., do nhà thực vật học Thụy Điển
Linnaeus đặt tên theo hệ thống tên kép Hy Lạp - La Tinh: Zea - từ Hy Lạp để
chỉ cây ngũ cốc và Mays là từ ―Maya‖- tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ
- xuất xứ của cây ngô. Ngô là một loại cây lương thực thuộc chi Maydeae, họ
hòa thảo (Gramineae), bộ hòa thảo (Graminales) [13]. Căn cứ vào kết quả
nghiên cứu khảo cổ học, tế bào học, di truyền học… cho thấy cây ngô có
nguồn gốc từ Châu Mỹ, ngô lan truyền sang Châu Âu và phần còn lại của thế
giới sau khi có sự tiếp xúc của người Châu Âu với Châu Mỹ. Ở Việt Nam ngô
được trồng vào thế kỷ thứ XVII.
Ngô thuộc nhóm cây hòa thảo, có bộ rễ phát triển rất mạnh, nên có khả
năng hút nước rất khỏe, hơn nhiều loài cây trồ

ễ của cây ngô

hoàn chỉnh chia thành 3 nhóm: rễ mầm, rễ đốt, rễ chân kiềng. Rễ mầm mọc từ
trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nướ

. Rễ đốt

mọc vòng quanh các đốt thấp của thân. Rễ chân kiềng mọc quanh các đốt thấp

sát mặt đất. Rễ này giúp cây chống đỡ và bám chặt vào đất, chúng cũng tham
gia hút nướ

. Số lượng rễ, số lông rễ và độ dài rễ khác nhau ở

mỗi giống.
Thân ngô đặc, đường kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m. Thân ngô
trưởng thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ.
Thân ngô ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận
chuyển chất hữu cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất
hữu cơ.


4

Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Các bộ phận
của lá bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa lìa. Theo hình thái và vị trí trên thân, lá
ngô được chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá bẹ, lá bi. Số lá, độ lớn của
lá phụ thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số lá
ngô thường biến động từ 15 - 20 lá. Đặc điểm nổi bật là lá ngô có rất nhiều
2

khí khổng. Trung bình một lá ngô có từ 2 - 6 triệu khí khổng, trên 1mm lá có
từ 500 - 900 khí khổng. Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ
tới điều kiện hạn hán. Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời
làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dưỡng…
Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Cơ quan sinh sản đực (bông
cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau.
Hoa đực nằm ở đỉnh cây. Hoa cái phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm
nách nhiều nhưng chỉ có từ 1 - 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Số

bắp trên cây phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ và phân bón.
Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi,
nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt bao xung quanh hạt là một màng nhẵn. Lớp
alơrôn nằm dưới vỏ hạt. N

: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá

mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm.
Quá trình sinh trưởng, phát triển của cây ngô được chia thành hai giai
đoạn: giai đoạn sinh dưỡng và giai đoạn sinh thực. Giai đoạn sinh dưỡng
được tính từ khi gieo đến trỗ cờ. Giai đoạn sinh thực được tính từ trỗ cờ đến
chín hoàn toàn. Căn cứ vào đặc điểm quá trình sinh trưởng phát triển có thể
chia ra các giai đoạn sinh trưởng phát triển quan trọng sau đây: giai đoạn hạt
nảy mầm và mọc; giai đoạn từ mọc đến 3 lá; giai đoạn từ 3 lá đến 7 lá; giai
đoạn từ 7 lá đến trổ cờ; giai đoạn từ trỗ cờ đến tung phấn, phun râu; giai đoạn
từ thụ phấn đến chín [10].


5

1.1.2. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô
Thành phần hydratcacbon ở ngô chủ yếu là tinh bột (60 - 70%), lipid
chủ yếu là acid béo, protein, hàm lượng đường khoảng 3,5%, lượng tro
khoảng 1 - 2,4%, chất khoáng chiếm trên 60% khối lượng của phôi [10].
Tỷ lệ protein trong hạ

8 - 12%. Protein chính của ngô là

zein, một loại prolamin, gần như không có lysine và tryptophan. Protein của
ngô được chia thành 3 loại chính: protein hoạt tính (enzyme), protein cấu tạo

và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất. Hàm lượng
protein cũng như các thành phần amino acid bị thay đổi bởi những tác động
của các yếu tố di truyền (giống) và môi trường, kỹ thuật canh tác.
Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm. Ngô cũng có
nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6..). Vitamin PP hơi thấp cộng với
thiếu tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP. Riêng ngô vàng chứa
nhiều carotene (tiền vitamin A) [9].
3% là stearic. Hàm lượng lipid là một chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá chất lượng hạt [7].
1.1.3. Đặc điểm di truyền học của cây ngô
Chi Zea có một loài duy nhất zeamays nhưng có rất nhiều giống, hàng
ngàn giống được phân chia thành nhiều loài phụ khác nhau dựa vào đặc điểm
cấu trúc hạt. Ngô gồm có chín loài phụ như sau: Ngô răng ngựa (Zea mays
var.indentata Sturt.), ngô đá (Zea mays var.indurata Sturt.), ngô nổ (Zea mays
var.everta Sturt.), ngô bột (Zea mays var.amylacea Sturt.), ngô đường (Zea
mays var.saccharata Sturt.), ngô bọc (Zea mays var.tunicata Sturt.), ngô nếp
(Zea mays var.ceratina Kulesh.), ngô đường bột (Zea mays var.amylacea
saccharata Sturt.), ngô bán răng ngựa (Zea mays var.semiindentata Kulesh.).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


6

Ngô có bộ nhiễm sắc thể 2n = 20. Chiều dài tổng cộng của các nhiễm
sắc thể là 1.500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có cái mà người t a gọi
là "bướu nhiễm sắc thể": các vùng tạp sắc lặp đi lặp lại cao với vết màu
sẫm. Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ
ngô. Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minh

thuyết transposon của bà về các "gen thay đổi đột ngột", và với công trình
này bà đã đoạt giải Nobel năm 1983 trong lĩnh vực sinh lý học và y học.
Ngô vẫn còn là sinh vật mẫu quan trọng cho di truyền học và sinh học phát
triển ngày nay.
Tại Hoa Kỳ có một kho trung tâm lưu trữ các đột biến ở ngô, The
Maize Genetics Cooperation — Stock Center, do Cục Nghiên cứu Nông
nghiệp của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) thành lập và nằm tại Khoa các
khoa học cây trồng của Đại học Illinois tại Urbana-Champaign. Tổng cộng bộ
sưu tập có gần 80.000 mẫu. Bộ sưu tập này bao gồm vài trăm gen đã đặt tên,
cộng với các tổ hợp gen bổ sung và các biến thể có thể di truyền khác. Ở đây
có khoảng 1000 sai lệch nhiễm sắc thể (chẳng hạn các hoán vị hay nghịch
đảo) và các nguồn với số nhiễm sắc thể bất thường (như các dạng tứ bội). Dữ
liệu di truyền miêu tả các nguồn đột biến ở ngô cũng như vô số các dữ liệu
khác về di truyền học của ngô có thể truy cập tại MaizeGDB (Maize Genetics
and Genomics Database: Cơ sở dữ liệu di truyền học và bộ gen ngô).
Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp
Hoa

Kỳ

và Bộ

Năng

lượng

Hoa

Kỳ (DOE)

đã

thành

lập

một côngxoocxiom để xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô. Dữ liệu về
chuỗi DNA trong kết quả đã được đưa ngay vào Ngân hàng gen, kho chứa
công cộng của các dữ liệu chuỗi gen. Việc thiết lập trình tự chuỗi cho bộ gen
ngô là khá khó khăn do kích thước lớn và các sắp xếp phức tạp. Bộ gen ngô
có 50000 – 60000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ bazơ – các phân tử tạo ra
AND. (Để so sánh, bộ gen người chứa khoảng 2,9 tỷ bazơ và 26.000 gen.).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


7

1.1.4. Giá trị kinh tế của cây ngô
Ngô là loại cây lương thực chính được trồng rộng rãi trên toàn thế giới.
; ngô
còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho đại gia súc đặc biệt là bò sữa. Gầ
cấp vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao; ngô nếp, ngô đường (ngô
ngọt) được dùng làm quả ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm
xuất khẩu. Ngoài việc cung cấp lương thực cho con người và vật nuôi, nhiều
nước đang tiến hành sử dụng ngô để chế biến ethanol- năng lượng sạch cho
tương lai [9], [13].
Chính vì tầm quan trọng của nó trong nền kinh tế như vậy, cho nên cây
ngô đã được toàn thế giới gieo trồng và hình thành 4 vùng sinh thái cây ngô

chính là: vùng ôn đới, vùng cận nhiệt đới, vùng nhiệt đới cao và vùng nhiệt
đới thấp. Việt Nam nằm trong vùng sinh thái nhiệt đới thấp; cây ngô đã được
đưa vào sản xuất cách đây 300 năm.
Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là
cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau. Cây
ngô không chỉ cung cấp lương thực cho người, vật nuôi mà còn là cây trồng
xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn [1].
1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam
* Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
Năm 1961, diện tích ngô toàn thế giới đạt 105,5 triệu ha, năng suất 19,4
tạ/ha, sản lượng 205 triệu tấn, đến năm 2009, diện tích trồng ngô thế giới đạt
khoảng 159,5 triệu ha, năng suất bình quân 51,3 tạ/ha, sản lượng 817,1 triệu
tấn. Sản lượng ngô thế giới năm 2013 đạt khoảng 963 triệu tấn, tăng 10% so
với năm 2012. Trong đó Hoa Kỳ, Trung Quốc, Brazil là những nước đứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


8

đầu về diện tích và sản lượng (Hoa kỳ đạt khoảng 340 triệu tấn, Trung Quốc
đạt khoảng 214 triệu tấn, Brazil đạt 77,8 triệu tấn) [55], [61].
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới giai đoạn 1961 - 2012
Diện tích

Sản lượng

Năng suất

(triệu ha)

(triệu tấn)

(tạ/ha)

1961

105,56

205,03

19,42

1962

103,50

204,88

19,80

2005

148,16

713,68

48,17

2006

146,96

706,84

48,10

2007

158,53

789,88

49,82

2008

162,87

830,34

50,98

2009

158,85

820,00

51,62

2010

164,31

851,17

51,80

2011

172,05

888,01

51,61

2012

177,38

872,07

49,16

Năm

(Nguồn: FAOSTAT 2012)

Trên thế giới, Mỹ là nước có diện tích, năng suất, sản lượng ngô lớn
nhất thế giới. Kết quả trên có được, trước hết là nhờ sự đầu tư cho ngành nông
nghiệp, không ngừng cải thiện các kỹ thuật canh tác, đồng thời ứng dụng
công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống đã góp phần đưa năng suất và sản
lượng ngô của nước này cao hơn các nước khác. Các giống cây trồng chuyển
gen được tạo ra nhờ công nghệ sinh học đã được trồng phổ biến, đem lại lợi
nhuận nông nghiệp cao, trong đó nước Mỹ tập trung vào các cây mũi nhọn là
bông, đậu tương và ngô.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


9

Có thể nói Mỹ và Trung Quốc là hai nước có diện tích trồng ngô lớn
nhất và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác. Mỹ và Trung Quốc, cùng
với Ấn Độ là những nước xuất khẩu ngô lớn, các nước nhập khẩu ngô chính
là Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malaysia, Mexico, châu Phi…[9].
* Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam
Trước đây sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ, phân tán, mặt khác do
kĩ thuật canh tác kém và chất lượng giống kém dẫn đến năng suất rất thấp. Từ
đầu những năm 1990 đến nay, khi tiến hành mở rộng diện tích trồng kết hợp
với các giống ngô lai cùng với việc cải thiện các kĩ thuật canh tác nhằm đáp
ứng yêu cầu của giống mới đã tạo ra những bước tiến nhảy vọt trong ngành
sản xuất ngô. Tình hình sản xuất ngô ở việt nam trong những năm gần đây
được thể hiện ở bảng 1.2 dưới đây.
Bảng 1.2. Thống kê diện tích, năng suất, sản lượng ngô của Việt Nam
từ năm 2007 - 2013
Diện tích

Năm

(triệu ha)

Sản lượng
Năng suất (tạ/ha)

(1000 tấn)

2007

1,096

39,3

4303,20

2008

1,140

40,11

4573,10

2009

1,089

40,1

4371,70

2010

1,126

41,08

4625,7

2011

1,121

43,13

4835,6

2012

1,156

43,02

4973,6

2013

1,172

44,31

5193,5

(Nguồn Tổng cục Thống kê, 2014)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


10

Từ năm 2007 tới nay, năng suất và sản lượng ngô của Việt Nam đã có
những bước nhảy vọt. Tốc độ tăng trưởng diện tích, năng suất và sản lượng
ngô của Việt Nam cao hơn nhiều lần, lợi nhuận trồng ngô lai cao hơn hẳn so
với các loại cây trồng khác. Năm 2007, diện tích trồng ngô của cả nước đạt
trên 1 triệu ha (trong đó diện tích trồng ngô lai chiếm ưu thế), tổng sản lượng
gần 4 triệu tấn. Năm 2008, diện tích trồng ngô tăng lên 1,4 triệu ha, tổng sản
lượng lên tới hơn 4,5 triệu tấn. Năm 2013 là năm tạo dấu ấn ấn tượng của ngô
Việt Nam, đạt mức sản lượng cao nhất từ trước đến nay với 5,19 triệu tấn và
năng suất 44,31 tạ/ha [56]. Có được thành tựu này là do việc tạo ra các giống
ngô lai mới, đồng thời mở rộng diện tích trồng ngô lai trong sản xuất, kết hợp
các biện pháp kĩ thuật canh tác hiện đại.
Những vùng trồng ngô lớn ở Việt Nam là khu vực Đông Nam Bộ, Tây
Nguyên, trung du miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng và duyên hải
miền Trung [1]. Trong đó, khu vực miền núi phía Bắc trồng chủ yếu là các
giống ngô địa phương. Năng suất của các giống ngô địa phương thường thấp,
tuy nhiên các giống ngô địa phương vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu vì

các ưu điểm như khả năng chịu hạn, kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng
trên nhiều loại đất khác nhau.
1.2. ĐẶC ĐIỂM MỌT HẠI NGÔ Sitophyllus zeamais
1.2.1. Sơ lược về mọt hại ngô
Mọt hại ngô (gọi tắt là mọt ngô) có tên khoa học là Sitophyllus zeamais
Motsch, thuộc bộ Coleoptera, họ Curculionidae. Mọt ngô là loại đa thực,
chúng có thể ăn được hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và
nhiều sản phẩm thực vật khác. Thức ăn thích hợp nhất với nó là ngô hạt. Mọt
này có phổ biến ở hầu hết khắp các nước trên thế giới, nhất là ở châu Á, vùng
Địa Trung Hải (Châu Âu) và Bắc Mỹ. Ở nước ta trong các kho lương thực,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


11

nhất là kho bảo quản ngô, gạo thường gặp loài mọt này. Mọt có thể đẻ trứng ở
ngoài đồng và cả trong kho. Nó thuộc loại phá hoại nghiêm trọng [40].

Hình 1.1. Mọt ngô Sitophilus zeamais
Mọt gây hại trên bắp và hạt ngô ngay giai đoạn ngô chín sáp ngoài
đồng, chúng theo ngô vào kho và gây hại liên tục trong suốt quá trình bảo
quản. Trong kho mọt hoạt động nhanh nhẹn, hay bay bò và có tính giả chết,
chúng thích bò lên các vị trí cao trong đống hạt. Khi gặp điều kiện độ nhiệt
cao, mọt thường tập trung vào kẽ kho, mép bao… để ẩn nấp.
1.2.2. Đặc điểm hình thái của mọt ngô
Giai đoạn trưởng thành mọt ngô rất giống mọt gạo, vì thế trong phân
loại trước đây, có nhiều ý kiến khác nhau. Có người cho rằng mọt ngô và mọt

gạo là cùng loài nhưng khác tên, nhiều người khác cho rằng mọt ngô và mọt
gạo là 2 loài độc lập với nhau [37]. Cho đến nay, mọt ngô được xem như
một loài riêng biệt, rất gần với mọt gạo. Về hình dạng ngoài, mọt ngô rất
giống mọt gạo, nhưng kích thước cơ thể lớn hơn (3,5 - 5mm). Cánh trước
trơn bóng và các điểm màu đỏ tròn cánh khá rõ. Các lỗ chấm trên tấm lưng
ngực trước thô và dày ở phía trước. Do đó việc phân biệt chủ yếu dựa vào
dạng cơ quan sinh dục đực (penis) ở mọt gạo có hình bán nguyệt, còn ở mọt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


12

ngô là hình 3 góc. Bề mặt phía trên của penis ở mọt gạo đơn giản, không có
lông dài, còn ở mọt ngô thì có 2 lông dài. Đầu máng đẻ trứng của con cái mọt
gạo có hình chữ Y, còn của mọt ngô là hình móc nhọn.
Các lỗ chấm ở ngực trước khá trơn và không có vùng lỗ chấm lộn xộn ở
giữa. Chấm lõm trên đầu rất rõ ràng. Đoạn trước trán rất bằng dẹt, phần gốc
vòi có 3 chiếc máng, dọc theo viền mép ngực trước còn có một dảy chấm lõm.
Chấm lõm trên mảnh lưng ngực trước hình tròn, ở khu giữa chấm lõm rất dày,
chấm lõm ở 2 cạnh gần như hỗn hợp lại. Cánh cứng có 2 vệt chấm màu trắng
đỏ, một ở bên vai, một ở gần đoạn cuối. Chấm lõm ở mặt bụng thân mình dày
hơn. Cánh sau phát triển và có thể bay được. Cánh màu nâu đen bóng.
Các điểm vá màu vàng đỏ hình bán nguyệt rất rõ. Trên mặt ngoài của gai giao
cấu (Aedeagus) con đực có các rãnh chạy dọc; các con cái đầu nhánh rẽ hình
chữ Y hóa cứng mạnh nên nhọn.
Giai đoạn trứng có đặc điểm: dài 0,5-0,7mm, rộng 0,25- 0,3mm, hình
bầu dục hơi dài màu trắng sữa. Giai đoạn sâu non: Khi đã lớn dài 3-3,2 mm,
rất mập, lưng cong lại như hình bán nguyệt, mặt bụng tương đối bằng. Toàn

thân màu sữa đến màu nâu nhạt. Giai đoạn nhộng: dài 3-4 mm, hình bầu dục,
cân đối 2 đầu, lúc đầu màu vàng sữa sau chuyển sang màu vàng nâu.
Cũng như mọt gạo, mọt ngô có thể bay được, nó còn bay mạnh hơn
mọt gạo cho nên mọt ngô đã gây hại ngay từ ngoài đồng. Trên các ruộng
ngô ở Tây Nguyên, mọt ngô thường xuất hiện và phát triển vào thời kỳ
chuẩn bị thu hoạch [6], [29].
1.2.3. Đặc điểm về chu kì sống
Khả năng sinh trưởng và phát triển của mọt ngô trong ngô hạt là lớn
nhất, sau đó mới đến thóc và các ngũ cốc khác. Kết quả nghiên cứu ở Nhật
Bản xác nhận mọt ngô chịu lạnh tốt hơn mọt gạo [29].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


13

Toàn bộ thời gian phát triển cho vòng đời của S. zeamais trung bình 36
ngày. Thời gian phát triển này là gần giống như S. oryzae và nhanh hơn so với
S. granarius khoảng 7 ngày trong điều kiện tương tự. Hầu hết trứng được lắng
đọng trong nội nhũ. Tốc độ sin

75% [60].

những lỗ này, sau đó tiết ra một thứ dịch nhầy để bít kín lỗ đó lại. Sâu non nở
ra ăn hại ngay trong hạt và lớn lên. Khi ăn hạt, nó thường ăn phôi trước, sau
đó mới đến nội nhũ và các bộ phận khác làm hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng,
nhìn bề ngoài dễ lẫn với hạt còn nguyên vẹn. Khi đẫy sức, sâu non đục những
lỗ nhỏ lộ rõ trên mặt hạt để vũ hoá bay ra ngoài. Tùy theo điều kiện mà mọt

đẻ ít hay nhiều, nhiều nhất mỗi con cái có thể đẻ được 384 trứng [54].
Thức ăn có ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của mọt, trong cùng một
điều kiện độ nhiệt và độ ẩm như nhau, nuôi mọt ngô bằng thức ăn khác nhau
đã thu được kết quả như sau: Khi nuôi bằng ngô hạt, thời gian vòng đời của
mọt là 34 ngày; khi thay bằng loại thức ăn khác là gạo, thời gian vòng đời sẽ
là 47 ngày; thóc là 53 ngày.
Ở nhiệt độ 0ºC, mọt có thể sống được 37 ngày, ở -5ºC mọt chết sau 23
ngày, còn ở -10ºC tất cả các giai đoạn phát triển của mọt chết sau 13 ngày. Ở
55ºC, mọt chết sau 6 giờ, ở 60ºC chết sau 2 giờ. Trong điều kiện độ nhiệt
25ºC mọt có thể sống không có thức ăn 18 - 26 ngày [35], [54].
1.3. PROTEINASE VÀ CYSTATIN
1.3.1. Proteinase và các loại proteinase
Quá trình phân giải protein có sự tham gia của các loại enzyme thủy
phân protein, trong đó có proteinase. Proteinase là một nhóm các enzyme phá
vỡ các phân tử chuỗi dài của các protein thành các đoạn ngắn hơn (peptide)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


14

và cuối cùng là thành phần các amino acid. Proteinase có liên quan đến quá
trình tiêu hóa, hoạt hóa tiền enzyme, giải phóng các peptide hoạt động sinh lí,
hoạt hóa bổ sung và các quá trình viêm.
Người ta phân loại proteinase làm bốn nhóm dựa vào gốc amino acid
thiết yếu ở vị trí trung tâm hoạt động, sự thay đổi hoạt động ở pH tối ưu, sự
tương đồng của trình tự amino acid và sự tương đồng về các chất ức chế. Bốn
nhóm proteinae bao gồm: serin-, cysteine-, aspartic- và metallo-proteinase.
Trong bốn nhóm này, một lượng lớn chất ức chế của serine- và cysteineproteinase đã được nghiên cứu nhiều [46].

Trong động vật có xương sống, các proteinases cysteine được tham
gia vào hệ thống phân hủy protein lysosome. Trong động vật không có
xương sống như giun tròn, proteinases cysteine là một trong các enzym tiêu
hóa [44]. Trong động vật chân đốt như tôm hùm, chúng đóng vai trò tiêu
hóa, nhưng cũng có liên quan trong hệ thống thần kinh [23]. Trong côn
trùng, chúng được sử dụng trong quá trình tiêu hóa nhưng được tìm thấy
trong nhiều mô khác [44]. Các nghiên cứu về sự phụ thuộc độ pH của hoạt
động proteinase cysteine
teinases cysteine [21], [24], [46].
Cysteine proteinase hoạt động bằng cách loại bỏ đoạn amino tận cùng
trong chuỗi polypeptide để tạo ra các enzyme hoạt động. Vùng amino tận (hay
còn gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của
enzyme mà còn giúp các protein mới được tổng hợp cuộn xoắn chính xác và
bảo vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh. Về phương diện
proregion, các enzyme giống Cathepsin L và giống Cathepsin B là các phân
họ của papain. Chúng hình thành nên 2 nhóm enzyme khác biệt: vùng
proregion của Cathepsin L (với xấp xỉ 60 gốc amino acid) ngắn hơn proregion
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


15

của Cathepsin B (với xấp xỉ 100 gốc amino acid). Vị trí hoạt động của
Cathepsin B khác so với các Cathepsin khác ở chỗ nó có vùng móc, vùng này
có chức năng nhất định trong hoạt tính exopeptidase của protein này. Người ta
đã quan sát được hai vùng khác biệt trong cấu trúc không gian ba chiều của
các thành viên thuộc họ papain. Vùng amino tận cùng có cấu trúc xoắn anpha
trong khi vùng cacboxyl tận có chứa chủ yếu cấu trúc gấp nếp beta. Vị trí hoạt

động có chứa gốc Cys 25 và His 159, chúng được bổ sung nhờ Asn 175 liên
kết với His 159 và Gln 19. Các nhà khoa học cũng đã tìm ra các hoạt tính
khác biệt của các enzyme họ papain bao gồm endopeptidase, aminopeptidase,
carboxylpeptidase. Cũng có sự khác biệt trong hoạt động phân giải protein
của các Cathepsin ở các pI và pH tối ưu khác nhau như: Cathepsin B (pI= 4,55,5, pH=6), Cathepsin H (pI= 6,0-7,1, pH=6,8), Cathepsin L (pI= 5,5-6,1,
pH=5,5) [21], [46].
1.3.2. Proteinase inhibitor và Cystatin
Các chất ức chế proteinase (Proteinase inhibitor -

không của cây, thường gây ra để đáp ứng với chấn thương hoặc tấn công của
côn trùng hoặc các mầm bệnh.
Các hoạt động của proteinases cysteine được kiểm soát bởi protein ức
chế tự nhiên như α2-macroglobulin và cystatin. Cystatin là một thuật ngữ đề
cập đến các loại protein có khả năng ức chế đặc hiệu hoạt động của papain và
các enzyme phân hủy cysteine như Cathepsin B, H, và L, ficin và Bromelain.
Sự tồn tại của chúng trong cơ thể vi sinh vật, động vật, và các loài thực vật rất
phổ biến [11]. Các nghiên cứu gần đây bàn luận nhiều về mối liên quan giữa
Cystatin với hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, vi
sinh vật gây bệnh. Protein này có mối quan hệ về mặt cấu trúc và chức năng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/


16

với chất ức chế của cysteine proteinase, nó được mô tả lần đầu tiên ở lòng
trắng trứng gà và sau đó được gọi là Cystatin lòng trắng trứng gà [21].
Các Cystatin kìm hãm hoạt động của cysteine protenase có liên hệ với
nhau về mặt tiến hóa, hình thành nên siêu họ Cystatin. Các thành viên của

siêu họ này được phân chia thành ba nhóm có mối liên hệ chặt chẽ với nhau,
sự phân loại đó dựa trên sự tương đồng của trình tự bậc một, khối lượng phân
tử, số lượng liên kết disulfide và sự định vị của chúng trong tế bào.
Cystatin họ 1, được biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc
các nhóm carbohydrate, nó có trọng lượng phân tử khoảng 11kDa, gồm 100
gốc amino acid.
Cystatin họ 2, là protein có 2 liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu
carbon cuối cùng và được glycosyl hóa, có trọng lượng phân tử khoảng 13-24
kDa với 115 amino acid.
Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết
tương, nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết các phức hợp
phân tử Cystatin có trọng lượng phân tử cao (60-120 kDa) với khoảng 355
gốc amino acid có chứa các liên kết disulfide. Các kininogen giữ vai trò quan
trọng trong quá trình đông máu.
Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa Cystatin phân lập từ động
vật và thực vật, người ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin, gồm hầu hết các
chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với
hầu hết các Cystatin họ I và II [35]. Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin
từ hạt gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên được nghiên cứu. Nó có
mối liên hệ về mặt cấu trúc và chức năng với Cystatin lòng trắng trứng gà.
Oryzacystatin cũng được xếp vào Cystatin nhóm I do sự vắng mặt của liên kết
disulfide, chuỗi pentapeptide cũng được tạo thành bởi Gln-Val-Val-Ala-Gly
(gốc thứ 57 - 61) và khối lượng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với 102 gốc amino
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐHTN

tnu.edu.vn/