Định lượng đồng thời acetaminophen, codein photphat trong thuốc actadol codein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV VIS)

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi cùng với sự
hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Mai Xuân Trường. Các số liệu, kết quả
nghiên cứu nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực. Nếu sai tôi chịu hoàn
toàn trách nhiệm.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2015
Tác giả

Trần Quốc Chính
XÁC NHẬN CỦA
KHOA HÓA HỌC

XÁC NHẬN CỦA
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS.TS. NGUYỄN THỊ HIỀN LAN

PGS.TS. MAI XUÂN TRƯỜNG

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tác giả đã nhận được nhiều
sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn bè và gia đình.
Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
Đào tạo -

-

Nguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúp

tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo
PGS.TS. Mai Xuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè những
người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện
đề tài nghiên cứu của mình.
, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy
giáo, cô giáo và bạn đọc.
Xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2015
Tác giả

Trần Quốc Chính

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ........................................................................................................ i
Lời cảm ơn ...........................................................................................................ii
Mục lục ...............................................................................................................iii
Danh mục các từ viết tắt của luận văn................................................................iv
Danh mục các bảng của luận văn ........................................................................ v
Danh mục các hình của luận văn ........................................................................vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 2
1.1. Tổng quan về acetaminophen, codein phot phat ..........................................
2

1.1.1. Acetaminophen .......................................................................................... 2
1.1.1.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 2
1.1.1.2. Tính chất ................................................................................................. 2
1.1.1.3. Dược lý cơ chế tác dụng .........................................................................
4
1.1.1.4. Dạng thuốc.............................................................................................. 5
1.1.2. Codein photphat......................................................................................... 6
1.1.2.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 6
1.1.2.2. Tính chất ................................................................................................. 7
1.1.2.3. Tổng hợp................................................................................................. 7
1.1.2.4. Dược lý và cơ chế tác dụng .................................................................... 7
1.1.2.5. Dạng thuốc.............................................................................................. 8
1.2. Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng ................................................
8
1.2.1. Định luật Bughe - Lămbe – Bia................................................................. 8
1.2.2. Định luật cộng tính .................................................................................... 8
1.2.3. Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch
không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia ................................................
9
1.3. Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử .................................. 10
1.3.1. Phương pháp Vierordt ............................................................................. 10


iii


1.3.2. Phương pháp phổ đạo hàm ...................................................................... 12
1.3.3. Phương pháp lọc Kalman ........................................................................ 14
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ...................................... 15
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC ....................................................... 15

1.4.1.1. Pha tĩnh ................................................................................................. 16
1.4.1.2. Pha động ............................................................................................... 17
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí .......................................... 18
1.4.2.1. Thời gian lưu và thể tích lưu ................................................................ 18
1.4.2.2. Hệ số phân bố ....................................................................................... 19
1.4.2.3. Hệ số chọn lọc ...................................................................................... 19
1.4.2.4. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ........................................... 19
1.4.2.5. Độ phân giải ( R S ) ................................................................................. 20
1.4.3. Hệ thống máy HPLC ............................................................................... 21
1.4.4. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC ......................... 21
Chương 2: THỰC NGHIỆM .......................................................................... 23
2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 23
2.1.1. Phương pháp HPLC................................................................................. 23
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................ 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 24
.......................................................... 24
....................................................................... 24
2.2.2.1. Phương pháp HPLC.............................................................................. 24
2.2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ............................................. 24
........................................................... 24
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích ............................................... 25
2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) ....................................................................... 25
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ) ..................................................................... 25
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp ..................................................... 25
iv


2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê ...................................... 26
2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất...................................................................... 27
2.4.1. Thiết bị ..................................................................................................... 27

2.4.2. Dụng cụ.................................................................................................... 27
2.4.3. Hóa chất ................................................................................................... 27
2.4.4. Chế phẩm actadol codeine ....................................................................... 28
...................................................... 28
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 30
3.1. Phương pháp HPLC.................................................................................... 30
3.1.1. Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 2 chất ACT và CĐI ............. 30
3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn pha động ................................................................. 30
3.1.1.2. Lựa chọn bước sóng ............................................................................. 30
3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng ........................................................................... 31
3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng .......................................................... 33
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn ...................................................... 33
3.1.2.2. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống ................................................... 33
3.1.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp ............................................. 34
3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký ........................................ 36
3.1.3. Xác định ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein ................................ 37
3.1.4. Khảo sát độ đúng của phép xác định ACT và CĐI theo phương pháp
thêm chuẩn ......................................................................................................... 38
3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................... 39
3.2.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của ACT và CĐI....................................... 39
3.2.2. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI vào pH........ 40
3.2.3. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI theo thời gian ...
40
3.2.4. Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI theo nhiệt độ.....
41
3.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia

v

của ACT và CĐI. Xác định chỉ số LOD và LOQ ................................................
42


.................................................. 42
3.

......................................................... 43

3.2.5.3. Khảo sát khoảng tuyến tính của CĐI.................................................... 44
.......................................................... 45
3.2.6. Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các
mẫu tự pha ......................................................................................................... 46
..................... 46
3.2.7. Xác định hàm lượng ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein.............. 48
3.2.8. Đ

.... 49

KẾT LUẬN....................................................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 53

vi


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN
Tiếng việt

Tiếng Anh

Viết tắt

Acetaminophen

Acetaminophen

ACT

Côđêin phốt phát

Codein phosphat

CĐI

Giới hạn phát hiện

Limit Of Detection

LOD

Giới hạn định lượng

Limit Of Quantity

LOQ

Sai số tương đối

Relative Error

Độ lệch chuẩn

Standard Deviation

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

High

năng cao

Chromatography

iv

Performance

RE
S hay SD
Liquid

HPLC


DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN
Bảng 3.1. Giá trị các đại lượng đặc trưng.......................................................... 33
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian lưu .......................................................... 34
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát diện tích pic ........................................................... 34
Bảng 3.4. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của ACT và CĐI.... 35
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại ................................................................ 36
Bảng 3.6. Kết quả phân tích thuốc Actadol codein ........................................... 37

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng .................................................................. 38
........................ 40
..... 41
theo nhiệt độ .... 41
Bảng 3.

......... 43
....................................... 44
............... 45

Bảng 3.14. Kết quả tính LOD và LOQ của CĐI ............................................... 46
................................. 46
........
47
Bảng 3.17. Kết quả tính nồng độ, sai số ACT và CĐI trong mẫu thuốc
Actadol codein................................................................................... 48
Bảng 3.18. Hàm lượng các chất chuẩn ACT và CĐI thêm vào mẫu thuốc
Actadol codein................................................................................... 49
Bảng 3.19. Kết quả xác định độ thu hồi của ACT và CĐI trong mẫu thuốc
Actadol codein................................................................................... 50

5


DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN
1.1. Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman ............................................. 15
Hình 1.2. Thời gian lưu của cấu tử phân tích ................................................... 19
Hình 1.3. Hình ảnh máy HPLC ......................................................................... 21
Hình 2.1. Chế phẩm thuốc Actadol codein........................................................ 28
Hình 3.1. Sắc kí đồ của ACT (500 µg/mL) ...................................................... 31

Hình 3.2. Sắc kí đồ của CĐI (8 µg/mL)............................................................ 31
Hình 3.3. Sắc kí đồ của ACT (1) và CĐI (2).................................................... 32
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic của ACT................................................................................ 35
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic của CĐI................................................................................. 36
3.6. Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ACT và CĐI ......................... 39
Hình 3.7. Phổ hấp thụ quang của ACT ở các nồng độ 0,2

40,0 g/mL......... 42

3.8.
........................................................ 43
Hình 3.9. Phổ hấp thụ quang của CĐI ở các nồng độ 0,2

40 g/mL ............ 44

Hình 3.10. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp
thụ quang A vào nồng độ CĐI ......................................................... 45

6


MỞ ĐẦU
Khi xã hội càng phát triển thì vấn đề bảo vệ sức khỏe của con người
ngày càng được quan tâm, vì vậy ngành dược phẩm cũng phát triển không
ngừng, hiện nay các nhà dược phẩm đã sản xuất ra rất nhiều loại thuốc như cảm
cúm, giảm đau, hạ sốt, nhức đầu, ho… được bán rộng rãi với những tên gọi và
thành phần rất khác nhau. Việc định lượng các chất trong thuốc này theo tiêu
chuẩn nhà sản xuất là rất cần thiết trong công tác kiểm nghiệm dược.

Hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu
áp dụng nhiều phương pháp định lượng khác nhau trong đó có phương pháp sắc
kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử, những
phương pháp này có độ lặp và độ chính xác cao, ngoài ra sử dụng phương pháp
trắc quang dùng phổ toàn phần kết hợp với kĩ thuật tính toán và ứng dụng phần
mềm máy tính đã bước đầu được nghiên cứu và cho nhiều ưu điểm như độ
nhạy, độ lặp, độ chính xác, độ tin cậy của phép phân tích, phân tích nhanh, tiện
lợi
:
acetaminophen, codeine phosphate trong thuốc Actadol codeine bằng
phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ
phân tử”.

1


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về acetaminophen, codein phot phat
1.1.1. Acetaminophen
1.1.1.1. Giới thiệu chung
- Tên quốc tế: Pracetamol.
- Tên khác: Acetaminophen.
- Mã giải phẫu - điều trị - hóa học: NO2B EO1.
- Biệt dược: Panadol, Pradon, Efferalgan, Pandol...
- Công thức phân tử: C8H9O2N.
- Khối lượng mol phân tử: 151,17g/mol.
- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl) acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit

hoặc 4-hydroxy acetanilit.
- Tên gọi acetaminophen được lấy từ tên hóa học của hợp chất paraacetyl aminophenol [1-4].
1.1.1.2. Tính chất
Tính chất vật lý
- ACT là chất bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ.
- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm 3 .
- Nhiệt độ nóng chảy: 169 0 C.

2


- Độ tan trong nước: 0,1÷0,5g/100mL nước tại 22 0 C. Ngoài ra còn có
khả năng tan trong etanol, dung dịch kiềm, dung dịch axit...
- Chế phẩm tan ít trong nước, tan nhiều hơn trong nước sôi, khó tan trong
clorofom, ete, etanol và các dung dịch kiềm... dung dịch bão hòa trong nước có
pH khoảng 5,3÷5,6; pKa=9,51.
Tính chất hóa học
acetaminophen (ACT) d

-OH, nhóm chức

acetamit và tính chất của nhân thơm quyết định.
Sự có mặt của 2 nhóm hydroxyl và acetamit làm cho nhân benzen được
hoạt hóa có thể phản ứng được với các hợp chất thơm có ái lực electron. Sự liên
kết giữa nhóm acetamit, hydroxyl với vòng benzen làm giảm tính bazơ của
nhóm amit và làm tăng tính axit của nhóm hydroxyl.
muối sắt (III) cho màu tím.
, thêm nước thì không có
kết tủa vì p-aminophenol tạo thành tan trong axit. Thêm thuốc thử kali dicromat
thì có kết tủa màu tím khác với phenacetin là không chuyển sang đỏ.

Quá trình xảy ra chủ yếu là:
HO

NHCOCH3

HCl
t

O

HO

NH2

K2Cr2O7
[O]

O

NH

ACT.
Tổng hợp
Năm 1878 Harmon Northrop Morse lần đầu tiên đã tổng hợp được
acetaminophen từ con đường giáng hóa p-nitrophenol cùng với thiếc trong
giấm đóng băng. Tuy nhiên, acetaminophen không được sử dụng trong suốt 15
năm sau đó. Năm 1893, acetaminophen được tìm thấy trong nước tiểu của
người uống phenacetin, và được cô đặc thành một chất kết tinh màu trắng có vị

3

đắng. Năm 1948, Brodie và Axelrod đã nghiên cứu việc sử dụng thuốc
acetanilide và họ phát hiện ra rằng, tác dụng giảm đau của acetanilide là do
acetaminophen – một chất chuyển hóa của acetanilide và họ chủ trương tổng
hợp và sử dụng như một thuốc giảm đau hạ sốt. Sau này, acetaminophen trở
thành thuốc giảm đau hạ sốt được sử dụng rộng rãi nhất với rất nhiều tên biệt
dược được lưu hành.
Acetaminophen được tổng hợp theo 4 bước từ nguyên liệu đầu là phenol:
- Phenol được nitro hóa bởi axit sunfuric và natri nitrit tạo ra hỗn hợp 2
đồng phân o, p-nitro phenol.

- Đồng phân para được tách ra khỏi đồng phân ortho bằng phản ứng
thủy phân.
- Khử para-nitro phenol bằng NaBH4
para-aminophenol.
- Para-aminophenol phản ứng với anhidrit axetic cho ra acetaminophen.

Đem kết tinh acetaminophen lại trong hỗn hợp etanol-nước.
1.1.1.3. Dược lý cơ chế tác dụng
Acetaminophen là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin , thuộc
nhóm thuốc giảm đau hạ sốt. Acetaminophen làm giảm đau bằng cách làm
tǎng ngưỡng đau. Thuốc làm hạ sốt thông qua tác động trên trung khu điều
nhiệt của não.


Acetaminophen được dùng để làm giảm tạm thời sốt, nhức và đau do
cảm lạnh thông thường và các nhiễm virus khác. Thuốc cũng được dùng để
giảm đau đầu, đau lưng, đau rǎng, nhức cơ ... Acetaminophen làm giảm đau
trong viêm khớp nhẹ nhưng không có tác dụng trên tình trạng viêm, đỏ và sưng

khớp. Gần đây thuốc được cho là có hiệu quả ngang với thuốc chống viêm
không teroit trong làm giảm đau khớp gối do viêm xương khớp.
Cách dùng: Có thể uống cùng hoặc không cùng đồ ǎn. Acetaminophen
được chuyển hóa ở gan và cần giảm liều ở bệnh nhân rối loạn chức nǎng gan
thận.
Nói chung acetaminophen được dung nạp tốt với ít tác dụng phụ. Khi
dùng quá liều acetaminophen có thể gây ra ngộ độc gan, suy gan và thậm chí tử
vong. Bệnh nhân bị quá liều acetaminophen cần đi khám cấp cứu ngay. Điều trị
sớm bằng acetylcystein có thể ngǎn ngừa hủy hoại gan hoặc tử vong. Các dấu
hiệu và triệu chứng ngộ độc gan có thể không rõ trong 2-3 ngày sau khi dùng
quá liều. Những người thường xuyên uống quá nhiều rượu thường bị ngộ độc
gan ở liều acetaminophen thấp hơn. Những người hay phải uống acetaminophen
không nên uống rượu vì tǎng nguy cơ tổn thương gan. Bệnh nhân bị bệnh gan
và thận cũng cần thận trọng khi uống acetaminophen để tránh ngộ độc.
Acetaminophen không gây quen thuốc.
Tác dụng phụ: Khi dùng đúng, tác dụng phụ hiếm gặp. Các tác dụng
phụ bao gồm vàng da hoặc mắt, phát ban, ngứa, xuất huyết, sốt, đau họng và
thiểu niệu.
1.1.1.4. Dạng thuốc
- Chế phẩm viên nén: Acetaminophen, Panadol, Donodol…
- Chế phẩm viên đạn: Efferalgan, Panadol…
- Chế phẩm viên sủi: Efferalgan, Donodol, Panadol…
- Chế phẩm gói bột Efferalgan.
- Chế phẩm dạng bột tiêm: Pro-Dafalgan 2g pro acetaminophen.
- Chế phẩm dạng dung dịch uống.
- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác.


1.1.2. Codein photphat
1.1.2.1. Giới thiệu chung

- Tên quốc tế: Codeine phosphate.
- Loại thuốc: Giảm đau gây ngủ và giảm ho.
- Mã giải phẫu - điều trị - hóa học: R05D A04
- Biệt dược: Codeine phosphate
- Công thức phân tử:
1
H2O (hemihydrat)
2

+ C18H21NO3. H3PO4.

khối lượng mol phân tử:

406,4 g/mol
+ C18H21NO3. H3PO4.

3
H2O (sesquihydrat) khối lượng mol phân tử :
2

424,4 g/mol
- Công thức cấu tạo
H

N

CH3

H

H3CO

1
3
H3PO4 . H2O (hay H2O)
2
2

O

H OH

H

- Tên IUPAC:
+ C18H21NO3. H3PO4.

1
H2O : 4,5 a-epoxy-3-methoxy-17-methyl-7,82

- didehydromorphinan - 6a-ol phosphat hemihydrat .
hoặc:
3
2

+ C18H21NO3. H3PO4. H2O: sesquihydrat, phải chứa từ 98,5 đến 101,0%
C18H21NO3. H3PO4, tính theo chế phẩm đã làm khô.


1.1.2.2. Tính chất

- Tinh thể nhỏ không màu hoặc bột kết tinh trắng, không mùi.
- Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%
- Khối lượng riêng: 1,32g/cm

3
0

- Nhiêt độ nóng chảy: 154- 156 C.
- Độ tan trong nước: 400mg/mL ở nhiệt độ thường
1.1.2.3. Tổng hợp
Codein có nhiều trong cây thuốc phiện nên nó được tổng hợp thông qua
quá trình chiết xuất từ cây thuốc phiện
1.1.2.4. Dược lý và cơ chế tác dụng
Codein là một chất hóa học tự nhiên thuộc nhóm thuốc phiện. Trong y
học nó được sử dụng chủ yếu như một chất giảm đau và giảm ho khi kết hợp
với acetaminophen
Codein là methylmorphin, nhóm methyl thay thế vị trí của hydro ở nhóm
hydroxyl liên kết với nhân thơm trong phân tử morphin, do vậy codein có tác
dụng dược lý tương tự morphin, tức là có tác dụng giảm đau và giảm ho. Tuy
nhiên codein được hấp thu tốt hơn ở dạng uống, ít gây co thắt mật hơn so với
morphin. Ở liều điều trị, ít gây ức chế hô hấp (60% thấp hơn so với morphin)
và ít gây nghiện hơn morphin.
Codein có tác dụng giảm đau trong trường hợp đau nhẹ và vừa (tác dụng
giảm đau của codein có thể là do sự biến đổi khoảng 10 % liều sử dụng thành
morphin), vì vậy nên dùng codein kết hợp với các thuốc chống viêm, giảm đau
không steroit để tăng tác dụng giảm đau .
Codein có tác dụng giảm ho do tác dụng trực tiếp lên trung tâm gây ho ở
hành não; codein làm khô dịch tiết đường hô hấp và làm tăng độ quánh của
dịch tiết phế quản. Codein không đủ hiệu lực để giảm ho nặng. Codein là thuốc
trấn ho trong trường hợp ho khan.

Sau khi uống, chu kỳ bán phân hủy là 2 - 4 giờ, tác dụng giảm ho xuất
hiện trong vòng 1 - 2 giờ và có thể kéo dài 4 - 6 giờ. Codein được chuyển hóa ở


gan và thải trừ ở thận dưới dạng tự do hoặc kết hợp với acid glucuronic. Codein
hoặc sản phẩm chuyển hóa bài tiết qua đường tiêu hóa rất ít. Codein qua được
nhau thai và một lượng nhỏ qua được hàng rào máu - não.
1.1.2.5. Dạng thuốc
Viên nén: 15 mg, 30 mg, 60 mg. Siro 25 mg/mL.
Thuốc nước: 3 mg, 15 mg/5 mL. ống tiêm:15 mg, 30 mg, 60 mg/mL.
1.2. Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng
1.2.1. Định luật Bughe - Lămbe – Bia

và bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng truyền qua.
Phương trình toán học biểu diễn định luật Bughe - Lămbe - Bia
A =

. b. C

Trong đó :
A : độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng

(A không có

thứ nguyên).
: hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử tại bước sóng .
b: bề dày lớp dung dịch (cm).
C: nồng độ của cấu tử trong dung dịch (mol/lít).
Định luật Bughe – Lămbe – Bia là sự tổ hợp của hai định luật thứ nhất và
thứ hai của sự hấp thụ ánh sáng.

1.2.2. Định luật cộng tính
Định luật cộng tính là một sự bổ sung quan trọng cho các định luật hấp
thụ ánh sáng. Định luật cộng tính là cơ sở định lượng cho việc xác định nồng
độ của hệ trắc quang nhiều cấu tử.
Bản chất của định luật cộng tính là sự độc lập của đại lượng độ hấp
thụ quang của một chất riêng biệt khi có mặt của các chất khác có sự hấp thụ
ánh sáng riêng.


Biểu diễn tính cộng tính về độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp
chứa n cấu tử tại bước sóng

bằng phương trình toán học:

A λ =A1,λ +A 2,λ +...+A i,λ +...+A n,λ =

n

A i,λ

i=1

Trong đó :
A : độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch hỗn hợp chứa n cấu tử ở
bước sóng .
A i, : độ hấp thụ ánh sáng của cấu tử thứ i ở bước sóng
cấu tử hấp thụ ánh sáng có trong hỗn hợp ; với i = 1
Vì A =

.b.

C

; n là số

n.

nên ta có:
n

ε i,λ .b .C i

A λ = ε1,λ .b.C1 +ε 2,λ .b.C2 +...+ε n,λ .b.Cn =
i=1

Định luật cộng tính được phát biểu như sau: “Ở một bước sóng đã cho độ
hấp thụ quang của một hỗn hợp các cấu tử không tương tác hóa học với nhau và
bằng tổng độ hấp thụ quang của các cấu tử riêng biệt ở cùng bước sóng này”.
1.2.3. Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch
không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia
Xuất phát từ biểu thức của định luật Bughe – Lămbe – Bia A= f( , b, C)
nghĩa là độ hấp thụ quang A là hàm số của ba biến:
). Do đó
mọi sự sai lệch của các tham số này đều có thể đưa đến làm sai lệch quy luật
hấp thụ quang, gây
-

, bao gồm:
.

- Các điều kiện đo quang như: bề dày cuvet, độ trong suốt của bề mặt

cuvet không thật đồng nhất, bề mặt cuvet gây các hiện tượng quang học phụ
như tán xạ, hấp thụ...


- Sự có mặt của các chất điện giải lạ trong dung dịch màu làm biến dạng
các phần tử hoặc các ion phức màu làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của
các tiểu phân hấp thụ ánh sáng.
- Hiệu ứng solvat hóa: sự solvat hóa (hay hydrat hóa) làm giảm nồng độ
các phần tử dung môi tự do, do đó làm thay đổi nồng độ của dung dịch màu và
làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu.
- Hiệu ứng liên hợp: trong một số trường hợp có sự tương tác của
chính các tiểu phân hấp thụ ánh sáng để tạo ra các tiểu phân polime làm thay
đổi nồng độ hợp chất màu.
+

- Ảnh hưởng pH của dung dịch: sự thay đổi nồng độ của ion H (tức thay
đổi
pH) của dung dịch sẽ ảnh hưởng đến sự tuân theo định luật Bughe – Lămbe –
Bia
theo các trường hợp sau:
+

+ Thuốc thử có đặc tính axit: sự thay đổi nồng độ ion H làm chuyển
dịch cân bằng tạo thành chất màu.
+ Thay đổi pH kéo theo sự thay đổi thành phần hợp chất màu.
+ Khi tăng pH phức màu có thể bị phân hủy do sự tạo thành phức hydroxo.
+

+ Dưới ảnh hưởng của ion H trạng thái tồn tại và màu của dung dịch
cũng thay đổi.

- Ảnh hưởng của sự pha loãng dung dịch phức màu: khi pha loãng các
dung dịch phức màu sẽ gây ra sự lệch khỏi định luật Bughe – Lămbe – Bia.
- Nhiệt độ môi trường và dung dịch đo phổ trong cuvet là không hằng
định suốt trong thời gian đo. Vì trong một mức độ nhất định độ hấp thụ quang
A phụ thuộc vào nhiệt độ.
1.3. Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử
1.3.1. Phương pháp Vierordt


Để xác định nồng độ của các cấu tử trong hỗn hợp, lần đầu tiên Vierordt
đã đo độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ở các bước sóng khác nhau,
sau đó


thiết lập hệ phương trình bậc nhất mà số phương trình bằng số ẩn số (số cấu tử
trong hỗn hợp), giải hệ phương trình này sẽ tính được nồng độ của các cấu tử.
Điều kiện để áp dụng phương pháp này là các cấu tử trong hỗn hợp phải tuân
theo định luật Bughe - Lămbe - Bia và thỏa mãn tính cộng tính của độ hấp thụ
quang.
Với hỗn hợp chứa n cấu tử ta cần phải lập hệ n phương trình n ẩn. Hệ
phương trình này được thiết lập bằng cách đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở
n bước sóng khác nhau.
A(

1)

=

11C1b

+

21C2b

+... +

i1Cib

+...+

n1Cnb

A(

2)

=

12C1b

+

22C2b

+... +

i2Cib

+...+

n2Cnb

...
A(

...

n)

=

...

1nC1b

+

...
2nC2b

...

...

+ ... +

...
inCib

...

+... +

...
nnCnb

Trong đó : A( 1), A( 2),..., A( n): độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở bước
sóng

1,

bước sóng

in :

2,

. . ., và bước sóng

n.

hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử i tại bước sóng

n

(được xác

định bằng cách đo độ hấp thụ quang của dung dịch chỉ chứa cấu tử i ở
bước sóng

n

).

b: bề dày lớp dung dịch (cm).
Ci: nồng độ của cấu tử thứ i trong hỗn hợp (mol/lít). Với i, j = 1 n.
Giải hệ n phương trình với n ẩn số là C1, C2 . . . Cn sẽ tìm được nồng độ
của các cấu tử. Khi số cấu tử trong hỗn hợp ít thì việc giải hệ n phương trình
tuyến tính khá đơn giản. Tuy nhiên khi số cấu tử lớn thì việc giải hệ phương
trình phức tạp hơn.
Phương pháp Vierordt chủ yếu được vận dụng để tìm cách giải hệ
phương trình như: giải bằng đồ thị, giải bằng phép ma trận vuông, phương pháp
khử Gauss, . . . để xác định nồng độ của mỗi cấu tử.
Một số tác giả sử dụng phương pháp Vierordt để xác định đồng thời
Acetaminophen và clopheninamin maleat trong thuốc viên nén bằng cách đo độ


hấp thụ quang ở các bước sóng 242 và 264 nm, còn một số tác giả khác đã xác
định đồng thời axit salixylic và chloramphenilcol bằng cách đo độ hấp thụ
quang ở các bước sóng 278nm và 297 nm.[17]
Phương pháp Vierordt đơn giản, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được
khi số cấu tử trong dung dịch hỗn hợp ít, phổ hấp thụ quang phân tử xen phủ
nhau không nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang được thoả mãn nghiêm
ngặt, thiết bị đo quang tốt thì phương pháp cho kết quả khá chính xác. Đối với
hệ nhiều cấu tử, đặc biệt là khi phổ của các cấu tử xen phủ nhau nhiều, tính
chất cộng tính độ hấp thụ quang không được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo
có độ chính xác không cao thì phương pháp không chính xác và có sai số lớn
[17]. Bởi vậy mặc dù phương pháp Vierordt tuy ra đời đã lâu, nhưng ứng dụng
trong thực tế còn rất ít. Tuy nhiên đây là cơ sở lý thuyết cơ bản nhất, đặt nền
móng cho các nhà khoa học sau này phát triển, cải tiến để xây dựng nên các

phương pháp mới.
1.3.2. Phương pháp phổ đạo hàm
Độ hấp thụ quang của các cấu tử là hàm của độ dài bước sóng của ánh
sáng tới A = f( ). Phổ đạo hàm của độ hấp thụ quang theo bước sóng
biểu diễn bằng phương trình toán học:
Đạo hàm bậc 1 của độ hấp thụ quang: A 1λ =
2

Đạo hàm bậc 2 của độ hấp thụ quang: A =
λ

...

...

...

...

...

...

dA
,
=f λ
dλ
d2 A
dλ

...

f

,,

λ

=

2

...

...
n

Và đạo hàm bậc n của độ hấp thụ quang: A n =
λ

d A
dλ

n

f

(n)

λ

=

Theo định luật Bughe - Lămbe - Bia thì: A λ0 = A = .C.b
Với C và b là hằng số, không phụ thuộc vào bước sóng

nên:

được


A 1λ =

dA
dε
= C.b.
dλ
dλ

A 2λ =

d A
d ε
2 = C.b.
2
dλ
dλ

...

...

2

2

...

n

A

n
λ

n

d A
d ε
= n = C.b. n
dλ
dλ

Độ hấp thụ quang của dung dịch có tính cộng tính nên:
A

n
λ hon hop

=A

n
λ Cau tu 1

+A

n
λ Cau tu 2

Để tính đạo hàm tại bước sóng

+ ... +A

n
λ Cau tu n

người ta chọn một cửa sổ

n điểm số

liệu từ phổ bậc 0 và một đa thức hồi quy được tính bằng phương pháp bình
phương tối thiểu. Đa thức này có dạng:
A = a0 + a1. + a2.

2

+ . . . + ak.

k

Các hệ số a0, a1 . . . ak tại mỗi bước sóng tương ứng là các giá trị đạo hàm
bậc 0, 1, 2 . . . k. Để có phổ đạo hàm đối với tập số liệu phổ bậc không, đầu tiên
ta phải sử dụng phương pháp hồi quy bình phương tối thiểu để tìm được hàm
hồi quy là đa thức bậc cao. Sau đó lấy đạo hàm của hàm này ta sẽ được các phổ
đạo hàm.
Đối với phổ đạo hàm bậc 0, 1 . . . n ta thấy có những đặc điểm như sau:
đỉnh của phổ đạo hàm bậc n là điểm uốn của phổ đạo hàm bậc (n - 1), còn tại
đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n-1) thì phổ đạo hàm bậc n có giá trị bằng 0. Số
đỉnh của phổ đạo hàm bậc n nhiều hơn số đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n - 1).
Như vậy, dùng phương pháp phổ đạo hàm ta có thể tách phổ gần trùng
nhau thành những phổ mới và khi đó ta có thể chọn được những bước sóng mà
tại đó chỉ có duy nhất 1 cấu tử hấp thụ quang còn các cấu tử khác không hấp
thụ, nhờ đó mà có thể xác định được từng chất trong hỗn hợp. Bằng toán học,
người ta xây dựng được phần mềm khi đo phổ của dung dịch hỗn hợp có thể
ghi ngay được phổ đạo hàm các bậc của phổ đó. Căn cứ vào các giá trị phổ đạo
hàm ta lựa chọn được bước sóng xác định đối với từng cấu tử.