Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của ba kết hợp với NAA và 2,4 d lên mẫu cây lá kim ngân ( lonicera japonica thunb )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------o0o-----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT
HỢP VỚI NAA VÀ 2,4-D LÊN MẪU CẤY LÁ KIM NGÂN
(Lonicera japonica Thunb)
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành

: 111

GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH
SVTH : NGUYỄN THÁI QUỲNH QUYÊN
MSSV : 105111053

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009


Lời cảm ơn
Em xin chân thành cảm ơn:
 Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ
Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn
Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã
truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học
tập tại trường.
 Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn,
truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt
thời gian thực hiện đề tài.

 Thầy Phạm Minh Nhựt và các thầy cô, anh chò nhân
viên tại Phòng Thí Nghiệm khoa Môi Trường và Công
Nghệ Sinh Học thuộc Trường Đại học Kỹ Thuật Công
Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn
và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này.
 Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có được ngày
hôm nay.
 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp 05DSH đã gắn
bó, giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm qua.

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Mục lục
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt............................................................i
Danh mục bảng.........................................................................ii
Danh mục hình............................................................................iii

1.

MỞ ĐẦU...............................................................1

1.1.

Đặt vấn đề..................................................................2

1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu............................4

1.2.1. Mục đích..........................................................................4
1.2.2. Nội dung nghiên cứu...................................................4

2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................5

2.1.

Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật.....6

2.1.1. Khái niệm......................................................................6
2.1.2. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật.............................................................................6
2.1.2.1. ...............................Về mặt lý luận sinh học cơ bản 6
2.1.2.2. .......................................Về mặt thực tiễn sản xuất 7
2.1.3. Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp
nhân giống in vitro...................................................................7
2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô..................9
2.1.5. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô
10
2.1.6. Các bước nhân giống in vitro..................................10
2.1.6.1. .............................Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
10
2.1.6.2. .........................................Tạo thể nhân giống in vitro
12
2.1.6.3. ........................................................Nhân giống in vitro

13


2.1.6.4. .................................Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
13
2.1.6.5. ..........................Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm
13
2.1.7.

Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro14

2.1.7.1. ......................................Sự hình thành chồi bất đònh
15
2.1.7.2. ..........................................Sự hình thành rễ bất đònh
17
2.1.8.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh
hình thái trong nuôi

cấy in vitro.........18

2.1.8.1. .........................................Ảnh hưởng của mẫu cấy
18
2.1.8.2. ...................Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
21
2.1.9.

Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong

nuôi cấy mô..........................................................................26
2.2.

Giới thiệu chung về Kim Ngân Hoa........................27

2.2.1.

Vò trí phân loại............................................................27

2.2.2.

Đặc điểm quan trọng của Kim Ngân Hoa..............28

2.2.3.

Tác dụng dược lý......................................................31

2.2.4.

Điều kiện trồng trọt.................................................33

2.2.5.

Những nghiên cứu chính về Kim Ngân Hoa..........36

3.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.....................37

3.1.

Thời gian và đòa điểm thí nghiệm..........................38

3.2.

Vật liệu.......................................................................38

3.2.1.

Đối tượng nghiên cứu..............................................38

3.2.2.

Trang thiết bò và dụng cụ........................................38

3.2.3.

Các loại môi trường.................................................39

3.2.4.

Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi cấy in vitro40

3.3.

Phương pháp bố trí thí nghiệm................................40


3.3.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng
mẫu cấy bằng dung

3.3.2.

dòch Javel 7%..................40

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của cách
đặt mẫu lá lên môi trường nuôi cấy đến
khả năng phát sinh hình thái của mẫu..............41

3.3.3.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất
kích thích tăng trưởng BA kết hợp với 2,4 D và
NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim
Ngân Hoa.....................................................................42

3.4.

Phân tích thống kê...................................................42

4.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................43

4.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng
mẫu cấy bằng dung dòch Javel 7%..........................44

4.2.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của cách
đặt mẫu lên khả năng phát sinh hình thái
của mẫu cấy............................................................47

4.3.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất
kích thích tăng trưởng BA kết hợp với 2,4 D và
NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim
Ngân Hoa.....................................................................50

4.3.1.

Thí nghiệm 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của chất
kích thích tăng trưởng BA kết hợp với 2,4 D lên
sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân
Hoa................................................................................50

4.3.2.

Thí nghiệm 3.2 : Khảo sát ảnh hưởng của chất
kích thích tăng trưởng BA kết hợp với NAA lên
sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân
Hoa................................................................................58

5.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................. 68

5.1.

Kết luận......................................................................69

5.2.

Đề nghò.......................................................................70


6.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

6.1.

Tài liệu tham khảo trong nước

6.2.

Tài liệu tham khảo nước ngoài

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
 2,4-D

: 2,4-dichlorophenolxyacetic acid

 BA

: 6-benzyladenine

 MS

: Môi trường MS (Murashige và Skoog,1962)

 NAA

: α – Naphthalene acetic acid


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy
mô
Bảng 3.1. Môi trường MS bổ sung 2,4-D và BA ảnh hưởng
lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim
Ngân Hoa
Bảng 3.2. Môi trường MS bổ sung NAA và BA ảnh hưởng
lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim
Ngân Hoa
Bảng 4.1.

Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu
cấy lá Kim Ngân Hoa

Bảng 4.2.

Ảnh hưởng của cách đặt mẫu cấy lên sự

phát sinh hình thái sau 1 tháng nuôi cấy

Bảng 4.3. nh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA
kết hợp 2,4-D lên sự phát sinh hình thái của
mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1
tháng nuôi cấy
Bảng 4.4. nh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA
kết hợp NAA lên sự phát sinh hình thái của
mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1
tháng nuôi cấy


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1.

Cây Kim Ngân Hoa (Lonicera japonica Thunb)

Hình 2.2.

Một số hình ảnh về Kim Ngân Hoa

Hình 2.2.

Hoa Kim Ngân phơi khô

Hình 4.1.

Cách đặt mẫu lá

Hình 4.2.

Mô sẹo phát sinh từ mẫu lá được đặt theo 2
cách khác nhau

Hình 4.3.

Ảnh hưởng của BA kết hợp với 2,4-D lên sự
phát sinh mô sẹo của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Hình 4.4.

Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên sự
phát sinh mô sẹo của mẫu lá Kim Ngân Hoa


1.1.

Đặt vấn đề

Kim Ngân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuộc Họ Kim Ngân
(Caprifolianceae) là cây dược liệu chứa tanin và một
saponin. Hoa chứa một flavonoid là scolymosid lonicerin và
một số carotenoid (ε. caroten, cryptoxanthin, auroxanthin). Quả
mọng giàu carotenoid mà phần lớn là cryptoxanthin. Lá
chứa một glucosid gọi là loganin và khoảng 8% tanin.
Theo Y học cổ truyền: Kim Ngân Hoa có tác dụng thanh
nhiệt giải độc.
Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại chứng minh
cây thuốc Kim Ngân Hoa có tác dụng: kháng khuẩn,
chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làm

tăng tác dụng thực bào của bạch cầu, tác dụng hưng
phấn trung khu thần kinh cường độ bằng 1/6 của cà phê,
làm hạ cholesterol trong máu, tăng bài tiết dòch vò và
mật.
Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các
phương pháp khuyếch tán và hệ nồng độ, người ta thấy
nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác dụng
kháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dòch hạch,
thương hàn, cận thương hàn, liên cầu khuẩn tan máu,


phẩy khuẩn tả. Tác dụng yếu hơn đối với các trực khuẩn
bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng. Nước sắc
lá Kim Ngân với nồng độ 201,2% ức chế trực khuẩn
Shiga, với nồng độ 2050% ức chế trực khuẩn cận thương
hàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn
(Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam).
Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng
điều trò ung thư trong Đông và Tây y như ung thư tuyến vú,
gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáp trạng, trực tràng,..
Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho
cảnh đẹp, hoa thơm, mành che nắng và mái che nắng, Kim
Ngân còn có tác dụng hấp thu nhiệt của ánh nắng mặt
trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành
tre, mành nhựa và mái tôn chống nóng. Ngoài ra, nó
còn hút thán khí (CO2), nhả dưỡng khí (O2) làm sạch môi
trường, tạo bầu không khí trong lành.
Việt Nam được xem là một nước có nguồn dược liệu
phong phú và đa dạng với số lượng trên 3.800 loài cây
làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật và là

thò trường đầy hứa hẹn khi nhu cầu sử dụng rất lớn
không chỉ là thuốc mà xu thế mỹ phẩm dùng nguyên
liệu từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu tổng hợp đã
chiếm 90% tổng số mỹ phẩm được sản xuất.
Tuy nhiên, trong vấn đề sản xuất, kinh doanh và lưu
thông, phân phối dược liệu, nguồn dược liệu chưa tương
xứng với tiềm năng hiện có và còn rất nhiều bất cập.
Hơn 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước vẫn
phải nhập khẩu, chủ yếu sản xuất những loại thuốc
thông thường, ngay cả những mặt hàng thuộc về thế
mạnh của Việt Nam là các loại thuốc y học cổ truyền


(YHCT), dược liệu lưu hành trên thò trường cũng chủ yếu
nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Singapore.
Tại TP.HCM, nơi chiếm đến 70% tỷ trọng số lượng thành
phẩm và nguyên liệu dược liệu của cả nước, 90% mặt
hàng đông dược lưu hành trên thò trường là hàng nhập
lậu.
Một điều đáng lưu tâm nữa là chất lượng dược liệu
hiện nay vẫn chưa được kiểm soát (trên 50% mẫu kiểm tra
không đạt tiêu chuẩn chất lượng) và tỷ lệ này với các
loại thuốc từ dược liệu là 10%.
Ngoài ra, việc trồng dược liệu hiện nay vẫn thiếu sự
quy hoạch tập trung, thiếu sự hỗ trợ căn cơ từ nhà nước
khiến thò trường dược liệu không ổn đònh, cây dược liệu vì
thế cũng không phát triển.
Vẫn chưa có một cơ quan chuyên môn nào đảm trách
khâu kỹ thuật sản xuất dẫn đến tình trạng các cây dược
liệu không đảm bảo được năng suất – chất lượng – giá

cả ổn đònh để cạnh tranh được với dược liệu nhập khẩu.
Như vậy với giá trò to lớn của cây Kim Ngân, là cây
thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam trong tình hình dược liệu
của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nói riêng thì
việc đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy
mô theo quy mô công nghiệp để có thể nâng cao năng
suất và số lượng cây trồng trong thời gian ngắn nhất
đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ cho thò trường Việt Nam
và trên thế giới là điều hết sức cần thiết.
1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu

1.2.1. Mục đích
Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân
trong điều kiện in vitro. Đồng thời tạo tiền đề cho những
nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trò dược lý


trong cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành
công nghiệp dược.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều
hòa tăng trưởng đến mẫu cấy lá của cây Kim Ngân.



2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1. Khái niệm
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ

mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật
trong ống nghiệm có chứa môi trường xác đònh ở điều
kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng
thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng
trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002).
2.1.2. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô
tế bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý
nghóa vô cùng to lớn đối với nghiên cứu lý luận sinh học
cơ bản, đồng thời nó có giá trò đóng góp trực tiếp cho
thực tiễn sản xuất và đời sống.
2.1.2.1.

Về mặt lý luận sinh học cơ bản

Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm
hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống.
Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể
tiến hành so sánh đặc tính của cơ thể với hợp phần của
chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra qui luật về
mối tương quan giữa các bộ phận trong cây.
Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước
hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào
không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thể
kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh và có thể gây ra
những thay đổi đònh hướng ở mức độ tế bào (trước khi
cho ra cây hoàn chỉnh).
Trong một cơ thể, rất khó phân biệt được từng giai
đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát
triển của cá thể. Bằng phương pháp nuôi cấy mô,

chúng ta có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ


dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt
một cách rõ rệt. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt
thúc đầy sự phát triển của cây trồng theo chiều hướng
mong muốn.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta
có thể tìm hiểu và tiến hành nghiên cứu mối quan hệ
khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ. Từ đó, người ta tìm ra
được những cơ chế miễn dòch thực vật. Khi con người hoàn
toàn làm chủ được cơ chế này thì các biện pháp phòng
bệnh được hoàn thiện và như vậy việc chống bệnh sẽ
trở nên đỡ tốn kém hơn rất nhiều.
2.1.2.2.

Về mặt thực tiễn sản xuất

Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản,
phương pháp nuôi cấy mô còn có những đóng góp hết
sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống.
Ý nghóa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế
bào là áp dụng kỹ thuật sản xuất đại trà có kiểm soát
trong tạo giống và nhân giống cây trồng. Những lợi ích
trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông
nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắt như sau:


Kiểm soát được dòch bệnh cây trồng. Bằng phương
pháp nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào, ta hoàn

toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay
mang mầm bệnh.



Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm
soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất.



Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân
giống đến khâu thu hoạch.



Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng
loạt của sản phẩm cuối. Sự đồng loạt này sẽ giúp
cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch.


Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lượng
sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện cho khâu tiêu
thụ và chế biến.
Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật
đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp
và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách
mạng xanh trong ngành trồng trọt.
2.1.3. Những thuận lợi và khó khăn của phương
pháp nhân giống in vitro
Một số thuận lợi của phương pháp nhân giống in vitro

(Pierik, 1975, Anonymous, 1980; van Assche, 1983; Gebhard và
cộng sự, 1983; Kunneman-Kooij, 1984):
 Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô
tính in vivo.
 Có thể tái sinh được một số loài thực vật mà
không thể tiến hành in vivo và sự tăng trưởng của
những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh
hơn do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự
trẻ hóa của mô và tạo được cây sạch bệnh vì có
sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu
vào nuôi cấy, đồng thời cũng có thể xử lý mẫu
cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa
vào môi trường nuôi cấy. Các cây sạch bệnh này
có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau
do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất.
 Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy
ban đầu rất nhỏ cho nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng
và dễ dàng.
 Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn
toàn thích hợp (nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi
trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm.


 Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây
mẹ cho các bước nhân giống kế tiếp.
 Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi
cấy.
 Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng
để tạo ra các ngân hàng gen.
 Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối

tượng hữu dụng trong việc lai soma.
 Một số loại cây bò mất khả năng sinh sản hữu tính
như các cây đơn bội, cây bất thụ đực, cây bất thụ
do đột biến… có thể được duy trì và nhân giống
bằng phương pháp nhân giống in vitro.
Tuy nhiên bên cạnh những thuận lợi trên, phương pháp
nhân giống in vitro có những bất lợi sau:


Kiểu gen thực vật không được ổn đònh trong một
số hệ thống nuôi cấy.



Đặc biệt đối với một số loài cây thân gỗ, việc
cảm ứng rễ rất khó thực hiện.



Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm
rất khó đối với một số cây.



Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn
ươm rất dễ bò tấn công bởi một số loại bệnh hại do
nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng. Vì vậy,
cần phải xử lý môi trường và giá thể sống của
cây thật cẩn thận.



Khả năng tái sinh cây có thể bò mất đi do việc
cấy chuyển mô sẹo và huyền phù tế bào được lặp
lại nhiều lần.



Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa
vào cấy rất khó thực hiện.


Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao



động làm cho giá thành của cây tăng lên.
2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được
ứng dụng trong một số lónh vực như:
 Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng
phương pháp dung hợp (nuôi cấy tế bào trần).
 Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng
(nuôi cầy huyền phù tế bào) trên quy mô lớn để
sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside,
các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong
công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh
trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp.
 Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho
phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngoài

đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).
 Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao
phấn và túi phấn).
 Vi nhân giống những giống cây có giá trò khoa học
và thương mại.
 Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ
thấp.
 Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.
 Nuôi cấy quang tự dưỡng.
2.1.5. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy
mô
Bảng 2.1. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy
mô
Nguồn gốc
mẫu cấy

Kích thước

Mẫu được tách


Đỉnh sinh trưởng
Chồi đỉnh

0,5 – 1 mm
0,5 – 1 cm

Chồi bên

0,5 – 1 cm

Mẫu lá

0,2 – 0,3 cm

Phiến lá

0,2 – 1 cm

Rễ

0,5 – 1 cm

Dạng củ hành

1 – 2 cm

Hạt nảy mầm

2 – 3 mm

Hạt phấn

0,1 – 0,5 mm

Tế bào đỉnh sinh
trưởng
Chốp đỉnh có
chứa một phần
thân

Chồi
bên
có
chứa một phần
thân, lá và chồi
nách
Mẫu lá được cắt
nhỏ, phân nửa
được
cấy
chìm
vào môi trường
Phiến lá non được
đặt
trên
môi
trường, mặt dưới
đặt
trên
mặt
thạch
Mẫu rễ được đặt
trên mặt thạch
Mẫu
được
đặt
trên mặt hay được
cấy chìm phân
nữa
vào

môi
trường
Chồi non
Hạt phấn trong túi
phấn

2.1.6. Các bước nhân giống in vitro
Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai
đoạn sau:
2.1.6.1.

Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác đònh đúng cây cần
nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn
cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng.
Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu
cấy được lấy vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của
cây mẹ.


Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được
một lượng lớn các mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả
năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm
rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy.
+ Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30
phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu bằng xà phòng sẽ làm
giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy.
+ Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung
dòch khử trùng để khử các nguồn lây nhiễm trên bề

mặt mẫu cấy. Dung dòch thường được sử dụng để khử
trùng

mẫu

là

hypochlorite

sodium

0,5

–

5,25%,

cồn,

hypochlorite calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dòch bromine,
chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylene
sorbitan monolaurate) vào dung dòch khử trùng thì sẽ làm
tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt
giữa nước và mô thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp
xúc với chất khử trùng tốt hơn.
+ Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần
bằng nước cất vô trùng trong tủ cấy để rửa sạch các
chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những phần
bò tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải
được cắt theo kích thước thích hợp.

+ Mẫu thực vật thường bò nhiễm bên trong và có thể
được khử trùng bằng cách bổ sung benomyl hoặc benlate
10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu bằng
các chất này trước khi khử trùng.
+ Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu
hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy. Khi bò
hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bò ức chế và lâu
ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi
trong mẫu cấy có chứa một lượng lớn tannin hoặc các


hợp chất hydroxyphenol. Các mô non thường ít bò hóa nâu
hơn mô trưởng thành hay mô già. Hiện tượng hoại tử
hoặc hóa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase có
nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và tryosinase), nó được
tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong
suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu.
Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn
cản hiện tượng hóa nâu là dùng than hoạt tính để hấp
thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường
dùng 0,5 – 5 g/l. Ngoài ra còn có một số chất khác như:
polyvinyl pyrolidone (PVP), acid ascorbic, acid citric, L–cystein,
hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và mercaptoethanol.
Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng
enzyme này hoạt động mạnh ở pH 6,5 và hoạt động yếu
ở pH thấp. Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảm được hiện
tượng hóa nâu.
Tóm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng
để làm giảm hiện tượng hóa nâu của mẫu cấy nên:
 Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non. Gây vết thương

trên mẫu với kích thước nhỏ nhất.
 Ngâm mẫu vào dung dòch acid ascorbic trong vài giờ
trước khi cấy vào môi trường.
 Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O 2
thấp, không có ánh sáng trong 1 – 2 tuần đầu.
 Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh
trưởng nồng độ thấp sang môi trường có chất kích
thích sinh trưởng nồng độ cao.
 Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4
tuần kể từ khi bắt đầu nuôi cấy thì một lượng
lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ.


2.1.6.2.

Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc
biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai
thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt.
Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân
giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên, có những
loài cây trồng không có khả năng nhân giống, người ta
thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo.
Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ
sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác.
2.1.6.3.

Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây
trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu
nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông
thường giống với môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng
độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình
nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp
cho quá trình tăng sinh được nhanh. Cây nhân giống in vitro
có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô
hạn.
2.1.6.4.

Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ
thân, lá và rễ chuẩn bò chuyển ra vườn ươm cây. Cây
con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra môi
trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được
loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo
rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên
bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi được tách ra
khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu
tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ


hòa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung
auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.
2.1.6.5.

Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân
giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện
ổn đònh về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm…
Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn
khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ
mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bò
stress, dễ mất nước và mau héo.
Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải
mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí
mát, ẩm độ cao,… cây con thường được cấy trong luống
ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm,
trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm
quá trình thoát nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày
cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình cấy mô sẽ dần dần
bò lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý
với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để
rút ngắn thời gian ra rễ.
2.1.7. Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in
vitro
Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô không xảy ra ngay
khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình
rất phức tạp vì:


Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ
được phá vỡ và những mối tương quan mới được hình
thành.



Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:
 Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản
biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa tế bào).


 Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành
mô sẹo): sự hình thành cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự
phân chia tế bào diễn ra.
 Sự hình thành cơ quan
 Sự phát triển cơ quan
Sự tái sinh bò giới hạn về số lượng và chất



lượng do nhiều nhân tố:


Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy



Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong
nhà kính hoặc ngoài thiên nhiên



Vò trí của mẫu cấy trên cây



Thời gian thu mẫu trong năm



Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực
vật nội sinh
Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy,



nuôi, thành phần dưỡng chất trong môi trường nuôi
cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố vật
lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,…
sự bổ sung một số cơ chất khác vào trong môi
trường,…
Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ
quan trong nuôi cấy mô rất phức tạp, chúng ta không thể
đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý
đến một số vấn đề sau:


Quá trình tái sinh phức tạp do chòu sự tương tác của
nhiều nhân tố khác nhau (môi trường dinh dưỡng, ánh
sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,…).



Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất
cả các loài vì mỗi loài khác nhau cần điều kiện tái

sinh khác nhau.


Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng



tái sinh của mỗi loài khác nhau: trong những trường hợp
này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết đònh do
đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh
hưởng không nhiều.
Sự hình thành rễ bất đònh thường đối lập với sự hình



thành chồi bất đònh. Nếu cả hai quá trình này được
thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều
thiếu sót. Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất
chúng ta nên tạo chồi bất đònh trước sau đó cảm ứng
tạo rễ.
2.1.7.1.

Sự hình thành chồi bất đònh

Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất đònh như
một phương pháp nhân giống vô tính nhằm làm tăng số
lượng cây mong muốn.
Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để
nhân giống ví dụ như:

Saintpaulia, Begonia, Achimenes,

Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin…
Có nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất đònh và
tạo rễ bất đònh:


Sự hình thành chồi bất đònh ở cây hạt trần chỉ
thành công khi sử dụng các bộ phận của cây con
(Anonymous, 1984).



Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự
tạo cơ quan (chồi và rễ).



Sự hình thành chồi và rễ đều bò ức chế bởi
gibberellin và acid abscisic.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất đònh


Ánh sáng