Nghiên cứu nhân giống lan long tu bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS.
Chu Hoàng Hà đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện luận văn này.
Tôi xin được cảm ơn: Phòng Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa SinhKTNN, Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường ĐHSP Hà Nội 2; Lãnh đạo
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. La Việt Hồnggiảng viên trường ĐHSP Hà Nội 2; TS. Phạm Bích Ngọc, Th.S Hoàng Đăng
Hiếu - phòng Công nghệ tế bào thực vật đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn sinh viên Nguyễn Nguyệt Quỳnh đã giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình làm thí nghiệm tại Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường ĐHSP
Hà Nội 2.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, các
bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và
nghiên cứu hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 11 năm 2016
Học viên

Đào Văn Kiên


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Long tu bằng
kỹ thuật nuôi cấy in vitro” là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả
cùng cộng tác với cộng sự khác. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong
luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng
xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, tháng 11 năm 2016
Tác giả

Đào Văn Kiên


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 6
1.1. Giới thiệu về chi lan Dendrobium.............................................................. 6
1.1.1. Hệ thống phân loại ............................................................................... 6
1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 7
1.1.3. Phân bố vùng sinh thái ......................................................................... 9
1.1.4. Giá trị của lan Dendrobium................................................................ 11
1.2. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam ..................... 13
1.3. Nhân giống in vitro .................................................................................. 14
1.3.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro ............................................ 14
1.3.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro......................................................... 15
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro ...................................... 17
1.3.5. Quy trình sản xuất cây cấy mô ........................................................... 22
1.3.6. Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam ............................ 24
1.4. Ứng dụng DNA barcode vào việc xác định loài ...................................... 25
1.4.1. Giới thiệu DNA barcode .................................................................... 25
1.4.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode ......................................... 26
1.4.3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở
thực vật............................................................................................................ 27
1.4.4. Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật................................. 30
Chương 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 32


2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 32
2.2. Dụng cụ hóa chất...................................................................................... 32
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 32

2.3.1. Nhận dạng loài Dendrobium sp. bằng kỹ thuật DNA Barcode ......... 32
2.3.2. Nhân giống lan Dendrobium sp. bằng kỹ thuật nuôi cấy mô ............ 33
2.3.3. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên................... 36
2.3.4. Phương pháp phân tích thống kê........................................................ 36
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 37
3.1. Kết quả nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA ............................................... 37
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................... 37
3.1.2. Kết quả nhận dạng loài dựa trên các trình tự trnL, matK và ITS ......... 38
3.2. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro................................................... 42
3.2.1. Nhân nhanh protocorm và tạo chồi từ protocorm .............................. 42
3.2.2. Nhân chồi ........................................................................................... 46
3.2.3. Tạo rễ - hình thành cây....................................................................... 50
3.2.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên................... 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 57


DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

BAP

Benzyl aminopurin

bp

Base pair

CT

Công thức

CTAB

Cetyltrimethyl ammoium bromide

ĐC

Đối chứng

DNA

Desoxyribo nucleic acid

GA3

Giberellic acid

IAA

Indol acetic acid

ITS

Internal transcribed spacer

KIN

Kinetin

KTNN

Kỹ thuật nông nghiệp

matK

Gen mã hóa Maturase K

MS

Murashige and Skoog

NAA

Naphthaleneacetic acid

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

SSR

Simple Sequence Repeates


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................ 33
Bảng 3.1. Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được
công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị trnL .................... 38
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được
công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị matK .................. 39
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được
công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị ITS ..................... 41
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm
của loài D. transparens ..................................................................... 43
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tạo chồi từ protocorm
của D. transparens ............................................................................ 44
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của KIN lên khả năng nhân chồi của D. transparens
sau 8 tuần nuôi cấy............................................................................ 47
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của lan Long tu
sau 8 tuần nuôi cấy............................................................................ 48
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi

của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy
.....................................................49
Bảng 3.9. Ảnh hưởng NAA đến khả năng tạo rễ in vitro của lan Long tu
sau 6 tuần nuôi cấy............................................................................ 51
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D.
transparens sau 6 tuần nuôi cấy ....................................................... 52


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Một số loài Phong lan thuộc chi Dendrobium ............................... 12
Hình 3.1. Điện di kiểm tra .............................................................................. 37
Hình 3.2. Cây phân loại dựa trên chỉ thị trnL của mẫu lan nghiên cứu
(TTP11) với các loài đã được công bố trên Genbank
............................39
Hình 3.3. Cây phân loại dựa trên chỉ thị matK của mẫu lan nghiên cứu
(TTP9) với các loài đã được công bố trên Genbank....................... 40
Hình 3.4. Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS của mẫu lan nghiên cứu (TTP12)
với các loài đã được công bố trên Genbank
............................................41
Hình 3.5. Protocorm phát sinh từ protocorm của D. transparens.................. 44
Hình 3.6. Chồi phát sinh từ protocorm của D. transparens trên môi
trường MS +10% ND...................................................................... 45
Hình 3.7. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trường MS + 0,5 mg/l KIN ............................................................. 47
Hình 3.8. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trường MS (a) + 2,0 mg/l BAP, (b) + 0,5 mg/l BAP ...................... 49
Hình 3.9. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trường MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA ................................. 50
Hình 3.10. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro D.
transparens sau 6 tuần nuôi cấy ..................................................... 51

Hình 3.11. Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D.
transparens sau 6 tuần nuôi cấy ..................................................... 53
Hình 3.12. D. transparens in vitro rèn luyện ngoài tự nhiên ......................... 54


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Từ xưa tới nay, Phong lan được biết đến như một thứ hoa đại diện cho
sự cao quý. Hoa Phong lan vô cùng đa dạng về chủng loại, mỗi loài đều mang
những vẻ đẹp khác nhau, muôn hình vạn sắc nhưng tất cả trong chúng đều
ánh lên một vẻ đẹp của sự trong sáng, vẻ đẹp hoàn hảo, tinh tế và vô cùng
thanh cao. Từ những loài Phong lan ẩn mình dưới tán lá cây rừng, cho đến các
giò Phong lan treo mình trên vách núi đá cao vời vợi đều mang đến hơi thở
của núi rừng hoang dại, vẻ mộc mạc hoang sơ nhưng lại gần gũi thiết tha. Đối
với những người chơi Phong lan bằng tâm hồn thì đây là một thú chơi tao nhã
và lành mạnh, sẽ khiến tâm trạng con người được thư thái, hay đơn giản hơn
ta có thể bắt gặp ở bất cứ nơi đâu nếu cần một không gian đẹp và sang trọng,
ở đó có sự xuất hiện của hoa Phong lan [14].
Ngoài giá trị về vẻ đẹp thẩm mỹ, Phong lan còn được biết đến như là
một trong những vị thuốc Đông y khá phổ biến trong nhiều bài thuốc chữa
bệnh. Có thể kể đến như: Phong lan Thạch hộc có tác dụng chữa ho, đầy hơi,
gầy còm [10]; Phong lan Kim tuyến được coi là “vua của thuốc” hoặc “cỏ
vàng” thường được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường, cao huyết áp,
bệnh tim, viêm phổi, viêm gan cấp và mãn tính, viêm thận và các bệnh khác...
Với giá trị như vậy, Phong lan hứa hẹn mang lại nguồn doanh thu
khổng lồ cho ngành sản xuất, kinh doanh loại mặt hàng này. Cùng với sự phát
triển của ngành trồng lan trong thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ làm
giàu cho người nông dân mà còn làm đẹp hơn hình ảnh của Việt Nam trong

con mắt du khách quốc tế. Trong những loài Phong lan mang lại giá trị kinh tế
cao ở nước ta có thể kể đến các loài thuộc chi Dendrobium, đây là một trong
những chi thực vật phổ biến nhất trên thế giới, chi này có khoảng 1200-1500
loài phân bố rộng khắp ở Châu Á, Bắc Australia và New Zealand. Các loài


thuộc chi này sinh trưởng nhanh, dễ dàng tái sinh thế hệ mới, hoa đẹp, ra hoa
quanh năm [19]. Ngoài giá trị thương mại, một số loài lan thuộc chi
Dendrobium còn là thành phần của các bài thuốc truyền thống ở Trung Quốc
và Ấn Độ [48].
Cũng chính vì những lợi ích to lớn mà Phong lan nói chung, các loài
Phong lan thuộc chi Dendrobium nói riêng mang lại đã làm cho loài hoa này
trong tự nhiên bị con người săn lùng và khai thác một cách triệt để, rất nhiều
giống Phong lan rừng quý hiếm đang đến gần nguy cơ của sự tuyệt chủng.
Trong tự nhiên, các loài lan sinh trưởng chậm, tái sinh chủ yếu bằng hạt. Tuy
nhiên, khả năng nảy mầm tự nhiên của hạt lan là cực kì thấp. Do đó, sự phục
hồi của các quần thể lan ở rừng tự nhiên là rất khó [6], [7]. Đứng trước thực
trạng này, việc nhân giống cung cấp cho sản xuất và bảo tồn vốn gen của
những loài lan quý hiếm càng trở nên cấp thiết. Để giải quyết vấn đề này,
việc áp dụng nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô là một giải pháp hữu ích,
đây là phương pháp nhằm cung cấp số lượng lớn cây lan giống sạch bệnh
trong một thời gian ngắn cho nghiên cứu và sản xuất.
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn một trăm năm
hình thành và phát triển, đem lại giá trị to lớn cho loài người. Hiện nay, hầu
hết các cơ sở nghiên cứu giống cây trồng trên thế giới đều áp dụng công nghệ
này với các mục đích khác nhau. Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào
thực vật đã được bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng từ giữa những năm 70 của
thế kỷ XX. Trong bước đầu nghiên cứu và ứng dụng đã đạt kết quả khả quan
đối với một số đối tượng cây trồng như chuối, khoai tây, mía, lúa…, đặc biệt
là Phong lan.

Trong quá trình nghiên cứu nhân giống Phong lan, đặc biệt là áp dụng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thì việc xác định rõ nguồn gốc loài nghiên
cứu nuôi cấy là việc làm rất quan trọng bởi nếu nhầm lẫn sẽ định hướng áp


dụng sai các kỹ thuật nuôi cấy và kết quả cuối cùng sẽ không nhân được
giống loài Phong lan mong muốn. Việc phân loại các loài trong chi
Dendrobium thường rất khó khăn do chúng có đặc điểm cơ quan sinh dưỡng
tương đồng, số lượng loài trong chi lớn, nhiều đặc điểm hình thái giữa các
loài chồng lấn. Trong những năm gần đây, với sự ra đời của các nghiên cứu
về hệ thống học phân tử , nhiều phương pháp phân tích đã cho kết quả nhanh
và chính xác. Để phân loại sinh vật, phương pháp phân loại truyền thống chủ
yếu dựa vào các đặc điểm hình thái. Hiện nay, công cụ phân tử dựa trên trình
tự DNA của các phân đoạn gen chuẩn hay còn gọi là DNA barcode được phát
triển mạnh mẽ để phân loại sinh vật ở mức độ loài [18].
Nhằm mục đích nhận dạng loài Phong lan có tên địa phương là Long tu
(Dendrobium sp.) và tiến hành nhân giống in vitro loài Phong lan này chúng
tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Long tu bằng kỹ thuật
nuôi cấy in vitro”. Công trình này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh
lý thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nhận dạng mẫu lan Long tu nghiên cứu bằng kỹ thuật DNA
Barcording.
- Xác định nồng độ Kinetin (KIN) bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS
có ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng nhân nhanh protocorm của lan Long
tu.
- Xác định tỉ lệ thể tích nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS
có ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng tạo chồi từ protocorm của lan Long tu.

- Xác định nồng độ của KIN, BAP và tổ hợp BAP kết hợp NAA bổ
sung lần lượt từng loại vào môi trường nuôi cấy MS có ảnh hưởng tốt nhất
đến khả năng nhân chồi in vitro của lan Long tu.


- Xác định nồng độ của NAA và IAA bổ sung lần lượt từng loại vào
môi trường nuôi cấy MS có ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng tạo rễ in vitro
của lan Long tu.
- Đánh giá sự sinh trưởng của lan Long tu sau giai đoạn in vitro trên giá
thể xơ dừa khô ngoài điều kiện tự nhiên.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Sử dụng kỹ thuật DNA Barcording nhận dạng mẫu Phong lan
nghiên cứu.
- Khảo sát sự sinh trưởng của mẫu Phong lan nghiên cứu trên các môi
trường nuôi cấy in vitro có bổ sung liều lượng và các loại chất điều hòa sinh
trưởng khác nhau.
- Khảo sát sự sinh trưởng của mẫu Phong lan nghiên cứu trên giá thể xơ
dừa khô.
4. Đối tượng nghiên cứu
Quả Phong lan có tên địa phương là Long tu (Dendrobium sp.) do
Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật (Khoa Sinh - KTNN, ĐHSP Hà Nội 2) thu
tại Trạm Đa dạng sinh học Mê Linh.
5. Phạm vi nghiên cứu
5. 1. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
- Thực hiện các thí nghiệm nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử tại
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Thực hiện các thí nghiệm nuôi cấy in vitro tại Phòng thí nghiệm Sinh
lý thực vật, khoa Sinh - KTNN ,trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5.2. Nghiên cứu ngoài điều kiện tự nhiên

Đánh giá sự sinh trưởng của lan Long tu (Dendrobium sp.) giai đoạn ex
vitro trên giá thể xơ dừa khô ngoài điều kiện tự nhiên tại vườn ươm của Khoa
Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.


6. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nhận dạng loài bằng kỹ thuật DNA Barcode.
- Phương pháp nhân giống thực vật lan bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
- Phươn pháp rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên.
- Phương pháp phân tích thống kê.


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chi lan Dendrobium
1.1.1. Hệ thống phân loại
Thuộc lớp một lá mầm: Monocotyledones
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Họ phụ: Epidendroideae
Tông: Epidendreae
Chi: Dendrobium
Họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25.000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau
họ Cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong ngành một lá
mầm. Các loài trong hệ thống này phân bố rất rộng, do đó hình thái và cấu tạo
cũng hết sức đa dạng và phức tạp [9].
Dendrobium có tên từ chữ Hy Lạp ghép lại: Dendro (cây) và bios (cuộc
sống) để chỉ dòng lan sinh sống trên các cành cây cao. Tên gọi Dendrobium
đã được nhà thực vật người Thụy Điển Swartz đưa ra lần đầu tiên vào năm
1799 trong “Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis 6”. Từ đó
đến nay hầu hết các nhà nghiên cứu hoa lan đều dùng tên gọi này, chi lan

Dendrobium theo danh pháp tiếng Việt có tên gọi là chi lan Hoàng Thảo [8].
Tuy nhiên, từ trước đó Loureiro đã công bố hai loài có tên gọi là
Ceraia simplicissima và Callista amabilis trong “Flora Cochinchinensis"
(1970) mà các nhà nghiên cứu sau này xếp vào chi Dendrobium. Tên gọi
Ceraia và Callista ít được quan tâm nên sau này nó trở thành tên đồng nghĩa
của Dendrobium [43].
Đại đa số các nhà phân loại như Lindley (1830), Reichenbach (1861),
Bentham và Hooker (1883), Pfitzer (1890), Holttum (1953), Seidenfaden


(1985) đều chia Dendrobium thành các nhóm khác nhau (section). Song cũng
có vài tác giả chọn cách phân chia chi Dendrobium thành các phân chi
(subgennus) như Kraenzlin [42], [43].
Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) ở Việt Nam
thường dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985). Hệ thống này rõ ràng,
không phức tạp, có độ tin cậy cao và phù hợp với các đại diện của chi lan
Dendrobium ở Việt Nam [7], [8].
Với khoảng 1200-1500 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóc
khác nhau, nguyên do là vì chúng du nhập từ nhiều địa danh khác nhau: Nhật
Bản, Triều Tiên và Newzealand, đặc biệt là Guinea là nơi sản sinh ra nhiều
loài Dendrobium nhất [1].
Ở Việt Nam, Dendrobium có khoảng hơn 100 loài, xếp trong 14 tông
được phân biệt bằng thân , lá và hoa [12].
1.1.2. Đặc điểm hình thái
a. Thân
Là các cây thân thảo, mọc nhóm, đứng thẳng hoặc rủ thõng phân đốt,
sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc ít gặp các loài sống bám trên đá, trong
rừng ẩm. Thân của các đại diện chi lan Dendrobium đều phân đốt, hình trụ,
hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 3cm đến 120cm hoặc đôi khi
hơn, kích thước phổ biến là 20 - 50 cm [7].

Thân có thể mảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên. Phần dày mập
lên của thân gồm một vài lóng ở sát gốc hoặc sát ở đỉnh. Đôi khi phần dày lên
có hình con suốt có 4 gờ sắc. Ở cá biệt vài loài chỉ có các mấu dày lên, còn
lóng thì hầu như không, làm thân có dạng tràng hạt (D. pendulum) hoặc sự
dày lên là dần dần độc lập ở mỗi lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D.
nobile, D. wardianum). Phần tận cùng là gốc, nơi xuất phát của rễ, thường là
nhỏ mảnh nhưng cũng không ít trường hợp phình to ra [2], [8].


b. Lá
Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm
thân, ít khi không có bẹ. Lá phân bố suốt dọc thân nhưng ở nhiều đại diện lá
tập trung 2 - 5 chiếc ở đỉnh thân, cũng có khi phần đỉnh thân chỉ có hoa mà
không có lá (D. acinaciforme, D. dalatense). Tùy loài mà lá có thể còn tồn tại
hoặc rụng đi trước khi hoa nở. Số lượng lá thay đổi từ rất nhiều đến khi chỉ
còn 3 - 5, hiếm khi 2 hoặc 1.
Lá thường cứng, dạng da, bóng, ít khi nạc và mềm, bề mặt thường
nhẵn, đôi khi bề mặt bẹ và lá (thường là khi lá còn non) có phủ lông cứng
ngắn màu đen sớm rụng. Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình
cung. Lá thường hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi
lá hình thoi dài. Đỉnh lá nhọn hoặc tù, rất nhiều trường họp lá xẻ 2 thùy nhọn,
tù hoặc là tròn lệch nhau. Chiều dài của lá thay đổi từ l - 19cm và chiều rộng
lá từ 0,3 - 3,5 cm. Lá hình trụ thường có bề dày (đường kính) từ 0,2 - 0,4cm
[2], [7].
c. Hoa
Hoa thường là nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc hoa đơn độc. Nhóm hoa
dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài mang nhóm hoa đẹp có giá trị làm cảnh
rất cao [7].
Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ. Hoa đa
số các loài có hương thơm. Bao hoa chia hai vòng, vòng ngoài gồm 1 lá đài

giữa và 2 lá đài bên, vòng trong gồm có 2 cánh hoa và 1 cánh môi.
d. Quả
Quả nang thường là hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt
nằm xen lẫn những sợi lông mảnh. Khi quả già, gặp trời ẩm sợi này sẽ hút
nước và trương lên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài. Hạt rất nhỏ, hầu
như không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng, dạng mắt võng, trong


suốt, chứa đầy không khí, dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió.
So với những chi gần cận là Flickingeria, Epigenium, Eria thì
Dendrobium có những đặc điểm phân biệt căn bản sau đây:
- Các đại diện của chi Dendrobium luôn mọc nhóm và có thân phân đốt
chứ không mọc đơn độc trên thân rễ và chỉ có 1 lóng như các đại diện của
Flickingeria.
- Dendrobium luôn có số lượng khối phấn là 4, khác với 2 như ở chi
Epigennium hoặc 8 như ở Eria.
- Dendrobium không có lông mềm mịn trên lá hay các bộ phận của hoa
như chi Eria.
e. Rễ
Rễ của các đại diện chi lan Dendrobium là rễ khí sinh, thường mảnh,
hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể
hoặc buông thõng xuống. Độ dày của rễ từ 0,1- 0,3cm. Rễ thường mọc ra từ
phần gốc của thân hoặc đôi khi có thể ở mấu thân một vài loài (D.
Bilobulatum; D. parcum…) [7], [8].
1.1.3. Phân bố vùng sinh thái
Chi Dendrobium trên thế giới phân bố chủ yếu ở lục địa Đông Nam Á
và các đảo thuộc Philippin, Malaixia, Inđônêxia, Đông Bắc Ôxtrâylia
(Dressler, 1981). Riêng ở Việt Nam, chi lan Dendrobium đã phát hiện gồm
hơn 100 loài phân bố chủ yếu ở vùng nói suốt từ Bắc, Trung, Nam và ở trên
một số đảo ven biển nước ta [7], [20]. Có thể kể đến một số loài điển hình là

đại diện của các vùng miền trên khắp đất nước như:
Vùng Đông Bắc: Hoàng Thảo Ri vơ (D. rivesti), Hoàng Thảo Mỡ gà
(D. haveyanum), Hoàng Thảo Tuyết mai (D. crumenatum Sw).
Vùng Tây Bắc: Hoàng Thảo Sợi (D. tenellum Ldl), Hoàng Thảo Mỹ
dung (D. devodianum Paxt), Hoàng Thảo Thủy tiên (D.farmeri Paxt), Hoàng


10

Thảo Gai dài (D. longicornu Ldl), Hoàng Thảo Ý ngọc (D. transparens)
Vùng Trung du Bắc Bộ: Hoàng Thào Vảy rồng (D. lindleyi), Hoàng
Thảo Giả hạc (D. Superbuni Rchb.f), Hoàng Thảo Hợp (D.fimbriatum Hook),
Hoàng Thảo Xoắn(D. tortile Ldl), Hoàng Thảo Tam Đảo (D. dơoense).
Vùng Đồng bằng Bắc Bộ: Hoàng Thảo Lệch (D. aduncum Wall),
Hoàng Thảo Dẹt (D. nobile Ldl), Hoàng Thảo Trúc (D. hancockii), Hoàng
Thảo Thái Bình (D. moschatum).
Vùng Bắc Trung Bộ: Hoàng Thảo Xoắn (D. tortile Ldl), Hoàng Thảo
Long nhãn (D. fimbriatum), Hoàng Thảo Tím huế (D. hercoglossum Rchb.f),
Hoàng Thảo Tiểu hộc (D. podagraria Hook.f), Hoàng Thảo Nanh sấu (D.
terminale Par et Rchb.f).
Vùng duyên hải Trung Bộ: Hoàng Thảo Bạch nhạn (D. oxyanthum
Gagn), Hoàng Thảo Phong tuyết lan (.D. tenellum Lindl).
Vùng Tây Nguyên: Hoàng Thảo Tua (D. hadveyanum Reichb.f), Hoàng
Thảo Bạch hỏa hoàng (D. hadveyanum Reichb.f), Hoàng Thảo Bạch nhạn (D.
formosum Roxb), Hoàng Thảo Long nhãn (D. fimbriatum Hook), Hoàng Thảo
Ngọc lan (D. pierardii), Hoàng Thảo Ý thảo (D. gratiosissimum Reichb.f),
Hoàng Thảo Xươg cá (D. kentrophylium Hook.f), Hoàng Thảo Môi tơ (D.
delacourii Guill), Hoàng Thào Vani (D. aduncum), Hoàng Thảo Đại bạch hạc
(D. christyanum).
Vùng Đông Nam Bộ: Hoàng Thảo Móng rùa (D. anceps Sw), Hoàng

Thảo Thạch hộc vôi (D. cretaceum Lindl), Hoàng Thào Trụ cứng (D.
caryaecoium Guill), Hoàng Thào Trúc lan (D. cathcartii Hook.f).
Vùng đồng bằng Nam Bộ: Hoàng Thảo Lá cong (D.acinaciforme
Roxb).
Các đại diện của chi Hoàng Thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc
cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, thường ở nơi ẩm, mọc ở


11

độ cao 500 - 1500m so với mực nước biển, nhưng có khi gặp chúng mọc ở độ
cao từ 200m - 2000m [7], [20], [42].
1.1.4. Giá trị của lan Dendrobium
Lan Hoàng Thảo là một chi có ý nghĩa kinh tế lớn bởi rất nhiều loài
trong chi có dáng cây đa dạng, hoa đẹp để trồng làm cảnh. Lan Hoàng Thảo
có khả năng thích nghi rộng với điều kiện sống, phân bố rất rộng nên có ý
nghĩa thương mại lớn. Đặc biệt có nhiều loài là đặc hữu, được đưa vào Sách
đỏ Việt Nam rất quý hiếm như Ngọc vạn vàng (D. chrysanthum), Thạch hộc
môi răng (D. devonianum) (Hình 1.1a,b) [20]. Ngoài ý nghĩa làm cảnh, một số
loài Hoàng Thảo cũng là một vị thuốc dân tộc cổ truyền. Các loài D. nobile,
D. gratiosissimum, D. crumenatum (Hình 1.1d,e) được dùng để chữa sốt
nóng, khô cổ, bứt rứt, kém ăn, giảm thị lực. Các vị thuốc từ Hoàng Thảo có
tên Shih-Hu hay Shiliu có vị ngọt, tính hàn có tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng
lực, bồi bổ dạ dày, gây tiết nước bọt, tăng sự ngon miệng. Đó cũng là bài
thuốc dùng khi sốt cao, khát nước và đổ mồ hôi trộm, đuối sức [3], [24].
Nhiều nghiên cứu cho thấy những loại canh mọi người thuờng dùng như canh
hành tây, canh cà chua, canh cà rốt... nếu cho thêm một số vị thuốc Đông y
trong đó có lan Hoàng Thảo sẽ có tác dụng phòng chống ung thư rất tốt. Lan
D. primulinum (Hình 1.1c) ngoài được trồng làm cảnh vì dáng cây mềm mại,
hoa dày đặc trên giả hành không có lá, nở nhiều vào dịp Tết Nguyên Đán thì

giả hành của loài này có tính mát nên được dùng để làm thuốc trị bỏng lửa, tê
liệt nửa người, bệnh mẩn ngứa. Thân của Hoàng Thảo Thạch hộc môi răng có
vị ngọt, nhạt, hơi mặn, tính hàn, có tác dụng tư âm tích vị, sinh tân chỉ khát
nên thường dùng để chữa bệnh sốt cao, tổn thương bên trong cơ thể, miệng
khô [24], [29], [34].


12

Hình 1.1. Một số loài Phong lan thuộc chi Dendrobium (a):
D. devonianum, (b): D. chrysanthum, (c): D. primulinum, (d):
D. crumenatum, (e): D. nobile

Trước đây “Vua chơi lan, quan chơi trà” thể hiện thú chơi lan chỉ dành
cho các bậc Đế vương. Ngày nay, nhu cầu tiêu thụ cũng như thưởng thức loài
hoa vương giả này ngày càng trở nên phổ biến. Lan Hoàng Thảo cũng không
nằm ngoài nhu cầu chung của người tiêu dùng, đặc biệt vào các dịp lễ, Tết…
Nước ta là nước có điều kiện thuận lợi cho các loài lan sinh trưởng và
phát triển, cho nên hoa lan đã được nhân dân ta thuần hoá và trồng từ lâu đời.
Càng ngày các loài lan càng trờ nên phong phú và đa dạng nhờ được bổ sung
các giống lai mới do lai tạo và nhập nội. Đối với người Việt Nam, hoa lan là
hình ảnh gần gũi và thân thiết vì nó là loài hoa vừa đẹp vừa dễ trồng. Trồng
lan không những là thú vui tiêu khiển bồ ích giúp con người hòa hợp với thiên
nhiên mà còn là nghề đưa lại nguồn thu nhập kinh tế khá cao. Nó phù hợp với
tình hình kinh tế của nước ta hiện nay, tạo điều kiện để mở rộng các mặt hàng


13

xuất khẩu và giải quyết công ăn việc làm cho mọi người ở mọi lứa tuổi. Ngoài

ra trồng lan tốn ít đất, không phải sử dụng đất của nông nghiệp. Trồng lan còn
tạo vùng cây xanh cho gia đình, làm không khí thêm trong lành, góp phần tích
cực báo vệ môi truờng, nhất là ờ thành phố. Trồng lan còn nâng cao cuộc
sống tinh thần cùa chúng ta, giúp ta biết hưởng thụ và cảm nhận cái đẹp, biết
yêu và bảo vệ thiên nhiên [14].
1.2. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam
Cây hoa lan được biết đến đầu tiên ở Phương Đông là loài Kiến lan.
Theo tác giả Bretchacidor thì từ đời vua Thần Nông 2800 trước công nguyên,
ở Trung Quốc loài lan này đã được dùng làm thuốc chữa bệnh. Sau đó, cùng
với vẻ đẹp và hương thơm của nó kết hợp với công dụng chữa bệnh nên loài
hoa này đã có mặt ờ châu Âu. Tại đây, người ta đã tiến hành nhiều nghiên cứu
khá công phu và tỉ mỉ về hoa lan [45].
Các thế kỷ XVI - XVII, những người châu Âu đặc biệt là người Anh đã
đi khắp thế giới nghiên cứu, sưu tập cây cỏ. Trong thời kỳ này, nhiều loài lan
nhiệt đới đã được đưa về nước Anh. Năm 1794 ở Anh, người ta đã biết được
15 loài lan nhiệt đới. Đầu thế kỳ XX, kỹ thuật gieo trồng hoa lan từ hạt bằng
nhiều nấm cộng sinh có từ cây lan mẹ bắt đầu một giai đoạn mới đối với nghề
nuôi trồng lan. Đặc biệt là đưa kỹ thuật lai tạo áp dụng vào giống lan, tạo ra
những cây lan lai có vẻ đẹp về màu sắc và hình dạng duyên dáng hơn hẳn cây
bố mẹ. Năm 1856, nhà làm vườn người Anh tên là Fohn Domini đã lai tạo
thành công loài hoa lan Calanthe dominii bằng cách lai C. masutra và C.
furcata. Năm 1960, lần đầu tiên Morel đã thực hiện thành công nhân giống vô
tính bằng phương pháp nuôi cấy mô trên đối tượng lan Kiếm thuộc nhóm lan
đa thân [31]. Ngày nay, các loài lan đã xếp thành hệ thống phân loại chung
gọi là Orchidaceace, lan rừng đã xác định được 750 chi và hơn 25.000 loài tự
nhiên và có hơn 30.000 loài lan lai [30].


14

Trước đây, các nghiên cứu về hình thái học chù yếu tập trung vào các
nghiên cứu nhằm thống kê toàn bộ họ của phong lan như công trình nghiên
cứu của Dressier, 1993. Sau này các nghiên cứu tiến hành nghiên cứu về đa
dạng di truyền dựa trên sự kết họp giữa hình thái và chi thị phân tử như
RAPD, RFLP, AFLP, SSR.., giải trình tự các vùng ITS, matK....Đây là một
phương pháp rất phổ biến để xác định mối quan hệ di truyền cùa các giống
loài lan phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn, chọn và lai tạo giống mới
[51], [55], [59].
1.3. Nhân giống in vitro
1.3.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro
Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học
người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực
vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế
bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng
phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa
bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi
trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.
Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực
vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự
biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong
các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các
tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh
ra nó - tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng
phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế
bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt
hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể
giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc [46].


15

Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng
sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được
kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra
đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích
nhân giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro?
Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại.
1.3.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống
vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa
sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống
vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích.
Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm
của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây
con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ, nên
có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn
thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng
đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy,
phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn
nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và
phức tạp, hệ số nhân thấp. Hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm
thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính
truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế
giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương
pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như:
- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo
thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong

16

6

12

phạm vi 3 đến 10 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào [5].
- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra
giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc
ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng
không hạn chế.
- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ
được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn
đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương
pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn
toàn sạch virus.
- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt
kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải mất 10
- 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống
mới rất khó khăn. Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có
thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm.
- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và
chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền
sản xuất liên tục.
- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội.
- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen. Bên cạnh những ưu điểm
trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số nhược điểm như:
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa
thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và
tái sinh thực vật.

- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện
đại và lao động có tay nghề.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến


17

dị soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc
biệt là khi nuôi cấy từ callus). Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực
vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh.
Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến
đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng
không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro
1.3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy
Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết,
vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất
nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác
nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử
nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà
tốn ít nhiên liệu ban đầu.
Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào
nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách
trên bề mặt của mô cấy.
Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng
loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite,
người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời
gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể
gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên
mẫu dễ bị nhiễm.

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ
đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy
có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy.


18

1.3.3.2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học
Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây
trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng
phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như
amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự
sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ,
pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì
trong giới hạn chấp nhận.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi
trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường
Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann… Trong đó
môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây
trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong
một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:
Các nguyên tố khoáng
Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai
nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.
Chất hữu cơ bổ sung
• Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và
cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa.
• Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái,
amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng
nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết.

Nguồn cacbon
Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc
tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các
loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được