Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện gò dầu, tỉnh tây ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN
CÓ LỢI TẠI MỘT SỐ VÙNG ĐẤT NÔNG NGHIỆP
HUYỆN GÒ DẦU, TỈNH TÂY NINH

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện

: Lê Thị Mỹ Hạnh

MSSV: 1051110011

Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên

cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm
Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về
lời cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày ....... tháng ....... năm 2014
Sinh viên

Lê Thị Mỹ Hạnh

ii


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường
Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ
sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những
kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.
Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt,
người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở
Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các
anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn
thành tốt đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên
con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng
như trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày ...... tháng ...... năm 2014
Sinh viên

Lê Thị Mỹ Hạnh

3


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa .................................................................................................................. i
Lời cam đoan .......................................................................................................... ii
Lời cảm ơn ............................................................................................................. iii
Mục lục .................................................................................................................. iv
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... vii
Danh sách các bảng ............................................................................................. viii
Danh sách các hình ................................................................................................ ix
Mở đầu ....................................................................................................................
1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................
1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................
2
3. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................
2
4. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................
2
Chương 1. Tổng quan ........................................................................................... 3
1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp ....
3

1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất ....................................................................
3
1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất .............................................................
3
1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất ...................................................
5
1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật .......................................
9
1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào ........................................................................
9
1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào.......................................................................... 9
1.2.3. Đặc điểm – tính chất.................................................................................... 10
4


Đồ án Một
tốt nghiệp
1.2.4.
số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật .....................................................
13
1.3. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay .................................... 23
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu........................................... 24
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...............................................................
24
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 24
2.1.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 24

5

2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 24
2.2.1. Nguồn mẫu phân lập ................................................................................... 24
2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị ........................................................................................... 24
2.2.3. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị....................................................................... 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 25
2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu .............................................................. 25
2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu ....................................................................... 26
2.3.3. Phương pháp tăng sinh ................................................................................ 27
2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ........................................ 27
2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật............................................................. 28
2.3.6. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn .... 30
2.3.7. Phương pháp xác định mật độ tế bào .......................................................... 31
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................... 31
2.4. Bố trí thí nghiệm........................................................................................... 31
2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn ................................ 32
2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các
chủng vi khuẩn phân lập........................................................................................ 33
2.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng
vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh ............................................................. 36
Chương 3. Kết quả và thảo luận ........................................................................ 38
3.1. Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu.................. 38
3.2. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ ........................................................ 40
3.2.1. Kết quả phân lập .......................................................................................... 40
3.2.2. Kết quả định danh sơ bộ.............................................................................. 41
3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................... 43
3.2.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase ................................................... 43
3.2.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase .................................................. 44
3.3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease ................................................... 46
3.3.4. Đánh giá khả năng sinh enzyme lipase ....................................................... 47

3.3.5. Đánh giá khả năng sinh enzyme catalase ................................................... 49
3.3.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme oxidase .................................................... 49
3.4. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập
đối với vi khuẩn gây bệnh.................................................................................. 51
3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập
đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp................................................................... 52
3.4.2. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập
đối với nhóm vi khuẩn E. Coli .............................................................................. 53
3.4.3. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập
đối với nhóm vi khuẩn Shigella ............................................................................ 55
3.4.4. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập
đối với nhóm vi khuẩn Vibrio ............................................................................... 57
3.4.5. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập
đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus ........ 59
3.5. Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và
đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập ................... 63
Chương 4. Kết luận và đề nghị .......................................................................... 68
4.1. Kết luận ......................................................................................................... 68
4.2. Đề nghị ........................................................................................................... 68
Tài liệu tham khảo............................................................................................... 69


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CMC: carboxymethyl cellulose
HEC: hydroxyethyl cellulose
EG: endoglucanase
CBH: exoglucanase
CBD: cellulose binding domain
Ser: Serine

His: Histidine
Asp: Acid aspartic
TSB: Trypton Soya Broth
TSA: Trypticase Soya Agar

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập ....................................................................... 24
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập .......................... 40
Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ của các chủng vi khuẩn phân lập ................. 41
Bảng 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập ..... 43
Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập .... 45
Bảng 3.5. Khả năng phân huỷ gelatin và casein của các chủng vi khuẩn
phân lập.................................................................................................................. 46
Bảng 3.6. Khả năng sinh enzyme lipase của các chủng vi khuẩn phân lập ......... 48
Bảng 3.7. Khả năng sinh enzyme catalase của các chủng vi khuẩn phân lập ...... 49
Bảng 3.8. Khả năng sinh enzyme oxidase của các chủng vi khuẩn phân lập ...... 50
Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập
đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp................................................................... 52
Bảng 3.10. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập
đối với nhóm vi khuẩn E. Coli ............................................................................. 54
Bảng 3.11. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập
đối với nhóm vi khuẩn Shigella ............................................................................ 56
Bảng 3.12. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập
đối với nhóm vi khuẩn Vibrio .............................................................................. 58
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng
vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua,

E. feacalis, S. aureus ............................................................................................. 60
Bảng 3.14. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào
của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................................... 64
Bảng 3.15.A. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn
gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................... 65
Bảng 3.15.B. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn
gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập ........................................................... 66

8


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật ...................... 3
Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn............................................................. 6
Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn............................................................................ 7
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase .............................. 14
Hình 1.5. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein ........... 15
Hình 1.6. Cấu trúc không gian của enzyme protease ........................................... 17
Hình 1.7. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase........................................... 19
Hình 1.8. Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa................ 21
Hình 1.9. Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan
trong nước .............................................................................................................. 22
Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu ................................................................. 26
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.......................................................................... 31
Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp ............... 32
Hình 2.4. Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường
Starch Agar ............................................................................................................ 34
Hình 2.5. Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường
Skim Milk Agar ..................................................................................................... 34

Hình 2.6. Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường
Tween Peptone Agar ............................................................................................. 35
Hình 2.7. Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC Agar ... 35
Hình 2.8. Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase .................. 36
Hình 3.1. Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 39
Hình 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn phân lập ....................... 42
Hình 3.3. Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102,
ĐTT112 trên môi trường Starch Agar .................................................................. 44
Hình 3.4. Vòng phân giải cellulose của các chủng ĐMT701, ĐRD801,
ĐTQ901 và ĐTT111 trên môi trường CMC Agar ............................................... 46

9


Hình 3.5. Kết quả dương tính của cáic chủng vi khuẩn phân lập so với
mẫu đối chứng trong thử nghiệm gelatinase ......................................................... 47
Hình 3.6. Kết qảu kiểm tra khả năng sinh enzyme lipase của các chủng
ĐTL201, ĐTL301, ĐTL502 và ĐTB601 trên môi trường
Tween Peptone Agar ............................................................................................. 48
Hình 3.7. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL501, ĐRD801
và ĐTT111 đối với vi khuẩn S. dublin.................................................................. 53
Hình 3.8. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL401
và ĐTL501 đối với nhóm vi khuẩn E. Coli .......................................................... 55
Hình 3.9. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL501,
ĐRD801 đối với vi khuẩn Shi. sonnei .................................................................. 57
Hình 3.10. Vòng kháng khuẩn của sinh khối chủng ĐTT112 đối với
các vi khuẩn chỉ thị nhóm Vibrio .......................................................................... 59
Hình 3.11. Vòng kháng khuẩn của các chủng ĐTL501, ĐTT112, ĐRD801
đối với các vi khuẩn chỉ thị L. monocytogenes, L. innocua ................................. 61

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong giai đoạn hiện nay, nước ta đang trên đà phát triển theo hướng công
nghiệp hóa - hiện đại hóa nhưng nông nghiệp vẫn đóng vai trò quan trọng, trong đó
ngành trồng trọt vẫn là nền tảng với diện tích đất canh tác chiếm 17% tổng diện tích
đất. Theo báo cáo Tổng điều tra đất đai năm 2010, tổng diện tích nhóm đất nông
nghiệp của nước ta năm 2010 là 26.100.160 ha, tăng 5.179.385 ha (gấp 1,25 lần) so
với năm 2000. Trong canh tác nông nghiệp, ngoài trồng lúa nước, người dân còn sử
dụng để trồng trọt các loại hoa màu để tăng thêm thu nhập. Do đó, để có được mùa
vụ trồng trọt tốt thì chất lượng đất đóng vai trò quyết định, trong đó có sự đóng góp
quan trọng của các vi sinh vật.
Đất là nơi diễn ra hàng loạt các quá trình chuyển hoá vật chất, trao đổi dinh
dưỡng và năng lượng để hình thành và phát triển độ phì nhiêu của đất mà trong đó
vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng. Ngoài chức năng tham gia vào các quá trình
chuyển hoá vật chất, vi sinh vật đất sau chu kỳ sống còn để lại cho đất sinh khối rất
lớn tạo nên độ phì nhiêu của đất. Vì thế vi sinh vật đất là một trong các chỉ tiêu
quan trọng trong việc đánh giá độ phì nhiêu và chất lượng của đất. Với sự hiện diện
thường xuyên của các vi sinh vật có lợi trong đất ngoài việc giúp cho đất tăng độ
phì nhiêu, giúp người dân hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học thì đây cũng
chính là nguồn cung cấp các nhóm vi sinh vật có lợi như có khả năng sinh enzyme
ngoại bào cũng như có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Do đó, việc xác
định sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất, nhất là trong các vùng đất
nông nghiệp như đất trồng lúa, đất trồng hoa mùa sẽ phục vụ cho mục tiêu này.
Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện
đề tài "Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông
nghiệp huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí
nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công
nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

1


2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi - sản sinh enzyme ngoại bào
và đặc tính đối kháng, trong đất nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn hiện diện trong một số vùng
đất trồng lúa và đất trồng hoa màu.
- Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập.
- Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối
với một số chủng vi khuẩn gây bệnh.
4. Phạm vi nghiên cứu
Chỉ khảo sát vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng,
ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp
1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất
Hầu hết vi sinh vật là sinh vật dị dưỡng, chỉ một số ít vi sinh vật là vi sinh
vật tự dưỡng. Quan hệ sinh thái được biểu diễn bằng sơ đồ Hình 1.1.
Ánh sáng
Chất vô cơ

SV sản xuất

Chất hữu cơ

SV tiêu thụ

Chất hữu cơ

SV phân huỷ

Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật
Vai trò của vi sinh vật là khép kín vòng tuần hoàn trong hệ sinh thái, tái tạo
thức ăn cho động vật, thực vật bằng cách phân huỷ để lấy lại chất dinh dưỡng cung
cấp cho nhiều cơ thể dạng sống. Nó đem lại hai hiệu quả:
- Tăng độ phì của đất.
- Giải quyết nạn ứ đọng chất thải trong đất.
Như vậy, vi sinh vật khép kín vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, P, S, K...
thông qua các quá trình phân huỷ các nguyên tố này trong đất.
1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất
Trong hệ vi sinh vật đất, vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn
chiếm khoảng 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo và nguyên sinh động vật. Tỉ lệ này
thay đổi tuỳ theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý, tầng đất, thời vụ,
chế độ canh tác... Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt
độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành
phần. Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu,
màu mỡ.

3


Sự phân bố của vi sinh vật trong đất có thể chia ra như sau:
• Phân bố theo chiều sâu
Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác. Đó là nơi

tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích
hợp nhất. Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi
sinh vật.
Riêng đối với các đất bạc màu, do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20 cm ít chất
hữu cơ hơn tầng 20 - 40 cm nên ở tầng này số lượng vi sinh vật nhiều hơn ở tầng
trên, sau đó giảm dần ở các tầng dưới.
Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn hiếu khí, vi
nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này có nhiều oxy. Càng xuống
sâu, các nhóm vi sinh vật hiếu khí càng giảm mạnh. Ngược lại, các nhóm vi khuẩn
kỵ khí như vi khuẩn phản nitrate hoá phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40 cm. Ở vùng
khí hậu nhiêt đới nóng ẩm thường có quá trình rửa trôi, xói mòn nên tầng 0 - 20 cm
dễ biến động, tầng 20 - 40 cm ổn định hơn.
• Phân bố theo các loại đất
Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH
khác nhau dẫn đến sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau. Ở đất lúa nước, tình
trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất dinh
dưỡng,... Chỉ có một lớp mỏng ở trên khoảng 0 - 3 cm là có quá trình oxy hoá, ở
tầng đất dưới quá trình khử oxy hoá chiếm ưu thế. Do đó trong đất lúa nước các loại
vi sinh vật kỵ khí phát triển mạnh. Ví dụ như vi khuẩn amon hoá, vi khuẩn phản
nitrate hoá. Ngược lại, các loại vi sinh vật hiếu khí như vi khuẩn nitrate hoá, vi
khuẩn cố định nitrogen, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít. Tỷ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí
và yếm khí luôn nhỏ hơn 1.
Ở đất trồng hoa màu, không khí lưu thông tốt, quá trình oxy hoá chiếm ưu
thế, bởi vậy các loài vi sinh vật hiếu khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát
triển yếu. Tỷ lệ gữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường
hợp


đạt tới 4 – 5. Ở đất giàu dinh dưỡng như đất phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật
tổng số rất cao. Ngược lại, vùng đất bạc màu Hà Bắc có số lượng vi sinh vật rất ít.

• Phân bố theo cây trồng
Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển
mạnh hơn so với vùng không có rễ do rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ
khi nó chết đi. Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu
cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ
được độ ẩm. Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát
triển mạnh hơn vùng ngoài rễ.
Tuy nhiên, mỗi loại cây trồng trong quá trình sống của nó thường tiết qua bộ
rễ những chất khác nhau. Bộ rễ khi chết đi cũng có thành phần khác nhau. Thành
phần và số lượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng
vi khuẩn cố định nitrogen cộng sinh còn ở vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố
định nitrogen tự do hoặc hội sinh... Số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay
đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng. Đất vùng phù sa sông Hồng, số
lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúa chồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là
cây lúa sinh trưởng mạnh. Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ
rễ càng lớn – đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ. Số lượng vi sinh vật
đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín. Thành phần vi sinh vật cũng biến động theo các giai
đoạn phát triển của cây, phù hợp với hàm lượng các chất tiết qua bộ rễ.
1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất
Theo nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố, hệ vi sinh vật trong đất
rất phong phú với rất nhiều nhóm gồm: vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn, virus, tảo và
nguyên sinh động vật (protozoa) (Lê Quốc Tuấn, 2009).
1.1.3.1. Vi khuẩn
Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước hiển vi, có cấu trúc tế
bào đơn giản gồm màng tế bào, tế bào chất và nhân (không có màng nhân)
(prokaryote). Kích thước của vi khuẩn từ 0,1- 1,2 x 0,2- 6,0 µm. Peptidoglycan là
chất đặc biệt ở vách tế bào prokaryote, dựa vào khả năng bắt màu của crystal violet


vi khuẩn được phân biệt hai loại là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Một

số vi khuẩn di chuyển bằng tiên mao. Vi khuẩn sinh sản bằng con đường vô tính.
Hình thái vi khuẩn rất đa dạng, có thể chia thành 3 nhóm hình dạng chính: hình cầu,
hình que và hình xoắn (Hình 1.1).

a)

b)

c)

Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998)

Staphylococcus aureus (a); Bacillus subtilis (b); Spirillum (c).
Các nhóm vi khuẩn rất đa dạng và giữ những vai trò quan trọng trong quá
trình chuyển hoá vật chất để khép kín vòng tuần hoàn các chất trong đất và trong tự
nhiên. Vi khuẩn tham gia hình thành và cải tạo đất trồng trọt, phân huỷ, chuyển hoá
hợp chất khó tan trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây
trồng. Một số vi khuẩn có khả năng đồng hoá nitơ trong không khí để làm giàu nitơ
cho đất và cung cấp nitơ cho cây trồng. Ngoài ra, vi khuẩn còn có khả năng tiết ra
các enzyme, các chất kích thích sinh trưởng, các acid hữu cơ trong đất ...
Một số vi khuẩn quan trọng thường gặp trong đất: Bacillus subtilis,
Chostridium, Lactobacillus, Rhizobium,...
1.1.3.2. Vi nấm
Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi. Vi nấm khác với vi khuẩn và xạ
khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, vì vậy chúng được xếp vào nhóm
Eukaryote. Vi nấm gồm 2 nhóm lớn là nấm men (yeast) và nấm sợi (filamentous
fungi). Trong đó, nấm men có cấu trúc đơn bào còn nấm sợi có cấu trúc đa bào.
Nấm men (yeast) có khả năng sinh sản bằng vô tính theo hình thức nẩy chồi,
một vài loài sinh bào tử và cũng có thể sinh sản hữu tính như chi Saccharomyces.
Nấm sợi có quá trình sinh sản phức tạp hơn nấm men. Sinh sản vô tính có nhiều

cách: bào tử trần, bào tử kín. Sinh sản hữu tính của nấm sợi cũng có vài hình thức
khác nhau.
Thường gặp là các chi Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Chaetomium,
Alternaria, Rhizoctonia, Verticillium,... Có vai trò quan trọng trong quá trình mùn
hoá và phân giải xác hữu cơ cho đất (phân giải cellulose, tinh bột, nhựa, lignin,...).
1.1.3.3. Xạ khuẩn
Xạ khuẩn là những vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm prokaryote, hình sợi,
phân bố rộng rãi trong đất, trong nước và trong các cơ chất hữu cơ. Kích thước của
xạ khuẩn nằm trong khoảng 0,2 – 0,5 x 0,4 – 100 µm.

Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998)
Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì
nhiêu của đất. Tham gia vào các quá trình chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất


hữu cơ phức tạp (cellulose, mùn, kitin, lignin,...). Hầu hết các xạ khuẩn thuộc giống
Actinomyces có khả năng hình thành chất kháng sinh. Đây là đặc điểm quan trọng
nhất của xạ khuẩn.
Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ
như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic,
acid acetic và nhiều acid amin như acid glutamic, tryptophan,...
Một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme như: protease,
amylase, chitinase, cellulase... Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số
xạ khuẩn lại sinh ra các chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật. Một số khác
lại là nguyên nhân gây ra một số bệnh khó chữa ở người và gia súc. Các bệnh này
gọi chung là Actynomycose.
Một số giống xạ khuẩn quan trọng trong đất: Actinomyces, Bacterionema,
Pseudonocardia, Streptomyces...

1.1.3.4. Tảo
Tảo là sinh vật tự dưỡng không bắt buộc (nhờ quá trình quang hợp), phát
triển mạnh ở lớp đất mặt. Tảo có tác dụng làm tăng khả năng hoà tan của khoáng
vật đặc biệt là carbonate, làm tăng tốc độ phong hoá, cung cấp một lượng lớn chất
hữu cơ cho đất. Một số tảo lục, lam có khả năng cố định nitơ tự do. Bên cạnh đó tảo
còn giúp hạn chế xói mòn đất do gió.
1.1.3.5. Nguyên
(protozoa)

sinh

động

vật

Nguyên sinh động vật có kích thước hiển vi, cấu tạo và hoạt động của tế bào
nguyên sinh động vật giống tế bào của sinh vật đa bào. Nhưng chính tế bào này là tế
bào biệt hoá đa năng, đảm nhận mọi chức năng sống của một cơ thể độc lập.
Nguyên sinh động vật có vai trò quan trọng ở mức sản xuất sơ cấp và phân
huỷ, chúng có thể làm nguồn thức ăn chủ yếu cho nhiều loài không xương sống và
gián tiếp cho nhiều loài động vật có xương sống.
Một số nguyên sinh động vật thường gặp là: trùng chân giả (Amoeba), trùng
roi (Flagellata), ...


1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật
1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào
Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng
hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp
chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Các quá trình dị hóa bên ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho
quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn. Vì các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng
cho vi sinh vật là các hợp chất cao phân tử nên vi sinh vật không thể vận chuyển
qua màng tế bào, cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng thuỷ phân các hợp
chất cao phân tử này thành các hợp chất có trọng lượng thấp hơn để vi sinh vật có
thể vận chuyển qua màng tế bào. Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản
ứng bên ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật.
1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào
Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các
enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm
phụ:
- Nhóm 1: Oxidoreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy
hóa khử.
- Nhóm 2: Transferase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
- Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự
phân giải có mặt của H2O tham gia).
- Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo
thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi
hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi.
- Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.
- Nhóm 6: Ligase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử
kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside
triphosphate khác.


Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme
thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase.
Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O
Tinh bột + H2O

α-amylase

R1OH + R2H

Dextrin + Maltose + Glucose

Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme:
amylase, cellulase, protease và lipase…
1.2.3. Đặc điểm – tính chất
Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một
enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa:
- Về bản chất, enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của một
protein, có trọng lượng phân tử từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do có
trọng lượng phân tử lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào.
- Vì có bản chất là protein nên enzyme cũng có tính lưỡng tính (do có nhóm
-COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị
phân ly như sau:
Kiềm
Protein - COO- + H+

Protein - COOH
Acid
Acid

Protein - NH+ + H+

Protein - NH2
Kiềm

- Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng

tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác.
- Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao.
Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có
nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110 0C như: α-amylase từ vi
khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis có thể chịu
được nhiệt độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt


còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và
pH kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi
khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid 2,1…
- Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ
trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme. Trong trung
tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme
lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và
hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc
tác như α-amylase có chứa ion Ca2+.
- Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo quy luật cảm
ứng cơ chất. Khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng
hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không có
cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này
gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc
đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi
là cơ chất cảm ứng. Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp
enzyme cảm ứng cũng tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một
mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp
suất thẩm thấu cơ chất gây ra.
- Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai
đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất
hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng

được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất
khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng
trước là cơ chất cho phản ứng sau.
- Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các
phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng
lượng rất lớn. Ví dụ: Trong quá trình thủy phân saccharose thành fructose và
glucose:


+ Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân tử gam.
+ Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam.
Phương trình phản ứng: Saccharose

Acid

Fructose + Glucose

+ Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân
tử gam.
Phương trình phản ứng: Saccharose

Saccharase

Fructose + Glucose

- Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết
định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một
số phản ứng sinh hóa.
- Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng. Chỉ
làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có

enzyme.
- Enzyme vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế
bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, môi trường lên men rẻ
tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ
dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất
phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành
các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm
enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động vật hay
thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ như từ malt
có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu
đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ vi sinh vật thì ngược lại;
từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì số lượng enzyme vi sinh vật
rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong
thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính
rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh


vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực
vật. Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất.
1.2.4. Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật
Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng. Sau
đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng
rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp.
1.2.4.1. Enzyme amylase
a) Đặc điểm
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong
nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
RR’ + H-OH → RH + R’OH
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen.

b) Phân loại
Hiện nay, có sáu loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase
(amylase nội bào) và Exoamylase (amylase ngoại bào).
- Endoamylase: gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm enzyme khử
nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là
pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là oligo-1,6glucosidase hay còn gọi là dextrinase tới hạn (EC 3.2.1.10) và amylo-1,6glucosidase (EC 3.2.1.20). Các enzyme này thuỷ phân các liên kết bên trong của
chuỗi polysaccharide.
- Exoamylase: gồm có β-Amylase (EC 3.2.1.2) và Amyloglucosidase
(glucoamylase hay ��-Amylase) (EC 3.2.1.3). Đây là những enzyme thuỷ phân tinh
bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
c) Cấu trúc
Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần,
trung tâm hoạt động thường là những nhóm chức như: -NH2, -COOH, -SH ...


α-Amylase (EC 3.2.1.1)

β-Amylase (EC 3.2.1.2)

oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10)

Amyloglucosidase (EC 3.2.1.3)

amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.20)
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase

d) Cơ chế tác dụng
Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thuỷ phân do các liên kết
glucoside bị phân cắt. Sự thuỷ phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức