Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm aspergillus niger và mucor sp của vi khuẩn lactobacillus sp l5

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì nghiên
cứu nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Tp.Hồ Chí Minh, 8/2015
Sinh viên thực hiện

Phan Nguyễn Hương Thảo


Đồ án tốt
nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ và gia đình đã luôn bên
cạnh, cổ vũ, động viên, quan tâm, chia sẻ, giúp em có thêm nghị lực mỗi khi gặp
khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực hiện đồ án.
Em xin cảm ơn các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi
trường trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM đã quan tâm chỉ bảo, giảng dạy và
cung cấp những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương đã tận tình giúp
đỡ, hướng dẫn và quan tâm theo dõi em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực
hiện đồ án tốt nghiệp.
Em cũng xin cảm ơn quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh
học, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại học Công
Nghệ Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em thực hiện và hoàn thành đồ án
tốt nghiệp của mình.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cộng sự và tất cả các bạn làm

việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện đồ án tốt nghiệp của mình.
Tp. Hồ Chí Minh, 8/2015
Sinh viên thực hiện


Đồ án tốt
nghiệp

Danh mục bảng....................................................................................................... iv
Danh

mục

hình

.........................................................................................................v

MỞ

ĐẦU

...................................................................................................................1
Chương
1:
TỔNG
........................................................................................5

QUAN

1.1.
Tổng
quan
về
................................................................................................5

nấm

1.1.1.
Giới
thiệu
................................................................................................5

chung

1.1.2.
Độc
tố
do
nấm
.........................................................................................5

tiết

ra

1.1.3. Tác hại của nấm ................................................................................................6
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật..............................................6
1.1.3.2.
Tác

hại
của
nấm
..............................................................7

gây

ra

cho

thực

vật

1.1.4. Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm.......................................................7
1.2.
Tổng
quan
về
vi
...............................................................................8
1.2.1.
Giới
thiệu
vi
..................................................................................8
1.2.1.1.
Giới
thiệu

.............................................................................................8

khuẩn
khuẩn

lactic
lactic
chung

1.2.1.2. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus ......................................................10
1.2.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic......................................................12
1.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men - quá trình sinh trưởng và phát
triển của vi khuẩn lactic ............................................................................................14
1.2.2. Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic................................16
1.2.3. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic.............................................18
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................27
i


Đồ án tốt
nghiệp
2.1.
Địa
điểm
nghiên
..........................................................................................27

cứu

2.2.

Thời
gian
thực
............................................................................................27

hiện

2.3.
Vật
liệu
nghiên
............................................................................................27

cứu

2.3.1.
Giống
vi
sinh
.............................................................................................27

vật

i


Đồ án tốt
nghiệp

2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng .....................................................................27

2.3.2.1. Hoá chất .......................................................................................................27
2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy.....................................................................................27
2.4. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................28
2.4.1. Thiết bị ............................................................................................................28
2.4.2. Dụng cụ ...........................................................................................................28
2.5. Phương pháp luận ..............................................................................................28
2.6. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................29
2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................29
2.6.2. Thí nghiệm khảo sát lại đặc điểm nuôi cấy, hình thái và khả năng lên men
lactic của chủng vi khuẩn lactic. ...............................................................................31
2.6.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 đối
với nấm Aspergillus niger và Mucor sp. ...................................................................33
2.6.4. Khảo sát khả năng đối kháng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn
Lactobacillus sp.L5 đối với nấm Aspergillus niger và Mucor sp. ............................35
2.6.5. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá. .............37
2.6.5.1. Nhuộm Gram................................................................................................37
2.6.5.2. Nhuộm bào tử...............................................................................................37
2.6.5.3. Thử nghiệm khả năng lên men đường .........................................................37
2.6.5.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic .........................................................38
2.6.5.5. Xác định hàm lượng acid tổng .....................................................................38
2.6.5.6. Thử nghiệm protease ....................................................................................39
2.6.5.7. Thử nghiệm chitinase ...................................................................................40
2.6.6. Ứng dụng của vi khuẩn lactic kháng nấm trên đậu phộng..............................40
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................42
3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý – sinh hoá và sự thuần khiết của chủng vi
khuẩn lactic
...............................................................................................................42
3.1.1. Nhuộm Gram...................................................................................................42
ii

Đồ án tốt
nghiệp

3.1.2. Nhuộm bào tử..................................................................................................44
3.1.3. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí ..........................45
3.1.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic.............................................................47
3.1.5. Xác định hàm lượng acid tổng ........................................................................47
3.1.6. Thử nghiệm protease. ......................................................................................49
3.1.7. Thử nghiệm chitinase ......................................................................................49
3.2. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic.................................51
3.2.1. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp.L5 đối với
nấm Aspergillus niger. ..............................................................................................52
3.2.2. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp.L5 đối với
nấm Mucor sp............................................................................................................55
3.2.3. Khảo sát khả năng đối kháng sản phẩm trao đổi chất của chủng Lactobacillus
sp.L5 đối với nấm Aspergillus niger. ........................................................................58
3.2.3.1. Không trung hoà...........................................................................................59
3.2.3.2. Trung hoà pH = 6 .........................................................................................61
3.2.4. Khảo sát khả năng đối kháng sản phẩm trao đổi chất của chủng Lactobacillus
sp.L5 đối với nấm Mucor ..........................................................................................63
3.2.4.1. Không trung hoà...........................................................................................64
3.2.4.2. Trung hoà pH = 6 .........................................................................................66
3.2.5. Thử nghiệm protease và chitinase của dịch trong sau ly tâm chủng
Lactobacillus sp.L5 khi không xử lý nhiệt và khi xử lý nhiệt ..................................68
3.2.5.1. Thử nghiệm protease ....................................................................................68
3.2.5.2. Thử nghiệm chitinase ...................................................................................70
3.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic kháng nấm trên đậu phộng ................................71
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................76
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................78

3


Đồ án tốt
nghiệp

Danh mục bảng
Bảng 1.1. Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986) ............12
Bảng 1.2. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998) .......................................................................................19
Bảng 1.3. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm
mốc và nấm men .......................................................................................................21
Bảng 1.4. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh.
(Holzapfel và cộng sự, 1995) ....................................................................................22
Bảng 3.1. % acid lactic của 2 chủng khuẩn nuôi cấy trong 24 giờ ...........................48
Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ của hai chủng vi khuẩn lactic ...........................50
Bảng 3.3.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5......53
Bảng 3.4.Tỉ lệ ức chế nấm Mucor của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5.......................56
Bảng 3.5.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger của canh trường nuôi cấy với dịch
trong sau ly tâm không trung hoà của chủng Lactobacillus sp.L5 khi không xử lý
nhiệt và khi xử lý nhiệt ở ngày 1...............................................................................60
Bảng 3.6.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger của canh trường nuôi cấy với dịch
trong sau ly tâm trung hoà của chủng Lactobacillus sp.L5 khi không xử lý nhiệt và
khi xử lý nhiệt ở ngày 1. ...........................................................................................62
Bảng 3.7.Tỉ lệ ức chế nấm Mucor của canh trường nuôi cấy với dịch trong sau ly
tâm không trung hoà của chủng Lactobacillus sp.L5 khi không xử lý nhiệt và khi xử
lý nhiệt ở ngày 1.
.......................................................................................................65
Bảng 3.8.Tỉ lệ ức chế nấm Mucor của canh trường nuôi cấy với dịch trong sau ly

tâm trung hoà của chủng Lactobacillus sp.L5 khi không xử lý nhiệt và khi xử lý
nhiệt ở ngày 1. ...........................................................................................................67
Bảng 3.9.Khả năng kháng nấm của canh trường nuôi cấy ứng dụng trên đậu phộng.
...................................................................................................................................71
Bảng 3.10.Khả năng kháng nấm của huyền phù tế bào LAB ứng dụng trên đậu
phộng. ........................................................................................................................7
3
4


Đồ án tốt
nghiệp

Danh mục hình
Hình 1.1. Hình dạng tế bào Lactobacillus ................................................................10
Hình 1.2. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng kháng nấm của vi khuẩn nói chung
và vi khuẩn lactic nói riêng ............................................................... ........................26
Hình 2.1.Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khảo sát khả năng kháng nấm của chủng
Lactobacillus sp. L5 ............................................................................................... ...30
Hình 2.2. Sơ đồ khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng ...31
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic ...............33
Hình 2.4.Sơ đồ khảo sát kháng nấm của sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn
lactic ..........................................................................................................................35
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic...........................................................42
Hình 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn ..........................................43
Hình 3.3. Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn ........................................44
Hình 3.4. Khả năng lên men đường của vi khuẩn lactic ...........................................46
Hình 3.5. Khả năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn....................................47
Hình 3.6. Đồ thị biểu hiện % acid lactic của 2 chủng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy....48
Hình 3.7. Thử nghiệm protease. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 cho kết quả

dương tính với đường kính D-d = 2,65 cm. ..............................................................49
Hình 3.8.Thử nghiệm chitinase. Chủng Lactobacillus sp. L5 cho kết quả dương tính
với đường kính D-d = 3,15 cm. .................................................................................50
Hình 3.9.Khả năng ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus sp. L5 ở
ngày 3.
............................................................................................... ........................52
Hình 3.10.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus sp. L5 theo
từng độ pha loãng.
.....................................................................................................54
Hình 3.11.Khả năng ức chế nấm Mucor của chủng Lactobacillus sp. L5 ở ngày 3 .55
Hình 3.12. Tỉ lệ ức chế nấm Mucor của chủng Lactobacillus sp.L5 theo từng độ pha
loãng ..........................................................................................................................57
Hình 3.13.Khả năng ức chế nấm Aspergillus niger của dịch trong sau ly tâm chủng
Lactobacillus sp. L5 khi không trung hoà ở ngày 1 (pH = 4,0). ...............................59
5


Đồ án tốt
nghiệp

Hình 3.14.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger giữa canh trường nuôi cấy và dịch
trong sau ly tâm không trung hoà của chủng Lactobacillus sp. L5 ở ngày 1. ..........60
Hình 3.15.Khả năng ức chế nấm Aspergillus niger của dịch trong sau ly tâm chủng
Lactobacillus sp.L5 khi trung hoà ở ngày 1 (pH = 6,0). ...........................................61
Hình 3.16. So sánh tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger giữa canh trường nuôi cấy và
dịch trong sau ly tâm của chủng Lactobacillus sp. L5 ở ngày 1. ..............................62
Hình 3.17.Khả năng ức chế nấm Mucor của dịch trong sau ly tâm chủng
Lactobacillus sp.L5 khi không trung hoà ở ngày 1 (pH = 4,0). ................................64
Hình 3.18.Tỉ lệ ức chế nấm Mucor giữa canh trường nuôi cấy và dịch trong sau ly
tâm không trung hoà của chủng Lactobacillus sp. L5 ở ngày 1. ..............................65

Hình 3.19.Khả năng ức chế nấm Mucor của dịch trong sau ly tâm chủng
Lactobacillus sp. L5 khi trung hoà pH = 6 ở ngày 1.................................................66
Hình 3.20. So sánh tỉ lệ ức chế nấm Mucor giữa canh trường nuôi cấy và dịch trong
sau ly tâm của chủng Lactobacillus sp.L5 ở ngày 1. ................................................67
Hình 3.21.Thử nghiệm protease của canh trường nuôi cấy và dịch trong sau ly tâm
chủng Lactobacillus sp. L5 .......................................................................................69
Hình 3.22.Thử nghiệm chitinase của canh trường nuôi cấy và dịch trong sau ly tâm
chủng Lactobacillus sp. L5. ......................................................................................70
Hình 3.23.Khả năng đối kháng nấm của canh trường vi khuẩn lactic trên đậu phộng
sau khi ủ 13 ngày.......................................................................................................73
Hình 3.24.Khả năng đối kháng nấm của huyền phù tế bào vi khuẩn lactic trên đậu
phộng sau khi ủ 13 ngày............................................................................................75

6


Đồ án tốt
nghiệp

1


Đồ án tốt
nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, cùng với nhiều lĩnh vực khoa học phục vụ lợi ích của con người,
cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật đã đưa con người bước vào nền văn minh hiện

đại. Cùng với sự phát triển đó, con người ngày càng quan tâm đến sức khoẻ của
mình hơn. Do đó, vấn đề an toàn thực phẩm lại trở nên cần thiết và khá quan trọng.
Vệ sinh an toàn thực phẩm trong cả nước nói chung và của thực phẩm nói riêng
đang là vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo vệ sức khoẻ con người.
Theo thống kê hàng năm số ca ngộ độc thực phẩm đã tăng lên đáng kể trong
bối cảnh xã hội đang phát triển, gây hoang mang cho người tiêu dùng. Trong đó ngộ
độc do vi sinh vật chủ yếu là nấm mốc chiếm phần lớn, bắt nguồn nhiễm từ nông
sản, các sản phẩm thực phẩm,... Cuộc sống tất bật ngày nay đã vô tình đưa con
người chúng ta vào vòng quay của các sản phẩm đông lạnh, thức ăn nhanh mà hầu
hết chúng đều được bảo quản bằng các chất hoá học. Hàng trăm loại hoá chất khác
nhau được sử dụng cho mục đích bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, có những loại
hoá chất đã bị nghiêm cấm sử dụng vì tính độc hại của nó, nhưng chúng vẫn được
sử dụng trái phép và gây hậu quả nghiêm trọng tới sức khoẻ con người.
Trước thực trạng đó, con người đã và luôn tìm kiếm ra những sản phẩm vừa
chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ, vừa có thể là dược phẩm để trị liệu một số bệnh của
thời đại. Trên quan điểm về an toàn sinh học thì probiotics là sản phẩm đáp ứng
được các yêu cầu đó. Probiotic là các vi sinh vật sống có tác dụng tốt cho sức khỏe
của con người do cân bằng hệ sinh vật đường ruột. Vi khuẩn dạng probiotic có hoạt
tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêu diệt vi sinh vật có hại và là nguồn vi
sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn đường ruột. Những nghiên cứu cho
thấy rằng khi bổ sung probiotic vào thực phẩm sẽ có tác dụng tốt cho sức khỏe như
giảm cholesterol trong máu, cải thiện hệ vi sinh vật hoạt động đường ruột, tăng hệ
thống miễn dịch và giảm nguy cơ ung thư ruột kết, loại bỏ táo bón tiêu chảy.

2


Từ những lợi ích của probiotics, hướng giải quyết để đảm bảo an toàn sức
khoẻ cho người tiêu dùng là sử dụng các lợi khuẩn từ vi khuẩn lactic để ức chế khả
năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm. Do đó, người thực hiện đề tài xin

trình bày đề tài về “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus
niger và Mucor sp. của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5”.
2.Tình hình nghiên cứu
Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm
trong nông nghiệp cả trong nước và trên thế giới.
Ở trong nước có các công trình nghiên cứu như sản xuất chế phẩm Sadi Bio 1
(là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện công nghệ Môi trường Việt
Nam. Chế phẩm Sadi Bio 1 được sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc
nhóm xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 15 -370C) sinh
tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào (xenlulaza, amylaza và proteinaza) có khả
năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm. Ngoài ra, sản phẩm còn
chứa vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng ức chế mạnh các vi khuẩn gây bệnh
(Coliform, Salmonella). Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 có tác dụng xử lý mùi
chuồng trại chăn nuôi và bãi chôn lấp chất thải.
Ngoài nước có các công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn
lactic cách ly từ Kim chi chống Aspergillus fumigatus của Jeong-Dong Kim của
viện công nghệ sinh học công nghiệp thuộc đại học Inha, Inhcheon 402-75, Hàn
Quốc.
Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi
khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới.
3. Mục đích nghiên cứu
Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus niger và Mucor
sp. của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5. Mục đích cuối cùng là sản xuất chế phẩm vi


sinh vật LAB hay sản phẩm trao đổi chất của chúng để ức chế nấm mốc trên thực
phẩm.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Khảo sát lại đặc điểm nuôi cấy, hình thái và khả năng lên men lactic của
chủng vi khuẩn lactic, chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men lactic

mạnh.


Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5
đối với nấm Aspergillus niger và Mucor sp.



Khảo sát khả năng đối kháng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn
Lactobacillus sp.L5 đối với nấm Aspergillus niger và Mucor sp.



Khảo sát ứng dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản đậu phộng.

5.Phương pháp nghiên cứu
a) Phương pháp luận
Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua nên bản thân chủng vi
khuẩn đã có tính an toàn thực phẩm. Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi
khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng thực phẩm, người thực hiện đề tài tiếp tục
nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm. Từ đó đưa
ra phương án ứng dụng của chủng vi khuẩn lactic để ức chế nấm mốc trên thực
phẩm.
b) Phương pháp xử lí số liệu
 Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị
 Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lí số liệu
6.Kết quả đạt được của đề tài
Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng nấm tốt từ bộ sưu
tập vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua.

Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của canh trường vi khuẩn
lactic.
Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của sản phẩm trao đổi chất vi
khuẩn lactic.
Đánh giá khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic khi ứng dụng trên đậu
phộng.
7. Kết cấu đồ án
 Mở đầu
 Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.
 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
 Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả
mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biến chứng cho kết quả
thu
được.
 Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.


Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm
1.1.1. Giới thiệu chung
Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng
có thành tế bào bằng kitin (chitin). Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi
đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh
sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô
tính hay hữu tính.
Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả

thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần
chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể
động vật, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái,
chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển
hóa và trao đổi vật chất.
1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra
Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối
lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc
đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người.
Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên
chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên
quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium,
Fusarium, Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm:
- Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),
ochratoxin A, stermatocystin, axit cyclopianxoic.
-

Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A
và axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.


- Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2
toxin.
- Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether
alternarion.
-

Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Các độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm

do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticussản sinh, thường gây ô nhiễm trên một
số hạt (như lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu mức độ ô
nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và
về dài lâu sẽ gây ung thư.
Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium
và Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm
Fusarium tiết, độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết.
1.1.3. Tác hại của nấm
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật
 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm
Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có
thể là nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium,Epicoccum, Penicillium,Fusarium...,
chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula,có một số loài là nấm lớn
như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma...Bào tử nấm có thể gây ra những
chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và
viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo
giác, hoặc trầm trọng có thể tử vong.


Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp


Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida,
Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài
da ở người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,… cho đến những
bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay
viêm phổi do nấm Pneumocystis carinii.
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật
Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành

nông nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae)gây bệnh
cho lúa.Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría
và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa,
quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,...
1.1.4. Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm
Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm
mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và
Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào thời gian trước, trong và
sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ,…
Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột
biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng
hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác
động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể
gây tổn thương não và chết. Nhiều công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm
có thể gây ung thư, đặc biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà
đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu
quả là đột biến hoặc quái thai.


1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic
1.2.1.1. Giới thiệu chung
Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các
loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc
để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên
nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men
chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả
hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó
(1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày
nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ

vi khuẩn lactic đã được hình thành.
Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ
sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học, được sử dụng
thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con
người.
Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có một sự thống nhất
về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chẳng hạn như chúng là
trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào
tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic
được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá
trình lên men carbohydrat. Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, acid
hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Vi khuẩn lactic có thể lên men
các loại đường monosaccarit và disacarit nhưng không phải tất cả các vi khuẩn
lactic đều lên men được bất kỳ loại disacarit nào, một số không lên men được
saccaroza, một số không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men
được tinh bột (trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccarit khác.
LAB có rất nhiều hình dạng khác nhau:dạng trực khuẩn ngắn hay dạng đơn,


đôi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoặc
xếp thành chuỗi. Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có dạng hình que. Đặc biệt khuẩn lạc
tỏ ra mùi chua của acid.
Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình
cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau.Kích thước tế bào trực
khuẩn lactic từ 1 - 8μm.Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.
Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptit, acid amin,
hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn.
Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn
sống được trong môi trường 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với
NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 - 10% NaCl.

Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 350C, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 - 450C, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở
nhiệt độ tương đối thấp (<= 50C). Khi gia nhiệt đến 60 - 800C thì hầu hết bị chết sau
10 - 30 phút.
Một số vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả
năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực
phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo ra acid lactic, các loài này còn sinh ra các hợp
chất có hoạt tính kháng sinh (Bacteriocin).
Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp trong không khí, đất, nước, nhưng
chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (rau, quả, sữa, thịt,...) một số tìm
thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật.
Hầu hết các vi sinh vật sinh acid lactic đều thuộc họ Lactobacillaceae và
được xếp vào 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc.
Ngày nay người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc
giống Bifidobacterium.
Theo bảng phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20
giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và
hình que, trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium,


Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella. Trong khóa phân loại
của Bergey 1957, giống Bifidobacterum cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic,
trong đó chúng được xem như là Lb.bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù
hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến
nhóm Actinomycetaceae - một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên
men khác với vi khuẩn lactic. Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau
phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau,
tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển
ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa
học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương
pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại.

1.2.1.2. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus
Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng
hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài.

Hình 1.1. Hình dạng tế bào Lactobacillus


Đồ án tốt
nghiệp

Bảng phân loại khoa học giống Lactobacillus:
- Giới:

Vi khuẩn

- Ngành:

Firmicutes

- Lớp:

Bacilli

- Bộ:

Lactobacillales

- Họ:

Lactobacillacea

- Giống:

Lactobacillus

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L.acidophilus,
L.brevis, L.casei, L.fermentum, L.plantarum, L.bulgaricus,...
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase
âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ
yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ
giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc.
Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và
thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết
và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức
năng cũng có chứa các vi khuẩn này.
Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus
pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei,
Lactobacillus sake, plantarum.
Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao
đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacilluscó thể chia thành 3 nhóm như
bảng 1.1.
- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium,
cófructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có
phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không
lên men được pentose, chúng phát triển ở 450C.
- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có

11

Đồ án tốt
nghiệp

FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng
hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic.
- Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có
phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả
hexose và pentose lên men dị hình.
Bảng 1.1. Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986)
Đặc điểm

Nhóm I

Nhóm II

Nhóm III

Lên men pentose

-

+

+

Tạo CO2 từ glucose

-

-

+

Tạo CO2 từ gluconate

-

+a

+a

Sự hiện diện FDP aldolase

+

+
+b

+

L.acidophilus
L.delbrueckii

L.casei
L.curvatus

L.brevis
L.buchneri

L.halveticus

L.plantarum

L.fermentum

L.salivarius

L.sake

L.reuteri

Sự hiện diện
phosphoketolase
Một vài đại diện

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacilluscó vai trò hữu ích
trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột
kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do
nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp Lactose, bệnh về da
như: bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng
đường hô hấp.
1.2.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi
khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình
thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như nguồn

12


Đồ án tốt

nghiệp

carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúng
còn có nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng.
- Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các
monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza) và các disaccarit (saccaroza, lactoza,
maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin).
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu
trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid
citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,..
- Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn
vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa
nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các
nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men,
trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,.. .Hiện nay, cao nấm men là nguồn
nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp
người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
- Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế
bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic
không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các
loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây,
ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men.
- Nhu cầu các chất hữu cơ khác
Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ

13

Đồ án tốt
nghiệp

khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ.
Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi
khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối
citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo
quản các chủng vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan
trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới
dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
- Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các
muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali,
photpho, lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia
và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và
ổn định cấu trúc tế bào.
- Nhu cầu dinh dưỡng oxy
Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên
bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí. (Wood
B.J.B and Holzapfel W.H. 1995).
Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa
sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh
khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí.
1.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men - quá trình sinh trưởng và phát
triển của vi khuẩn lactic
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển
cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu

hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng
cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi

14


Đồ án tốt
nghiệp

cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh
khối sau này.
 Thành phần môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết
cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất
với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS (Phụ lục A) để nuôi cấy vi
khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến
quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá
trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường
dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid
amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các
nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển
tốt, nâng cao hiệu suất lên men.
 Yếu tố môi trường
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi
sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các
enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình
sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh.
Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 - 400C. Một số có
thể sinh trưởng dưới 150C và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 50C

(Wood B.J.B and Holzapfel W.H, 1995).
- Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm,
và khi nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic.
Do đó, cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá

15