Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC
CHỊU NHIỆT SỬ DỤNG TRONG THỨC ĂN CHO
CHĂN NUÔI HEO, GÀ QUY MÔ PILOT
Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Huỳnh Ninh
Sinh viên thực hiện

: Trần Lệ Quyên

MSSV: 1311100608

Lớp: 13DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực
Sinh viên thực hiện

Trần Lệ Quyên


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp tốt nghiệp ở Phân Viện Chăn Nuôi
Nam Bộ, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã
hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến:
Em xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả
những người thân trong gia đình đã nuôi em khuôn lớn nên người và tận tâm lo lắng,
tạo mọi điều kiện cho em được học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp .
Ngôi trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn
năm qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong
cuộc sống.
Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, các Thầy
Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh
đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để em thực hiện đề tài và
làm tốt công việc sau này.
TS. Phạm Huỳnh Ninh, Phó bộ môn Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân
Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài tại đây, nhiệt
tình hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp
Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh, anh Lê Quang Trí phòng Dinh Dưỡng và
Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và
giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án
Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm
– Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em
trong quá trình nhận đề tài


MỤC LỤC

MỤC LỤC........................................................................................................................ i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................ vii
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1 Đại cương về probiotic .............................................................................................................3
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic ..................................................................................................3
1.1.2 Định nghĩa probiotic .................................................................................................................4
1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp..............................................................................................4
1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic ..............................................................7
1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic................................................................................................8
1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi ...............................................................................11
1.1.7 Probiotic từ bào tử ...................................................................................................................12
1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng Probiotic trên thế giới và Việt Nam ....................13
1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus ...........................................................................................18
1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus ...........................................................................................18
1.2.2 Bào tử Bacillus .........................................................................................................................22
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 25
2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài……...………...…………………………...... .........25
2.2 Vật liệu ........................................................................................................................25
2.2.1 Chủng vi sinh vật:..................……………………………….……….........................………25
2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ……………………………………….…. ......................…....25
2.3 Môi trường nghiên cứu………………………………………………..…………26
2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)…………........... 30
2.5 Phương pháp nhuộm Gram……………………………………………… .......…31
i


2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton......................... ............ ….32

2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc……………… .......…………32
2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang………….....................….33
2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng………………………………........... .....................................34
2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử…………………………………….........................................35
2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic……………………………………… ............…...…..….35
2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày…………………………………… ........................…35
2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật…………………………………… .........................…..36
2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ….…………………… ..........................…..37
2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường
vuông góc Cross Streak……………………………………………… .......................................….40
2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử……………………………………...........................…….40
2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất…………………….......................….41
2.8.7 Sản xuất bào tử dạng pilot…………………………………………… ............................….42
2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu…………………………………………… ............................….44
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………................................... ….45
3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic………………………… ............………………………..45
3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày…………………………………… ...................………………..45
3.1.2 Khả năng chịu muối mật…………………………………………............................………46
3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase)…… ..................…48
3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường
vuông góc Cross Streak………………………………………….… .................... ……51
3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn………………….......…………..53
3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi…………………………........................……..53
3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi……… ...................……..54
3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub…………….........……………………….54
3.3.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… .............................…...54
ii


3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng……………………………… ..........................……….56

3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi…………… .........……………………….56
3.4.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… ....................................56
3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng………………………… ..........................…………….58
3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các
chủng Sub và Yoi……………………………………………………………..… .....................……58
3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất………………… .......……………..59
3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot……………………………………………… .............……...61
3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô
pilot………………………….………………………………………..….....................................……61
3.7.2 Tiến hành tạo bào tử…………...……………………………….................................…..…..62
3.8 Tạo chế phẩm……………………………………………………………… ..................……..64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ……………………… …………………....65
4.1 Kết luận………………………………………………………..………...…. …….65
4.2 Kiến nghị……………………………………………………………….… ...................………65
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… ................ …66
PHỤ LỤC…………………………………………………………………….…......... 74
Phụ lục I: Bảng biểu…………………………………………… ………………….….74
Phụ lục II: Hình ảnh……………………………… ................................ ………….….85

3


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
KL

Khuẩn lạc

MT

Môi trường

N

Mật độ tế bào

TB

Tế bào

TN

Thí nghiệm

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

4


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị
trường............................................................................................. ........... ....................17
Bảng 1.2. Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử... ............... .........23
Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn vi khuẩn trong môi trường pH
thấp........................................................ .................. ......................................................45

Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật
2%........................................... ........................ ..............................................................47
Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus.......... ............... ..........49
Bảng 3.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định ...... ....51
Bảng 3.5. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi... ................... ...54
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub............................................. .......55
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi...... ................................. .............57
Bảng 3.8. Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô
pilot............................................. ....................................... ...........................................63
Bảng 5.1. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường pH
thấp................ ........................................ ........................................................................74
Bảng 5.2. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường
muối mật 2%................................................ ....................................... ..........................75
Bảng 5.3. Số liệu đường chuẩn của chủng Sub....................................................... ......76
Bảng 5.4. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng
Sub................................................................................... ..............................................77
Bảng 5.5. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub.......... .................................. .....78
Bảng 5.6. Số liệu đường chuẩn chủng Yoi.............. ..................................... ................79
Bảng 5.7. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng
Yoi.................................... ............................................. ................................................80
Bảng 5.8. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi................. .................... ............81
5


Bảng 5.9. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào
và bào tử của các chủng Sub......................................... .................................... ............82
Bảng 5.10. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào
và bào tử của các chủng Yoi............................... .............................. ............................82
Bảng 5.11. Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi.......... .83
Bảng 5.12. Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời gian

khảo sát khác nhau........................ ................................................... .............................83
Bảng 5.13. Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp khác nhau
.......................................................................... .............................................................84
Bảng 5.14. Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô
pilot............. .................................................................................................................. 85
Bảng 5.15. Kết quả khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot.............. ...86

6


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật……..................... …..9
Hình 1.2. Các cấu trúc chính của bào tử B. Subtilis........................................... ...........23
Hình 1.3. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus...... .............. .24
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát............................................................. .....30
Hình 3.1. Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase)
của các chủng Bacillus……

.............................. ……………………………........50

Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillu… ............... .52
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub .................... 53
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi ................... .53
Hình 3.5. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub . .......................... 55
Hình 3.6. Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian .................................... ..56
Hình 3.7. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi . .......................... .57
Hình 3.8. Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian… .................................. 58
Hình 3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng Sub và
Yoi………………… ..................................................................... ……………………59
Hình 3.10. Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời gian của

chủng Bacillus subtilis ..……………… ...................................................................... .60
Hình 3.11. Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis ..................... ..61
Hình 5.1. Máy ly tâm Avanti JXN Series .................................................................... .87
Hình 5.2. Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis… ......................................... 87
Hình 5.3. Hệ thống lên men 5 L………………........................................................... .88

vii


LỜI MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Khí hậu Việt Nam nóng ẩm theo mùa, thời tiết thay đổi thường xuyên, nhiệt độ
không ổn định là môi trường lí tưởng để vi khuẩn gây bệnh bùng phát ở các chuồng trại
chăn nuôi. Ngành chăn nuôi gặp rất nhiều vấn đề về bệnh tật xuất phát từ đường ruột
và hệ tiêu hóa. Theo thống kê hằng năm, tỷ lệ gia súc và gia cầm chết do mắc bệnh
đường ruột lớn nhất so với nguyên nhân gây bênh khác. Không chỉ vậy, trong chăn
nuôi còn tồn tại các vấn đề khác như lạm dụng kháng sinh và chất tăng trọng gây tác
hại đối với người sử dụng, lãng phí thức ăn do vật nuôi không hấp thụ hết thức ăn, dinh
dưỡng. Vì vậy, để giải quyết được những vấn đề trên đồng thời có thể nâng cao năng
suất hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân, Probiotic là một giải pháp hiệu quả nhất
hiện nay. Các tác dụng cơ bản của probiotic là tăng cường khả năng miễn dịch, chống
lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng của vi khuẩn
có hại trong hệ tiêu hóa.
Một lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất hay nhập khẩu, phân phối
và sử dụng trong chăn nuôi. Các chế phẩm này chủ yếu chứa các vi khuẩn sống thuộc
các giống Bacillus, Lactobacillus, Enteroccocus, nấm men. Số lượng và chủng loại chế
phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam hiện nay rất đa dạng. Tuy
nhiên, không phải chế phẩm nào cũng đạt chuẩn và phù hợp với môi trường, khí hậu,
điều kiện chăn nuôi Việt Nam. Một chế phẩm probiotic đạt hiệu quả ở một quốc gia
nông nghiệp tiên tiến nhưng có thể hoàn toàn không hiệu quả ở một quốc gia nông

nghiệp đang phát triển như Việt Nam. Nguyên nhân lớn nhất xuất phát từ hệ sinh thái
vi sinh từng nơi.
Hiện nay, trong công nghiệp chế biến thức ăn dạng viên thì nguyên liệu thức ăn
o

o

sẽ được xử lý ở nhiệt độ từ 70 - 80 C, có khi lên đến 90 C nhằm kiểm soát nguy cơ về
nhiễm khuẩn, ví dụ như Salmonella (Jones và cộng sự, 2004; Doyle và cộng sự, 2006)

1


cũng như để hồ hóa tinh bột. Quá trình xử lý nhiệt làm giảm đáng kể số lượng vi sinh
vật probiotic trong chế phẩm (chứa các tế bào sinh dưỡng). Vì vậy để đảm bảo cung
cấp đủ lượng vi sinh vật probiotic trong thức ăn viên thì cần phải chọn ra một chủng vi
khuẩn có hoạt tính probiotic và có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Bào tử vi khuẩn
probiotic thuộc chi Bacillus được xem là một giải pháp thích hợp cho vấn đề sử dụng
trong thức ăn ép viên cho chăn nuôi gia súc và gia cầm. Bào tử Bacillus khá bền nhiệt,
tính kháng axit cao hơn so với tế bào sinh dưỡng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bào
tử Bacillus nảy mầm và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật nuôi khoảng 70 - 90%. Ở
Việt Nam, hiện có rất ít các nghiên cứu về việc sử dụng bào tử của các chủng Bacillus
bổ sung vào thức ăn cho động vật, hoặc là chưa được quan tâm thực hiện hoặc đã thực
hiện nhưng không công bố, nếu có cũng rất hạn chế về số lượng các nghiên cứu.
Từ hiện trạng nghiên cứu và sản xuất probiotic như trên cho thấy, việc nghiên
cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus ở quy mô pilot là một yêu cầu
cấp thiết nhằm tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao
của ngành chăn nuôi an toàn và góp phần hạn chế nhập khẩu, chủ động nguồn sản
phẩm và làm giảm giá thành sản phẩm. Đây là cơ sở cho việc thực hiện khóa luận
“ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho

chăn nuôi heo, gà quy mô pilot”.
Mục đích đề tài
Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot
Nhiệm vụ của đề tài



Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic tốt
Khảo sát điều kiện tạo bào tử trong điều kiện lên men lỏng



Sản xuất bào tử Bacillus dạng pilot (5 lít )



Tạo chế phẩm Probiotic


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đại cương về probiotic
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser
(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc
bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe
mạnh [53].
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng
minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật
đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở
Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên

nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo
cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53].
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang
tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [37].
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn
lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [38]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu
Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo
bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường
ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung
cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản
xuất ra được [37]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult”
từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái
niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm
lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên
80 [38].


Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus
được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm
chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.
1.1.2 Định nghĩa probiotic
Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic
được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và
những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” [26]. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic
đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được
đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng
có lợi cho vật chủ.
Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất.
Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của
probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) probiotic là “chất bổ

sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu
hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” [26]; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (2001),
probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số
lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.
1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp
Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng VSV có ích. Đó là các TB sống
của các chủng VSV, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất sinh học có tác dụng
đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện MT, đồng thời cũng có tác dụng dương tính
đối với sức khỏe con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [12].
Chế phẩm probiotic thường gồm các nhóm VSV sau:
Các nhóm VSV cơ bản:
 Nhóm VK lactic [17]:
Đây là nhóm VK thân thuộc với con người từ ngàn xưa. Trong tự nhiên, chúng
phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, cà


muối, mắm chua, sữa chua…Ngoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và
dị hình, VK lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi
chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin,…
Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với vai
trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh đường
tiêu hóa cho người và vật nuôi.
Các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng VK lactic sau: L.
acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes,
Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S. faecalis…[24].
Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng 1 chủng VSV như chế phẩm Antibio của
Hàn Quốc (100% là L. acidophilus) hay Biosubtyl của Đà Lạt (100% là bào tử B.
subtilis) hoặc kết hợp nhiều chủng VSV như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học
Nông nghiệp Hà Nội (ngoài VK lactic còn có VK Bacillus, VK quang dưỡng khử H2S
và nấm men..) [17].

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng: các VK lactic có một vai trò quan trọng
trong quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Nhờ khả năng sản sinh ra axit
lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B, sản sinh enzyme…nên có tác dụng ức
chế VSV đường ruột, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ…
 Nhóm VK Bacillus
Các VK Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện nhưng
trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Chúng phân bố phổ biến trong tự nhiên.
Một số loài của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người
và động vật. Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như
protein, tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào khá mạnh như:
amylase, cellulase, protease [17].


Ngoài các enzyme trên, các VK này còn có khả năng sinh bacterioxin-chất có
hoạt tính kháng sinh có khả năng ức chế một số VSV gây bệnh đường ruột đặc biệt là E.
coli, đồng thời giúp kích thích tiêu hóa và tăng trọng ở vật nuôi.
Trong chế phẩm probiotic, người ta thường sử dụng các chủng thuộc giống
Bacillus sau: B. subtilis, B. mesentericus, B. megathericum, B. licheniformis, B.
clausii,…[8, 17]. Các chủng này rất có ích, không gây bệnh cho người và vật nuôi.
 Nấm men Saccharomyces:
Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong nghề làm
bánh mì, nấu rượu, làm bia, ủ rượu vang…Trong thành phần của TB nấm men rất giàu
protein, vitamin nhóm B và khoáng chất nên thường được bổ sung vào chế phẩm
probiotic để làm giàu sinh khối TB [17]. Chúng còn hấp thu và bài thải độc tố ra ngoài,
tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt
động và sinh sản [14, 20]. Ngoài ra, TB nấm men có trong chế phẩm còn tạo mùi thơm,
giúp cải thiện mùi cho MT và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi.
Để sản xuất probiotic, người ta thường dùng các chủng sau: S. cerevisiae, S.
carlsbergensis, S. vini hoặc S. pombe [13], đặc biệt là S. boulardii. S. boulardii có tác
động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy do kháng sinh

và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori [10].
 Nấm mốc:
Điển hình là Asp. oryzae, Asp. niger. Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai
trò sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase,…nhằm tăng cường khả năng tiêu
hóa thức ăn của con người và vật nuôi, đồng thời cũng có thể được bổ sung vào chế
phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do thức ăn thừa hay phân do
vật nuôi bài tiết ra [17].
Ngoài ra, còn một số nhóm VSV khác cũng được bổ sung vào chế phẩm
probiotic giúp cải thiện MT nước nuôi trồng thủy sản, tăng khả năng làm sạch ao hồ,


giảm hoặc mất mùi hôi thối do H2S… như: VK nitrat (Nitrobacter và Nitrosomonas),
VK quang dưỡng khử H2S, VK tía có lưu huỳnh và VK tía không chứa lưu huỳnh
(Rhodobacter sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas
palustris…) [17]
1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic
Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an
toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt
trong đường tiêu hóa vật chủ. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các
tiêu chuẩn chủ yếu sau:
-

Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày:
Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu

hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên,
các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chịu được áp
lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được sử dụng làm
probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô
ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ. Vì vậy,

đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan
trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic [10].
-

Khả năng chịu muối mật:
Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi

sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, khi thức ăn cùng với VSV probiotic từ dạ
dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây, chúng sẽ chịu tác động của muối mật.
Khả năng sống sót của các chủng VSV sau tác dụng của muối mật là một trong
những đặc tính quan trọng của VSV được sử dụng làm probiotic [10, 21, 23]. Thông
thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1 – 3 % [50]. Để tồn tại


và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ
muối mật ≥ 2%
-

Khả năng sinh enzyme ngoại bào:
Một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh

enzym tiêu hoá như: amylase, cenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm
tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ
-

Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh:
Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính

quan trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế
vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Staphylococcus aureus. Hoạt tính kháng

khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:
+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic.
+ Tạo ra H2O2.
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.
-

Khả năng sinh enzyme ngoại bào:

1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic
Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn
nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được
nhiều nhà khoa học chấp nhận [9, 24, 26].
Cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau [9, 27]


Cải thiện sức
khỏe và năng suất
Giảm thiểu sự sản sinh
nhóm amin độc hại

Tăng độ hữu dụng
của chất dinh dưỡng

Cải thiện sự cân bằng
hệ VK dạ dày – ruột
Cải thiện sự hấp
thu

Phân giải các chất dinh
dưỡng như protein,…

Tổng hợp
vitamin

Vi sinh vật có lợi
đường ruột

Cạnh tranh với
VK gây bệnh

Sản xuất axit hữu cơ
Sản xuất kháng
sinh
Làm giảm pH
Kích thích miễn
dịch

Ức chế sự phát
triển của VK gây
bệnh

Trung hòa các độc tố đường ruột

Hình 1.1 Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật
-

Probiotic giúp duy trì hệ VSV có lợi trong đường ruột bằng hoạt động đối kháng

với VSV gây bệnh [28].
Đối kháng là hiện tượng một loài VSV bằng cách này hay cách khác ức chế
hoặc tiêu diệt sự ST và phát triển của một loài VSV khác. Một số nhà khoa học cho


rằng, cơ chế tác động đối kháng xảy ra khi nguồn thức ăn cạn kiệt do sự phát triển
nhanh chóng của một vài loại VSV và tạo điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VSV
khác
Hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh bao gồm:
 Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành
chất
dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra. Khi VSV gây bệnh bị cạnh tranh,
thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được. Từ đó có thể ức
chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Phương
pháp sử dụng probiotic để loại trừ các VK có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn
nhiều so với phương pháp sử dụng kháng sinh [24]


Ngoài khả năng gia tăng về số lượng để cạnh tranh vị trí bám với

VSV
gây bệnh, VSV probiotic còn có thể tác động nhờ khả năng sản sinh các chất có hoạt
tính kháng khuẩn như: kháng sinh, bacterioxin, axit hữu cơ, H2O2, ethanol,… Những
chất này được sinh ra trong quá trình sống của VSV, có khả năng tiêu diệt có chọn lọc
các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột [17, 20].
-

Gia tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: probiotic kích thích tính

thèm ăn, làm tăng tích lũy mỡ, nitrogen, Ca, P, Cu, Mn, tiết các enzyme tiêu hóa như
amylase, cellulase, lipase, protease…giúp phân giải các chất dinh dưỡng phức tạp
thành chất đơn giản dễ hấp thụ.
-

Tổng hợp vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, B12, làm giảm hoạt tính urease

trong ruột non, ngăn chặn tổng hợp những amin độc, giảm nồng độ NH3 trong phân gia
súc, gia cầm, do đó có ảnh hưởng tốt đối với MT [17].
-

Kích thích hệ thống miễn dịch: yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ

thống miễn dịch là thành phần của vách TB vi khuẩn (peptidoglycan). Sự phân hủy
peptidoglycan tạo ra chất muramyl peptid có tác dụng kích thích hoạt động của đại
10


thực bào (Tannock, 1997). Saarela và cộng sự (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm
mạc ruột của probiotic tạo nên sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống

11


lympho bào đường ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và
tạo nên sự ổn định của hàng rào bảo vệ ruột [24].
Tóm lại, probiotic được xem là sản phẩm hữu hiệu cho việc phòng ngừa và điều
trị bệnh tiêu chảy ở vật nuôi nhờ cơ chế cạnh tranh và đối kháng với VSV gây bệnh,
sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể
vật chủ… Tuy nhiên, lợi ích của nó chỉ thể hiện rõ khi vật nuôi có sức khỏe kém, stress

hoặc có sự xáo trộn hệ VSV đường ruột [4].
1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi [17]
Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi như gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy
sản. Cụ thể như sau:
- Probiotic giúp phát triển hệ VSV đường ruột bình thường, tăng cường khả năng
tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia súc dạ cỏ, probiotic còn
giúp hệ VSV dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn.
- Ức chế và có thể tiêu diệt được các VSV có hại. Làm tăng sức đề kháng và khả
năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh
thường gặp, nhất là bệnh phân trắng ở heo con do E. coli.
Nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002) về tác dụng kháng khuẩn
của chế phẩm EM1 (do Nhật Bản sản xuất) cho thấy: chế phẩm này có tác dụng ức chế
E. coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococcus,
Clostridium perfringens, Sarcina lutea. Sau khi dùng chế phẩm EM1 trộn với thức ăn
9

cho heo (khoảng 10 cfu /kg thức ăn), kết quả kiểm tra số lượng E. coli trong 1g phân
heo đã giảm 7% ở heo từ 1 - 21 ngày tuổi, giảm 5,3% ở heo từ 22 - 60 ngày tuổi [24].
- Làm cho gia súc, gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt và tăng năng suất
chăn nuôi [17].
Lã Văn Kính (1998) đã tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả nước
ngoài khi sử dụng các chế phẩm probiotic trên gà đẻ và gà thịt với kết quả như sau: Đối
với gà đẻ, sản lượng trứng tăng 5% ở mức bổ sung 100mg probiotic/kg thức ăn (Mohal
11


6

và ctv, 1995). Khi bổ sung hỗn hợp L. acidophilus và L. casei (khoảng 10 cfu /kg
thức ăn) đã cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển hóa thức ăn và chất lượng lòng

trắng (Tortuero và Fernandez, 1995). Đối với gà thịt, tăng trọng cao và tiêu tốn thức ăn
thấp hơn đối chứng. Đặc biệt là hiệu quả sử dụng thức ăn đã cải thiện 2% khi bổ sung
9

hỗn hợp L. acidophilus và S. faecium (2 x 10 cfu /kg thức ăn) cho gà thịt. [9]
- Góp phần cải thiện chất lượng nước, chống ô nhiễm MT nước, tăng cường khả
năng phân hủy các chất hữu cơ, giảm nồng độ N và P, kích thích sinh trưởng của tảo,
giảm nguy cơ mắc bệnh và tăng năng suất tôm, cá,…[3, 27, 28]. Chẳng hạn như sử
dụng chế phẩm chứa B. subtilis, B. licheniformis, B. polymixa, B. circulans, B.
laterosporus đã làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng của ấu
trùng cá tầm Acipenser nudiventris [59].
- Đặc biệt, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nước uống cho vật nuôi
sẽ làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối gây ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi. Có thể
dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể vật nuôi như chó, lợn…sẽ mất mùi
thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái khi cho con bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại
[17].
Tóm lại, probiotic đã trở thành sản phẩm hữu hiệu, là bạn đồng hành của người
chăn nuôi, giúp người chăn nuôi tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi [1, 8] .
1.1.7 Probiotic từ bào tử
Probiotic từ bào tử đang ngày càng được dùng rộng rãi dưới dạng thực phẩm bổ
sung cho người và động vật dưới dạng các chất thúc đẩy sinh trưởng và cạnh tranh với
vi khuẩn có hại; trong thủy sản để thúc đẩy sự tăng trưởng của tôm, cá; và dùng để
phòng ngừa bệnh tật. Hiện nay không chỉ ở nước ngoài mà ở tại Việt Nam, nhiều sản
phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng. Các loài được
nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus
coagulans và Bacillus licheniformis.[41]
12


Các ưu điểm của probiotic từ bào tử:

-

Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều

kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống.
-

Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH axit của dịch vị dạ dày

[30,54], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt [58]. Một
liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạn không cần để trong tủ
lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào ruột để phát triển thành vi
khuẩn sống và phát huy tác dụng.
-

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn,

các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausii, B. subtilis, B. cereus, B.
licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau.
1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacilllus trong
chăn nuôi gia súc và gia cầm trên thế giới và Việt Nam
Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacillus là một nguồn gen phong phú,
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực
phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học… Đặc biệt là trong chăn nuôi, con
người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế phẩm
probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc, gia cầm…
1.1.8.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế
giới
Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura
từ B. subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Asp.

Flavus, Asp. Paraciticus. Nghiên cứu này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ
sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc dạng lỏng chứa B. subtilis chủng IP
5832, đến năm 1955 có thêm dạng bột và viên nang mềm. Năm 1962, Guy Albot còn
13


phát hiện B. subtilis có tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và
viêm đại tràng mãn tính. Còn khi trộn thêm với VK lactic, B. subtilis chữa chứng loạn
khuẩn rất hiệu quả ở người và vật nuôi.
Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M. (Effective
Microorganisms) trong đó có Bacillus, do GS.TS. TeRuo Higa, Trường Đại học
Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên cứu năm 1980. Chế phẩm này được sử dụng
nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ môi trường và đã mang lại hiệu quả
khả quan. Cho đến nay, đây là chế phẩm được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng,
đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc,
Thái Lan và Việt Nam.
Năm 1999, Kyriakis và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic LSP
122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy trên heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí
nghiệm này được tiến hành trên 4 lô: Lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng B. toyoi
6

6

7

với liều 10 cfu/kg thức ăn, lô 3 và 4 sử dụng B. licheniformis với liều 10 và 10 cfu/kg
thức ăn. Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (2, 3 và 4) đều có tỷ lệ tiêu chảy và tình
trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng. Ngoài ra, sự tăng trọng và tiêu
7

tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng. Trong đó, lô sử dụng 10 cfu B.
licheniformis/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất.
Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu ăn liên
6

tục trong 7 ngày với liều 6 x 10 cfu/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải của E.coli
O157:H7. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E. coli trong phân thấp hơn so với
đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn.
1.1.8.2Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt
Nam
Năm 1962, yaourt và canh trùng subtilis được Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng
dùng để phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bước đầu cho kết quả khả quan [5].
14