Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng

Đồ án tốt nghiệp

PHẦN MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết cùa đề tài
Trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam, phân bón đóng vai trò quan trọng
trong việc tăng năng suất cây trồng. Tuy nhiên tình hình hiện nay, để đáp ứng nhu
cầu về năng suất, một lượng lớn phân hoá học đã được sử dụng, gây ra các tác động
tiêu cực đến môi trường đất, không những thế mà còn ảnh hưởng đến môi trường
nước, các vi sinh vật cũng như con người.
Lân (phốt pho) là yếu tố rất cần thiết đối với sự tăng trưởng và năng suất của
cây trồng. Đóng vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động sinh lý của cây như phân
chia tế bào, quang hợp và phát triển hệ thống rễ tốt (J. Microbiol, 2011). Tuy nhiên
không phải hợp chất chứa lân nào trong đất cây cũng sử dụng được. Điển hình là
đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên có hàm lượng lân tổng số đạt 0,02%, nhưng lượng
lân mà cây có thể sử dụng được chỉ 4,12mg/100g đất (Đoàn Triệu Nhạn, 1999). Vì
vậy, để nâng cao năng suất cây trồng các nhà nông sử dụng các loại phân lân hoá
học để bón cho cây, nhưng khoảng 2/3 phân lân hoá học bón vào đất bị kết tủa ở
dạng khó tan cây trồng không hấp thụ được bởi nguyên tố sắt, nhôm hoặc các hợp
chất canxi có trong đất (Gyaneshwar và cộng sự, 2002; Turan và cộng sự, 2006).
Điều này khiến cho đất trồng ngày càng chai cứng, thiếu màu mỡ. Mặt khác lượng
phân lân còn lại trong đất có thể bị rửa trôi hoặc thấm vào mạch nước ngầm gây ô
nhiễm môi trường nước.
Để khắc phục tình trạng trên, hiện nay Việt Nam nói riêng và các nước trên
thế giới như Ấn Độ, Nhật Bản… đang tập trung nghiên cứu phân bón theo hướng
thân thiện với con người và môi trường, chi phí thấp, đồng thời cải thiện môi trường
đất chai cứng do sử dụng phân hoá học trước đó.
Một số báo cáo khoa học cho thấy một số loài vi khuẩn khác nhau có khả
năng hoà tan các hợp chất phốt pho vô cơ chẳng hạn như tricalcium phosphate,
dicalcium phosphate, hydroxyapatite. Sự xuất hiện của vi khuẩn hoà tan phốt pho
tập trung cao ở vùng rễ, mật độ phụ thuộc vào tính chất của đất (J. Microbiol,
2011).

1


Đồ án tốt nghiệp

Dựa trên cơ sở đó, phân lân vi sinh được tập trung nghiên cứu làm giải pháp
thay thế cho phân lân hoá học. Phân lân vi sinh là sản phẩm chứa một hay nhiều
chủng vi sinh vật sống đã được tuyển chọn với mật độ theo tiêu chuẩn hiện hành có
khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng dễ tan mà cây trồng sử
dụng được. Phân lân vi sinh là giải pháp bền vững, an toàn cho sự hướng tới nền
nông nghiệp sạch hiện nay.
Trong thực tế, các doanh nghiệp sản xuất phân bón vi sinh ở hai dạng rắn và
lỏng. Đối với phân bón vi sinh dạng rắn có những hạn chế nhất định như thời gian
bảo quản ngắn, tác dụng chậm, nhiều cơ hội bị tạp nhiễm, khả năng sống của VSV
dưới điều kiện khắc nghiệt kém, chi phí vận chuyển cao…(Viveganandan và Jauhri,
2000). Trong bối cảnh đó, phân bón vi sinh dạng lỏng càng có tầm quan trọng và trở
nên phổ biến với thời gian sử dụng lâu hơn từ 12 – 24 tháng, dễ tương tác với cây
trồng, không gây ô nhiễm, mật độ VSV hữu ích cao, bảo vệ tốt tế bào khỏi các yếu
tốt bất lợi từ môi trường… (Sridhar và cộng sự, 2004).
Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu qui trình sản xuất chế
phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng” được tiến hành nhằm tuyển
chọn các vi sinh vật có khả năng phân giải lân tốt, từ đó nghiên cứu và thiết lập qui
trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân ở dạng lỏng.
Nội dung nghiên cứu
Tuyển chọn chủng vi sinh vật hoặc các chủng vi sinh vật phối hợp có khả
năng phân giải lân khó tan tốt nhất, đồng thời có khả năng sinh tổng hợp các chất
dinh dưỡng, cũng như chất kích thích tăng trưởng cây trồng để ứng dụng vào sản
xuất chế phẩm.
Xác định môi trường lên men chính và điều kiện nuôi cấy phù hợp với vi

sinh vật.
Xác định chất ổn định chế phẩm phù hợp với vi sinh vật và tạo chế phẩm
phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng.
Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân.

2


Đồ án tốt nghiệp

Ý nghĩa khoa học
Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân lân vi sinh dạng lỏng.
Ý nghĩa thực tiễn
Thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm
vi sinh vật phân giải lân khó tan trong sản xuất nông – lâm nghiệp, vừa phân giải tốt
lân khó tan trong đất vừa có khả năng sinh tổng hợp các chất dinh dưỡng và chất
kích thích tăng trưởng cây trồng. Cải thiện môi trường đất nông nghiệp đang xuống
cấp của Việt Nam. Đồng thời đóng góp vào các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh
dạng lỏng hiện còn ít biết đến ở Việt Nam.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Các dạng lân trong đất
Lân là chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự tăng trưởng của cây trồng, khi không
cung cấp đủ lân, cây sẽ sinh trưởng, phát triển chậm, do đó giảm năng suất (Sawyer
và Creswell, 2000). Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng lân của cây trồng không quá 25%,

phần lớn lân dễ tan trong đất sẽ bị cố định ở dạng cây trồng khó hấp thụ, chiếm tới
95 – 99% tổng lượng lân có trong đất. Thành phần lân dễ tan và khó tan trong đất
được quyết định bởi tính chất đá mẹ, thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữu cơ.
Hoạt động của các cation kim loại (Ca, Fe, Mg…) và các hợp chất oxide của các
kim loại này trong đất cũng làm lân dễ tan bị cố định.
Theo Sharpley (2006), thì hàm lượng lân trung bình ở nhiều loại đất thường
từ 0,02 – 0,08 %. Do quá trình tích luỹ sinh học, hàm lượng lân ở lớp đất mặt cao
hơn lớp dưới.
Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung cấp cho đất một nguồn lân
quan trọng. Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng, lân tồn tại ở hai hình
thức: vô cơ và hữu cơ (Sharpley, 2006).
1.1.1. Lân vô cơ
Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối phosphate của những nguyên tố Ca, Fe, Al,
Mg… Ở đất trung tính và đất kiềm thì phosphate caxi là chủ yếu, còn ở đất chua thì
phosphate sắt và nhôm là chủ yếu. Phosphate canxi dễ được huy động để làm thức
ăn cho cây hơn phosphate sắt và phosphate nhôm. Sự tồn tại của ion phosphate
trong môi trường đất bị chi phối bởi ion phosphate bị chuyển đổi hoá trị (Võ Thị
Lài, 2006).
Có thể phân loại lân vô cơ theo tính tan như sau:
-

Lân vô cơ khó tan (Ca3(PO4)2, AlPO4, FePO4, …): là các muối phosphate khó
tan trong nước, cây không thể hấp thụ được.

-

Lân vô cơ dễ tan (Na2HPO4, K2HPO4, MgHPO4, …): cây trồng dễ dàng sử
dụng các loại muối phosphate này.

4

Đồ án tốt nghiệp

-

Trong thực tế H2PO4 là dạng cây trồng dễ hấp thu nhất, các dạng phosphate
còn lại thường là các dạng khó hoà tan, muốn cây trồng sử dụng được phải qua quá
trình biến đổi thành dạng dễ tan (Võ Thị Lài, 2006). Trong quá trình này vi sinh vật
giữ vai trò quan trọng.
1.1.2. Lân hữu cơ
Lân hữu cơ trong đất chủ yếu có trong mùn, đất càng giàu mùn càng giàu lân
hữu cơ. Tuỳ loại đất lân hữu cơ thường chiếm 20 – 80% lân tổng số (Trần Long
Tấu, 2009).
Trong lân hữu cơ của đất dạng phổ biến nhất là fytat, có thể chiếm đến 50%
tổng số lân hữu cơ. Khi có sự tham gia của các vi sinh vật phân giải lân, những hợp
chất hữu cơ sẽ được khoáng hoá giải phóng lân vô cơ hay lân hữu cơ, là nguồn cung
cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Có 70 – 80 tập đoàn vi sinh vật tham gia vào quá
trình phân giải lân (Võ Thị Lài, 2006).
1.1.3. Vòng tuần hoàn
Cây xanh

Động vật
-3

Ion PO4 trong dung dịch đất
-3

Ion PO4 bị hấp thụ
Quá trình khoáng

Hoà tan

Quá trình cố định

Phốt pho vô cơ

Cố định tạm thời

Chất hữu cơ tươi và tế bào sinh vật
Chất hữu cơ mùn hoá
Hình 1.1. Vòng tuần hoàn lân trong tự nhiên

5


Đồ án tốt nghiệp

Lân trong tự nhiên luôn tuần hoàn chuyển hoá (Hình 1.1), nhờ vi sinh vật lân
hữu cơ được vô cơ hoá thành dạng muối của acid phosphoric. Các dạng này một
phần được cây trồng sử dụng biến thành lân hữu cơ, một phần bị cố định ở dạng
khó tan. Trong quá trình này vi sinh vật giữ vai trò quan trọng.
Trong tự nhiên, lân tham gia vào các quá trình chuyển đổi vật chất bằng cả
con đường hóa học và sinh học. Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của lân trong tự
nhiên diễn ra theo 3 quá trình sau:
Khoáng hóa: Là quá trình chuyển hóa lân dạng hữu cơ thành lân dạng vô cơ.
Cố định sinh học (Immobilization): Là quá trình tái sử dụng lân vô cơ nhờ
VSV và qua đó chuyển đổi lân vô cơ thành lân hữu cơ trong protoplasm của VSV.
Cố định hóa học (Fixation): Là quá trình chuyển đổi lân dạng tan sang dạng
3-

khó tan dưới tác dụng của các phản ứng hóa học giữa ion PO4 và cation kim loại.
1.1.4. Vai trò của lân đối với cây trồng
Phốt pho là một trong những yếu tố quan trọng trong nông nghiệp hiện nay,
nằm trong nhóm ba nguyên tố đa lượng chính của cây trồng (N, P, K). Tầm quan
trọng của phốt pho đối với sản lượng mùa vụ được minh hoạ bằng tổng lượng phân
lân được sử dụng trong suốt 35 năm gần đây, ổn định ở khoảng dưới 20 triệu
tấn/năm trong 10 năm gần đây.
Phốt pho có nhiều chức năng quan trọng đối với thực vật, chức năng cơ bản
là lưu trữ và vận chuyển năng lượng trong thực vật. Adenosine diphosphate (ADP)
và adenosine triphosphate (ATP) là những hợp chất phốt pho năng lượng cao, điều
khiển hầu hết những tiến trình trong thực vật bao gồm quang hợp, hô hấp, tổng hợp
acid nucleic và protein và vận chuyển dinh dưỡng thông qua những tế bào thực vật.
Ngoài ra còn đẩy mạnh sự phát triển của rễ, tăng khả năng hấp thu nước và khoáng
chất. Thúc đẩy quá trình sinh nhánh, nảy chồi cho ra hoa tạo quả sớm (Lê Văn Căn,
1968).
1.2. Tổng quan về vi sinh vật phân giải lân
VSV phân giải lân - VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing
Microorganisms - PSM) hay còn được gọi là VSV huy động lân (Phosphate

6


Đồ án tốt nghiệp

mobilizing Microorganisms) là các VSV có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho
khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Các VSV phân giải hợp chất phốt
pho khó tan được biết đến nay gồm cả vi khuẩn, nấm mốc và nấm men. VSV phân
giải lân không chỉ là các VSV chuyển hoá photphate vô cơ, mà bao gồm cả các
VSV có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo nguồn lân dễ tiêu cung

cấp cho đất và cây trồng (Vũ Thuý Nga, 2003).
VSV phân giải lân được chia làm 2 nhóm: nhóm VSV phân giải lân vô cơ và
nhóm VSV phân giải lân hữu cơ.
1.2.1. VSV phân giải lân hữu cơ
Như ta đã biết, lân hữu cơ cũng là nguồn dự trữ lân trong đất đáng kể cho sự
phát triển của thực vật. Tuy nhiên, để thực vật sử dụng được thì nguồn lân hữu cơ
này cần phải được vô cơ hóa (khoáng hóa) dưới dạng dễ tan. Quá trình khoáng hóa
của hầu hết các hợp chất lân hữu cơ được thực hiện nhờ hệ enzyme phosphatase của
các vi sinh vật đất. Càng gần vùng rễ cây thì hoạt động của các vi sinh vật phân giải
lân hữu cơ càng mạnh mẽ (Tarafdar và Junk, 1987). Rõ ràng, sự tồn tại hệ vi sinh
vật vùng rễ này đã góp phần đáng kể tăng lượng lân khả dụng cho cây trồng (Garcia
và cộng sự, 1992; Xu và Johnson, 1995).
VSV phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus (Skrary và
Cameron, 1998) và Pseudomonas (Gügi và cộng sự, 1991), ngoài ra còn một số xạ
khuẩn và nấm khác. Đáng chú ý là B.megaterium var phosphatsum có khả năng
phân giải lân hữu cơ cao. Đồng thời B. megaterium còn có khả năng hình thành bào
tử nên sức sống rất mạnh (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009).
Qua nghiên cứu hoạt động phân giải lân hữu cơ của các enzyme phosphatase
khác nhau ở vùng rễ ngô, lúa mạch, lúa mì, Burn (1983) đã nhận thấy hoạt tính của
các phosphatase mạnh nhất ở đất chua đến trung tính.
Tất cả những nghiên cứu trên đã khẳng định vi khuẩn đất có vai trò quan
trọng trong việc cung cấp lân khả dụng cho cây trồng từ các nguồn lân vô cơ và hữu
cơ sẵn có trong đất mà cây trồng không sử dụng được.
1.2.2. VSV phân giải lân vô cơ

7


Đồ án tốt nghiệp

Nhiều vi khuẩn như B.megaterium, B.mycoides, B.butyricus, Pseudomonas
fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn hệ rễ, xạ khuẩn có khả năng phân
giải Ca3(PO4)2 và bột apatit. Khả năng phân giải lân vô cơ có liên quan mật thiết tới
sự sản sinh acid của vi sinh vật. Quá trình lên men tạo ra acid carbonic, là acid chủ
yếu thúc đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ.
Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O  Ca(PO4)2H2O + Ca(HCO3)2
Trong đất vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác
dụng trong việc phân giải Ca3(PO4)2. Vì trong quá trình sống các vi khuẩn này tích
lũy HNO3 và H2SO4 trong đất.
1.2.3. Khả năng kích thích sự phát triển cây trồng của VSV phân giải lân
Trong tự nhiên tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn mà đa phần là các vi
khuẩn liên quan đến rễ cây, có tác dụng kích thích tăng trưởng cây trồng. Nhóm vi
khuẩn này gọi là PGPB (plant growth promoting bacteria). Theo Ahmed và Shahab
(2011), PGPB sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp một hoặc nhiều cơ chế để cải thiện
mức độ tăng trưởng và sức khoẻ cây trồng. Những cơ chế này có thể hoạt động
đồng thời hoặc hoạt động tuần tự ở các giai đoạn khác nhau của sự phát triển thực
vật. Chúng bao gồm:
- Hoà tan lân.
- Cố định đạm.
- Kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng.
- Tăng cường sự hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết khác.
- Sản xuất phytohormone như acid indole-3-acetic và acid butyric indol.
Trong số đó vi khuẩn phân giải lân khó tan (PSB) đã được sử dụng như phân
bón sinh học thương mại để cải thiện tình trạng nông nghiệp (Subba-Rao, 1993;
Rodríguez và Fraga, 1999). Nhóm vi khuẩn phân giải lân được coi là phân bón sinh
học có triển vọng nhất vì rất nhiều loại đất giàu lân tổng số nhưng lại thiếu hụt trầm
trọng lân dễ tan cung cấp cho cây trồng.
Tác động có lợi của vi khuẩn phân giải lân đã được nhiều tác giả mô tả
(Antoun và cộng sự, 1998; Chabot và cộng sự, 1998; Pal, 1998; Peix và cộng sự,

8


Đồ án tốt nghiệp

2001; Sarawgi và cộng sự, 1999; Tomar và cộng sự, 1996). Hơn nữa, các vi khuẩn
phân giải lân lại rất có tiềm năng để sản xuất phân vi sinh đa chức năng vì có thể
tương tác kết hợp tốt với các vi khuẩn có lợi khác như Azospirillum (Gaur và
Alagawadi, 1992; Belimov và cộng sự, 1995) và Azotobacter (Kundu và Gaur,
1984).
Ngoài vai trò cung cấp lân dễ tan cho cây trồng, các vi khuẩn hòa tan lân còn
có khả năng sinh các yếu tố có vai trò nâng cao hiệu suất tăng trưởng như cố định
đạm, sinh tổng hợp các phytohormone, kháng sinh, hay các enzyme chitinase,
cellulase, pectinnase,... giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với
điều kiện bất lợi từ bên ngoài.
1.2.4. Cơ chế hòa tan lân của VSV
1.2.4.1. Cơ chế hòa tan lân vô cơ
Một số lý thuyết giải thích các cơ chế hoà tan lân của VSV như lý thuyết
+

acid hữu cơ và lý thuyết acid hóa bằng cách giải phóng H (Ahmed và Shahab,
2011).
Lý thuyết acid hữu cơ
Lý thuyết acid hữu cơ được chấp nhận bởi nhiều nhà nghiên cứu. Trong lý
thuyết này, các nguồn lân vô cơ không hòa tan trong môi trường được hòa tan bởi
VSV phân giải lân, đi kèm với sản xuất các acid hữu cơ, làm giảm pH và làm tăng
sự tạo phức của các ion dương liên kết với nhóm phosphate (Puente và cộng sự,
2004).Việc giảm độ pH của dịch nuôi cấy VSV từ giá trị ban đầu của môi trường là
7.0 đến giá trị cuối cùng 2.0 được ghi lại bởi nhiều nghiên cứu (Gaur và Gaind
1999; Illmer và Schinner, 1992). Việc sản xuất các acid hữu cơ dẫn đến hiện tượng

acid hóa các tế bào VSV và môi trường xung quanh. Do đó, việc giải phóng các ion
+

2+

P trong các khoáng P-Ca là do sự thay thế H bằng Ca .
Phân tích dịch nuôi cấy của các VSV có khả năng hòa tan lân đã cho thấy sự
hiện diện của số lượng các acid hữu cơ như malic, glyoxalic, succinic, fumaric,
tartaric, alpha keto butyric, oxalic, citric, acid 2-ketogluconic và gluconic (Lapeyrie
và cộng sự, 1991; Cuningham và Kuaick, 1992; Illmer và cộng sự, 1995; Fasim và

9


Đồ án tốt nghiệp

cộng sự, 2002; Kim và cộng sự, 1997). Trong số đó, acid gluconic có vẻ là tác nhân
thường gặp nhất của quá trình hòa tan lân vô cơ. Các vi khuẩn sinh acid gluconic đã
được báo cáo là Pseudomonas sp (Illmer và Schinner, 1992), Erwinia herbicola
(Liu và cộng sự, 1992), Pseudomonas cepacia (Goldstein và cộng sự, 1993). Chủng
vi khuẩn Bacillus liqueniformis và Bacillus amyloliquefaciens đã được xác định là
có khả năng sản xuất hỗn hợp các acid lactic, isovaleric, isobutyric, và acit acetic có
vai trò tham gia vào quá trình hòa tan lân vô cơ khó tan (Rodríguez và Fraga, 1999).
Goldstein (1995) đã chứng minh rằng kết quả của sự oxy hóa glucose sản
sinh ra acid gluconic và acid 2-ketogluconic là cơ sở của quá trình hòa tan lân vô cơ
khó tan của một số vi khuẩn Gram âm.
Bên cạnh các acid hữu cơ, acid vô cơ như acid nitric và acid sulfuric cũng
được sản xuất bởi các vi khuẩn nitrat và các Thiobacillus trong quá trình oxy hóa
của các hợp chất vô cơ có chứa nitơ hoặc lưu huỳnh. Các acid vô cơ này phản ứng
với canxi phosphat và chuyển đổi chúng thành các dạng hòa tan (Gaur và Gaind,

1999).
Hàm lượng và loại acid hữu cơ được các VSV tiết vào dịch nuôi cấy rất đa
dạng. Lượng lân được VSV hòa tan phụ thuộc vào cường độ và loại acid. Acid béo
được đánh giá là có hiệu quả hơn acid phenolic và acid citric khi hòa tan lân. Acid
fumaric có khả năng hòa tan lân tốt nhất. Tribasic acid và dibasic acid cũng có hiệu
quả hơn acid monobasic (Gaur và Gaind, 1999).
Goldstein (1994) đề xuất rằng quá trình oxy hóa trực tiếp periplasmic
glucose thành acid gluconic, thường là acid 2-ketogluconic, hình thành cơ sở trao
đổi chất của chất khoáng trong một số vi khuẩn gram âm phân giải lân.
Mặc dù nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ giả thuyết acid hữu cơ, nhưng rất khó
khăn trong việc định lượng lân hòa tan tương ứng với từng loại acid hữu cơ xuất
hiện trong môi trường chất lỏng.
Lý thuyết acid hóa
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật vẫn có khả năng hòa tan lân mà
không hề sản sinh bất cứ loại acid hữu cơ nào trong quá trình sinh trưởng. Việc hòa

10


Đồ án tốt nghiệp

tan lân mà không sản xuất acid được giải thích là do việc phát hành các proton kèm
theo quá trình hô hấp hoặc đồng hóa amoni (Taha và cộng sự, 1969; Kucey, 1983;
Dighton và Boddy, 1989; Parks và cộng sự, 1990). Illmer và Schinner (1995) đã
+

giải thích sự hòa tan lân nhờ giải phóng H làm giảm pH của môi trường. Họ đã sử
dụng Pseudomonas aurantiogriseum và Pseudomonas sp. phân lập từ đất rừng để
phân giải 2 hợp chất Ca-P là hydroxyapatite và brushite. Tác giả quan sát thấy rằng
nồng độ lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy lỏng tăng lên tương ứng với mức

tiêu thụ apatit (Ca5(PO4)3(OH, F, Cl)) và brushite (CaHPO4.2H2O). Nồng độ lân hòa
tan cũng đạt mức cao nhất ở một số thời điểm nhất định trong suốt quá trình nuôi
cấy. Họ cho rằng các hợp chất hữu cơ đã được đồng hóa như các chất dinh dưỡng
bởi hai chủng sinh vật này khi môi trường chất lỏng chứa ít chất vô cơ. Việc giải
+

+

phóng H được cho là liên kết với đồng hóa cation, như ion amoni (NH4 ). Giải
+

+

phóng H đi kèm đồng hoá NH4 chịu trách nhiệm hòa tan lân. Họ đã chứng minh
+

rằng Pseudomonas aurantiogriseum và Pseudomonas sp. Đã tạo H để hòa tan
hydroxyapatite một cách hiệu quả mà không cần sự liên kết với brushite giữa các tế
bào và các chất nền, đồng thời giảm độ pH. Vi khuẩn huy động lân để giải phóng
+

+

H tại bề mặt tế bào. Hoạt động giải phóng H đi kèm với giảm pH tạo thành một
điều kiện thích hợp cho sự hòa tan lân.
Bên cạnh đó, các chất dễ tạo phức, CO2, H2S cũng tăng cường quá trình phân
giải lân vô cơ khó tan (Luo và cộng sự, 1993; Kapoor và cộng sự, 1989).
1.2.4.2. Cơ chế hòa tan lân hữu cơ
Tương tác emzyme – cơ chất là cơ sở của quá trình hòa tan lân hữu cơ. Các
enzyme phosphatase đóng vai trò phân giải hầu hết các dạng lân hữu cơ trong đất.

Một số loại enzyme có hoạt tính phosphatase có thể kể đến như acid
phosphatase, phytase, lecithinase, D-α-Glycerophosphatase, phosphonoacetate
hydrolase …
1.3. Phân bón vi sinh phân giải lân
1.3.1. Định nghĩa

11


Đồ án tốt nghiệp

Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất phốt pho khó tan (tên thường gọi là
phân lân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật đã được tuyển
chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt
pho khó tan thành dạng dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng
cao năng xuất và (hoặc) chất lượng nông sản. Phân lân vi sinh và các chủng vi sinh
vật không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và
chất lượng nông sản.
1.3.2. Quy trình sản xuất
Qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh tổng quát bao gồm 2 phần: từ
giống gốc ban đầu tiến hành nhân giống thu sinh khối và tạo chế phẩm.
Giống gốc
Nhân giống cấp 1
Nhân giống cấp 2
Chất mang

Lên men chính thu sinh khối

Xử lý

Phối trộn

Chế phẩm
dạng rắn

Chế phẩm
dạng lỏng

Hình 1.2. Qui trình sản xuất tổng quát phân bón vi sinh
1.3.2.1. Phân lập tuyển chọn chủng VSV phân giải lân (PSM)
Trong quy trình sản xuất chế phẩm PSM, công tác đầu tiên là phân lập và
tuyển chọn những chủng VSV tốt.
Chủng VSV phân giải lân được phân lập từ đất hoặc từ vùng rễ cây trồng

12


trên các loại đất hay cơ chất giàu hữu cơ theo phương pháp nuôi cấy pha loãng trên
môi trường đặc Pikovskaya (Pikovskaya, 1948). Trong quá trình nuôi cấy các chủng
VSV phân giải lân sẽ tạo vòng phân giải, tức là vòng tròn trong suốt bao quanh
khuẩn lạc. Vòng phân giải được hình thành nhờ khả năng hoà tan phosphate khó tan
được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Căn cứ vào đường kính vòng phân giải, thời
gian hình thành và độ trong của vòng phân giải người ta có thể đánh giá định tính
khả năng phân giải mạnh hay yếu của các các chủng VSV phân lập. Để đánh giá
chính xác mức độ phân giải các hợp chất lân khó tan của VSV, người ta phải định
lượng hoạt tính phân giải của chúng bằng cách phân tích hàm lượng lân dễ tan trong
môi trường nuôi cấy VSV có chứa loại phosphate không tan.

Hình 1.3. VK phân giải lân trên
MT P

Hình 1.4. VK phân giải lân trên
MT P bổ sung Bromophenol blue

Để sản xuất phân lân VSV người ta cố gắng tuyển chọn các chủng VSV có
khả năng phân hu

nhiều loại hợp chất lân hữu cơ và vô cơ khác nhau và có ảnh

hưởng tốt đến cây trồng. Vì ngoài hoạt tính phân giải lân, nhiều chủng VSV còn có
các hoạt tính sinh học khác gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng, phát triển và năng
suất cây trồng. Do vậy cần chọn những nguồn phân lập an toàn sinh học hoặc sau
khi phân lập cần được đánh giá ảnh hưởng đến đối tượng cây trồng sử dụng. Chỉ sử
dụng chủng VSV vừa có hoạt tính phân giải lân cao, sức cạnh tranh lớn, thích ứng ở
pH rộng, phát huy được ở nhiều vùng sinh thái khác nhau và đặc biệt không gây ảnh
hưởng xấu đến cây trồng và môi trường sinh thái, tốt hơn nếu chủng VSV đó sinh
tổng hợp các hợp chất có lợi cho cây trồng.


1.3.2.2. Nhân sinh khối VSV
Từ các chủng VSV tuyển chọn, sinh khối VSV được nhân giống cấp 1, nhân
giống cấp 2 và lên men chính để thu sinh khối (Hình 1.2), trong đó các yếu tố ảnh
hưởng như môi trường nhân sinh khối, nồng độ ô xy, nhiệt độ và pH cần được đặc
biệt chú ý.
Môi trường nhân sinh khối VSV cần đáp ứng đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cho
VSV sinh trưởng phát triển, đồng thời phải rẻ và luôn sẵn có.
Theo Wang JinLing và cộng sự (2013), để xác định môi trường nuôi cấy tốt
nhất cần tiến hành thí nghiệm bề mặt phản ứng tối ưu hoá. Thí nghiệm được tiến
hành đối với chủng vi khuẩn hoà tan phosphate Bacillus megaterium, OD600 được
xem như tiêu chuẩn để đánh giá số lượng tế bào. Các yếu tố trong môi trường được

tiến hành tối ưu như nguồn carbon, nguồn nitơ, nồng độ muối vô cơ và đạt được các
giá trị tốt nhất của từng yếu tố. Từ đó thiết kế đồ thị bề mặt phản ứng nhằm xác
định môi trường tối ưu hoá. Kết quả cho thấy các thành phần môi trường tối ưu bao
gồm: Lactose 6g/L, Pepton 7,45g/L, NaCl 5g/L, MgSO4.7H2O 2,46g/L, CaCl2
1,22g/L, K2SO4 0,087g/L. Với môi trường nuôi cấy tối ưu này, số lượng tế bào sống
9

của vi khuẩn Bacillus megaterium trong dịch lên men có thể đạt 2,0 10 cfu/ml. Có
thể cung cấp mật độ cao vi khuẩn hoà tan phosphate cho sản xuất công nghiệp.
Hầu hết các VSV sử dụng trong sản xuất phân bón được nhân sinh khối bằng
phương pháp lên men chìm trong các nồi lên men (J. F. Walter và A. S. Paau,
1996).
1.3.2.3. Tạo chế phẩm
Phân bón VSV được sản xuất bằng cách phối trộn sinh khối VSV ở một mật
độ nhất định vào chất mang vô trùng hoặc không vô trùng.
* Chất mang và xử lý chất mang
Chất mang là cơ chất để VSV trú ngụ và duy trì mật độ trong thời gian từ khi
sản xuất đến khi sử dụng. Ngoài các yêu cầu về đặc tính vật lý, cảm quan, chất
mang phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến VSV, thực vật và môi trường.


Chất lượng phân VSV trên nền chất mang khử trùng phụ thuộc rất lớn vào
mật độ VSV hữu ích và khả năng tồn tại của chúng trong sản phẩm. Nhằm hạn chế
tối đa sự cạnh tranh của các VSV tạp trong phân bón, chất mang được khử trùng
bằng các phương pháp khác nhau. Phương pháp thông dụng đang được sử dụng
rộng rãi hiện nay là khử trùng bằng hơi nước bão hòa.
Nhằm giảm giá thành, tạo điều kiện thuận lợi cho người sử dụng sản phẩm
phân bón VSV trên nền chất mang không khử trùng cũng đã được nghiên cứu và áp
dụng trong sản xuất. Phân VSV trên nền chất mang không khử trùng là sản phẩm
phân VSV, trong đó chất mang sau xử lý được phối trộn trực tiếp với sinh khối

VSV không thông qua khử trùng.
Ưu và nhược điểm của 2 loại phân bón VSV trên nền chất mang khử trùng
và không vô trùng được tổng kết trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Ưu điểm và hạn chế của phân bón VSV trên nền chất mang khử trùng và
không khử trùng
C
hấ

K
h
ử
tr
ù
n

K
h
ô
n
g

C
ó
th
ể
p
ha
lo
ãn
g,

qK
ỹ
th
uậ
t
p
h
ối
tr

C
ần
đầ
u
tư
lớ
n
ba
n
đầ
C
ầ
n
l
ư
ợ
n
g
si

(Phạm Văn Toản, 2002)


* Chủng sinh khối VSV vào chất mang, tạo sản phẩm
Sinh khối VSV sau lên men được ly tâm hay vi lọc, rửa tế bào để thu sinh
khối. Chủng sinh khối vào chất mang vô trùng theo mật độ nhất định tạo ra phân
VSV trên nền chất mang vô trùng, trong đó sinh khối VSV được chủng trong điều
kiện vô trùng bằng bơm tiêm hoặc hệ thống tiêm dịch tự động, bán tự động, sau đó
đưa vào buồng sinh trưởng ở nhiệt độ phù hợp với từng giống VSV. Sau thời gian
sinh trưởng 1 tuần sản phẩm có thể mang đi sử dụng.
Đối với phân VSV trên nền chất mang không khử trùng, ngoài công đoạn
khử trùng chất mang, các công đoạn sản xuất phân bón hoàn toàn đồng nhất với qui
trình sản xuất phân VSV trên nền chất mang khử trùng.
Trong thực tế, nhiều doanh nghiệp sản xuất phân bón VSV dạng lỏng và
dạng bột sinh khối VSV đông khô. Để sản xuất phân bón VSV dạng lỏng, trong quá
trình chuẩn bị môi trường người ta bổ sung vào môi trường chất bảo quản, đó là hợp
chất polyme (PB 40, Gum arabic v.v...) với liều lượng 0,5% so với thể tích môi
trường nuôi cấy. Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được bảo quản lạnh, ly tâm
thu sinh khối và tiến hành phối trộn vào chất mang. Cuối cùng đóng gói tạo sản
phẩm phân bón vi sinh vật dạng lỏng.
Phân VSV dạng bột đông khô là sản phẩm trong đó sinh khối VSV sau lên
men được ly tâm loại bỏ nước tự do và đông khô trong thiết bị đông khô. Sản phẩm
tạo ra được đóng gói với chất mang hoặc không có chất mang.
1.3.2.4. Yêu cầu chất lượng và công tác kiểm tra chất lượng
Để đảm bảo chất lượng phân bón trong quá trình sản xuất cần thiết phải kiểm
tra chất lượng ở các công đoạn sản xuất sau:
- Giống gốc và chất lượng giống lên men cấp 1.
- Chất mang.
- Sinh khối VSV sau khi kết thúc lên men.
- Sản phẩm sau phối trộn sinh khối, sau thời gian sinh trưởng và bảo quản.

Phân VSV phân giải lân phải có hiệu quả đối với đất và cây trồng, ngh a là
có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng phát triển của cây trồng, đến năng suất, chất


lượng nông phẩm hoặc độ phì nhiêu của đất. Mật độ VSV trong sản phẩm phải bảo
đảm các tiêu chuẩn ban hành. Phân lân vi sinh được coi là có chất lượng tốt khi có
chứa một hay nhiều loại VSV có hoạt tính phân giải lân cao, có ảnh hưởng tốt đến
cây trồng. Mật độ vi sinh vật trong sản phẩm phải bảo đảm các tiêu chuẩn ban hành.
Bảng 1.2. Chỉ tiêu mật độ VSV trong phân bón vi sinh.
T
ê

CC
hh

M
ật

V
S
V
hV
S
V
(Nguồn: TCVN 6169:1996)
1.3.3. Phân bón vi sinh dạng lỏng
Phân bón VSV dạng rắn có những hạn chế nhất định như: thời gian sử dụng
ngắn (3 tháng), khả năng sống của VSV trong điều kiện khắc nghiệt kém, nhiều cơ
hội bị tạp nhiễm làm ảnh hưởng mật độ tế bào VSV có lợi, thời gian tác dụng lâu,
chi phí vận chuyển cao. Vì thế chế phẩm lỏng ngày càng quan trọng và phổ biến với

thời gian sử dụng lâu hơn, khả năng tồn tại trong điều kiện bất lợi cao.
Từ những hạn chế của phân bón vi sinh dạng rắn, năm 1998 tiến s Krishan
Chandra giám đốc trung tâm RCOF, đã xây dựng công nghệ phân bón sinh học dạng
lỏng tại trụ sở Bangalore. Công nghệ này là giải pháp thay thế các chế phâm phân
bón sinh học trước đây. Chế phẩm phân bón vi sinh vật dạng lỏng là một chế phẩm
đặc biệt không những bao gồm các vi sinh vật có lợi mà còn chứa các chất có thúc
đẩy VSV phát triển và bảo vệ chúng dưới các điều kiện bất lợi giúp cho thời hạn sử
dụng chế phẩm lâu hơn.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, các loại polyme được sử dụng để sản xuất chế
phẩm bởi khả năng hạn chế sự truyền nhiệt, giúp chế phẩm phân bố đều không bị kết


cặn, bảo vệ tế bào VSV khỏi những yếu tố bất lợi từ môi trường. Chẳng hạn như
Sodium alginate, Carboxyl methyl cellulose (CMC), Polyvinyl pyrrolidone (PVP),
Xanthan gum…
Theo Mahdi (2010), polysorbate 20 thương mại được gọi là Tween 20 ở
nồng độ 0,025% được tìm thấy là chất hoạt động bề mặt cho quần thể tế bào tốt
hơn. Polysorbate là một chất bề mặt không ion có tính ổn định và không độc tính
cho phép nó được sử dụng như một chất tẩy rửa và chất nhũ hóa trong một số ứng
dụng trong nước, khoa học, và dược lý.
Được biết Glycerol có khả năng bảo vệ các tế bào chống lại điều kiện bất lợi
từ môi trường, chống sự mất nước của chế phẩm lỏng trong thời gian bảo quản dài
(Somasegaran và Hoben, 1985). Ngoài ra còn hoạt động như một nguồn carbon
thay thế (Lorda và Balatti, 1996).
Việc sản xuất phân bón VSV dạng lỏng tạo ra một bước ngoặc lớn trong việc
sản xuất phân bón vi sinh vật vì nó được thiết lập dựa vào bốn đặc điểm yêu cầu
sau:
- Ổn định sinh vật trong quá trình sản xuất phân bón và lưu trữ.
- Dễ dàng phối trộn VSV vào các chế phẩm lỏng thích hợp.
- Bảo vệ VSV khỏi các yếu tố bất lợi từ môi trường từ đó tăng khả năng sống

sót của VSV có lợi.
- Giữ được hoạt tính sinh học của VSV, dễ dàng tương tác với cây trồng.
Theo Chandra và cộng sự (1999), để việc sản xuất chế phẩm phân bón dạng
lỏng có hiệu quả cao cần quan tâm đến các yếu tố ảnh hưởng sau:
a) Nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong sản xuất, vì ảnh hưởng của nhiệt độ là
khác nhau đối với các giống vi sinh vật khác nhau. Thông thường chủng VSV phối
0

vào trong chế phẩm lỏng tăng trưởng bình thường ở 37 C và có khả năng chịu đựng
0

nhiệt độ lên tới 45 C trong 2 năm hoặc nhiều hơn.
b) Môi trường


Chế phẩm phân bón vi sinh vật có hiệu quả gần như là giống nhau trong tất
cả môi trường, nhưng hiệu quả có thể giảm 20 – 25% trong điều kiện môi trường
khí hậu khác nhau. Thông thường, VSV vẫn sẽ hoạt động trong suốt thời gian bảo
quản và khi bón xuống đất vẫn sẽ duy trì hoạt động trong suốt mùa vụ hoặc trong
suốt chu kỳ cây trồng. Tuy nhiên, VSV có thể bị bất hoạt do một số yếu tố môi
trường như nhiệt độ cao, thậm chí là các VSV cạnh tranh. Không những thế nó còn
bị mất đi do quá trình rửa trôi, mưa, gió. Tầm quan trọng tương đối của yếu tố này
là cần phải lựa chọn việc sử dụng phân bón ở đâu, điều đó làm hạn chế việc sử dụng
phân bón VSV. Vì vậy, việc tạo chế phẩm phân bón VSV dạng lỏng có thể chứa các
chất phụ gia để bảo vệ VSV chống lại điều kiện bất lợi từ môi trường.
c) Ảnh hưởng pH
Độ pH đóng vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy, nó phải đảm bảo ổn
định trong phạm vi nhất định. Ngoài ra, các chất hóa học có trong đất như magie,
mangan, canxi,… làm tăng giá trị pH, khi bị ướt sương hoặc phun nước, có thể ức

chế, vô hiệu hóa môt số sinh vật. Điều kiện pH rất cao hoặc rất thấp sẽ làm bất hoạt
VSV. Vì vậy, cần phải duy trì pH bằng một chất đệm phụ gia làm cho thời gian sử
dụng tốt hơn. Duy trì pH tối ưu nâng cao tuổi thọ của một số các vi sinh vật như
Azospirillum, Azotobacter, vi khuẩn phospho hòa tan (PSM),...
d) Ổn định VSV trong chế phẩm chất lỏng
Đây là giai đoạn bảo quản chế phẩm sau sản xuất. Giai đoạn này có thể kéo
dài vài tuần đến nhiều năm. Vi sinh vật có lợi được lưu trữ trong chất lỏng chế phẩm
thích hợp cho sự ổn định và tăng trưởng của chúng. Ngoài ra, người ta còn nghiên
cứu sử dụng chất mang để cải thiện sự ổn định của VSV trong suốt thời gian bảo
quản.
e) Ảnh hưởng ánh sáng mặt trời
Các yêu cầu trong quá trình bảo quản trong đó luôn là phải bảo quản các sản
phẩm nơi mát tránh xa ánh sáng mặt trời. Bởi vì, trong ánh sáng mặt trời có các tia
có hại là tia UVB có bước sóng 280 – 320 nm và tia UVA có bước sóng 320 – 400


nm những tia này có thể gây hại đến VSV có trong chế phẩm. Người ta có thể khắc
phục bằng cách có thể bổ sung các chất phản xạ ánh sáng, tán xạ hay sử sử dung các
chất hấp thụ bức xạ, chuyển đổi thành những bước sóng ngắn để gây vô hại đến
VSV. Tuy nhiên, việc tìm ra những vật liệu hay những chất như thế rất khó khăn và
chưa có cơ sở vững chắc cho việc tránh ảnh hưởng của mặt trời đến chế phẩm tạo ra.
f) Xử lý và sử dụng chế phẩm phân bón dạng lỏng
Chế phẩm phân bón sinh học dạng lỏng đảm bảo dễ dàng xử lý và sử dụng.
Điển hình, chế phẩm phân bón lỏng có thể giúp việc duy trì phân bố VSV tránh hiện
tượng vón cục nên có thể sử dụng ngay sau thời gian bảo quản. Còn các chế phẩm
dạng bột hay viên không thể duy trì tính đồng nhất VSV. Ví dụ như trong tường hợp
5

của Azospirillum mật độ tế bào đi xuống 10 cfu/ml sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ
phòng trong khi bảo quản bằng chế phẩm lỏng trong suốt 2 năm mà vẫn duy trì mật

8

độ tế bào 10 cfu/ml. Tương tự như vậy, trong khi Azotobacter, Rhizobium ở dạng
chế phẩm rắn duy trì hạn sử dụng là 6 tháng, PSM đến 8 tháng, nhưng trong trường
hợp bảo quản trong chế phẩm lỏng Azotobacter, PSM và KMB sử dụng đến 2 năm
sau, Rhizobium lên đến 14 tháng. Điều này cho thấy sự vượt trội của chế phẩm lỏng
so với chế phẩm dạng rắn.
1.3.4. Ưu điểm của phân bón sinh học dạng lỏng
Theo Dr. Krishan Chandra và cộng sự (1999), chế phẩm phân bón dạng lỏng
có các ưu điểm sau:
- Thời gian sử dụng kéo dài hơn từ 12 – 24 tháng.
- Không gây ô nhiễm môi trường.
- Dễ tương tác với cây trồng.
0

- Có khả năng chịu được nhiệt độ lên đến 45 C trong 2 năm.
- Kiểm soát chất lượng dễ dàng.
- Hiệu quả kinh tế cao.
- Dễ dàng xử lý và lưu trữ.


Hơn nữa, vì là phân bón dạng lỏng nên VSV được bảo quản trong chế phẩm,
môi trường là chất dinh dưỡng cho VSV sinh trưởng, phát triển và bảo vệ khỏi
những vi khuẩn bất lợi. Có thể giải quyết vấn đề phân bón vsv trước đây đem lại.
1.4. Nghiên cứu trong nƣớc
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững, Việt Nam từ lâu
đã có nhiều nghiên cứu phát triển phân lân vi sinh.
Từ thập kỉ 90 của thế kỉ XX, các vi sinh vật phân giải lân sau khi nhân sinh
khối được tẩm nhiễm vào chất mang tạo thành chế phẩm vi sinh vật phân giải lân
hoặc phối trộn với chất hữu cơ tạo thành phân lân hữu cơ vi sinh vật.

Nhiều thực nghiệm trong khuôn khổ đề tài Khoa học Công nghệ 02 – 06
(Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam giai đoạn 1992 – 1995) ở nhiều
địa phương trong cả nước đã xác định việc sử dụng phân VSV phân giải lân thay
thế 30 – 50% lượng phân lân cần bón bằng quặng phosphoric mà năng suất cây
trồng không thay đổi. Sử dụng phân VSV phân giải lân có thể làm tăng 15% năng
suất cây trồng hoặc tiết kiệm 1/3 lượng phân lân hóa học cần bón (Phạm Văn Toản
và cộng sự, 2000).
Một số chế phẩm phân bón vi sinh dạng lỏng có tác dụng phân giải lân khó
tiêu đã được nghiên cứu và bán trên thị trường hiện nay như: chế phẩm Nobala của
Công ty TNHH Công nghệ nông lâm, chế phẩm lỏng Dasvila của Công ty TNHH
Dasco, phân bón vi sinh BioGro của Trung tâm nghiên cứu và ứng dụng phân bón
vi sinh thuộc Trường ĐH Khoa học tự nhiên Hà Nội.
Tuy nhiên nhìn chung cho thấy, các chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân
dạng lỏng hiện nay vẫn còn ít được biết đến, giá thành còn khá đắt đối với nhà nông
Việt Nam.
1.5. Nghiên cứu ngoài nƣớc
Phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng với những ưu điểm nổi trội, ngày
càng được nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Nhiều công trình nghiên
cứu ở châu Âu, châu Mỹ, Ấn Độ đã cho thấy những cải tiến tốt hơn so với phân bón
vi sinh phân giải lân dạng rắn nhờ bổ sung các chất bảo vệ tế bào, chất ổn định chế


phẩm, chất bảo quản…
Một nghiên cứu sơ bộ đã được tiến hành để xác định sự tồn tại của vi khuẩn
Bacillus megaterium trong chế phẩm lỏng có bổ sung chất bảo vệ tế bào PVP,
glycerol 12ml/L và nguồn đường, dưới ảnh hưởng của nhiệt độ trên cây đậu đũa.
0

10

Trong 4 tuần ở 48 C cho mật độ tế bào 4 10 cfu/ml, tăng cường lượng phosphate
hấp thu, thời gian lưu trữ lên đến 6 tháng.
Các chế phẩm trên nền chất mang rắn vốn có những hạn chế nhất định như
thời gian sử dụng thấp, khả năng sống trong điều kiện nghèo nàn thấp, ô nhiễm cao.
Đã có nhiều nghiên cứu nhằm thay thế, Calcium alginate đã được tìm thấy cho hiệu
quả tốt hơn than chì đối với Bacillus polymyxa và Pseudomonas striata
(Viveganandan và Jauhri, 2000).
Chế phẩm phân bón sinh học trên nền chất mang rắn có khả năng chịu nhiệt
0

kém, trong khi các công thức chất lỏng có thể chịu được nhiệt độ cao đến 55 C. Độ
pH trong việc xây dựng chất lỏng của PSB dao động khoảng 7,0 – 6,46,
Azospirillum 7,01 – 6,71 và Azotobacter 7,1 – 6,6 (Leo Daniel và cộng sự, 2013).
Chế phẩm lỏng được xây dựng với 0,5% Sodium alginate, sau 10 ngày nuôi
8

ủ cho mật độ tế bào trong chế phẩm 3,2 10 cfu/ml. Chế phẩm lỏng với 0,5% CMC,
8

sau 10 ngày ủ cho mật độ tế bào trong chế phẩm 0,7 10 cfu/ml (Leo Daniel và
cộng sự, 2013).
Theo Leo Daniel và cộng sự (2013), môi trường cải tiến cho chế phẩm phân
lân vi sinh dạng lỏng đã nghiên cứu trên vi khuẩn Bacillus megaterium là môi
trường Pikovskaya (g/L) gồm: chiết xuất từ nấm men 5, dextrose 10, Ca3(PO4)2 5,
KCl 0.5, MgSO4 0.2, MNSO4 0.1, FeSO4 dấu vết, (NH4)SO4 dấu vết, glycerol 10ml.
Theo Wang RinLing và cộng sự (2013), thì thành phần nuôi cấy tối ưu hoá
bao gồm: lactose 6g/L, peptone 7,45g/L, NaCl 5g/L, MgSO4.7H2O 2,46g/L, CaCl2
1,22 g/L, và K2SO4 0,087 g/L. Dưới môi trường nuôi cấy tối ưu này, số lượng các tế
bào sống của vi khuẩn Bacillus megaterium trong dịch lên men có thể đạt trên
9

2,0×10 cfu/ml.
Hiện nay, hai nước Trung Quốc và Ấn Độ đang đẩy mạnh nghiên cứu và ứng


dụng công nghệ sinh học trong sản xuất phân lân vi sinh với quy mô công nghiệp,
ứng dụng trên hàng chục triệu ha (Bạch Phương Lan, 2004).


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, thiết bị, hoá chất
2.1.1. Vật liệu
Bộ sưu tập 4 chủng VSV có khả năng phân giải phosphate khó tan tốt nhất
đã phân lập được từ mẫu đất ao Đồng Nai, mẫu vỏ cà phê ở Lâm Đồng, mẫu đất
trồng đậu ở Đắk Nông của Nguyễn Thuý Hằng (2013).
2.1.2. Thiết bị
Nồi tiệt trùng Autoclave, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy lắc, máy ly tâm,
máy đo độ hấp thụ quang học, bộ chưng cất Kjeldahl, tủ lạnh thường, tủ cấy vô
trùng, tủ ấm, kính hiển vi…
Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm,
đ a petri, Eppendorf, đũa thủy tinh, que cấy…
2.1.3. Hoá chất các môi trường sử dụng
Môi trƣờng Pikovskaya – P (g/L)
Gl
1
uc
0
Ca 5
,

3(P
(N 0
H4 ,
K
0
Cl
,
Na 0
Cl
,
M
0
gS ,
M
0
nS ,
Fe
0
S
,
Ye 0
ast ,
Môi trƣờng Nutrient Broth – NB (g/L)
Meat extract

3,0

Pepton

5,0

Môi trƣờng Ashby (g/L)


M
an
K2
H
M

2
0
0
,
0
gS ,
Na 0
Cl
,
K2 0
,
S
Ca 5
C
,
Môi trƣờng NB + Glucose – NB1 (g/L)
M
3
eat ,
Pe

5
pt
,
D- 5
gl
,
Môi trƣờng NB + Glucose + Khoáng – NB2 (g/L)
Meat extract

3,0

Pepton

5,0

D-glucose

5,0

NaCl

5,0

MgSO4.7H2O

2,46

CaCl2

1,22

K2SO4

0,087

2.2. Nội dung nghiên cứu
- Từ 4 chủng VSV có hoạt tính phân giải phosphate canxi khó tan tốt nhất
trong bộ sưu tập 19 chủng VSV của Nguyển Thuý Hằng (2013) đã phân lập được từ
mẫu đất ao Đồng Nai, mẫu vỏ cà phê ở Lâm Đồng, mẫu đất trồng đậu ở Đắk Nông.
Tiến hành kiểm tra độ thuần khiết của ống giống, đánh giá hoạt tính phân giải
phosphate canxi khó tan, khả năng sinh tổng hợp IAA, khả năng cố định đạm sau
thời gian bảo quản. Từ đó tuyển chọn ra chủng VSV hoặc các chủng VSV phối hợp
tốt nhất để sản xuất chế phẩm.
- Nghiên cứu thời gian và phương pháp lên men phù hợp với các chủng VSV
được tuyển chọn để sản xuất chế phẩm.