Nghiên cứu mã vạch di truyền cá tra (pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DI TRUYỀN CÁ TRA
(PANGASIANODON HYPOPTHALMUS) BẰNG
CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ CYTOCHROME
B

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:

ThS. Trần Nguyễn Ái Hằng

SVTH:

Huỳnh Long Anh

MSSV:

1151110052

TP.HCM, tháng 8/ 2015

Lớp : 11DSH01


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DI TRUYỀN CÁ TRA
(PANGASIANODON HYPOPTHALMUS) BẰNG
CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ CYTOCHROME
B

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:

ThS. Trần Nguyễn Ái Hằng

SVTH:

Huỳnh Long Anh

MSSV:

1151110052

TP.HCM, tháng 8/ 2015

Lớp : 11DSH01


Đ ồ án tốt nghiệ p
Hằ ng

GVHD: Trầ n Nguyễ n Ái

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và không
sao chép dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõ
ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc. Kết quả trình bày trong đề tài được thu thập
trong quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trước đây.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học của đề tài nghiên cứu
này.
TP.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện đồ án

Huỳnh Long Anh

i


LỜI CẢM ƠN

Không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp
đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt quá
trình thực tập và nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra
(Pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b” đến
nay, em đã nhận rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy Cô, gia đình, anh,
chị, bạn bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi đến Quý Thầy Cô của trường Đại học
Công Nghệ Tp. HCM nói chung, các Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực
Phẩm – Môi Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức,
các kỹ năng chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình
học tập.
Em xin gửi đến Ths. Trần Nguyễn Ái Hằng, Ths. Bùi Thị Liên Hà, kỹ sư
Lê Ngọc Thùy Trang cùng các anh chị của phòng thí nghiệm Di truyền phân tử,
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II lời cảm tạ sâu sắc vì đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em trong suốt quá trình thực tập và
nghiên cứu đề tài.
Xin cảm ơn toàn thể các bạn trong lớp 11DSH01 đã đóng góp ý kiến, giúp
đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Lời cảm ơn con xin gửi đến Ba Mẹ và gia đình thân yêu đã luôn yêu
thương, đùm bọc con, là điểm tựa vững chắc và niềm tin của con trong suốt cuộc
đời.
Bước đầu đi vào thực tế tìm hiểu nghiên cứu khoa học, kiến thức của em
còn nhiều hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu
sót, kính mong nhận được sự góp ý của Quý Thầy Cô để kiến thức của chúng em
ngày càng hoàn thiện hơn và rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình
học tập và làm việc sau này.
Xin kính chúc các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh
dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình. Đồng kính
chúc các Thầy Cô, anh chị của phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Viện Nghiên

ii


Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II luôn dồi dào sức khỏe và đạt được nhiều thành
công tốt đẹp trong cuộc sống.
TP.Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện đồ án

Huỳnh Long Anh

3


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................
i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.............................................................................
vii

MỞ

ĐẦU

................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3
1.1. Tổng quan về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus) ...................................
3
1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm chung ......................................................................................... 3
1.1.2.1. Đặc điểm sinh học ............................................................................... 3

1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái và môi trường sống .............................................. 3
1.1.2.3. Đặc điểm sinh trưởng .......................................................................... 4
1.1.2.4. Đặc điểm sinh sản................................................................................ 4
1.1.3. Tình hình nuôi và thương mại cá Tra ở Việt Nam .................................... 5
1.2. Các phương pháp định danh cá da trơn ...........................................................
7
1.3. Phân loại bằng sinh học phân tử (barcoding) ..................................................
9
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................
12
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu….……………………………………… 12
2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị..........................................................................
12
2.1.1. Hóa chất thí nghiệm ................................................................................. 12
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ................................................................ 12

4


2.2. Hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR ............................................................
13
2.3. Hóa chất sử dụng để chạy điện di ..................................................................
13
2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................
15

5


2.4.1. Phương pháp thu mẫu .............................................................................. 15

2.4.1.1. Mẫu cá Tra......................................................................................... 15
2.4.1.2. Mẫu cá da trơn khác .......................................................................... 15
2.4.2. Phương pháp định danh ........................................................................... 15
2.4.2.1. Phương pháp định danh bằng hình thái ............................................ 15
2.4.2.2. Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử................................ 17
2.4.3. Phương pháp thu và bảo quản mẫu phục vụ cho PCR ............................ 17
2.4.4. Phương pháp chạy PCR ........................................................................... 18
2.4.4.1. Khái niệm .......................................................................................... 18
2.4.4.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR ......................................................... 20
2.4.5. Phương pháp tách chiết DNA .................................................................. 23
2.4.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose............................................ 25
2.4.6.1. Chuẩn bị agarose gel ......................................................................... 25
2.4.6.2. Đặt mẫu DNA vào giếng ................................................................... 25
2.5. Bố trí thí nghiệm............................................................................................. 27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 28
3.1. Thu mẫu cá Tra và các loài cá da trơn khác .................................................. 28
3.2. Định danh bằng hình thái học ........................................................................ 28
3.2.1. Định danh cá Tra tự nhiên (Pangasius hypophthalmus)......................... 29
3.2.2. Định danh cá Hú (Pangasius conchophilus) ........................................... 31
3.2.3. Định danh cá Basa (Pangasius bocourti) ................................................ 32
3.2.4. Định danh cá Vồ Đém (Pangasius larnaudiei)....................................... 33
3.2.5. Định danh cá Xác Sọc (Pangasius macronemus) ................................... 35
3.2.6. Định danh cá Bông Lau (Pangasius krempfi) ......................................... 36
3.2.7. Định danh cá Vồ Cờ (Pangasius sanitwongsei)...................................... 38


3.3. Kết quả tách chiết DNA ................................................................................. 40
3.3.1. Mẫu cá Tra chọn giống của Viện II ......................................................... 40
3.4. Định danh bằng sinh học phân tử................................................................... 41
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi cytochrome b............ 41

3.4.2. Thí nghiệm 2: Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR .................... 42
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát kích thước sản phẩm PCR của cá Tra và 6 mẫu
cá da trơn ............................................................................................................ 43
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 45
4.1. Kết luận........................................................................................................... 45
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 46


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

bp

: Base pair

cm

: Centimet

Cyt b

: Cytochrome b

dNTP

: Deoxynucleotide triphosphate

DNA

: Deoxyribonucleic acid

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long
EDTA

: Ethylene diaminetetra acetic acid

µg

: Microgam

µM

: Micromol/lít

mM

: Milimol/lít

Kb

: Kilobases

TBE

: Tris – borate-EDTA

TE

: Tris-EDTA

Ta

: Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)

RNA

: Ribonucleic acid

U

: Đơn vị tính hoạt tính của Taq

UV

: Ultra Violet

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Chỉ tiêu định danh hình thái ................................................................. 16
Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR .................................................... 22
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .................................................... 22
Bảng 2.4: Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA .............................................. 24
Bảng 3.1: Số lượng và kí hiệu mẫu cá .................................................................. 28
Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .................................................... 41
Bảng 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .................................................... 42

8

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cá Tra (Pangasius hypophthalmus)........................................................ 3
Hình 1.2: Ty thể mtDNA......................................................................................... 9
Hình 2.1: Thang chuẩn 1kp ................................................................................. 14
Hình 2.2: Thang chuẩn 50 bp .............................................................................. 14
Hình 2.3: Phản ứng PCR ....................................................................................... 21
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách chiết DNA ........................................................... 23
Hình 2.5: Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel ............. 26
Hình 2.6: Sơ đồ quy trình nghiên cứu................................................................... 27
Hình 3.1: Cá Tra .................................................................................................... 29
Hình 3.2:Bong bong kéo dài qua lỗ hậu môn ....................................................... 30
Hình 3.3:Răng khẩu cái và răng lá mía nối với nhau thành hình vòng cung .......
30
Hình 3.4: Cá Hú..................................................................................................... 32
Hình 3.5: Cá Basa .................................................................................................. 33
Hình 3.6: Cá Vồ đém............................................................................................. 34
Hình 3.7:Cá Xác sọc.............................................................................................. 36
Hình 3.8: Cá Bông lau ........................................................................................... 37
Hình 3.9: Cá Vồ cờ................................................................................................ 39
Hình 3.10: Kết quả chạy điện di trên gel của mẫu cá Tra chọn giống của Viện
Thủy sản II. ........................................................................................................... 40
Hình 3.11: Kết quả tối ưu phản ứng PCR ............................................................. 41
9


Hình 3.12: Kết quả chạy điện di............................................................................ 43
Hình 3.13: Kết quả điện di 7 mẫu cá da trơn ........................................................ 44

10

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cá Tra là đối tượng chủ lực của Việt Nam với sản lượng xuất khẩu không
ngừng tăng lên trong thời gian qua. Do hiệu quả kinh tế và nhu cầu tiêu dùng cá
Tra, nhiều nước trong khu vực cũng đã xác định cá Tra là đối tượng quan trọng
trong nuôi trồng thủy sản. Bên cạnh cá Tra, các loại cá da trơn như: cá Bông
Lau, cá Hú, cá Xác Sọc, cá Vồ Đém, cá Vồ Cờ, cá Basa,… cũng được xem là
đối tượng nuôi trồng tiềm năng. Tuy nhiên, việc phân loại các loài cá này bằng
phương pháp phân loại bằng hình thái gặp khá nhiều khó khăn. Phương pháp
này đòi hỏi mẫu vật phải còn nguyên hình dạng hay nói cách khác là phải còn
nguyên cả con, điều này sẽ rất bất tiện trong nhiều trường hợp. Thêm vào đó, sự
lai tạp giữa các loài trong cùng giống hoặc cùng họ sẽ dẫn đến nhiều khó khăn
trong việc phân loại bằng hình thái. Khắc phục những nhược điểm của phương
pháp phân loại dựa vào hình thái, phương pháp định dạng sinh học phân tử
(barcoding) được sử dụng trong một mức độ rộng, việc tạo ra DNA mã vạch ra
cho mỗi loài cần được cung cấp một chìa khóa để định nghĩa các mẫu chưa biết.
Trình tự mã vạch được tìm thấy từ cơ thể cá, cá khúc, vây, cá bột, trứng và ấu
trùng từ bất cứ mẫu vật nào có thể tìm thấy với trình tự trong BOLD để thực
hiện được mục đích này, gen ty thể (COI, cytochrome b,…) là những chỉ thị đầy
triển vọng cho định danh các loài và đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu
DNA mã vạch.
Ngoài ra khi thị trường toàn cầu cho ngành thủy sản và các sản phẩm nuôi
trồng thủy sản được mở rộng, dán nhãn sai của các sản phẩm này đã trở thành
một mối quan tâm ngày càng tăng trong lĩnh vực an toàn thực phẩm. Kỹ thuật
nhận dạng các loài cá Tra bằng phương pháp sinh học phân tử giữ tiềm năng,
đánh giá chính xác nhanh chóng các dán nhãn sản phẩm trên thị trường thế giới.
Do đó đề tài: “Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra (Pangasianodon
hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b”giúp giải quyết

những khó khăn trên.

1


2. Mục tiêu nghiên cứu
 Phân loại chính xác cá Tra (P. hypophthalmus).
 Xác định được bộ chỉ thị phân tử cytochrome b nhằm kiểm định cá Tra (P.
hypophthalmus) có độ tin cậy > 95%.
3. Nội dung nghiên cứu
 Thu mẫu cá Tra và các loài cá da trơn khác thuộc họ cá Tra.
 Định danh bằng hình thái học.
 Định danh bằng sinh học phân tử.


Tối ưu phản ứng PCR.



Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR.



Bước đầu thử nghiệm định danh trên cá Tra.

4. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án gồm các chương:



Chương 1: Tổng quan tài liệu.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.



Chương 3: Kết quả và thảo luận.



Chương 4: Kết luận và kiến nghị.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cá Tra (Pangasius hypophthamus)

Giới:

Animalia

Ngành:
Chordata
1.1.1.
Vị trí phân
loại
Phân
ngành:
Vertebrata
Lớp:
Phân lớp:

Actinopterygii
Pangasius
Neopterygii

Hình 1.1: Cá Tra

Bộ:

Siluriformes

Họ:

Pangasiidae

Chi:

Pangasianodon

Loài:

Pangasianodon hypophthalmus

hypophthalmus

1.1.2. Đặc điểm chung
1.1.2.1. Đặc điểm sinh học
Cá Tra là cá da trơn, thân dài, dẹp ngang, lưng xám đen, bụng hơi bạc,
miệng rộng, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to. Vây lưng cao, có một gai
cứng có răng cưa. Vây ngực có ngạnh, bụng có 8 tia phân nhánh, trong khi
các loài khác có 6 tia. Cá Tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các

loài cá khác. Cá có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí
và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan.
Họ cá Tra (Pangasiidae) thuộc bộ cá da trơn hay cá nhéo (silurformes),
phân bố tương đối rộng từ Tây Nam Á và bao gồm một số loài có kích thước
lớn. Các loài cá thuộc họ Pangasiidae được nhiều khoa học trên thế giới
quan tâm từ rất lâu do thịt ngon và đặc biệt có giá trị kinh tế cao.
1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái và môi trường sống
Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất
hữu cơ, oxy hòa tan thấp, có thể nuôi với mật độ cao và có thể sống được ở
vùng nước lợ (nồng độ muối 15oC, nhưng chịu nóng tới 39oC.


Cá Tra phân bố tự nhiên ở lưu vực sông Mê Kông và được coi là cá bản
địa của Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan. Ở Việt Nam, cá bột và cá
giống vớt được chủ yếu trên sông Tiền, cá trưởng thành thấy nhiều trong các
ao nuôi và ít khi tìm thấy trong tự nhiên. Cá Tra có thân dài, không vẩy, màu
sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng và có 2 đôi râu dài. Cá sống
chủ yếu trong nước ngọt, có thể chịu đựng được nước phèn với pH >= 5, ít
chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 15oC nhưng có thể chịu nóng tới 39oC.
1.1.2.3. Đặc điểm sinh trưởng
Cá Tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, lúc còn nhỏ cá tăng
nhanh về chiều dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng đạt chiều dài từ 10 – 12
cm, có khối lượng khoảng 14 – 15 g. Từ khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng
trọng lượng nhanh hơn nhiều so với chiều dài cơ thể. Cá nuôi trong ao 1 năm
đạt từ 1 - 1,5 kg/con (năm đầu), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn,
có khi đạt tới 5 - 6 kg/năm tuỳ thuộc môi trường sống và sự cung cấp thức ăn
cũng như loại thức ăn có hàm lượng đạm nhiều hay ít.
Cá con thích ăn mồi tươi sống, có thể ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp.
Khi lớn cá Tra ăn tạp, thiên về động vật và dễ chuyển đổi thức ăn. Trong ao
nuôi, cá Tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức ăn bắt

buộc như: mùn, bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, động vật đáy,… do vậy
khi nuôi trong ao, năm đầu tiên cá có thể đạt 1 – 1,5 kg/con, những năm tiếp
theo cá tăng trọng nhanh hơn. Cá Tra đực thành thục ở tuổi thứ 2 và cá cái
thành thục ở tuổi thứ 3 trở lên. Cá Tra không có cơ quan sinh dục thứ cấp
nên khó phân biệt đực cái bằng hình thái.
1.1.2.4. Đặc điểm sinh sản
Cá Tra không sinh sản trong ao nuôi, cá có tập tính di cư sinh sản trên
những khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp. Trong tự nhiên chỉ gặp cá
thành thục trên sông ở địa phận của Campuchia và Thái Lan. Ở Việt Nam, cá
Tra cũng không có bãi sinh sản tự nhiên. Cá sinh sản ở Campuchia, cá bột
theo dòng nước về Việt Nam.


Tuổi thành thục của cá Tra đực ở tuổi thứ 2 và cá Tra cái ở tuổi thứ 3.
Cá Tra không có cơ quan sinh dục phụ, nếu chỉ nhìn hình dáng bên ngoài thì
khó phân biệt được cá đực và cá cái. Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở
cá đục phát triển lớn gọi là buồng tinh hay tinh sào, ở cá cái gọi là buồng
trứng hay noãn sào. Mùa vụ sinh sản của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5
– 7 âm lịch hàng năm. Trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg.
Trong sinh sản nhân tạo, có thể nuôi thành thục sớm và cho cá đẻ sớm
hơn trong tự nhiên (từ tháng 3 dương lịch hàng năm), cá Tra có thể tái phát
dục 1 – 3 lần trong một năm.
1.1.3. Tình hình nuôi và thương mại cá Tra ở Việt Nam
Từ trước những năm 1970, kỹ thuật nuôi còn hạn chế thì nghề nuôi cá
Tra còn rất mới. Nguồn cá giống trước đây hoàn toàn phụ thuộc vào việc vớt
cá giống ngoài tự nhiên với sản lượng cá bột mỗi năm dạt khoảng 500 – 800
triệu con. Tuy nhiên, do biến động của điều kiện môi trường và sự khai thác
quá mức của con người, sản lượng bột cá ngày càng suy giảm đáng kể, ngày
nay chỉ đạt 15 – 25 % so với giai đoạn trước. Ở nước ta, nghiên cứu sinh sản
nhân tạo cá Tra được bắt đầu năm 1978 và hiện nay đã có thể chủ động giải

quyết vấn đề số lượng con giống cho nghề nuôi cá Tra.
Trong nhiều năm gần đây, cá Tra liên tiếp là một trong những mặt hàng
xuất khẩu chủ lực thủy sản Việt Nam, góp phần vào sự tăng trưởng của xuất
khẩu thủy sản nói riêng và nền kinh tế đất nước nói chung. Cá Tra được nuôi
tập trung tại khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với sản lượng cá
Tra nuôi đến hàng trăm nghìn tấn. Hình thức nuôi rất đa dạng, từ dạng ao nuôi
quy mô nhỏ đến các quy mô lớn (quy mô công nghiệp). Các hệ thống nuôi cá
Tra chính ở ĐBSCL là: ao đất, bè nỗi và nuôi đăng quầng ở vùng nước tự
nhiên. Sự phát triển của hệ thống nuôi bè và nuôi đăng quầng đã giảm dần
theo thời gian do mô hình nuôi này kém hiệu quả kinh tế như cá nuôi chậm
lớn, tỷ lệ sống thấp, sự bùng phát dịch bệnh thường xuyên và sự ô nhiễm
nước. Vì vậy nuôi cá Tra trong bè và đăng quầng phát triển chỉ trong khoảng
thời gian ngắn từ năm 2000 đến 2004. Cho đến nay phương pháp nuôi cá Tra


trong ao đang được xem là thành công trong hệ thống nuôi thủy sản ở Việt
Nam. Các tỉnh nuôi cá Tra với sản lượng cao phục vụ xuất khẩu có thể kể đến
là vùng ĐBSCL bao gồm: An Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh
Long, Bến Tre, Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh, Kiên Giang và 2 tỉnh Tây
Ninh và Quảng Nam với tổng diện tích nuôi 5509 ha (năm 2011) và dự kiến
đến năm 2020 có thể đạt đến 13000 ha. Trong đó Cần Thơ, An Giang và
Đồng Tháp là vùng nuôi cá Tra lớn nhất cả nước, sản lượng cá Tra chiếm trên
75 % so với tổng sản lượng cá Tra cả nước.
Nuôi cá Tra thực sự phát triển nhanh từ năm 2000 do sản phẩm được
xuất khẩu sang các nước ngày càng nhiều, mang lại hiệu quả cao và cá Tra đã
trở thành một mặt hàng chiến lược quan trọng, góp phần đưa Việt Nam trở
thành nước đứng thứ 6 thế giới về xuất khẩu thủy sản, thứ 5 về nuôi trồng
(Dương Tiến Thể, 2009).
Năm 2011, đã có trên 230 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu cá Tra, sản
lượng đạt khoảng 1,2 triệu tấn, chiếm 30 % tổng kim ngạch xuất khẩu cả

nước, giá trị xuất khẩu đạt 1,856 tỷ USD, tăng gần 26,5 % so với năm 2010.
Một số thị trường xuất khẩu cá Tra lớn ở Việt Nam: thị trường EU là thị
trường tiêu thụ chính, thị trường Mỹ, thị trường Mehico, thị trường ASEAN,
Trung Quốc và Hồng Kông.
Việt Nam đang đối mặt với hàng rào thuế quan, sự thay đổi của thị
trường và nhiều chính sách về an toàn thực phẩm từ các nước nhập khẩu.
Cuối năm 2010, cá Tra Việt Nam bị các thành viên của quỷ quốc tế bảo vệ
thiên nhiên (WWF) ở 6 nước EU (Đức, Áo, Thùy Sỹ, Bỉ, Na Uy và Đan
Mạch) chuyển từ “danh sách da cam” (sản phẩm có thể cân nhắc sử dụng)
sang “danh sách đỏ” (sản phẩm không nên sử dụng). Sau hơn 1 tháng kể từ
buổi ký kết biên bản thỏa thuận hợp tác phát triển cá Tra Việt Nam theo
hướng bền vững, WWF ở các nước EU đã cho cá Tra Việt Nam ra khỏi danh
sách đó. Tuy nhiên, điều đó đã làm ảnh hưởng đến hình ảnh cá Tra Việt Nam
trên thị trường thế giới.


Xuất khẩu cá Tra Việt Nam cũng đang đứng trước gian lận thượng mại
do một số công ty Việt Nam câu kết với nước ngoài làm mất uy tín của cá Tra
trên thị trường quốc tế, tình trạng bán phá giá lẫn nhau để giành hợp đồng, sự
cạnh tranh không lành mạnh làm trầm trọng thêm tình trạng mất cân đối cung
– cầu, ảnh hưởng tới chất lượng, hiệu suất kinh doanh.
1.2. Các phương pháp định danh cá da trơn
1.2.1. Phân loại bằng hình thái
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân loại và định dạng họ cá Tra
(Pangasiidae) còn ít, gồm các công trình định loại của một số tác giả: Mai
Đình Yên et al (1992), Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993). Các
tác giả trên đều dựa vào số lượng các tia vây, hình dạng các tia vây, thân và
miệng, hình dạng và số lượng răng để định danh một số loài cá thuộc họ
Pangasiidae với 14 loài với tên Việt như sau: Pangasianodon hypophthalmus
- Cá Tra nuôi, Pangasius – Cá Tra xiêm, Helicophagus waandersii – Cá Tra

chuột, Pangasianodon gigas – Cá Tra dầu, Pangasius kunyit – Cá Tra nghệ,
Pangasius micronema – Cá Tra, Pangasius macronema – Cá Xác Sọc,
Pangasius larnaudii – Cá Vồ Đém, Pangasius sanitwongsei – Cá Vồ Cờ,
Pangasius bocourti – Cá Basa, Pangasius pleurotaenia – Cá Xác Bầu,
Pangasius conchophilus – Cá Hú, Pangasius polyuranodon – Cá Dứa,
Pangasius krempfi – Cá Bông Lau. Trong đó, có 6 loài cá da trơn được xem là
phổ biến và có giá trị kinh tế là: cá Tra nuôi, cá Basa, cá Xác sọc, cá Vồ đém,
cá Hú, cá Bông lau (Cohen, 2009).
Năm 2009, tác giả Phạm Đình Văn đã điều tra thành phần loài và xây
dựng bộ mẫu về các loài cá có giá trị kinh tế, đặc biệt là các giống, loài trong
họ cá Tra (Pangasiidae), theo tác giả, họ cá Tra có thân tương đối dài, phần
bụng tròn hoặc có lườn bụng, miệng ở mút mõm hoặc dưới. Răng nhọn trên
hai hàm, xương lá mía và xương khẩu cái mọc thành dãy ghép liền hoặc không
ghép liền với các hình dạng khác nhau; cá biệt các loài không có răng. Trong
14 loài ghi nhận này, đặc biệt có loài cá Tra nghệ P. kunyit mới xác nhận gần
đây tại An Giang (Vương Học Vinh et al, 2012). Theo tác giả cá Tra nghệ P.


kunyit có 2 đặc điểm có thể phân biệt với cá da trơn khác là trên hai nắp mang
có vết hình rẻ quạt và vi lưng cá có tia vi cứng luôn dựng thẳng đứng, không
nằm sát xuống mặt lưng ngay cả khi chúng ta dùng tay áp sát vào.
Theo tác giả Roberts và Vilenciennes (1991), họ cá Tra (Pangasiidae)
vùng Đông Nam Á gồm có hai giống: giống Helicophagus Bleeker, 1858 và
giống Pangasius Valemciennes, 1940 có 19 loài. Sau đó tác giả Rainboth
(1996) đã bổ sung thêm 2 giống mới là: Pangasianodon Chevey, 1930 và
Petropagasius Flowe, 1937. Một nghiên cứu nữa của Rainboth (1996) nghi
vấn về giống Pseudolais như là một giống độc lập và được coi là một phân
giống của Pangasius. Theo Wikipedia tiếng Pháp, họ Pangasiidae có ba
giống: Sinopangasius (1 loài), Helicophagus (3 loài) và Pangasius (27 loài).
Tuy nhiên theo vài tài liệu cùa FishBase, giống và loài Sinopangasius được

coi là từ đồng nghĩa của Pangasius kempfi (cá Bông lau).
Như vậy, có thể phân loại họ Pangasius có hai giống và giống Pangasius
có 24 loài. Các loài hoặc dưới loài thuộc giống Pangasius có hình thái rất
giống nhau, gây nhiều khó khăn trong việc phân loại trong thời gian vừa qua.
Chẳng hạn đối với cá dứa, Pangiasius polyuranodon Bleeker 1931, việc phân
loại chủ yếu dựa trên hình dạng cơ thể, số lượng râu, răng lá mía, răng khẩu
cái, vị trí lỗ mũi, vị trí sắc tố xuất hiện và các đặc điểm ở bụng (Smith, 1945).
Các loài cá Tra đặc trưng bởi sự kết hợp của bóng hơi, răng vòm miệng, vây,
lược mang và màu sắc mẫu (Roberts và Vidthayanon, 1991; Vidthayanon và
Roongthongbaisuree, 1993).
Phân loại họ Pangasiidae cũng như các họ khác còn dựa trên sự khác
biệt về giải phẫu bộ máy Weber (Nelson, 1967; Burgess, 1989) và giả thuyết
này đã được chấp nhận rộng rãi. Bộ máy weber là một cấu trúc giải phẫu kết
nối bóng hơi với hệ thống thính giác khi nó được phát triển đầy đủ trong cơ
thể cá trưởng thành, các yếu tố của bộ máy đôi khi được gọi chung là các
xương nhỏ Weber (FishBase, 2007). Các chỉ tiêu hình thái để tách giống
Pangasianodon ra khỏi giống Pangasius là miệng có dạng trước (terminal
mouth), có 8 – 9 tia vi ngực; loài P. gigas có 7 tia vi lưng và không có lược
mang (gill rakers), trong khi loài P. hypophthalmus có 6 tia vây lưng và lược


mang rất phát triển. Theo Roberts và Vidthayanon (1991), các giống
Pangasianodon

Chevey,

1930,

Pteropangasius

Fowler,

1937

và

Sinopangasius Chang and Wu, 1965 là các đồng danh (synonyms) của giống
Pangasius.
Mặc dù phân loại hình dựa vào hình thái học đạt được những kết quả
nhất định đối với họ Pangasiidae, nhưng không phải lúc nào cũng có các kết
quả chính xác. Trong nhiều trường hợp, hình thái bị giới hạn do ảnh hưởng
của điều kiện sống, hoặc sản phẩm cần phân loại ở dạng chế biến,… Việc xác
định trở nên khó khăn hoặc thậm chí không thể. Do đó, phát triển các phương
pháp mới để xác định loài nhanh và chính xác là điều cần thiết.
1.2.2. Phân loại bằng sinh học phân tử
1.2.2.1. Ty thể

Hình 1.2: Ty thể mtDNA
Mặc dù hầu hết DNA được chứa trong NST nằm trong nhân, ty thể cũng
có một số ít DNA riêng (được biết đến như DNA ty thể hay mtDNA).
Ty thể là những cấu trúc nằm bên trong tế bào, chuyển hóa năng lượng từ
thức ăn thành dạng tế bào có thể sử dụng được. Mỗi tế bào chứa đựng hàng
trăm đến hàng ngàn ty thể, nằm lơ lửng trong tế bào chất xung quanh nhân.


Cytochrome b nằm ở vị trí giữa ubiquinon và cytochrom c. Nó có khối
lượng phân tử vào khoảng 17.000 (monomer) và có khuynh hướng tự ngưng tụ
mạnh mẽ để tạo thành dạng trùng hợp cao phân tử với khối lượng có thể lên
tới trên 4 triệu cytochrome b liên kết rất chặt chẽ với màng trong ty thể.
Cytochrome b nằm trong phức hợp III (ubiquinon-cytochrom creductase): có khối lượng tiểu phần vào khoảng 300.000 (protein + lipid) và

có 6 đến 8 chuỗi polypeptid cấu thành. Trong đó, hai hay ba chuỗi polypeptid
có chứa cytochrome b, một chuỗi chứa cytochrom c1 và một chuỗi chứa trung
tâm sắt-lưu huỳnh-protein; một chuỗi polypeptid có thể liên kết với atimycin
và các chuỗi còn lại chưa rõ chức năng. Protein của cytochrome b rất kỵ nước
và người ta cho rằng: chất truyền điện tử này cũng giống như ubiquinon là
định vị giữa lớp lipid kép của màng trong ty thể.
DNA ty thể gồm 37 gen, tất cả đều là tiềm năng cho chức năng bình
thường của ty thể. Ba mươi gen điều khiển sinh tổng hợp enzyme phosphoryl
hóa oxi hóa. Những gen còn lại điều khiển tổng hợp những phân tử gọi là
RNA vận chuyển (tRNA) và RNA ribosome (rRNA), những chất hóa học thân
thiết với DNA. Ba loại phân tử RNA này giúp lắp ráp khuôn tổng hợp amino
acid hình thành protein có chức năng. Trong số 37 gen của ty thể, trình tự
COI, cytochrome b, tRNA được xem là những trình tự gen ổn định, có khả
năng sử dụng cho việc định danh bằng sinh học phân tử.
1.2.2.2. Sử dụng gen ty thể cho việc định danh các loài thủy sản
COI thuộc hệ gen ty thể thường được sử dụng trong các nghiên cứu quan
hệ di truyền, phân loại và giám định các loài. Lợi ích từ việc sử dụng vùng gen
COI là đoạn trình tự ngắn để có thể giải trình tự một cách nhanh chóng và
không tốn kém. Thêm vào đó, trật tự nucleotit trong đoạn COI có tính bảo tồn
rất cao nên lợi thế trong việc xác lập nên các bộ mã vạch di truyền cho nhiều
loài động vật, trong đó có cá. Gene COI tham gia vào quá trình vận chuyển
electron trong giai đoạn hô hấp của vi sinh vật. Theo đó, các gene được sử
dụng cho nghiên cứu mã vạch được tham gia vào các phản ứng chìa khóa của
sự sống: dự trữ năng lượng (khi cần giải phóng nó để tạo thành ATP). Do đó,


các vùng trình tự thay thế đã được đề xuất sử dụng làm mã vạch DNA cho
nhóm này.
Bên cạnh COI, trình tự của cytochrome b và 16s RNA (16S) thuộc gen
ty thể (mtDNA) cũng nằm trong số các chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi

nhất cho việc nhận dạng các loài cá (Kochzius, 2009; Telatchea, 2009), kiểm
soát thủy sản (Marko, 2004) và định danh loài (Kochzius, 2003).
Cơ sở dữ liệu đã được thiết lập, có chứa trình tự cytochrome b hoàn
chỉnh (www.fishTrace.org), cho phép xác định, phân loại mẫu dựa trên một
trình tự cytochrome b của mẫu. Các nghiên cứu xác định các loài sử dụng
cytochrome b có thể kể đến là nghiên cứu trên cá bẹt, cá cơm, cá chình và
nhiều loài cá biển khác (Teletchea et al., 2005; Santaclara và et al., 2006). Do
mức độ tương đồng giữa các loài đa dạng cao và các loài cá có độ đa dạng
thấp, trình tự cytochrome b có thể thể hiện đột biến và cho phép phân biệt các
loài có liên quan chặt chẽ với nhau (Mackie et al., 1999; Aranishi et al.,
2005a). Một số nghiên cứu cũng đã sử dụng vùng gen của mtDNA mã hóa cho
cytochrome b và chuỗi tRNA lân cận (tRNA Glu – cyt b) để phát hiện các loài
như cá bơn, cá tuyết, cá tầm và cá hồi (Wolf et al., 1999; Sanjuan và
Comesana 2002; Akasaki et al., 2006).


CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
 Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di
truyền phân tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II (116
Nguyễn Đình
Chiểu, Phường Đakao, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh).
 Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ 1/2015 đến 7/2015.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất thí nghiệm



Nước cất.
Ethanol 70 %, 96 %, 100 %.



Tris-HCl.



Tris-Base.



EDTA.



SDS.



NaCl



Acid boric.



NaOH.



HCl.



Bộ DNA mix (Promega).



Bộ DNA maker (BIOLINE).
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm




Eppendorf: 0.2 ml, 1.5 ml.
Đầu tip các loại.



Trip 8, 12.



Plates 96 well PCR.



Đèn cồn.



Kéo, kẹp cắt mẫu.



Cốc thủy tinh 100, 1000 ml.



Ống đong 500, 1000 ml.



Micropipet các loại: 0.5 – 10 µl, 10 -100 µl,100– 1000 µl (BIO-RAD).