ứng dụng chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh lý cây trồng

TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU
BỆNH LÝ CÂY TRỒNG
Trần Văn Dương
1. Mở đầu
Sự phát hiện ra enzym giới hạn (Smith & Wilcox, 1970) và phương pháp
PCR (Mullis & Faloona, 1987) là cơ sở cho các phương pháp chỉ thị phân tử như
RFLP (Botstein et al. 1980 ), microsatellites (Weber & May và Litt & Luty, 1989),
RAPD (Welsh & McClelADN, 1990), AFLPs (Vos et al. 1995), v.v. Các phương này
cho phép xác định các chỉ thị phân tử, lập bản đồ liên kết gen, đánh giá tính đa
hình ADN...(1,2). Tuỳ những nghiên cứu cụ thể mà chỉ thị nào sẽ được lựa chọn
sử dụng. Tuy nhiên, về cơ bản ta có thể sử dụng bất cứ chỉ thị nào trong đánh giá
tính đa hình và lập bản đồ gen.
Ở Việt Nam đã bước đầu ứng dụng thành công các chỉ thị này vào nghiên
cứu gen, nghiên cứu tính đa hình trong sinh giới, tìm chỉ thị liên quan tới mội số
tính trạng …(3,4)
Bệnh ở thực vật do nhiều nguyên nhân. Có thể do côn trùng (sâu xanh, bọ
xít…), nấm (fuccinia arachidis gây bệnh gỉ sắt ở lạc, cà chua), vi khuẩn
(Xanthomonas oryze gây bệnh bạc lá lúa) hoặc virut (bệnh xoan lùn ở bông)… Tuy
nhiên, trong cùng một loài thường có những giống mang gen kháng các bệnh trên.
Chúng chủ yếu là các giống hoang dại, hoặc một số giống địa phương. Đây thực
sự là nguồn nguyên liệu quý để các nhà chọn giống dùng để lai tạo ra các giống
mang gen kháng. Bằng phương pháp chỉ thị phân tử người ta xác định các chỉ thị
ADN liên quan tới gen kháng các bệnh đó. Chỉ thị này có thể liên kết chặt với gen
kháng hoặc có thể chính là gen đó (tuỳ theo từng phương pháp cụ thể). Nhờ có sự
hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp các nhà chọn giống tiết kiệm thời gian chi phí
trong quá trình chọn tạo (5). Chính vì những hữu ích và tiện dụng của chỉ thị phân
tử trên chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xác định chỉ thị phân tử liên quan
đến bệnh rỉ sắt và héo xanh vi khuẩn ở cây lạc bằng một số kỹ thuật sinh học
phân tử” mong muốn tìm hiểu các chỉ thị phân tử để chẩn đoán bệnh giúp đẩy
nhanh quá trình chọn giống.
2. Tổng quan lài liệu

2.1.Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
2.1.1Nguyên lý
Về nguyên lý, kỹ thuật RFLP dựa trên thực tế của sự biến dị và tái tổ hợp tự nhiên
trong bộ gen ADN là nguyên nhân vài vị trí enzyme cắt giới hạn bị mất, được tạo
ra hay được sắp xếp lại(6). Điều này dẩn đến khi sợi ADN bị cắt thành nhiều đoạn
nhỏ bởi các enzym hạn chế thì giữa các giống/loài sẽ có những phân đoạn khác
nhau về kích thước hay chiều dài.
2.1.2Phương pháp
RFLP của ADN nhân là trình tự ADN có vị trí giới hạn ở 2 đầu và một trình tự đích
ở giữa và không thể nhận biết bằng mắt thường được (do kích thước ADN quá
lớn). Người ta phải dùng mẩu dò có gắn phóng xạ hay huỳnh quang để nhận biết
các phân đoạn cắt hạn chế. Khi mẩu dò liên kết với ADN đích theo nguyên tác bổ
sung, người ta có thể xác định được những phân đoạn cắt hạn chế riêng biệt từ
một hỗn hợp các phân đoạn của ADN nhân trong chế phẩm xử lý cắt hạn chế.
RFLP sản xuất ra một loạt băng khi lai Southern được thực hiện với sự kết hợp
đặc biệt của enzym hạn chế và trình tự mẩu dò. Để thực hiện tốt kỹ thuật này cần
phải có một loạt các đoạn ADN mẫu dò. Tập hợp các mẫu dò đó được gọi là thư
viện (7,8).
Kỹ thuật RFLP có thể được mô tả như sau: cắt ADN bằng một enzym giới hạn nào
đó. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose để phân giải chúng theo trọng lượng
phân tử. Sau đó tiến hành lai, để lai, các mảnh ADN trong bản gel phải được biến
tính thành sợi đơn và được chuyển lên một loại màng đặc biệt gọi là màng lai
(màng celuloze hoặc màng nilon) và ở đó chỉ có ADN được giữ lại. Bên cạnh đó
việc đánh dấu mẫu dò cũng được tiến hành ngay sau đó nhằm phát hiện ADN trên
màng lai và nó cũng được sử dụng để lai với ADN trên màng. Theo nguyên tắc bổ
sung, đoạn mẫu dò đã được đánh dấu sẽ tìm gặp và lai với đoạn ADN tương đồng
với nó, chúng liên kết với nhau theo bằng liên kết hydro. Từ đó, chúng ta có thể
phát hiện được các đoạn RFLP.
2.1.3Ứng dụng của RFLP
RFLPs có thể sử dụng theo nhiều mục đích khác nhau. RFLPs có thể sử

dụng trong nghiên cứu quan hệ huyết thống, tội phạm bằng cách xác định nguồn
ADN mẫu.RFLPs có thể sử dụng để xác định tình trạng bệnh trong một cá thể.
RFLPs có thể sử dụng để đo tỷ lệ tái tổ hợp để lập bản đồ di truyền với khoảng
cách giữa các vị trí RFLP đo bằng centiMorgans.
Gen đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính
trạng sâu bệnh. Người ta xác định được kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử ở từng
locut và kỹ thuật này có thể áp dụng trong trường hợp phân tích đa gen. Kỹ thuật
RFLP đã ứng dụng ở lúa mì với các gen ARN ribosom để nghiên cứu bệnh đạo ôn
trên lúa (Zhihong và cs, 1990). Kỹ thuật này còn áp dụng cho nhiều loại cây trồng
như cà chua (bematzky và cs, 1986), rau diếp (lADNy và cs, 1987), khoai tây
(Gebarat và cs, 1989) .v.v.
Hiện nay, ở Việt Nam RFLP đã được ứng dụng trong nghiên cứu gen Kappa
casein và õ-actoglobulin ở bò đực giống hướng sữa (10). Sử dụng RAPD và RFLP
định vị gen kháng rầy nâu ở lúa Indica (11). Lập bản đồ xác định vị trí gen ảnh
hưởng đến tính kháng mặn của lúa (Oryza sativa L)(12)…
Chỉ thị RFLP có vài trò trong nhiều khía cạnh của sinh học phân tử, đặc biệt trong
lĩnh vực lập bản đồ phân tử. Tuy nhiên, việc thực hiện phương pháp này mất
nhiều thời gian, công sức trong thiết kế mẩu dò. Chi phí đắt, cho nên những chỉ thị
tiện ích hơn lần lượt ra đời.
2.2.Chỉ thị RAPD (Random Aplified Polymorphic ADN)
2.2.1Nguyên lý
Kỹ thuật RAPD là loại chỉ thị dựa trên nguyên tắc PCR sử dụng các đoạn
mồi ngẫu nhiên. Mồi thường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếp theo một
trình tự ngẫu nhiên nào đó, vì vậy xác suất bắt cặp một đoạn nucleotide trong
genome có 10 gốc bổ trợ sẽ vào khoảng 1/4
10
≈ 1/10
10
= 1/1.000.000. Có nghĩa cứ
khoảng 1 triệu gốc nucleotide sẽ có 1 vị trí gồm 10 gốc bổ trợ cho 10 gốc của mồi

RAPD với trình tự xác định nào đó. Do kỹ thuật này chỉ sử dụng một loại mồi đồng
nhất cho cả hai đầu của đoạn ADN cần nhân bản, ngoài ra 2 đoạn mồi này phải
được kết cặp trên hai sợi đơn khác nhau của chuỗi ADN và phải đi theo chiều vào
nhau, nên xác suất trên phải nhỏ đi nhiều. Trên thực tế xác bắt cặp của các mồi
còn nhỏ hơn nhiều lần nữa, bởi trong điều kiện PCR thông thường chỉ tổng hợp
được một đoạn ADN không dài quá năm nghìn nucleotide. Đối với ADN thực vật,
các mồi RAPD thường cho sản phẩm PCR từ một vài băng đến vài chục băng có
chiều dài từ 100-5000 nucleotide. Tuỳ vào các đối tượng thực vật khác nhau mà
Tính đa hình trong kỹ thuật RAPD là do sự thay đổi base tại vị trí bắt mồi
hoặc do thay đổi nhiểm sắc thể trong vùng được nhân (xen đoạn, mất đoạn, hoặc
đảo đoạn) đẩn đến thây đổi kích thước hoặc cản trở sự nhân bản của ADN đích.
Tính đa hình thướng được chỉ ra bởi sự có mặt hay vắng mặt của sản phẩm được
nhân bản từ một locut đơn (9)
2.2.2Phương pháp
Phương pháp RAPD do dùng mồi ngẩu nhiên, ngắn nên có rất nhiều sản phẩm
được tạo ra. Kỹ thuật RAPD được tiến hành như sau:
1. Tách chiết ADN tổng số
2. Tiến hành phản ứng RAPD gồm có 4 bước: trong đó có bước gắn mồi- gắn mồi
được thực hiện ở nhiệt độ không cao ± 36oC
3. Sản phẩm được điện di trên gel agarose
Kết quả phản ứng RAPD là sẽ xuất hiện rất nhiều phân đoạn ADN với các kích
thước khác nhau ở các locut khác nhau trên nhiễm sắc thể. Số lượng các phân
đoạn ADN được nhân bản phụ thuộc vào độ dài và cấu trúc của đoạn mồi. Đối với
hầu hết các thực vật thì đoạn mồi có kích thước trung bình 9-10 nucleotide sẽ
nhân bản được từ 2-10 đoạn ADN.
2.2.3Ứng dụng
Kỹ thuật RAPD có khả năng phát hiện được những thay đổi những thay đổi
nhỏ trong hệ gen của các cá thể thân thuộc hơn hẳn so với kỹ thuật Isozym, kỹ
thuật RFLP (Foolad et al, 1993) khi nghiên cứu về các dòng khoai tây được nuôi
cấy thấy rằng: 63% trong tổng số 313 mồi phát hiện thấy đoạn ADN đa hình nhờ

phương pháp RAPD trong khi RFLP là 16% và Isozym là 0 %. Do sự phát hiện tính
đa hình dễ dàng nên kỹ thuật này được sử dụng cho việc nghiên cứu tính thuần
của giống.
Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy kỹ thuật RAPD là một phương
pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di
truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật RAPD cũng được sử dụng để nhận biết
và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa hình di truyền trong các kiểu gen lúa
nước và lúa nương, sự đa hình di truyền giữa lúa Indica và Japonica, xác định sự
đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo, tế bào huyền phù và tế bào
trần.
Ưu điểm của kỹ thuật RAPD đánh giá toàn bộ hệ gen của sinh vật, đem lại
tính đa hình cao. Phương pháp tiến hành đơn giản, ít tốn kém. Tuy nhiên, RAPD
cũng có những nhược điểm do mồi không đặc hiệu nên có rất nhiều băng khó
phân tích, dẩn đến khi phân tích kết quả rất dể sai lầm do cách đánh giá khách
quan của từng người. Nhưng vì nó dể tiến hành nên phương pháp này hiện nay
rất được ứng dụng ở những nước có điều kiện như nước ta. Hiện nay, phương
pháp RAPD được ứng dụng trong nước ta trong nhiều lĩnh vực: như đánh giá tính
đa hình ở lúa, đậu tương, lạc chè, cà phê, bông, vải, nhạn… định vị gen kháng rầy
nâu ở lúa (4)
2.2.Phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats)
2.3.1Nguyên lý
SSR hay còn gọi là Microsatellites, nó thường là những đoạn ADN ngắn có
trình tự lặp lại của hai đến sáu nucleotide như CACACACA, và chúng có khuynh
hướng chiếm các vùng ADN không mang mã (vùng dị nhiễm sắc như: tâm động
hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể), một vài đơn vị SSR (như CA) có thể được lặp
lại bốn lần, một số đơn vị khác lại được lặp lại từ hai đến ba mươi lần.
Vùng Microsatellites thường là những vùng siêu biến, nó không chỉ khác
nhau giữa các loài mà còn giữa các cá thể có quan hệ gần gũi. Đó chính là cơ sở
tạo ra tính đa hình của phương pháp SSR. Tính đa hình SSR thường biểu lộ tính
trội (13).

Cách thông thường nhất để dò Microsatellites là thiết kế các mồi PCR nó
nằm duy nhất trong một locus trên genome, do vậy một cặp mồi PCR có thể đặc