Tuyển chọn vi khuẩn bacillus SP có khả năng đối kháng nấm mốc sinh aflatoxin trên hạt nông sản

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ,ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ..................................................... vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................... 1
1.
1

Đặt vấn đề .............................................................................................................................

2.

Tình hình nghiên cứu............................................................................................................. 1

3.

Mục đích................................................................................................................................ 3

4.
3

Mục tiêu đồ án ......................................................................................................................

5.

Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................... 3

a)

Phương pháp luận ................................................................................................................

3 b)

Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................................

3
6.

Nội dung đồ án...................................................................................................................... 3

7.
4

Kết cấu đồ án ........................................................................................................................

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 5
1.1.
5

Nấm Aspergillus flavus .....................................................................................................

1.1.1

Hình thái............................................................................................................................ 5

1.1.2.

Sinh thái ............................................................................................................................ 5

1.1.3.

Thành tế bào...................................................................................................................... 8

1.2.

Độc tố aflatoxin............................................................................................................... 11

1.2.1.

Lịch sử phát hiện aflatoxin............................................................................................. 11

1.2.2.

Các loài có khả năng sinh độc tố.................................................................................... 12

1.2.3.

Cơ chất và môi trường .................................................................................................... 14

1.2.4.
18

Cấu trúc và tính chất của aflatoxin ................................................................................

1.2.5.

Cơ chế gây độc của aflatoxin.......................................................................................... 20

1.2.6.

Độc tính của aflatoxin..................................................................................................... 21

1.2.7.
24

Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin ........................................................................
i


1.2.8.
26

Đồ án......................................................................................
tốt nghiệp
Tình hình nhiễm độc aflatoxin

1.3.

Các phương pháp phát hiện Aflatoxin ......................................................................... 27

1.3.1.

Phương pháp phát quang sinh học (Hamed K.Abass và cộng sự, 2004)...................... 27

1.3.2.

Phát hiện bằng đường lý - hoá học ................................................................................ 32

i

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3.

Các phương pháp định lượng......................................................................................... 35

1.4.

Phương pháp khử nhiễm aflatoxin ............................................................................... 37

1.4.1. Phương pháp vật lý học ........................................................................................................ 37
1.4.2. Phương pháp hóa học ........................................................................................................... 38
1.4.3. Phương pháp sinh học:......................................................................................................... 39
CHƯƠNG II: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 41
2.1. Vật liệu – thiết bị – hóa chất................................................................................................... 41
2.1.1. Vật liệu .................................................................................................................................. 41
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ............................................................................................................... 41
2.1.3. Môi trường - Hóa chất ........................................................................................................ 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................ 43
2.2.1. Mục tiêu ................................................................................................................................ 43
2.2.2. Mục đích nghiên cứu............................................................................................................ 43
2.2.3. Nội dung ............................................................................................................................... 43
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................... 43
2.2.5. Bố trí thí nghiệm .................................................................................................................. 44
3.1 Phân lập nấm sinh aflatoxin từ sản phẩm nông nghiệp........................................................ 55
3.1.1 Phân lập nấm từ sản phẩm nông nghiệp và khảo sát đặc điểm hình thái........................ 55
3.1.2 Khảo sát hình thái nấm phân lập trên môi trường phân biệt AFPA ............................... 57
3.1.3 Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng nấm phân lập ....................................... 58

3.1.4 Định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC ................................................................... 60
3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn Bacillus spp. có sẵn từ các nguồn nông sản dễ nhiễm mốc
và đất trồng..................................................................................................................................... 61
3.3. Tuyển chọn vi khuẩn tổng hợp hợp chất kháng nấm sinh aflatoxin .................................. 62
3.3.1 Khảo sát vi khuẩn có khả năng kháng nấm khi đồng nuôi cấy với nấm sinh aflatoxin . 62
3.3.2

Chọn lọc chủng có khả năng tổng hợp chất kháng nấm mạnh nhất ......................... 65

3.3.3

Phương pháp đối kháng sử dụng dịch nuôi cấy có tơ nấm làm chất cảm ứng ......... 65

3.4. Khảo sát đặc điểm của VK chọn lọc và xác định sản phẩm trao đổi chất kháng nấm ..... 68
3.4.1 Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng VK
chọn lọc............................................................................................................................................ 68
3.4.2 Xác định tác nhân đối kháng nấm mốc ............................................................................... 71

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.5. Khảo sát khả năng sử dụng sản phẩm trao đổi chất chủng CS1b trong bảo quản hạt bằng
phương pháp tạo màng bao........................................................................................................... 77
KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 82
1.

Kết luận ................................................................................................................................ 82

2.

Kiến nghị ............................................................................................................................. 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 84
PHỤ LỤC.......................................................................................................................................... 1

3


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIẾT TẮT
AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar
EA: ethyl acetate
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth
MT: Môi trường
PDA: Potato dextrose agar
HPLC: High pressure liquid chromatography
TLC: Thin layer chromatography
UV: Ultraviolet
VK: vi khuẩn

4


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm............................... 8
Bảng 1.2 : Thành phần màng nguyên sinh chất ......................................................... 9
Bảng 1.3: Một số loài nấm mốc có khả năng sinh Aflatoxin ................................... 13
Bảng 1.4: Ảnh hưởng của chủng Asp. flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh ra
Aflatoxin.................................................................................................................... 16
Bảng 1.5: Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh
ra. ............................................................................................................................... 17
Bảng 1.6:Tính chất hóa lý của một số aflatoxin. ...................................................... 20
Bảng 1.7: Ảnh hưởng của Aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý
ở vật nuôi................................................................................................................... 22
Bảng 1.8: Giới hạn aflatoxin ở một số nuớc theo tiêu chuẩn của FDA. .................. 24
Bảng 1.9: Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên
liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam.
.......................................................................... 25
Bảng 1.10: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học. ....... 39
Bảng 2.1: Thành phần dung dịch được sử dụng để làm màng bao đậu phộng ........ 53
Bảng 3.1: Khả năng sinh aflatoxin của các nấm mốc phân lập trên sản phẩm nông
nghiệp.. ...................................................................................................................... 59
Bảng 3.2: Danh sách các chủng vi khuẩn phân lập. ................................................. 62
Bảng 3.3: Tỉ lệ đối kháng trực tiếp của các chủng vi khuẩn với các chủng nấm. .... 63
Bảng 3.4: Tỉ lệ đối kháng (%) của 4 chủng VK tuyển chọn đối với chủng nấm CĐP1
theo cả 3 phương pháp. ............................................................................................. 66
Bảng 3.5: Đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn CS1b. .................................................. 68
Bảng 3.6: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch nuôi cấy CS1b.................. 70
Bảng 3.7: Kết quả phân tích định tính các chất có trong các dung dịch trích ly...... 71
Bảng 3.8: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch kết tủa protein từ dịch nuôi
cấy CS1b ................................................................................................................... 75

5

Đồ án
nghiệpphát triển trên hạt đậu phộng được
Bảng 3.9: Khả năng ức chế nấm mốc
và tốt
vi khuẩn
bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b .................................................
95

6


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ,ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Hình thái nấm mốc Asp.flavus.................................................................... 5
Hình 1.2: Nấm mốc Asp.flavus trên hạt đậu phộng. ................................................... 7
Hình 1.3: Cấu tạo của Aflatoxin............................................................................... 19
Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan................................ 21
Hình 2.1: Sơ đồ chi tiết phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt đậu phộng, đậu nành,
cà phê hư hỏng, khảo sát khả năng sinh aflatoxin của chúng. .................................. 44
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm vi khuẩn chọn lọc và xác định
sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính kháng nấm. .......................................................
47
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm VK chọn lọc và xác định sản
phẩm trao đổi chất có hoạt tính kháng nấm.. .......................................................... 50
Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao
kháng nấm.
.......................................................................................................................... 54
Hình 3.1: Mẫu hạt nuôi cấy trên môi trường WA. ................................................... 56

Hình 3.2: Các chủng nấm phân lập trên PDA. ......................................................... 57
Hình 3.3: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng (TLC) của các chủng vi nấm phân lập phát
hiện phát huỳnh quang khi chiếu tia UV 254 nm. .................................................... 60
Hình 3.4: Kết quả định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC. ........................... 61
Hình 3.5: Kết quả khẳng định khả năng sinh tính aflatoxin bằng phương pháp tái
nhiễm ........................................................................................................................ 62
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng của các chủng VK Bacillus spp. đối
với các nấm sinh aflatoxin. ....................................................................................... 65
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng của các chủng 4 VK tuyển chọn đối
với chủng nấm CĐP1. ............................................................................................... 67
Hình 3.8 : Kết quả đối kháng của vi khuẩn CS1b với nấm mốc CĐP1 sau 72 giờ.. 68
Hình 3.9: Hình thái vi khuẩn CS1b. ........................................................................ 70
7


án bào
tốt nghiệp
Hình 3.10: Khả năng tiết enzyme Đồ
ngoại
của chủng CS1b sau 48 giờ ủ. ........... 71

8


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11: Khảo sát khả năng đối kháng nấm mốc của dịch protein kết tủa từ canh
trường nuôi cấy vi khuẩn CS1b................................................................................. 74
Hình 3.12: Phát hiện các enzyme thu hồi bằng phương pháp kết tủa sử dụng ethanol
bằng phương pháp đĩa thạch. .................................................................................... 75

Hình 3.13: Khảo sát đối kháng của cao ethyl acetate đối với sự phát triển nấm mốc
................................................................................................................................... 77
Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm mốc CĐP1........................... 78
Hình 3.15: Theo dõi quá trình phát triển của nấm mốc và vi khuẩn trên hạt đậu
phộng đã được bao gói bằng chitosan kết hợp các sản phẩm trao đổi chất vi sinh
vật.

Kết

quả

coating

đậu

.......................................................................... 82

vii

phộng

ngày

thứ

10


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên
lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và vật
nuôi.
Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc
cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư
gan…), gây quái thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử
vong. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất
độc nguy hiểm nhất. Mặc dù sự hiện diện của Aspergillus flavus không phải lúc nào
cũng gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể
hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm aflatoxin.
Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường
cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện
thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát là
điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi.
Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là cần thiết và quan trọng. Giới hạn về mức
nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm. Để
có cái nhìn tổng quan về aflatoxin, các ảnh hưởng của độc tố này lên cơ thể con
người cũng như các loài động vật và các biện pháp phòng tránh việc nhiễm
aflatoxin, nhó chúng tôi đã chọn đề tài: “Tuyển chọn VK Bacillus sp. có khả năng
đối kháng nấm mốc sinh aflatoxin trên hạt nông sản”.
2. Tình hình nghiên cứu
Ðã từ lâu độc tố nấm ít được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu, kể cả các
nước tiên tiến có đời sống cao. Tuy nhiên trong những năm 1920-1930 ở Anh và
Nga đã thấy xuất hiện nhiều trường hợp ngộ độc ankaloic ở người và gà mà chất
này có trong lúa mạch, lúa mì. Năm 1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện một loại
độc tố

1


được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc. Cũng trong thời gian này Nga
tìm ra bệnh Aleukemic ở một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc.
Ðến năm 1960 nhân một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây con tại một quần
đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học Tây âu tiến hành nghiên
cứu và phát hiện ra độc tố Aflatoxin, một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus
flavus, parasiticus và fumigatus. Năm 1961 ở Anh, người ta đã tiến hành thực
nghiệm trên chuột cống trong, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc
thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan.
Theo thống kê của một số tác giả thì ở những nước có đời sống cao như châu Âu,
cùng với điều kiện khí hậu lạnh khô thì tỉ lệ ung thư gan do Aflatoxin thấp hơn
nhiều so với các nước có đời sống thấp và khí hậu nóng ẩm như châu Phi. Robinson
nghiên cứu trên trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, bằng phương pháp sấc kí lớp mỏng, ông đã
tìm thấy Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ gan và trong sữa của những
bà mẹ có con bị xơ gan. Như vậy, theo ông giữa xơ gan và Aflatoxin có một mối
quan hệ khá chặt chẽ với nhau.
Ở Thái Lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu lương thực
thực phẩm bị mốc thì 50-60% số mẫu đó có Aflatoxin . Ðồng thời nhóm tác giả này
tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm tại các gia đình) cũng
thấy có 30-50% số mẫu có độc tố aflatoxin.
Ở Việt Nam cho đến nay còn ít có những công thành công bố vế vấn đế này. Theo
kết quả của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ đã nghiên cứu trên 29381 mẫu lương thực thực
phẩm thấy có 30 loại men mốc khác nhau, trong đó mốc Aspergillus chiếm tỉ lệ cao
nhất (5,2-80,39%) bao gồm 12 chủng loại Aspergillus khác nhau. Trong số đó có 11
chủng có khả năng sinh độc tố. Năm 1984 theo tài liệu của Viện dinh dưỡng quốc
gia đã nghiên cứu trên 200 mẫu gạo bán ở Hà Nội thấy ở 2 mẫu có nhiều nấm
Aspergillus Flavus một loại nấm có khả năng tạo ra Aflatoxin.

Năm 1988, Viện dinh dưỡng đã thông báo kết quả thăm dò Aflatoxin B1 trong lạc
và sản phẩm từ lạc như sau: Có 7/55 số mẫu lạc nhân có Aflatoxin B1 (13%) 2/6


mẫu xì dầu có Aflatoxin (33%).Theo kết quả nghiên cứu bước đầu của Bộ môn Dinh
dưỡng


và An toàn thực phẩm (Trường Đại Học Y Hà Nội) kết quả nghiên cứu 30 mẫu
tương ăn và trên 60 mẫu sữa mẹ ở Hà Nội, kết quả cho thấy xấp xỉ 30% số mẫu
tương có độc tố Aflatoxin; còn trên sữa mẹ thì chưa phát hiện thấy.
3. Mục đích
-

Phân lập VK có khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin.

4. Mục tiêu đồ án
-

Phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt đậu phộng, hạt đậu nành và hạt cà phê.

-

Sàng lọc tuyển chọn VK đối kháng nấm sinh aflatoxin.

5. Phương pháp nghiên cứu
a) Phương pháp luận
Có nhiều phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của các chủng VK với vi nấm
sinh afltoxin. Trong đó, các phương pháp tối ưu được sử dụng là phương pháp đồng
nuôi cấy không ly tâm, phương pháp đồng nuôi cấy có ly tâm và phương pháp sử

dụng tơ nấm làm chất cảm ứng. Từ các kết quả đối kháng tìm ra các tác nhân đối
kháng mà không phải sử dụng trực tiếp tế bào VK.
b) Phương pháp xử lý số liệu
-

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.

-

Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu.

6. Nội dung đồ án
Nghiên cứu được thực hiện bởi 2 sinh viên ( Đỗ Tuyết Mai, Nguyễn Vân Hương).
Riêng đồ án tốt nghiệp này được trình bày bởi Đỗ Tuyết Mai với các nội dung sau:
-

Phân lập vi nấm từ hạt đậu phộng, hạt đậu nành và hạt cà phê.

-

Sàng lọc vi nấm sinh aflatoxin.

-

Khẳng định khả năng sinh aflatoxin của vi nấm.

-

Sàng lọc, tuyển chọn và định danh sơ bộ VK Bacillus.

-

Khảo sát khả năng đối kháng của VK đã phân lập với vi nấm sinh aflatoxin mạnh
nhất.

-

Khảo sát các tác nhân đối kháng từ VK chọn lọc.

-

Khuyến cáo ứng dụng.


Đồ án tốt nghiệp

7. Kết cấu đồ án
- Chương I: Tổng quan tài liệu – nội dung chương này đề cập đến các nội dung
liên quan đến tài liệu nghiên cứu.
- Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
- Chương III: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả
mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả
thu được.
- Chương IV: Kết luận và đề nghị - nội dung chương tóm lại những kết quả mà
đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Nấm Aspergillus flavus

1.1.1 Hình thái
Loài Aspergillus flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít nhiều vón
cục của tán. Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình
thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài. Các thể chai
hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua một lớp
thể bình trung gian (thể bình 2 lớp); đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại.

Hình 1.1: Hình thái nấm mốc Asp.flavus.
Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7 μm) hình cầu, màu vàng nâu
đến hơi lục, hơi sần sùi. Đôi khi người ta chỉ coi là thuộc loài Asp. flavus những loài
nấm có cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình, còn ở loài Asp. parasiticus thì
cuống bào tử đính nhẵn và thể bình một lớp.
1.1.2. Sinh thái
Asp.flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới đất, trên các chất hữu
cơ, và các loại hạt nhất là các hạt có dầu. Từ lâu, người ta đã phát hiện sự có mặt của
nó ở dưới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất hoang sa mạc Sahara,
hoặc trong đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì. Người ta còn coi
nó là có thể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước. Đất đai
vùng nhiệt đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới. Nó thường
gặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì.


Đồ án tốt nghiệp

Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường chứa loài này. Nó có rất nhiều

trên sợi bông và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp hoặc
nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra... Ngoài ra người ta còn thấy nó trên:
hạt và khô dầu tương, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin,
thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường,
quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác... Sự có mặt của các loài này trong
các thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôi không có ngô lạc, trên cỏ khô gia
súc cũng vậy. Nếu có điều kiện thuận lợi, nó sinh sôi này nở rất nhiều; trên lúa mì
tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17 % bào tử của nó chiếm từ 50-100 %
tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏ
cứng sâu tới 0.6 m. Nó cũng thường có mặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15,5 %.
Nấm mốc độc Aspergillus flavus gặp nhiều ở các loại lương thực, thực phẩm khác
nhau, nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là đậu phộng) thích hợp nhất cho sự phát
triển của nó, và cũng ở đậu phộng độc tố aflatoxin hình thành mạnh nhất. Người ta
ngiên cứu hơn
1.000 mẫu đậu phộng thí nghiệm thì thấy hạt đậu phộng có 3,3 % số hạt là rất độc –
1 kg chứa trên 0,25 mg aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Aspergillus flavus) và
21,7% số hạt độc vừa, 75 % số hạt không độc. Còn trên đậu phộng khô: 42% số
mẫu là rất độc, 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc. Như vậy chất độc tích
lũy lại trong đậu phộng khô là do sự chế biến, hoặc do Aspergillus flavus phát triển
mạnh lên.
Bào tử của nấm Asp. flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước, trong
đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực,
thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng. Vì phạm vi ký
chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn.
Nấm Asp. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn, trên
một số loại hạt làm thực phẩm như: đậu phộng, đậu, vừng..., trên thực phẩm như:
các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, đậu phộng, vừng, đậu đỗ,…và thậm chí cả trên


Đồ án

tốt nghiệp
hoa quả tươi bị dập như: thanh long,
nhãn,
xoài, vải,… Trong quá trình xâm nhiễm,
sinh trưởng phát triển, chúng tiết ra độc tố aflatoxin.


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2: Nấm mốc Asp.flavus trên hạt đậu phộng.
Gạo và đậu phộng là nguồn lương thực, thực phẩm rất cần thiết và quan trong đối
với con người. Song nếu gạo và đậu phộng không đảm bảo an toàn thì đây lại là
nguồn lây nhiễm cho con người những căn bệnh hiểm nghèo, đặc biệt là ung thư
gan. Đứng trên góc độ an toàn thực phẩm các nhà khoa học đều cho rằng tác nhân
gây ngộ độc thực phẩm lớn nhất trong gạo và đậu phộng là nấm mốc.
Đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng chắn chắc là nơi phát triển ưa thích nhất
của Asp. flavus. Không phải chỉ có duy nhất loài này, nhiều loài nấm khác thường đi
kèm với nó, trong số này một số lớn loài cũng được xem là độc với súc vật: một số
loài Fusarium trong đó có F. monoliforme, các loài Rhizopus, các loài Penicillium
citrinum, P. purpurogenum.
Đậu phộng là một loại hạt có nước: 7,4%, protein:28%, lipid: 44,5%, glucid:
15%...Các nhà khoa học cũng đã phân lập được ở trong đậu phộng có một loài nấm
độc Aspergillus flavus và thấy rằng các trường hợp ngộ độc trước đây đều liên quan
đến nấm mốc độc đó. Nấm mốc độc này cũng có gặp ở trong một số ngũ cốc khác
nhưng với đậu phộng có thể là môi trường thuận lợi nhất cho nó phát triển. Nấm
mốc khi xâm nhập vào trong đậu phộng chúng phát triển làm cho đậu phộng bị mốc
xanh hoặc mốc vàng. Đặc biệt nấm mốc này sinh ra độc tố aflatoxin.
Trong gạo có chứa các thành phần hoá học như ở gạo tám glucid: 82,2%, protein:
6,6%, nước: 10%, lipid:1,0%, chất khoáng: 0,4%, vitamin B1: 0,08%. Do đó đây là
một môi trường rất thuận lợi cho nấm mốc xâm nhập và phát triển khi biện pháp bảo

quản không hiệu quả. So với thóc, gạo không còn lớp vỏ trấu để bảo vệ, các chất
dinh dưỡng ở lớp ngoài của gạo lại nhiều nên rất dễ bị nấm mốc phá hoại. Đặc biệt ở
nước


Đồ án tốt nghiệp

có khí hậu nóng ẩm, đây là một điều kiện tốt để cho nấm mốc sinh trưởng gây ảnh
hưởng đến chất lượng của gạo. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loài nấm
mốc trên gạo, trong mỗi loài có nhiều chủng, nhưng có hai loài hay gặp nhất là
Aspergillus và Penicilium.
1.1.3. Thành tế bào
Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có
thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì
thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30 µm (thông thường là 5-10 µm).
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc
sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng,
vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh
trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào.
Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kế cấu gấo nếp hay xoắn lại, người
ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi
chúng có tác dụng tiết xuất các chất nào đó.
Thành tế bào (cell wall) của nấm có thành phần hóa học khác nhau. Đây là một tiêu
chí quan trọng khi định loại nấm.
Bảng 1.1: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm
Chi nấm:

1

2

3

4

5

6

β-Glucan

16

54

0

43

29

6

Cellulose

-

36

0

0

0

0

58

0

9

19

1

10

Chitosan

-

10

33

-

0

-

Mannan

-

<1

2

2

31

<3

Protein

10

5

6

11

13

7

-

3

8

5

9

3

Thành phần thành tế
bào:

Chitin

Lipid


Đồ án tốt nghiệp

Chú thích: 1- Allomyces
2- Phytophthora
3- Mucor
4- Aspergillus
5- Saccharomyces
6- Schizophyllum
Thành phần chính trong thành tế bào của một số nhóm nấm là như sau:




Acrasiales Cellulose, Glycogen
Oomycetes Cellulose, Glucan



Hyphochytriomycetes



Zygomycetes



Chytridiomycetes, Ascomycota (dạng sợi), Basidiomycota (dạng sợi),



Fungi Imperfecti



Riêng với Saccharomycetales và Cryptomycocolacales là Glucan, mannan



Với Rhodotorula và Sporobolomycetales là Chitine, mannan

Cellulose. Chitin

Chitin, Chitosan
Chitin, Glucan

Với màng nguyên sinh chất (protoplasmic membrane) thì thành phần ít thay đổi ở
các loài nấm sợi, có khác nhau với dạng nấm men.
Bảng 1.2 : Thành phần màng nguyên sinh chất
Loài nấm

1

2

3

4

5

Thành phần màng
NSC
Protein

52,0

38,5 46,5

45,5

25,5

Lipid

43,0

40,4 41,5

31,0

40,0

Polysaccharide

9,0

5,2

3,2

25,0

30,0

Acid nucleic

0,3

1,1

7,5

0,5

-

Chú thích:

1- Candida albicans (dạng nấm men)
2- Candida utilis
3- Saccharomyces cerevisiae


Đồ án tốt nghiệp

4- Candida albicans (dạng nấm sợi)
5- Fusarium culmorum
Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ thủng,
trong nhân có hạch nhân (nucleolus). Thường có nhiều nhân tập trung ở phần ngọn
của sợi nấm. Trong các tế bào phía sau ngọn thường chỉ có 1-2 nhân.
Nhân của nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiễm
sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương đối nhỏ. Số lượng
này là 6 ở các nấm Magnaporthe grisea, Paecilomyces fumosoroseus, Trichoderma
reesei; là

7 ở các nấm Histoplasma capsulatum, Neurospora crassa,

Phenaerchateae chrysosporium, Podospora anserina, là 8 ở các nấm Aspergillus
nidulans. Aspergillus niger,Acremonium chrysogenum, Beauveria basiana, Lentinus
edodes, là

10 ở nấm Penicillium janthinellum,là 11 ở nấm Schizophyllum commune, là 12 ở
nấm Curvularia lunata, là 13 ở nấm Agaricus bisporus, là 15 ở nấm
Cyanidioschyzon merolae, là 20 ở nấm Ustilago maydis….
Trong tế bào nấm còn có các cơ quan giống như trong tế bào các sinh vật có
nhân thực (Eukaryote) khác. Đó là ty thể (mitochondrion), mạng nội chất
(endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), thể ribô (ribosome),
bào nang (vesicle) , thể Golgi sinh bào nang (Golgi body, Golgi apparatus,
dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường
kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể Vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body),
thể Chitô đường kính 40-70 nm(chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các
vi quản rỗng ruột, đường kính 25 nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8 nm
(microfilament),các

thể

màng

biên

(plasmalemmasome).

Ribosome của nấm thuộc loại 80S (S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường
kính khoảng 20-25 nm, gồm có 2 bán đơn vị (subunit); bán đơn vị lớn (large
subunit)
60S (gồm 3 loại RNA- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein). Bán đơn vị nhỏ
(small subunit) 40S (gồm loại RNA 18S và 21-24 loại protein)


án tốt
Phần ngọn có thể tách vớiĐồ

phần
bênnghiệp
dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ
nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo nế áp lực dồn tế bào chất về phía


Đồ án tốt nghiệp

đỉnh ngọn sợi nấm. Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan
(autolysis) hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzyme) do các
vi sinh vật khác sinh ra. Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và
kết hợp với thành tế bào tạo nên một màng dày, tạo thành những bào tử áo
(chlamydospore). Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua những điều
kiện môi trường khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh
(endospore).
Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một
môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một
đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của sự phát triển
khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho
cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận
chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hiện tượng kết mạng thường gặp ở
nấm bậc cao nhưng lại ít gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp. Hình
thái, kích thước màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…có ý nghĩa nhất định trong việc
định tên nấm.
Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm sợi nấm mang sắc tố tạo
nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và
làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo
nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên
cả khuẩn lạc thường có màu.
1.2.

Độc tố aflatoxin

1.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn
10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là“bệnh gà tây X” (Turkey X disease). Sau
đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết rất nhiều. Qua
điều tra người ta xác định được bệnh đó có liên quan đến một loại độc tố do nấm có
trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất hoá học của chất


Đồ án flavus
tốt nghiệp
này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus
và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin
có
4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì aflatoxin